KR20150089426A - 약물이 담지된 베타글루칸 미소구체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1,3-베타 글루칸(1,3-β-glucan)을 이용하여 미소구체(microsphere)를 만들고 여기에 약물을 담지시켜 미소구체를 약물전달체로 사용하는 것으로서, 천연 고분자의 베타 글루칸을 가수분해하여 저분자화 한 후 저분자화 된 베타 글루칸 용액을 물/유기용매(w/o) 형태인 유화법에 의해 제조된 베타 글루칸 미소구체를 가교결합을 통해 입자의 표면을 매끄럽게 함으로써, 비교적 균일한 크기로 제조 가능하여 원하는 크기의 베타 글루칸 미소구체를 제조할 수 있으며, 약물은 에멀젼 상태에서 혼합한 후 가교결합하여 약물이 담지된 미소구체를 얻거나, 베타글루칸 미소구체를 만든 후 약물 수용액에 넣고 약물을 담지할 수 있다. 이렇게 제조된 입자는 저독성, 생분해성, 생체친화성의 특징을 가지고 있어 건강보조식품, 화장품 또는 의약적 목적으로 사용하기 적합하다.

Description

약물이 담지된 베타글루칸 미소구체의 제조방법{Preparation of beta-glucan microspheres for drug delivery system}

본 발명은 천연 고분자를 이용해 약물이 담지된 미소구체, 즉 약물전달 시스템에 관한 것이다

최근에 생체 적합성이 우수하며 생체 내에서 분해되는 성질을 가지는 고분자를 이용하여 약물 전달체로 사용하기 위한 연구가 광범위하게 연구되어지고 있다. 특히, 최근에 이러한 고분자로 만들어진 콜로이드 입자들을 극히 미세한 크기의 나노 입자의 형태로 제조하여 약물을 담지하여 약물 전달체로 활용하기 위한 연구가 진행되고 있다. 이러한 나노 입자는 극히 작은 크기와 큰 표면적을 가지는 특성이 있으며, 미립구의 표면 특성에 따라 약물을 담지한 이 미립구를 피부에 적용 시 약물의 투과율도 향상시켜주는 방법으로 알려져 있다.

나노 입자 제조 연구에서 가장 중용한 핵심은 생리활성물질의 안정성을 확보하기 위한 소재를 선택하고, 피부 세포층을 통과할 수 있는 피부흡수율을 증가시키기 위한 입자크기와 피부친화도를 개선하며, 생리 활성 물질의 봉입(loading)효율을 개선하는데 있다.

화장품이나 의약품의 원료로 사용되고 있는 나노 입자의 소재에는 폴리디엘-락타이드-코-글리콜라이드{poly(DL-lactide-co-glycolide); PLGA}, 폴리캡로락톤(polycaprolacton; PCL)등의 고분자 소재, 셀루로오스 유도체, 인지질(pospholipid) 등이 있다. 기존에 나노 캡슐의 소재로 주로 이용된 물질은 인지질로서 리보솜이나 나노 에멀젼 형태로 생리 활성 물질을 봉입하였으나 안정성 등의 문제로 인하여 다른 소재에 대한 연구가 진행되게 되었다. 최근에는 주로 의약품 분야에서 생체용 소재로 연구되어오던, PLGA, PCL등의 고분자를 이용한 나노 소재의 연구가 활발히 진행되고 있다.

나노 캡슐과 나노 스페어는 그 내부 형태에 따라 명확하게 구별되어 있다. 나노 캡슐은 고분자 또는 지질 등에 의한 격벽 막이 존재한다. 즉, 나노 캡슐은 그 캡슐내부 공간이 10nm 내지 수십 nm 크기의 막에 의해 외계와 구분돼 있는 리저버 형(Reserver Type)이다. 가령 약물 송달에서는 막 두께, 막 밀도 및 막 전하 등의 제(諸) 특성에 의해 막 내부에 캡슐화된 약물의 방출 제어가 이루어진다. 한편, 나노 스페어는 기제(基劑)가 되는 고분자가 내부까지 고르게 분포되어 있어 매트릭스 형(Matrix Type)으로 불리고 있다. 약물 송달에서는 이 고분자 기제 중에 약물을 분산 또는 용해함으로써, 기제와의 친화성· 분배 또는 상호작용의 대소에 따라 약물 방출이 조절된다.

미소구체를 만드 데에는 화학고분자 이외에 생체 친화성이 뛰어난 천연고분자의 활용이 큰 관심을 얻고 있다. 그 일례로 키토산을 들수 있으며, 최근에는 고분자 자체의 기능성 때문에도 관심이 되고 있는 1,3-베타글루칸이 그것이다.

베타 글루칸 자체는 다당체이면서 판상형 구조를 가지고 소수성이어서 그대로 사용하는데에는 한계가 있다. 실제로 베타 글루칸이 인체 내에서 상기와 같은 기능을 나타내기 위해서는 반드시 갖추어야 할 전제조건이 있다. 즉, i )수용성이며 ii)장기내에서 흡수가 되어야 하며 iii)면역조절기능을 갖고 있어야 한다는 점이다. 그러나 현재 사용되고 있는 베타 글루칸을 살펴보면 상기의 전제조건과 많은 거리가 있다.

즉, 수용성면에 있어서 의약품으로 사용되는 레티난(Lentinan), 크레스틴(Krestin), 쉬조필탄(Shizofilan)등은 주사제로 사용되는 수용성 다당체이다. 이러한 면역증강기능을 갖고 있는 수용성 다당체는 그 원료를 얻기에는 많은 제한점이 있다. 따라서 자연계에 있는 고분자 다당체를 그대로 사용하거나 수용성으로 바꾸어 사용하기도 한다. 그러나 이러한 다당체는 고분자량으로 인하여 흡수가 잘 되지 않고 극히 일부만 흡수되어 기능을 나타내는 제한점이 있다. 따라서 국내외적으로 흡수성을 높이기 위하여 미립자화하여 사용하기도 하나 체내에서 미립자로의 유지가 쉽지 않은 단점이 있다. 또한 유지를 한다하여도 이는 불수용성 물질이므로 흡수되어 기능을 나타낼 수가 없는 원천적인 문제점을 안고 있다.

본 발명은 베타글루칸이 가지는 소수성, 생체 흡수되기에는 너무 큰 구조, 약물을 퐁ㅎㅂ하기에는 어려운 판산 구조 등과 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 면역증강기능을 갖는 베타 글루칸을 저분자화 및 가교화하여 비교적 균일한 크기의 매끄러운 외벽을 갖게 함으로써 장기 내에서 흡수가 용이하게 되어 면역관련 질환의 치료 및 예방에 도움이 되는 베타 글루칸을 이용한 미소구체를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 미소구체를 이용하여 약물을 담지시켜 약물전달체로서의 활용이 가능하게 하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a)베타 글루칸 분말을 포름산에 용해시켜 가수분해 하는 단계, b) 여기에 수용성 약물을 넣어 용해하는 단계, c)유화제와 유기용매를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계, d)상기 b)단계의 베타 글루칸 수용액을 상기 b)단계의 혼합용액에 첨가하여 에멀젼을 만드는 단계, e)상기 d)단계의 에멀젼에 글루타알데히드를 첨가한 후 교반하여 가교결합을 형성하는 단계, f)상기 e)단계의 에멀젼을 에탄올로 수회 세척 후 12시간 동안 동결건조 하는 단계를 포함하는 베타 글루칸을 이용한 미소구체의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 100 내지 1000nm의 입자크기를 갖지면서 내부에 약물을 갖지고 있어 약물전달체로서의 활용이 가능하게 하는 것을 목적으로 한다.

이상에서와 같이, 본 발명은 고분자의 베타 글루칸을 가수분해하여 저분자화 한 후 저분자화 된 베타 글루칸과 수용성 약물의 혼합 용액을 물/유기용매 안의 형태인 유화법에 의해 제조된 베타 글루칸 미소구체를 가교 결합을 통해 입자의 표면을 매끄럽게 함으로써, 비교적 균일한 크기로 제조 가능하여 원하는 크기의 베타 글루칸 미소구체를 제조할 수 있으며 이렇게 제조 된 입자는 저독성, 생분해성, 생체친화성의 특징을 가지고 있어 건강보조식품, 화장품 또는 의약적 목적으로 사용하기 적합하다. 특히, 본 발명의 베타 글루칸 미소구체에 약물을 담지 시켜 약물전달체로서의 활용이 가능하다.

도 1은 β-(1,3)-(1,6)-glucan, 의 구조식을 나타낸 도면이다.
도 2는 베타 글루칸을 이용한 미소구체의 제조공정의 흐름도를 나타낸 도면이다.
도 3은 비교예1의 베타 글루칸 입자를 주사전자현미경(SEM)을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 비교예2의 베타 글루칸 입자를 주사전자현미경(SEM)을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 비교예2의 베타 글루칸 입자를 입도분석기로 측정한 입자 분포도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 가수분해에 의해 포름산(HCOOH)에 베타 글루칸 1∼10(w/w)％를 용해하여 저분자화 시킨다. 그런 다음 이 용액에 수용성 약물을 넣어 혼합용액을 만들고, 상기 용액을 물/유기용매(W/O) 형태의 유화법에 의해 유화제인 스판80(Soritan Monooleate)과 이소옥탄(Isooctane)이 균일하게 섞여있는 용액에 천천히 적가 시킨다. 이렇게 생성된 에멀젼을 30분간 교반해준 후, 글루타알데히드(Glutaraldehyde)를 첨가하여 60분간 가교결합 하여 표면이 매끄러운 베타 글루칸을 이용한 미소구체를 얻는다.

즉, 본 발명에 따른 베타 글루칸을 이용한 미소구체의 구체적 제조방법은 다음과 같다.

1. 베타 글루칸 분말의 준비

본 발명에 사용된 베타 글루칸은 β-(1,3)-(1,6)-glucan으로 중성에서는 물에 녹지 않으며 알칼리 용액에 용해되고, 고온에서는 산 용액에 용해되는 특징을 가지고 있다. 베타 글루칸의 구조는 도 1에 나타내었다.

2. 베타 글루칸 수용액 제조 및 가수분해

베타 글루칸 분말을 가수분해에 의한 저분자화를 위하여 미리 준비한 포름산(HCOOH)에 1∼10(w/w)％로 용해한 후 교반기를 이용하여 80∼90℃에서 20∼30분간 교반한다.

화학적 가수분해 반응에 의한 분자량 조절을 하기 위한 용액은 포름산이 바람직하다.

상기된 베타 글루칸을 1(w/w)％ 미만으로 첨가하는 경우에는 수득률이 너무 낮아 실질적으로 활용하는데 문제가 있는 것으로 본다. 또한, 10(w/w)％를 초과하면 베타 글루칸의 크기가 너무 커져서 약물 전달용 수송체로 사용하는데 무리가 있는 것으로 보인다. 그로인해, 1∼10(w/w)％의 농도가 안정하고 균일한 베타 글루칸의 미소구체를 만들 수 있는 조건이다. 이때, 80℃ 이하에서 반응을 하게 되면 베타 글루칸이 용해되지 않고 90℃를 초과하게 되면 포름산이 휘발되어 베타 글루칸의 농도가 변하게 되어 실험의 오차를 내게 된다. 그로인해 80∼90℃에서 반응을 시켜주는 것이 안정한 베타 글루칸 미소구체를 얻을 수 있는 조건으로 바람직하다.

상기 반응시간과 온도가 바람직한 가수분해정도를 결정하게 된다.

상기의 희석· 교반한 상태의 베타 글루칸 용액은 그대로 사용한다. 이때 pH는 산으로 나타나는데, 특별히 일정 범위로 제한되는 것은 아니다.

3. 가교결합

상기 방법으로 제조된 베타 글루칸 수용액(포름산 내의 베타 글루칸 최종 농도 1∼10(w/w)％ 기준)을 유화제로 사용되는 스판 80과 유기용매로써 사용되는 이소옥탄의 혼합 용액에 첨가하여 약 30분 동안 교반하여 에멀젼을 만든다.

유기용매로 이소옥탄 외에 에탄올이나 프로판올 등을 사용하여도 W/O 형태의 유화법을 만들 수 있다. 이때 만들어진 베타 글루칸 미소구체에 약물을 로딩 시켰을 때, 국소 부위에서 약물의 과다방출 없이 서서히 약물이 영차로 방출할 수 있도록 하고, 점액 점착 특성을 갖게 하기 위하여 W/O 형태의 유화법을 사용하는게 바람직하다.

유상에 용해되는 유화제는 주로 베타 글루칸의 크기를 조절한다. 유화제로 스판 80의 경우는 스판 20, 스판 40, 스판 60등에 비해 보다 생체에 흡착 등에 의한 자극성 및 독성이 인체에 무해한 유화제로 쓰이기 때문이다.

베타 글루칸을 구성하는 물질에 대한 스판 80의 부피비가 0.079내지 0.167가량이 적당하다.

이로 인해 형성된 에멀젼에 글루타알데히드를 첨가하여 60분간 교반해주어 가교결합을 형성한다.

상기 가교제가 포름알데히드(formaldehyde), 아세트알데히드(acetaldehyde)및 글루타알데히드(glutaraldehyde)로 구성된 군에서 선택되는 것이며, 바람직하게는 글루타알데히드를 사용한다. 글루타알데히드는 인체에 대해 사용이 현재 최대 농도인 0.1％에서 크게 우려할 바가 없으므로 가교제로 바람직하다.

4. 동결건조

이와 같이 제조된 에멀젼은 에탄올을 이용하여 수회 세척 후 12시간 동안 동결 건조하여 100∼1000nm의 직경을 갖는 베타 글루칸 입자를 얻는다.

입자의 크기는 베타 글루칸의 농도가 감소함에 따라 감소한다. 상세하게는, 베타 글루칸 간의 표면장력이 감소하게 되어 시스템의 안정을 가져오게 되어 보다 작은 입자의 생성을 촉진하게 된다. 본 발명의 미소구체의 크기는 100∼1000nm로 바람직하게 약물을 봉입할 수 있고 약제 조성물의 부분을 형성할 수 있다.

여기서 베타 글루칸을 1(w/w)％ 미만으로 첨가하는 경우에는 베타 글루칸의 크기가 100nm보다 작아지나 수득률이 너무 낮아 실질적으로 활용하는데 문제가 있는 것으로 본다. 반면 베타 글루칸의 크기가 1000nm를 초과하게 되면 약물 전달용 수송체로 사용하는데 무리가 있는 것으로 보인다. 그로인해, 100∼1000nm의 직경을 갖는 베타 글루칸이 바람직하다고 본다.

약물은 물-가용성 또는 수성상에 분산성일 수 있다. 그러한 물-가용성의 약물은 단백질, 펩티드, DNA 플라스미드를 포함한 어떠한 성질의 것일 수도 있다.

약물의 봉입은 2가지 방법으로 수행할게 되는데, 첫째는 저분자화된 베타글루칸 수용액에 수용성 약물을 넣고 에멀젼을 만드는 것이고, 다른 하나는 건조된 글루칸을 약물에 넣은 다음 건조하여 담지하는 방식이다.

[실시예]

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시 예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

＜비교예 1＞

베타 글루칸 분말을 미리 준비한 폼산에 5％(w/w)로 용해한 후 유화제로 사용되는 스판80이 미네랄오일에 1％(w/w)로 혼합된 용액에 첨가하여 30분 동안 교반하여 에멀젼을 만들었다. 제조된 에멀젼은 에탄올을 이용하여 수회 세척 후 12시간 동안 동결 건조하여 100∼500㎛의 직경을 갖는 베타 글루칸 입자를 얻었다.

이와 같이 얻어진 베타 글루칸 입자를 주사전자현미경(SEM)을 통해 관찰한 결과를 도3에 나타내었다. 도3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 베타 글루칸 입자가 불규칙하고 판상형의 형태를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

불규칙하며 판상구조 형상의 베타 글루칸 미소구체는 약물 전달체로 사용이 거의 불가능할 것으로 본다.

＜비교예 2＞

베타 글루칸 분말을 미리 준비한 폼산에 5％(w/w)로 용해한 후 유화제로 사용되는 스판80이 미네랄오일에 1％(w/w)로 혼합된 용액에 첨가하여 30분 동안 교반하여 에멀젼을 만들었다. 이렇게 형성된 에멀젼에 가교결합을 하기 위해 0.008M 글루타알데히드를 6ml 첨가하여 60분간 교반하였다. 그 후 0.006M 글루타알데히드를 4ml 첨가하고 90분간 교반했다. 이렇게 제조된 에멀젼을 에탄올을 이용하여 수회 세척 후 12시간 동안 동결 건조하여 20∼200㎛의 직경을 갖는 베타 글루칸 입자를 얻었다.

이와 같이 얻어진 베타 글루칸 입자를 주사전자현미경(SEM)을 통해 관찰한 결과를 도4에 나타내었다. 도4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 베타 글루칸 입자가 규칙적이지는 않으나 표면이 매끄럽고 구형의 형상을 하고 있음을 확인할 수 있었다.

＜실시예 1 내지 4＞

가수분해를 위하여 베타 글루칸 분말을 미리 준비한 포름산에 1∼5％(w/w, 실시예 1∼5)로 각각 용해한 후 약 80∼90℃에서 30분간 교반해주었다. 상기 방법으로 제조된 베타 글루칸 수용액의 농도 1∼5％(w/w) 범위를 이용하였다. 이 베타 수용액에 수용성 약물인 비타민C를 20％ 되게 녹여 혼합수용액을 만들었다. 이 베타 글루칸 혼합 수용액을 스판80 0.125(vol.％)와 이소옥탄 35ml 혼합 용액에 첨가하여 약 30분 교반하여 에멀젼을 만들었다. 형성된 에멀젼에 28％ 글루타알데히드를 첨가하여 60분간 교반해주어 가교결합을 형성했다. 제조된 에멀젼은 에탄올을 이용하여 수회 세척 후 12시간 동안 동결 건조하여 20∼1000nm의 직경을 갖는 베타 글루칸 입자를 얻었다.

이와 같이 얻어진 실시예 1 내지 4에 에탄올에 분산된 베타 글루칸에서의 입자 크기에 대해 조사하였으며 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

비타민 C가 담지된 베타글루칸 미소구체 100mg을 물 10ml에 분산시킨 후 녹아 나오는 비타민 C의 농도를 분광법으로 분석한 결과 글루칸 미소구체에 담지된 비타민 C의 담지율은 8∼12％인 것으로 나타났다.

＜실시예 5 내지7＞

가수분해를 위하여 베타 글루칸 분말을 미리 준비한 포름산에 1∼5％(w/w, 실시예 1∼5)로 각각 용해한 후 약 80∼90℃에서 30분간 교반해주었다. 이 베타 글루칸 수용액을 스판80 0.125(vol.％)와 이소옥탄 35ml 혼합 용액에 첨가하여 약 30분 교반하여 에멀젼을 만들었다. 형성된 에멀젼에 28％ 글루타알데히드를 첨가하여 60분간 교반해주어 가교결합을 형성했다. 제조된 에멀젼은 에탄올을 이용하여 수회 세척 후 12시간 동안 동결 건조하여 20∼1000nm의 직경을 갖는 베타 글루칸 입자를 얻었다. 건조된 베타글루칸을 20％의 비타민 C 수용액에 넣고 30분 정도 교반하여 주고 난 후 물로 씻은 후 동결 건조하여 비타민이 담지된 베타글루칸 미소구체를 얻었다.

이와 같이 얻어진 실시예5 내지 8에 분석된 비타민C의 담지율을 하기의 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예1∼4와는 달리 글루칸의 입자가 크기와는 일정하 관계를 보기 어려우나 클수록 담지율은 낮아지는 것으로 나타났으며, 미소구체를 만든 후 비타민 C를 담지시키는 효율은 에멀젼 상태에서 로딩 시키는 것에 비해 50％이하로 떨어지는 것으로 나타났다.

Claims (3)

1. a)베타 글루칸 분말을 포름산에 용해시켜 가수분해 하는 단계;
   b)상기 a) 수용액에 수용성 약물을 혼합하여 수용액을 만드는 단계
   c)유화제와 유기용매를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계;
   d)상기 b)단계의 베타 글루칸 수용액을 상기 c)단계의 혼합용액에 첨가하여 에멀젼을 만드는 단계;
   e)상기 d)단계의 에멀젼에 글루타알데히드를 첨가한 후 교반하여 가교결합을 형성하는 단계;
   f)상기 e)단계의 에멀젼을 에탄올로 수회 세척 후 12시간 동안 동결건조 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타 글루칸을 이용한 미소구체의 제조방법.
2. a)베타 글루칸 분말을 포름산에 용해시켜 가수분해 하는 단계;
   b)유화제와 유기용매를 혼합한 혼합용액을 제조하는 단계;
   c)상기 a)단계의 베타 글루칸 수용액을 상기 c)단계의 혼합용액에 첨가하여 에멀젼을 만드는 단계;
   d)상기 c)단계의 에멀젼에 글루타알데히드를 첨가한 후 교반하여 가교결합을 형성하는 단계;
   e)상기 d)단계의 에멀젼을 에탄올로 수회 세척 후 12시간 동안 동결건조 하는 단계
   f)상기 e)에서 얻은 베타글루칸 미소구체를 10∼30％의 수용성 약물에 혼합한 후 물로 씻은 후 급속 동결 건조하여 약물이 담지된 베타글루칸 미소구체를 얻는 방법.
3. a)포름산에 저분자화된 베타글루칸을 5％(w/w)로 용해한 후 약 80∼90℃에서 30분간 교반하는 단계
   b)상기 a)단계의 베타 글루칸 수용액을 이소옥탄 35㎖와 스판80의 농도비 0.08∼0.2 비율로 달리하여 에멀젼을 만드는 단계
   c)상기 b)단계의 에멀젼에 28％ 글루타알데히드를 첨가하여 60분간 교반해주어 가교결합을 형성단계
   d)상기 c)단계의 에멀젼을 에탄올을 이용하여 수회 세척 후 12시간 동안 동결 건조하여 400∼3000nm의 직경을 갖는 베타 글루칸 입자를 제조하는 과정

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