KR20150074182A - 인플루엔자 항원 수송 벡터 및 구조물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역반응성 표적 세포로 인플루엔자 항원을 수송시키기 위한 플루오로카본 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간을 포함하는 동물에서의 백신 및 면역치료제로서 플루오로카본 벡터-인플루엔자 항원 구조물에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 항원 수송 벡터 및 구조물{INFLUENZA ANTIGEN DELIVERY VECTORS AND CONSTRUCTS}
본 발명은 면역반응성 표적 세포로 인플루엔자 항원을 수송시키기 위한 플루오로카본 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 백신 및 면역치료제로서 플루오로카본 벡터-인플루엔자 항원 구조물에 관한 것이다.
인플루엔자는 인플루엔자 바이러스에 의해 발생하는 질환 또는 감염을 나타내는 일반적 용어이다. 인플루엔자 바이러스는 바이러스의 오르토마익소비리대(Orthomyxoviridae) 패밀리의 멤버이며 인플루엔자 A와 B 바이러스 및 인플루엔자 C 바이러스의 두 속을 포함한다. 인플루엔자 A, B 및 C 바이러스는 각 바이러스 유형에 특이적인 이들의 내부 핵단백질 및 매트릭스 단백질을 기초로 하여 구분된다. 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 돼지, 조류, 바다표범 및 말을 포함하는 동물 종의 범위에 자연적으로 감염될 수 있다. 그러나 인플루엔자 B 바이러스는 인간에만 감염되며 인플루엔자 C 바이러스는 인간 및 돼지에 감염된다. 인플루엔자 A 바이러스는 표면 당단백질, 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미니다아제(N)의 항원성에 의해 결정되는 아형으로 추가로 분류된다.
역사적으로, 인플루엔자 A 인간 감염은 세 헤마글루티닌 아형(H1, H2 및 H3) 및 두 뉴라미니다아제 아형(N1및 N2)에 의해 발생하였다; 좀더 최근에는 이미 조류-한정 아형인 H5, H7 및 H9에 의한 인간 감염이 또한 보고되었다. 총 16개의 다른 헤마글루티닌 및 9개의 뉴라미니다아제 인플루엔자 A 아형이 현재까지 확인되었다; 이들은 모두 조류에서 우세하다. 인간과 유사한 돼지 및 말이 매우 한정된 범위의 아형으로 제한된다.
인플루엔자 A 및 B 비리온은 다형성 구조로서 구형의 경우에는 80 -120nm 지름을 가지며, 필라멘트상 형태는 300nm이하의 길이이다. 여기에는 숙주-유래 지질 이중층 막에 끼워진 입자 당 대략 500개 표면 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)(일반적으로 하나의 뉴라미니다아제에 대해 4 내지 5개 헤마글루티닌의 비율임)이 있다. 막 안에 막횡단 이온 채널 단백질 M2이 있으며 구조적 단백질 M1은 이중막 아래에 있다. 바이러스의 코어 내에, 단일 가닥 네거티브 센스 RNA는 이의 게놈으로부터 발현되는 6개의 다른 바이러스성 단백질에 관련되었다: 핵단백질(NP), 3개의 트랜스크립타아제(transcriptases) (PB2, PB1 및 PA) 및 2개의 비구조성 단백질(NS1 및 NS2). 인플루엔자 바이러스 게놈은 8개의 세그먼트를 포함한다; "유전자 스와핑(gene swapping)" 재편성이 가능한 특성. 헤마글루티닌은 바이러스가 숙주 세포 수용체에 결합할 수 있도록 하며 복제될 세포 내로의 바이러스 침입을 촉진한다. 뉴라미니다아제 단백질은 말단의 시알산 잔기를 효소적으로 절단하고, 호흡관의 뮤신층을 통해 바이러스가 이동하는 것을 원조할 뿐만 아니라 숙주 세포로부터 자손 바이러스가 이동해나가는 것을 원조한다고 여겨진다. 인간에게 훨씬 적은 건강상 위험으로 존재하는 인플루엔자 C 바이러스는 헤마글루티닌에 결합하는 단일 표면 단백질, 융합 활성 및 수용체 파괴 활성을 갖는다.
잘못되기 쉬운 RNA 폴리머라아제 효소의 결과로서, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 단백질 둘 다에서 점 돌연변이가 생기기 쉬우며, 이 돌연변이는 복제하기 위한 바이러스의 능력에 반드시 영향을 미치지 않는다. 숙주 항체 반응에 의해 인식되는 부위 중 하나에서의 이러한 돌연변이(또는 동시에 일어나는 돌연변이)는 백신화 또는 이전의 감염에 의해 유도된 숙주 항체를 야기할 수 있는데, 이 항체는 "신규한" 바이러스 균주에 효과적으로 결합할 수 없어 감염이 지속되도록 한다. 인간 인플루엔자 균주가 이러한 점 돌연변이를 통해 지속적으로 진화함으로써, 바이러스는 인간 면역 반응의 제한된 항체 레파토리로부터 탈출할 수 있으며 급속히 확산될 수 있다. 그러므로 인플루엔자 감염의 정기적인 "계절" 발병기간이 항원 이동을 겪은 집단에서의 순환 균주에 의해 발생한다.
계절 유행병 기간 동안 인플루엔자가 전세계에 빠르게 퍼질 수 있으며 병원 입원기간 및 그외 건강관리 비용 및 생산성 손실과 같은 상당한 경제적 부담이 발생한다. 바이러스는 인간에서 인간으로 공기를 통해 전파되며 기도 위의 호흡관 및 기관지의 상피 세포를 표적으로 한다. 인플루엔자 바이러스는 또한 오염된 표면으로부터 입으로 옮겨질 수 있다. 질환은 기침 및 재채기를 통해 복잡한 환경에서 특히 매우 빨리 전파된다. 바이러스의 안정성은 낮은 상대습도 및 낮은 온도에서 좋아지며, 그 결과로서 온대성 지역에서의 계절 유행병은 겨울에 나타나는 경향이 있다. 인플루엔자 A에 관련하여 더 많은 질병률 및 사망률이 관찰되었으며, 인플루엔자 B는 일반적으로 더 낮은 발병률 및 온건한 질환 상태를 나타낸다. 그러나, 때때로 인플루엔자 B는 A 유형 바이러스와 같은 심각성을 갖는 유행병을 야기할 수 있다. 인플루엔자 B는 주로 아동기 병원균이며 일반적으로 A 유형에서와 같은 정도의 항원 변이를 나타내지는 않는다.
전형적인 복잡하지 않은 인플루엔자 감염은 질병의 급격한 발병(두통, 기침, 한기) 후 발열, 인후염, 상당한 근육통, 불쾌감 및 식용저하를 나타내는 것으로 특징지어진다. 추가 증상은 콧물, 흉골하 긴장 및 안구 증상을 포함할 수 있다. 가장 두드러진 감염 조짐은 일반적으로 38-40℃ 온도 범위의 발열이다. 대부분 인간이 어떠한 의학적 치료 없이도 1-2주 안에 인플루엔자 감염으로부터 회복될 것이나, 집단 중 특정 구성원은 질환이 심각한 위험을 야기할 수 있다. 이러한 개체는 매우 어리거나 나이가 많거나 폐 질환, 암, 신장 또는 심장 문제와 같은 의학 증상을 갖는 사람을 포함한다. 이러한 "위험" 집단에서, 감염은 원질환의 심각한 합병증, 박테리아성 폐렴(스트렙토코쿠스 누모니애(Streptococcus pneumonia), 헤모필루스 인플루엔재(Haemophilus influenza) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 호흡기 병원균에 의해 발생함) 및 사망에 이르게 할 수 있다. 인플루엔자 감염의 임상학적 특성은 비록 이들의 발열이 더 높을 수 있으며 열성 경련이 일어날 수 있지만 아동에서도 유사하게 나타난다. 게다가, 아동은 구토 및 복통뿐만 아니라 중이염 합병증, 급성 폐쇄성 후두염 및 근염의 더 높은 발생률을 갖는다.
세계 보건 기구(World Health Organization)는 매년 인플루엔자 유행병에서 인구의 5-15%가 상기도 감염(upper respiratory tract infections)으로 인한 것이라고 추정했다. 입원 및 사망이 고위험군(노인 및 만성 질환자)에서 주로 발생했다. 추정하기 어렵지만, 이러한 매해의 유행병으로 심각한 질병의 경우 3만 내지 5만 사이이며 세계에서 매년 대략 250,000 및 500,000명이 사망한다고 여겨진다. 산업화 국가에서 현재 인플루엔자 관련 사망 중 90% 이상이 65세 이상의 노인 중에서 발생했다. 미국에서, CDC는 평균 200,000명 이상의 사람들이 매년 계절성 인플루엔자 감염으로부터 합병증이 생겨 입원하며 약 36,000명 이상이 사망한다고 보고되었다.
인플루엔자 감염으로부터의 회복을 조절하는 숙주 면역 반응은 표면 단백질을 겨냥하는 혈청 항체, 점막 분비 IgA 항체 및 세포-매개 면역 반응의 조합을 통해 부여된다. 일차 감염 후 약 1 내지 2주 후에 혈구응집 저해(haemagglutination inhibiting; HAI) 항체뿐만 아니라 뉴라미니다아제에 대한 항체를 중화하는 것이 혈청에서 검출가능하며 대략 3 내지 4주 후에 최대치를 나타낸다. 재-감염 후에, 항체 반응이 좀더 급격해진다. 일부 고위험군에서 항체 수준이 백신화 후 몇 달 안에 감소되기 시작할 수 있지만, 인플루엔자 항체는 몇 달 또는 몇 년 동안 지속될 수 있다. 분비성 IgA 항체는 감염 후 대략 14일 후에 최고치를 나타내며 타액, 비강 분비, 가래 및 기관 세척액에서 검출될 수 있다. 항체-생성 세포의 출현에 앞서, 인플루엔자에 대한 특이성을 갖는 세포독성 T 림프구가 나타나 항바이러스성 사이토카인의 유도 및 감염 세포의 용균을 통해 좀더 빠른 바이러스 청소율을 매개하는 동안 최대 바이러스 로드(viral load)를 감소시켜 감염을 제한하도록 한다. 게다가, 단핵 세포는 감염된 기도로 침투하여 인플루엔자-감염 세포에 대한 항체 의존 세포-매개 세포독성을 제공한다.
현재까지, 인플루엔자와 같은 호흡기 바이러스 감염에 대한 백신 접근은 비리온을 중화하거나 세포내로의 바이러스 유입을 차단하여 바이러스 감염에 대해 보호하는 항체의 유도에 기본적으로 의지해왔다. 이러한 체액성 면역 반응은 주어진 균주에 대해 보존된 외부 바이러스 표면 단백질을 표적으로 한다. 그러므로 항체-매개 보호는 상동성 바이러스 균주에 대해서는 효과적이나 혈청학적으로 별개인 표면 단백질을 갖는 이종성 균주에 대해서는 적합하지 않다. 이러한 구분은 많은 바이러스의 표면 단백질이 재빠른 돌연변이가 가능하기 때문이다; 예를 들어 인플루엔자 바이러스에 대항하는 효과적인 체액성 반응-기저 백신은 다음 계절의 변이체에는 효과가 없을 수 있다.
현재 허가된 인플루엔자 백신은 두 가지의 주요 유형이 있다. 백신 중 하나는 활성 면역원으로서 바이러스의 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 표면 단백질을 포함한다. 이들은 전체 비활성 바이러스 백신, 계면활성제 처리에 의해 분쇄된 비활성 바이러스 입자로 구성된 분할 바이러스 백신(split virus vaccine), 다른 바이러스 성분이 제거된 정제 표면 단백질로 본질적으로 구성된 서브유닛 백신 및 표면 단백질이 리포솜 표면 상에 존재하는비로솜(virosomes)을 포함한다. 이차 그룹은 약독화된, 한랭-적응(cold-adapted) 생균주의 바이러스이다. 이러한 모든 백신에서 일반적으로 3 내지 4개 바이러스 균주로부터의 표면 항체의 혼합이 요구된다; 현재 시판되는 인플루엔자 백신은 두 가지의 A 아형 H3N2와 H1N1 및 하나의 B형 바이러스로부터의 항원을 포함한다. 매년 9월과 2월에, WHO 글로벌 인플루엔자 프로그램(Global Influenza Program)은 남반구에서는 5월-6월, 북반구에서는 11월-12월에 시작되는 다음 계절을 위한 인플루엔자 백신 조성물을 추천한다. 조성물은 국가 인플루엔자 센터 및 WHO 협력 센터의 월드와이드 네트워크로부터의 감시 데이터에 기초한 것으로 9달 후에 유포될 가능성이 있는 균주를 가려내기 위한 의도이다. 이러한 이유로, 제조업자들은 유포될 바이러스 균주에 대해 적합하게 매치되는 것을 보장하기 위해 연간기준에서 인플루엔자 백신을 변화시켜야 한다.
대부분의 비활성 인플루엔자 백신은 유아를 제외하고는 삼각근에 근육내 경로를 통해 투여되며, 유아에게는 허벅지의 전외측면에 투여하는 것이 권고된다. 매년 비활성 백신을 단독 투여하는 것이 적합하나 적어도 한달 간격으로 2회 투여받아야 하는 의학적 증상을 이미 가지고 있는, 미리 백신화되지 않은 미취학 아동에게는 적합하지 않다. 약독화된 인플루엔자 생백신(live attenuated influenza vaccine; LAIV)을 비강내로 투여한다. 이들은 러시아에서 수년간 허용되어왔으며 최근에 미국에서 소아과 환자를 대상으로 허가되었다. 이러한 백신은 비강 상피 표면에서 국소 항체 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나 약독화된 인플루엔자 생백신을 노인층(50세 이상)에서 사용하는 것은 허가되지 않았다.
인플루엔자 바이러스 표면 단백질에 대한 면역 반응의 확산 및 강도를 증가시키기 위해, 다양한 보조약 및 대안적 면역-증강제를 백신 제형에 포함시키는 것이 평가되었다. 이러한 맥락에서 보조약은 그 자체로 투여됐을 때 직접적인 효과를 거의 가지지 않는, 공동-투여된 항원에 대해 면역 반응을 조절할 수 있는 제제이다. 인플루엔자 백신 분야에서 최근 허가된 개발품은 서브미크론(submicron) 수중유(oil-in-water) 에멀젼인 MF-59이다. 알루미늄-함유 보조약 또한 일부 제조업자에 의해 사용되었다. 상기 보조약의 의미는 투여된 항원에 대해 생성되는 혈청 항체 반응을 증폭시키기 위한 것이다.
백신 균주와 일반 집단에서 확산되는 균주사이의 항원성 매치가 우수할 경우, 비활성 인플루엔자 백신은 건강한 성인의 약 70%-90%에서 실험실- 확정 질환(laboratory-confirmed illness)을 예방한다. 그러나, CDC는 노인층(65세 이상)에서 백신 효능이 30-40%로 낮을 수 있음을 강조한다. 이 점에 있어서 인간의 노화가 메모리 T-세포 반응에서의 결함을 야기하고 자연적 감염의 위험을 증가시킴이 관찰되었다. 게다가, 설정된 상태의 집단에서의 임상 연구에서 세포 매개 면역이 60세 이상의 그룹에서 인플루엔자 질환 예방에 관련되나 체액성 면역은 그렇지 않음을 증명되었다.
게다가, 백신 균주가 확산되는 균주와 항원적으로 상이할 경우 효율이 상당히 감소한다. 항원성 변이 연구는 인플루엔자 A 헤마글루티닌의 적어도 2개의 항원성 부위에서 4개 또는 그 이상의 아미노산 치환이 백신의 효능을 상당히 저해하는 충분히 분리된 이동 변이체(drift variants)를 야기한다(Jin H, Zhou H, Liu H, Chan W, Adhikary L, Mahmood K, et al."Two residues in the hemagglutinin of A/Fujian/411/02-like influenza viruses are responsible for antigenic drift from A/Panama/2007/99." Virology. 2005;336:113-9). 백신 및 확산되는 A/H3N2 균주가 잘 매치되지 않을 때 2003-2004년 시기 동안에 실험실 확정 인플루엔자를 갖는 50-64세 성인의 환자군 대조군 연구에서, 백신 유효성은 CDC에 따라 건강한 개체군에서는 52%, 하나 또는 그 이상의 고위험 증상군에서는 38%으로 평가되었다. 매치되지 않을 가능성은 제한된 제조 윈도우의 기회(limited manufacturing window of opportunity)에 의해 증가한다; 빠른 생산, 항원 제조와 정제를 통한 균주 확인 시간 및 삼가 혼합(trivalent blending) 및 제품 충진은 통상적으로 6달 이하에 모두 이루어져야 한다.
때때로, 신규한 인플루엔자 균주가 높은 병원성 및 항원 신규성을 갖는 집단에서 나타나며 이는 전세계적 유행병을 야기한다. 유행병 인플루엔자는 표면 단백질에서의 항원 변이의 결과이며 이미 존재하는 면역성이 개체에 나타나지 않는 바와 같은 국제적인 보건 상황에서의 심각한 위협을 나타낸다. 유행병 균주는 집단에서의 이들의 갑작스러운 출현 및 이들의 항원성 신규성에 의해 특징지어진다. 20세기 동안에, 4가지의 유행병이 나타났다; 1918년에 발생한 원인 균주는 H1N1, 1957년에는 H2N2, 1968년에는 H3N2이었으며 1977년에는 H1N1이었다.
항원 변이의 발생에 대해 3가지의 대안적 설명이 있다. 첫 번째로는, 인플루엔자 바이러스 게놈이 분절화되었기 때문에, 두 인플루엔자 균주가 단일 숙주, 예를 들어 돼지에 공동-감염됨에 따라 그들의 유전자를 교환하여 상이한 부모 바이러스의 유전 정보를 나르는 복제-콤피텐트(competent) 후손의 구성을 야기했다는 것이다. 유전자 재결합이라고 알려진 이러한 과정은 1957년 및 1968년의 유행병의 원인이라고 여겨지고 있다. 1968년의 유행병은 조류 공여체로부터의 H3 헤마글루티닌 유전자 및 하나의 다른 내부 유전자가 순환계의 H2N2 인간 균주로부터의 N2 뉴라미니다아제 및 5개의 다른 유전자와 재결합되었을 때 발생했다. 두 번째로는, 비-인간 인플루엔자 균주가 인간에 감염되는 능력을 수득했다는 것이다. 1918년의 유행병은 조류 H1N1 균주가 인간에서 인간으로 빠르고 효과적으로 전이될 수 있도록 돌연변이되었을 때 발생했다. 세 번째로는, 이미 유행병을 발생시켰던 균주가 인간 집단 내에서 격리되고 불변된 상태로 유지될 수 있다는 것이다. 예를 들어 1977년의 H1N1 유행병 균주는 27년 전에 유전병을 발생시켰던 균주와 기본적으로 동일하며 27년 동안 인간 및 동물에게서 검출되지 않았었다.
인플루엔자 유행병은 다음 세 개의 주요기준을 충족했을 때 위협적이다:
1. 적어도 한 세대 동안 인간 집단에서 발견되지 않았던 인플루엔자 바이러스 HA 아형이 나타난다(또는 재-등장).
2. 바이러스가 인간에게 감염되고 효과적으로 복제되어 심각한 질병을 발생시킨다.
3. 바이러스가 인간들 사이에서 쉽게 그리고 지속적으로 전파된다.
국제적 유행병은 한 해에 세계 인구의 20% 내지 40%에서 발생한다.　예를 들어 1918-1919년에 전세계적으로 2억명이 유행병에 걸렸으며 3천여만명이 사망했다. 미국에서는, 50만명 이상의 사람이 사망했으며 이는 인구의 0.5%이다. 비록 그 이후로 개발된 백신 및 항바이러스 치료로 건강관리가 매우 개선되었으나, CDC는 현재에도 국제적으로 유행병으로 2백만 내지 7백만명이 사망할 것으로 추정하고 있다.
1999년 이후로, 3개의 상이한 인플루엔자 아형 균주(H5N1, H7N7 및 H9N2)가 조류 종으로부터 인간에게로 교차되었으며 이들 모두 인간의 사망을 야기했다. 2007년 8월 14일 현재 전세계적으로 총 320명의 인간이 H5N1 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(Highly Pathogenic Avian Influenza Virus; HPAIV)에 감염되었다고 보고되었으며 이 중 193명이 사망하였다.
대부분의 건강한 사람에게 경미한 호흡기 증상만을 일으키는 일반적인 계절성 인플루엔자와는 달리, H5N1에 의해 발생하는 질환은 급격히 악화되며 높은 치사율을 갖는 비정상적으로 공격적인 임상학적 진행을 보인다. 원발성 바이러스성 폐렴 및 다발성 장기 부전이 일반적이다. 대부분의 경우 이전에 건강했던 아동 및 청소년에서 발생했다는 점이 중요하다. H5N1 HPAIV는 증상이 발병하기 전에 인간 인플루엔자 바이러스보다 더 오래 배양되며 몇몇 경우에서는 8일까지 배양된다. 가족 클러스터의 경우에서, 구성원 사이에서의 시간이 일반적으로 2일 내지 5일의 범위이나 17일까지도 보고되었다.
H5N1 HPAIV 감염의 초기 증상은 설사를 포함할 가능성이 높으며 호흡기 증상을 나타내기까지 일주일이 걸릴 수 있다. 대변 시료에서 바이러스 RNA의 검출을 통해 이러한 특징은 바이러스가 위장관에서 증식함을 제안하는 것이다. 숨가쁨과 같은 하기도(lower respiratory tract) 증상이 질병의 진행시 초기에 나타나지만, 콧물과 같은 상기도 증상은 일반적이지 않다.
H5N1 HPAIV은 현재 유행병에서 요구되는 조건 중 2개를 충족한다; H5 헤마글루티닌은 인간에서 신규한 항원을 나타낸다. H5N1-유사 유행병 바이러스가 나타났을 때에 반응하는 면역성을 가진 사람은 없을 것이다. 게다가, 바이러스는 300명 이상의 인간에 감염되며 60% 이상의 사망률을 나타낸다.
그러므로 유행병이 시작되기 위한 모든 선행조건은 하나를 제외하고는 충족되었다: 인간에서 인간으로의 효과적이고 지속적인 바이러스 전파의 수립. H5N1 바이러스가 이러한 능력을 수득할 위험은 인간 감염이 일어날 기회가 있는 한 지속될 것이다. 이는 계단식 돌연변이를 통해 또는 인간-적응 균주와의 재결합을 통해 현실적으로 가능할 수 있다고 여겨진다.
과학 수준에서, 바이러스 표현형에 대한 하나 또는 그 이상의 변화는 바이러스 균주가 인간 대 인간 전이를 손쉽게 하고 유행병이 시작되도록 하기 전에 필수적인 것이다. 그러나, 최근 칠면조로부터의 인간 분리균에서 검출된 특정 돌연변이, 확산 바이러스의 포유동물에 대한 증가된 병원성, 조류 인플루엔자 바이러스에 감염되어 내성이 있을 것으로 간주되는 호랑이 및 고양이와 같은 그외 포유동물을 포함하는 H5N1 HPAIV 숙주 범위의 확산을 포함하는 최근의 많은 발견 모두는 H5N1 바이러스가 인간 대 인간 전파를 궁극적으로 촉진할 수 있는 능력을 개선시키키는 것을 지속함을 나타낸다.
더 큰 유전병 가능성이 있는 다른 인플루엔자 바이러스가 이미 나타났다. 이들은 많은 H9 및 H7 바이러스 균주를 포함하며 최근 몇 년간 또한 인간으로 전이되었다. H9 바이러스는 현재 아시아에서 가금류에 나타나는 풍토병으로 또한 중국 남동부 및 동부의 돼지 집단으로 효과적으로 교차되었다. H9N2 균주가 전형적인 인간-유사 수용체 특이성을 가지고 있으며 광범위한 숙주 범위를 가진다는 사실도 고려되고 있다.
2003년 초기에, H7N7 HPAIV가 네덜란드의 가금류에서 발생했다. H7N7 바이러스의 인간 대 조류 전이가 적어도 82건 발생했다. H7 균주에 감염된 사람에서 결막염이 가장 일반적인 질병 증상이었으며 7건의 경우에서만 전형적인 인플루엔자 유사 질병을 나타냈다. 바이러스는 인간에게는 높은 병원성을 나타내지 않았으며 오직 하나의 치명적인 경우만 관찰됐다. 유행병 가능성이 있는 그외 바이러스는 유행병 바이러스로서의 과거 전력이 있는 H2 아형 및 아시아 및 북미에서 가금류 종에서 높은 발생률을 나타내는 H6이다.
이는 새로운 인간 인플루엔자 유행병의 위협이 HPAI H5N1의 발생에만 유일하게 관련된 것이 아님을 나타낸다.
인플루엔자 유행병에 대한 준비로 H5N1 인플루엔자 백신 후보를 사용하는 많은 임상실험이 이루어졌다. 상기 실험들은 보호적일 것으로 예상되는 혈청 항체를 생성하기 위해 계절용 백신에 일반적으로 사용되는 것보다 더 많은 양의 헤마토글루티닌 항체를 포함하거나 아쥬반트가 추가된 다중 투여가 요구된다는 것을 일관되게 보여줬다. 이는 H5 헤마토글루티닌에 대한 집단의 면역학적 순수성(immunological naivety)을 직접적으로 반영한 것이다. 그러므로, 현재, 유행병 인플루엔자 백신에 대해 용인가능한 유일한 선택은 생산될 수 있는 투여제의 수를 심각하게 제한할 매우 높은 HA 함량을 갖는 백신이거나 주요 국가에서 현재 허가되지 않은 아쥬반트를 사용하는 것이다. 또한 유행병 균주와 매치되는 백신의 제조가 인간으로부터 처음으로 분리된 시간으로부터 여러 달이 소요될 것임이 인식될 수 있다; 유행병 발병에 앞서 생산된 비축 백신은 대부분 아마도 항원적으로 동일하지 않아 아주 한정된 예방만을 제공할 것이다. 항원 변이의 증거는 5N1의 가장 최근의 발생에서 이미 명백해졌다.
요약하면, 계절성 및 유행병 인플루엔자 백신 둘 다를 개선하기 위한 명확한 필요조건이 있다:
1. 특히 준비되지 않은 개체에서 효능의 분명한 제한이 있다. 이는 항원 변위로부터 발생하는 인플루엔자 유행병의 전망에 관련하여 특히 고려되고 있다.
2. 다음 가을/겨울 시즌에서 확산될 것 같은 인플루엔자 균주를 정확히 에측할 수 있는지의 여부. 백신 균주 및 실제로 발생한 감염 사이의 부조화는 상당한 비율의 집단이 인플루엔자에 취약한 것으로 나타날 것이다.
3. 바이러스가 항원 변이되는 것에 기초한 매년 위험군에서의 재백신화의 필요.
4. 전세계적으로 가능한 생물학적 제조 공장의 수가 제한됨에 따른 생산용량의 제한.
5. 통상적인 백신에 의해서 노년층 그룹에는 예방이 제한적으로 이루어진다.
그러므로 개선된 클래스의 인플루엔자 백신은 모든 인플루엔자 백신 A 균주(잠재적인 유행병 균주 포함)에 대해 바람직하게 합성적이고, 안정하며 효과적일 것이며 노인군(위험군)에서 증가된 효능을 나타낼 것이다.
인플루엔자 질환에 대한 예방에서 T 세포의 역할
통상적인 인플루엔자 백신 기술이 바이러스 표면 단백질에 대한 항체 반응에 우선적으로 초점을 맞추는 동안, 이들은 효능을 저해하고 기술된 논리주의적 취약성을 야기하는 항원성 변화 및 이동을 나타냈다. 이와는 대조적으로, 세포성 면역 반응을 매개하는 T 세포는 이종성 바이러스 균주 및 클라드(clades)에서 좀 더 고도로 보존된 단백질을 표적으로 할 수 있다. 이 특성은 이종성 바이러스 균주 및 클라드(이종아형 면역)에 대해 예방적일 수 있는 가능성이 있는 보호적 세포성 면역 반응을 유도하는 백신을 제공한다. 인플루엔자 바이러스에서, PB1, PB2, PA, NP, M1, M2, NS1 및 NS2 단백질의 보존 및 상응하는 항원-특이 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 존속은 이러한 단백질을 흥미로운 백신 표적으로 만든다.
보호성 항바이러스 세포-매개 면역은 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes; CTL) 뿐만 아니라 IFN-γ 및 IL-2와 같은 면역자극성 사이토카인을 유도하고 유지함을 포함하는 면역 작동체 메커니즘의 활성을 이끌어내는 유형 1 CD4+ T-헬퍼 림프구(T-helper lymphocytes; Th1)에 의해 뒷받침되는 유형 1 반응의 도입으로 구성된다. CD4+ T 헬퍼 세포는 주요 조직접합유전자 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 클래스 II 분자에 결합하는 항원성 T 세포 펩티드 에피토프를 인식한 후 사이토카인을 분비하거나 직접 세포-세포 상호작용을 통해 다른 면역 세포를 원조하기 위해 우선 반응한다. 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes; CTL)는 통상적으로 CD8을 발현하고 MHC 클래스 I에 의해 제시되는 외부 항원을 인식한 세포의 용균 또는 아폽토시스를 유도하여 바이러스와 같은 세포내 병원균에 대한 방어막을 제공한다. CD4+ 세포가 세포용해 활성을 나타낼 수 있으며 CD8+ 세포는 항바이러스성 사이토카인, 특히 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사인자를 분비하므로, 표현형 및 기능의 조합은 절대적이지 않다. 실제로, CD4+ CTL 활성이 인간에서 급성 및 만성 바이러스 감염을 제어하는 다른 면역 메커니즘으로서 제안되었다. CD4+ CTL은 직접 항바이러스성 세포용해 효과에 의해 바이러스 확산을 제어할 수 있으며 IFN-γ와 같은 항바이러스 사이토카인의 생성에 의한 직접 항바이러스성 활성을 실행할 수 있다. IFN-γ은 바이러스 생성시 직접 저해 및 비-세포용해 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. CD4+ T 헬퍼 세포는 또한 B 세포 항체 반응 및 클래스 스위칭(class switching)을 결정하고 대식세포와 같은 식세포의 항박테리아 활성을 최대화하는데 필수적이다.
세포성 면역 반응은 인플루엔자 감염을 제어하고 질환의 징후를 개선하며 질환 회복을 촉진하는 데서 중요한 역할을 수행한다고 여겨진다. 인플루엔자-특이 세포성 면역은 자연적 감염 후에 유도되며 여러 바이러스성 단백질이 핵단백질(NP), 폴라머라아제(PB1, PB2 및 PA), M1 및 M2 단백질 및 비-구조성 단백질-1(non-structural protein-1;　NS1)을 포함하는 인간 기억 이종아형 T 세포 반응에서 표적으로서 확인된다. NS2 또한 관련될 수 있다. 이러한 내부 단백질은 이들을 이상적인 T 세포 표적으로 만드는 고도로 보존된 면역우성 영역을 포함한다. 특히, 실험 연구에서 인플루엔자-A NP가 마우스 및 인간에서 아형-특이성 및 교차-반응성 CTL 둘 다에 대해 중요한 표적 항원을 나타냄이 밝혀졌다. 이는 인플루엔자 아형 내 및 사이의 이들의 높은 서열 변이성에 기인한 적합하지 않은 표적인 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)와 대비되는 것이다.
좀더 명확하게는, 세포-매개 면역은 고병원성 균주를 포함하는 인플루엔자 질환에 대한 보호에 밀접하게 관련된다. 기억 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 폐 기도에 존재하며 병원균이 적을 때 이러한 세포들이 감염 부위에서 병원균의 교전을 매개하여 인플루엔자 대항에 대한 폐의 면역에서 중요한 역할을 수행한다는 증거이다. CD8+ T 세포의 소모가 이차 보호 반응에서 CD8+ T 세포에서의 역할을 나타내는 인플루엔자 감염에 대한 반응에 대한 준비된 마우스의 효능을 감소시킨다. 바이러스 복제가 호흡기 상피의 세포에 한정되기 때문에, CD8+ T 세포는 이 부위에서 이들의 작동체 기능을 수행하여 항바이러스 사이토카인을 생성하고 특이 T-세포 수용체를 나타내도록 하는 바이러스 결정인자를 제시하는 표적 세포를 용해시킨다. 감염된 상피 세포의 용해는 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)을 포함하는 세포외배출 과립뿐만 아니라 Fas 메커니즘에 의해 매개된다(Thomas PG, Keating R, Hulse-Post DJ, Doherty PC. "Cell-mediated protection in influenza infection" Emerg Infect Dis. 2006 Jan;12(1):48-54).
인플루엔자에 대한 왕성한 CD4+ T 세포 반응은 배출하는 림프절에서 시작된 후 비장에서도 나타나며 이들은 감염 후 6-7일에 폐 및 기관지폐포 분비에서 정점에 도달한다. 인플루엔자 감염에 대한 이러한 일차 CD4 T-세포 반응은 CD8 반응보다 규모면에서 작지만 왕성한 CD4+ 확장, Th-1 분화 및 감염 부위로의 이들의 이동에 관련되어 있음을 보여준다. CD4+ T-헬퍼 세포는 또한 인플루엔자 감염에 대한 장기간 지속되는 효과적인 CD8 기억에 필수적이다. CD4 작동체 T-세포 및 기억 반응은 인플루엔자 특이 CD8+ CTL 반응의 생성 동안 헬퍼로서의 전형적인 기여인 감염성 바이러스 입자를 중화시키는 IgG2a를 구동시키는 이들의 능력을 포함하는 다중 메커니즘을 통해, 그리고 IFN-감마의 분비를 통한 이들의 직접 항바이러스 활성을 통해 인플루엔자에 대한 면역에 기여한다. CD4+ 및 CD8+ T-세포 에피토프 둘 다 인플루엔자 대항에 대해 마우스 내에서 바이러스 청소율을 촉진시키고 보호함을 보여준다.
인플루엔자-A 바이러스에 대한 마우스 모델은 T-세포 매개 면역에 대한 실험적 시스템을 제공한다. 특히, 인플루엔자 감염에 대한 T-세포 면역 반응은 C57BL/6 (H2b) 및 Balb/C (H2d) 마우스 및 이들의 하이브리드에서 잘 특성화되었다. Plotnicky 등의 문헌(Plotnicky H, Cyblat-Chanal D, Aubry JP, Derouet F, Klinguer-Hamour C, Beck A, Bonnefoy JY, Corva A "The immunodominant influenza matrix T cell epitope recognized in human induces influenza protection in HLA-A2/K(b) transgenic mice." Virology. 2003 May 10;309(2):320-9.)에서 치사량의 트렌스제닉 마우스 항원투여에 대한 인플루엔자 매트릭스 단백질(M1) 에피토프 58-66의 보호적 효능을 증명했다. CD8+ 및/또는 CD4+ T-세포의 생체내 소모 후에 보호가 폐지되므로 보호는 T-세포에 의해 매개된다. 마우스 생존은 인플루엔자 항원투여 후에 인플루엔자-감염 세포에 대한 직접 세포독성이 일어나는 폐에서의 M1-특이 T-세포에 관련되어 있다. Woodland 등의 문헌에서(Crowe SR, Miller SC, Woodland DL. "Identification of protective and non-protective T cell epitopes in influenza" Vaccine. 2006 Jan 23;24(4):452-6) 또한 단일 CD4+ T 세포 에피토프 HA (211-225)가 백신화 마우스에서의 바이러스 감염을 부분적으로 제어할 수 있음을 증명했다.
T 세포 표적은 인플루엔자 바이러스 표면 단백질 B 세포 에피토프에 비해 더 적은 빈도의 돌연변이가 일어나는 경향이 있으며, CD8+ 및 CD4+ T 세포 에피토프는 또한 시간에 따른 보호적 면역 압박 하에서 돌연변이가 일어날 것이다 (Berkhoff EG, de Wit E, Geelhoed-Mieras MM, Boon AC, Symons J, Fouchier RA,Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF. "Fitness costs limit escape from cytotoxic T lymphocytes by influenza A viruses" Vaccine. 2006 Nov 10;24(44-46):6594-6.). 이러한 탈출은 숙주 CD8+ 및 CD4+ T-세포 각각에 대한 항원 프로세싱 및 에피토프 제시를 결정하는 고도의 다형성 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen; HLA) 클래스 I 및 II 단백질 및 바이러스 사이의 대립으로부터의 결과일 것이다. 이러한 바이러스 탈출 메커니즘은 HIV 및 HCV에 대해 좀더 명백하게 수립되었으며 바이러스의 진화를 구체화하는 것으로 알려졌다. 그러므로 낮은 고유의 변이성(엔트로피)를 갖는 고도로 보존된 펩티드 서열의 선택이 항원성 변이 및 이동을 명확하게 취소시킬 수 있는 T-세포 백신의 설계시 간주될 수 있는 중요한 요소이다. 이러한 방법은 Berkhoff 등의 문헌에 기재되어 있다(Berkhoff EG, de Wit E, Geelhoed-Mieras MM, Boon AC, Symons J, Fouchier RA, Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF "Functional constraints of influenza A virus epitopes limit escape from cytotoxic T lymphocytes" J Virol. 2005 Sep;79(17):11239-46.).
현재 전체 인플루엔자-관련 사망률의 대략 90%가 65세 이상의 성인이다. 이는 또한 현재 백신이 가장 효과를 내지 못하는 표적 그룹이다. 인간에서 노화는 기억 아-집단으로부터 T-세포 작동체를 생성하는 능력이 감소되는 것에 관련되어 있음을 나타낸다. 백신화 후 노년층에서 작동체 기억 CD4+ T 세포의 감소된 빈도 및 증가된 중심 기억 CD4+ T-세포의 증가된 빈도가 발견되었으며, 이는 감소된 혈청 IL-7 수준에 관련된 것일 수 있다. 노년의 개체 또한 IgG1 반응과 직접적으로 관련된 인플루엔자 백신화에 대한 둔화 유형-1 T-세포 반응을 증명한다. 게다가, 마우스는 또한 일차 인플루엔자-A 감염 동안에 에피토프-특이 CD8+ CTL 활성의 연령 관련 장애를 나타낸다. 이는 인플루엔자-특이 CD8+ 세포의 작동체 활성보다는 CD8+ CTL의 확장에서의 결함에 관련된 것이다(Mbawuike IN, Acuna C, Caballero D, Pham-Nguyen K, Gilbert B, Petribon P, Harmon M. "Reversal of age-related deficient influenza virus-specific CTL responses and IFN-gamma production by monophosphoryl lipid A." Cell Immunol. 1996 Oct 10;173(1):64-78.).
T 세포 반응의 중요한 요소는 감염된 세포의 청소율에 영향을 미치므로, T-세포 백신은 메모리 소환을 생성하기 위한 예방적 방식뿐만 아니라 감염 후 숙주의 천연 세포-매개 면역을 증가시키기 위한 치료학적 모드에 사용할 수 있다. T-세포 백신은 또한 공동-투여 또는 분리 투여를 통해 항체-생성(체액성 반응-기저) 인플루엔자 백신과 병용하여 사용할 수 있다.
T-세포 백신 연구
T-세포 및 인플루엔자 백신 분야의 검토는 예방적 T-세포 백신 전반의 설계에 직면한 많은 결정적인 도전에 집중되고 있다. T-세포 백신은 우선 높은 비율의 백신 수용자에게서 CD4+ HTL 및 CD8+ CTL T-세포 기억 및 작동체 기능의 감작(priming) 및 부스팅(boosting)을 가능하게 해야한다. 이러한 백신은 또한 바이러스 유전자 다양성 및 진행 돌연변이뿐만 아니라 MHC 대립유전자 다형태성에서 명백한 인간 유전자 다양성을 나타내야 한다. 제시된 발명은 고도로 보존된 인플루엔자 펩티드와 함께 신규한 플루오로펩티드(fluoropeptide) 백신 수송 시스템을 병용하는 이들 설계를 제시하도록 한다. 펩티드는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 에피토프, 특히 T-세포 에피토프를 포함하는 것으로 알려진 항원이다.
전통적인 펩티드-기저 T-세포 백신 연구는 에피토프를 기초로 하며 단일 에피토프 또는 재구성된 인공 스트링으로 수송되는 최소한의 CTL (8-11aa) 또는 T-헬퍼(13aa) 에피토프에 초점을 맞추고 있다. 비-천연 서열은 비효율적 항원 프로세싱 제약뿐만 아니라 비관련 네오-에피토프의 잠재적 형성을 발생시키는 것에 직면할 수 있다. 단일 펩티드 서열에서 오버랩핑 T-세포 에피토프, 클러스터 T-세포 에피토프 또는 불규칙 T-세포 에피토프를 포함하는 자연 보존된 긴 펩티드 서열은 광범위한 집단 범위에 이르는 동안 자연적 항원 프로세싱을 허용한다. 게다가, 백신 제형에서 이러한 긴 천연 펩티드의 다중 사용이 더 많은 집단 범위에서도 시도될 수 있을 것이다. 선례에서 CD4+ 및 CD8+ T-세포 에피토프를 포함하는 긴 펩티드(30-35aa)가 동물 및 인간에서 다중-에피토프 반응을 유도하는 능력을 가짐이 밝혀졌다(Coutsinos Z, Villefroy P, Gras-Masse H, Guillet JG, Bourgault-Villada I. Gahery-Segard H, Pialoux G, Figueiredo S, Igea C, Surenaud M, Gaston J,Gras-Masse H, Levy JP, Guillet JG. "Long-term specific immune responses induced in humans by a human immunodeficiency virus type 1 lipopeptide vaccine: characterization of CD8+-T-cell epitopes recognized" J Virol. 2003 Oct;77(20):11220-31.). 효과적인 항-바이러스 CTL 반응(CD8 T 세포 구동)에서, 적합한 Th-1 사이토카인 환경이 요구되므로(CD4 세포에 의해 확보됨), CD4 및 CD8 에피토프의 부수적인 수송이 세포성 반응을 강화할 것으로 예상된다(Krowka, JF., Singh, B., Fotedar, A., Mosmann, T., Giedlin, MA., Pilarski, LM. "A requirement for physical linkage between determinants recognized by helper molecules and cytotoxic T cell precursors in the induction of cytotoxic T cell responses" J. Immunol 1986, May 15;136(10):3561-6.).
CD4+ 및 CD8+ T 세포는 MHC 시스템에 의해 코드되는 특이 세포 표면 분자에 결합함을 나타내는, 외부 및 자체 단백질의 세포외 및 세포내 프로세싱으로부터 생성된 짧은 펩티드를 인식한다. MHC 분자는 두 개의 분리된 클래스로 나뉜다: (i) MHC 클래스 I은 내인성 펩티드를 나타내며; (ii) MHC 클래스 II는 외인성 펩티드를 나타낸다. MHC 클래스 I 항원 제시의 과정은 단백질 분해, 소포체로의 펩티드 수송, 펩티드-MHC 결합 및 CD8+ T 세포에 의한 인식을 위한 펩티드-MHC 복합체의 세포 표면으로의 이출을 포함한다. 펩티드는 일반 결합 모티프를 공유하는 펩티드의 특이 서브세트(subsets)의 결합을 야기하는 특이 MHC 결합 홈, 모양 및 특징 내에서 결합한다. T 세포는 T-세포 수용체가 특이 펩티드-MHC 복합체를 인식할 때 활성화되며, 이러한 방식으로 세포내 기생충 또는 바이러스 또는 비정상 단백질을 포함하는 세포(예를 들어, 종양 세포)에 의해 감염된 세포를 확인하여 이들에 대한 적절한 면역 반응을 나타낸다. T-세포 인식(T-세포 에피토프)를 시발하는 특이 펩티드-MHC 복합체에 관련된 펩티드는 감염성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환 및 신생물성 질환의 진단 및 치료에서 중요한 수단이다. T-세포 에피토프가 MHC-결합 펩티드의 서브세트이므로, 분자에 결합할 수 있는 단백질 부분의 정확한 확인이 백신 설계 및 면역치료학에서 중요하다. MHC 다형성은 데이터로 알려진 580 HLA-A, 921 HLA-B, 312 HLA-C, 527 HLA-DR(베타), 127 HLA-DRQ(베타) 및 86 HLA-DQ(베타) 대립유전자를 갖는 인간 집단에서 매우 높다. 이러한 상황은 광범위한 집단 범위를 갖는 T-세포 기저 백신을 설계하고자 할 때 도전과제가 된다. MHC-결합 펩티드는 펩티드 결합에 기여하는, MHC 분자의 홈과 상호작용하는 위치-특이 아미노산을 포함한다. 결합 모티프의 각 위치에서의 바람직한 아미노산은 MHC 분자의 대립유전자 변이체 사이에서 다양할 수 있다. 컴퓨터상의 모델은 다양한 MHC 분자에 결합하는 펩티드의 동정을 용이하게 한다. MHC 결합 검정, X-선 결정학 연구 및 본 분야에서 공지된 그 외 많은 방법과 같은 다양한 컴퓨터 방법으로 MHC 분자에 결합하는 펩티드를 동정했다. 신규한 인실리코 항원 동정 방법은 T 세포 백신에서 유용한 바이러스 서열을 묘사하는데 필수적인 HLA 결합 모티프에서의 스크리닝 펩티드 서열에 관련된 많은 데이터를 빠르게 처리할 수 있는 능력을 제공한다. HLA 기저 생물정보학 접근법으로 다양한 면역학 분야에 성공적으로 적용되었으며 관련된 인간 유전자 다양성으로의 접근을 가능하게 만들었다. 예를 들어 다음을 참조하라: Depil S, Morales O, Castelli FA, Delhem N, Francois V, Georges B, Dufosse F, Morschhauser F, Hammer J, Maillere B, Auriault C, Pancre V. "Determination of a HLA II promiscuous peptide cocktail as potential vaccine against EBV latency II malignancies.", J Immunother (1997). 2007 Feb-Mar;30(2):215-26; Frahm N, Yusim K, Suscovich TJ, Adams S, Sidney J, Hraber P, Hewitt HS, Linde CH, Kavanagh DG, Woodberry T, Henry LM, Faircloth K, Listgarten J, Kadie C, JojicN, Sango K, Brown NV, Pae E, Zaman MT, Bihl F, Khatri A, John M, Mallal S,Marincola FM, Walker BD, Sette A, Heckerman D, Korber BT, Brander C. "Extensive HLA class I allele promiscuity among viral CTL epitopes." Eur J Immunol. 2007 Aug 17;37(9):2419-2433; Schulze zur Wiesch J, Lauer GM, Day CL, Kim AY, Ouchi K, Duncan JE, Wurcel AG,Timm J, Jones AM, Mothe B, Allen TM, McGovern B, Lewis-Ximenez L, Sidney J, SetteA, Chung RT, Walker BD. "Broad repertoire of the CD4+ Th cell response in spontaneously controlled Hepatitis C virus infection includes dominant and highly promiscuous epitopes." J Immunol. 2005 Sep 15;175(6):3603-13; Doolan DL, Southwood S, Chesnut R, Appella E, Gomez E, Richards A, HigashimotoYI, Maewal A, Sidney J, Gramzinski RA, Mason C, Koech D, Hoffman SL, Sette A. "HLA-DR-promiscuous T cell epitopes from Plasmodium falciparum pre-erythrocytic-stage antigens restricted by multiple HLA class II alleles." J Immunol. 2000 Jul 15;165(2):1123-37.
하나 이상의 MHC 대립유전자 변이체에 결합하는 펩티드("promiscuous promiscuous; 무차별 펩티드")는 백신 및 면역치료학적 개발에서 주요 표적으로, 이는 이들이 인간 집단에서 많은 부분에 관련되어 있기 때문이다. 무차별 CD4+ T 세포 에피토프는 또한 다중 MHC 클래스 II 분자에 결합한다고 보고되었다(Panina-Bordignon P, Tan A, Termijtelen A, Demotz S, Corradin G, Lanzavecchia A. Universally immunogenic T cell epitopes: promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells. Eur J Immunol. 1989 Dec;19(12):2237-42.) 이에 반해, 일부 무차별 CD8+ T 세포 에피토프는 결합 특성을 공유하고 소위 슈퍼타입(supertype)을 형성하는 다중 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 능력을 갖는다는 것이 이미 기술되었다(Frahm N, Yusim K, Suscovich TJ, Adams S, Sidney J, Hraber P, Hewitt HS, Linde CH, Kavanagh DG, Woodberry T, Henry LM, Faircloth K, Listgarten J, Kadie C, JojicN, Sango K, Brown NV, Pae E, Zaman MT, Bihl F, Khatri A, John M, Mallal S,Marincola FM, Walker BD, Sette A, Heckerman D, Korber BT, Brander C. "Extensive HLA class I allele promiscuity among viral CTL epitopes." Eur J Immunol. 2007 Aug 17;37(9):2419-2433 ; Sette A, Sidney J. 'HLA supertypes and supermotifs: a functional perspective on HLA polymorphism.' Curr Opin Immunol. 1998 Aug;10(4):478-82). 무차별 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프의 동정은 광범위한 집단에 적용하기 위한 백신 설계시 중요 전략을 나타낸다. MHC 다형성은 또한 특정 인종 그룹 또는 다중 교차 인종 그룹에서 고빈도 MHC 대립유전자에 관련된 MHC 결합 모티프를 포함한다고 알려졌거나 예상된 펩티드를 선택하여 이루어졌다.
집단에 광범위하게 적용되도록 하고 인플루엔자 균주(예를 들어 the National Center for Biotechnology Information (NCBI) 또는 Los Alamos National Laboratory (LANL) 인플루엔자 서열 데이터베이스를 사용하여 동정함)의 교차 범위를 보존하는 서열의 조합을 선택하여, 바이러스 유전자 다양성을 이룰 수 있으며 다는 아닐지라도 인플루엔자 균주 대다수에 대해 예방할 수 있다.
*역사적으로, T-세포 백신 기술(DNA 및 바이러스 백신)의 주요 실패는 백신에 반응하는 백신 피검자의 비율이 낮으며 종종 메모리 및 작동체 T-세포 반응의 부스터 증폭을 달성하기 위한 이들의 능력 및 면역원성의 낮은 수준에 의한 것이다. 효과적인 인플루엔자 T-세포 백신에 대한 주요 목적은 로버스트(robust) T-세포 메모리 반응을 촉진하기 위한 것으로, 항원에 대해 재-노출되었을 때 바이러스 부하(viral load)를 조절하고 폐로부터의 바이러스 청소율을 촉진하는 작동체 기능의 급격한 확산이 일어난다. 이를 달성하기 위해, CD4+ 및 CD8+ T-세포에 중앙 및 작동체 메모리 반응에 직접적인 로버스트 바이러스 특이 Th-1이 요구된다. 실행가능한 시판 산물에서 이러한 반응은 백신 수용자에서 높은 비율(>90%)로 유도되어야 하며 감염 후 메모리 회상 및 그 후의 질환 예방을 위해 요구될 장기간 메모리 반응을 생성할 수 있어야 한다. 그러나, 이러한 유형의 영속성이 있는 면역성을 생성하기 위해서 백신은 또한 반복된 백신 노출로 로버스트 부스터 증폭 효과를 이루어야 한다.
백신 및 면역치료에 의해 유도되는 세포성 면역성을 개선하기 위한 현재의 면역학적 전략은 약독화된 생 병원균의 개발 및 적절한 항원 또는 항원과 같은 것을 코드하는 DNA를 수송하는 생 벡터의 사용을 포함한다. 선택되지 않은 집단에서 의미있는 부스터 반응을 일으키는데 늘 실패하는 이러한 접근법은 뒤얽힌 프라임-부스트(prime-boost) 조합을 이끌어내며 또한 더욱 엄격한 조절 환경에서 안전성 고려에 의해 제한된다. 게다가, 제조 공정의 확장 및 과중한 비용으로부터 발생하는 문제는 종종 생물학적 기원의 산물의 상업적 가능성을 제한한다. 이러한 맥락에서, 합성 펩티드가 매우 매력적인 항원으로 여겨지게 됐는데 이는 이들이 화학적으로 잘 규정되어 있고 매우 안정하며 T 및/또는 B 세포 에피토프를 포함하도록 설계될 수 있기 때문이다.
생체내 T 림프구 반응을 자극하기 위해, 백신 또는 면역치료제에 함유된 합성 펩티드는 항원 제시 세포 및 특히 수지상 세포에 의해 흡수되어야 하는 것이 바람직하다. 수지상 세포(Dendritic cells; DCs)는 원발성 T-세포 매개 면역 반응에서 초기에 결정적인 역할을 한다. 상기 세포들은 상이한 기능에 관련된 성숙의 두 주요 단계에 존재한다. 미성숙 수지상 세포(Immature dendritic cells; iDCs)는 대부분의 조직 또는 순환계에 위치하며 체내의 염증 부위로 이동한다. 이들은 매우 전문화된 항원-포획 세포로, 항원 흡수 및 식작용에 관련된 많은 수용체를 발현한다. 항원 포획 및 처리 후, iDCs는 림프절 또는 비장의 국소 T-세포 위치로 이동한다. 이 과정 동안에, DCs는 자체 항원-포획 능력이 없어져 면역자극성 성숙 DCs(mature DCs; mDCs)로 바뀐다.
수지상 세포는 클래스 I 및 II MHC 분자와 결합하는 펩티드 항원에 대한 숙주 면역 반응을 시작하게 하는 효과적인 제시 세포이다. 이들은 천연 CD4 및 CD8 T-세포를 준비시킬 수 있다. 항원 처리 및 제시 경로의 현재 모델에 따라, 외인성 항원은 항원 제시 세포의 세포내기생성 구획(endocytic compartments) 내로 흡수되어 펩티드로 분해되고 이중 일부는 MHC 클래스 II 분자에 결합된다. 그런 다음 성숙한 MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 CD4 T-림프구에 대해 제시되는 세포 표면으로 이동한다. 이와는 달리, 내인성 항원은 세포질로 이송되기 전 프로테아좀의 작용에 의해서 세포질에서 분해되어 초기 MHC 클래스 I 분자에 결합한다. 그런 다음 펩티드에 복합된 안정한 MHC 클래스 I 분자는 CD8 CTL을 자극하기 위해 세포 표면으로 이송된다. 외인성 항원은 또한 교차-제시(cross-presentation)라고 명명된 과정에서 전문APC에 의해 MHC 클래스 I 분자 상에 제시될 수 있다. 세포외 항원을 포함하는 파고솜(phagosomes)은 소포체와 융합될 수 있으며 항원은 MHC 클래스 I 분자 상으로 펩티드를 부하하는데 필수적인 장치를 얻을 수 있다.
십 년 이상 페너트라틴(Penetratin), TAT 및 이의 유도체, DNA, 바이러스 벡터, 비로솜 및 리포솜과 같은 벡터를 포함하는 많은 수송 방법들이 평가되었다. 그러나, 이러한 시스템들은 매우 약한 CTL 반응을 이끌어내거나 메모리 반응에서 부스터 증폭을 생성시키는데 실패하거나 독성을 나타내거나 상업화할 때에 제조가 복잡하고 비용이 많이 든다.
그러므로 세포성 면역 반응을 이끌어낼 의도의 백신 및 약물의 개발에서 항원의 세포내 수송을 위해 개선된 벡터가 요구되었다. 면역치료 또는 백신 분야에서의 벡터는 숙주 내에서 면역 반응성 세포에 항원을 대입시키거나 수송시킬 수 있는 모든 제제이다.
플루오르화 계면활성제가 결정적 미셀(micelle) 농도가 낮으므로 저농도로 다중분자 미셀 구조 내로 자가-조직화됨을 보여준다. 이러한 물리화학적 특성은 물에서 자가-조립되어 경계면에 모이는 플루오르화 양성친화제 경향을 매우 증가시키는 플루오르화 사슬의 강한 소수성 상호작용 및 낮은 반데르발스 상호작용에 의한 것이다. 이러한 구조의 형성은 예를 들어 항원-제시 세포와 같은 세포에 의한 이들의 세포내기생성 흡수를 촉진시킨다 (Reichel F. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7989-7997). 게다가 플루오르화 사슬이 계면활성제 내로 도입될 때 용혈성 활성이 매우 감소되고 종종 억제되어(Riess, J.G.; Pace, S.; Zarif, L. Adv. Mater. 1991, 3, 249-251) 세포 독성의 감소를 야기한다.
본 발명은 면역원성을 증가시키기 위해 플루오로카본 벡터를 사용하여 면역 반응 세포로 인플루엔자 항원을 수송하는 문제를 해결하기 위한 것이다.
플루오로카본 벡터는 퍼플루오로카본(perfluorocarbon)으로부터 유래되거나 플루오로카본/탄화수소 라디칼과 혼합된 하나 또는 그 이상의 사슬을 포함하며 각 사슬은 3 내지 30개 원자를 갖는 포화되거나 불포화된 사슬일 것이다.
공유 결합을 통해 벡터가 항원에 결합하기 위해, 반응성기 또는 리간드는 예를 들어 -CO-, -NH-, S, O 또는 그외 다른 적절한 기와 같은 벡터 성분으로서 결합되었다; 공유 결합을 이루기 위한 이러한 리간드의 사용은 본 분야에 널리 공지되어 있다. 반응성기는 플루오로카본 분자의 어느 위치에든 위치할 수 있다.
항원과 플루오로카본 벡터의 결합은 자연적으로 존재하거나 항원의 어느 부위에 도입된 -OH, -SH, -COOH, -NH2 와 같은 작용기를 통해 이루어질 수 있다. 적합한 결합은 선형이나 시클로 형태로, 질소, 산소 또는 황 원자를 포함할 수 있다. 결찰에 의해 형성된 결합의 예는 옥심(oxime), 하이드라존, 이황화물 또는 트리아졸 또는 모든 적합한 공유 결합을 포함한다. 특히, 플루오로카본 성분은 펩티드의 면역원성을 증가시키기 위한 티오에스테르 결합을 통해 도입될 수 있다(Beekman, N.J.C.M. et al. "Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity."J. Peptide Res. 1997, 50, 357-364). 선택적으로, 스페이서 요소(펩티드성, 슈토펩티드성 또는 비-펩티드성)는 리포펩티드에서 이미 보여진 바와 같이, 항원-제시 세포 내에서의 처리를 위해 플루오로카본 요소로부터 항원을 분리시키고 항원 제시를 최적화하기 위해 결합될 수 있다(Verheul, A. F.M.; Udhayakumar, V.; Jue, D. L.; Wohlhueter, R.M.; Lal, A. L. Monopalmitic acid-peptide conjugates induce cytotoxic T cell responses against malarial epitopes: importance of spacer amino acids. Journal of Immunological Methods 1995, volume 182, pp219-226).
그러므로, 제1 양상에서, 본 발명은 화학 구조 CmFn -CyHx-(Sp )-R을 갖는 플루오로카본 벡터-항원 구조 또는 이의 유도체를 제공하며, 상기 구조에서 m = 3 내지 30, n <= 2m +1, y = 0 내지 15, x <= 2y, (m + y) = 3 - 30 이며 Sp는 선택적 화학 스페이서이고 R은 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 항원이다.
본 발명에서 "유도체"는 상대적으로 적게 변이된 플루오로카본 화합물을 의미하며, 이 화합물은 여전히 본원에 기재된 항원을 수송하는 것이 가능하다. 그러므로, 예를 들어, 많은 불소 성분이 염소(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I)와 같은 다른 할로겐 성분으로 치환될 수 있다. 게다가 많은 불소 성분이 메틸기로 치환되는 것도 가능하며 여전히 본원에 기재된 바와 같은 분자의 특성을 유지한다.
상기 화학식의 특정 예에서 벡터는 하기 화학식을 갖는 2H, 2H, 3H, 3H-퍼플루오로운데칸산(perfluoroundecanoic acid)일 수 있다:
Figure pat00001
그러므로 제2 양상에서 본 발명은 다음 구조식을 갖는 플루오로카본 벡터-항원 구조를 제공한다.
Figure pat00002
상기 구조식에서 Sp는 선택적 화학 스페이서 성분이며 R은 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 항원이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 또는 B 세포 수용체(B cell receptor; BCR 또는 항체)와 같은 면역학적 수용체에 의해 인식될 수 있는 분자를 의미한다. 항원은 이들이 적어도 하나의 에피토프, 예를 들어 T 세포 및/또는 B 세포 에피토프를 제시하는 조건 하에 천연 또는 비-천연의 단백질, 단백질 서브유닛, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 이의 조합일 수 있다.
이러한 항원은 천연 단백질로부터 정제하여 유도하거나 재조합 기술 또는 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 항원의 제조 방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다. 게다가, 항체는 또한 항원성 펩티드 또는 단백질을 코드하는 DNA 또는 올리고누클레오티드를 포함한다.
벡터에 결합된 항체는 인간을 포함하는 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 인플루엔자 항원일 수 있다. 바람직하게는 면역 반응은 숙주에서 유익한 효과를 나타낼 것이다.
인플루엔자 항원은 하나 또는 그 이상의 T 세포 에피토프 또는 하나 또는 그 이상의 B 세포 에피토프 또는 T 및 B 세포 에피토프의 조합을 포함할 수 있다.
T 세포 에피토프는 제한된 MHC 클래스 I 또는 II일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 다음을 포함한다:
(i) MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함하며 MHC 클래스 II 분자에 의해 항원 제시 세포의 표면에 제시될 수 있는 펩티드 서열인 CD4+ T 세포 에피토프, 및
(ii) MHC 클래스 I 결합 모티프를 포함하며 세포 표면에 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시될 수 있는 펩티드 서열인 CD8+ T 세포 에피토프, 및
(iii) B 세포 수용체에 대한 결합 친화성을 갖는 펩티드 서열인 B 세포 에피토프.
항원은 A형 인플루엔자 단백질, B 형 인플루엔자 단백질 또는 C형 인플루엔자 단백질 유래의 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. A형 및 B형 인플루엔자 둘 다로부터의 인플루엔자 바이러스 단백질의 예는 다음을 포함한다: 조합 형태의 헤마글루티닌, 뉴라미니다아제, 매트릭스(M1) 단백질, M2, 핵단백질(NP), PA, PB1, PB2, NS1 또는 NS2.
그러므로 추가 양상에서 본 발명은 벡터-항원 구조를 제공하며 상기 인플루엔자 바이러스 항원은 단백질, 단백질 서브유닛, 펩티드, 탄수화물 또는 지질 또는 이들의 조합이다. 면역학적으로 활성인 구조를 위해서 항원은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함해야 한다. 바람직하게는 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 펩티드 서열이다. 본 발명의 펩티드 또는 단백질은 적어도 7개, 좀더 바람직하게는 9 내지 100개 아미노산, 가장 바람직하게는 15개 내지 40개 아미노산의 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 펩티드를 산출하는 에피토프의 아미노산 서열은 수성 용매 내에서의 분자의 가용성을 증가시키기 위해 선택된다. 게다가, 벡터에 연결되지 않은 펩티드의 말단은 미셀, 라멜라(lamellae), 세관 또는 리포솜과 같은 다중-분자 구조의 형성을 통해 구조의 가용성을 촉진시키기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 미셀의 자발적 조립을 촉진하기 위해 양성 전하 아미노산을 추가할 수 있다. 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 중 하나는 구조를 형성하기 위해 벡터에 결합될 수 있다. 구조의 대규모 합성을 촉진하기 위해, 펩티드의 N- 또는 C-말단 아미노산 잔기를 변이시킬 수 있다. 요구되는 펩티드가 펩티다아제에 의한 절단에 특히 민감할 때, 일반 펩티드 결합은 비-절단 펩티드 유사체에 의해 치환될 수 있다; 이러한 결합 및 합성 방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다.
비-표준, 비-천연 아미노산은 또한 이들이 MHC 분자와 상호작용하는 펩티드의 능력을 손상시키지 않으며 천연 서열을 인식하는 T 세포와의 교차-반응을 유지시키는 것을 조건으로 하여 펩티드 서열에 추가될 수 있다. 비-천연 아미노산을 프로테아제에 대한 펩티드 저항성 또는 화학적 안정성을 증가시키는데 사용할 수 있다. 비-천연 아미노산의 예는 D-아미노산 및 시스테인 변이를 포함한다.
플루오로카본 벡터에 부착시기기 전에 하나 이상의 항원을 서로 연결시킬 수 있다. 이러한 한 예는 펩티드, 탄수화물 또는 핵산이 될 수 있는 하나 또는 다수의 B 세포 에피토프 또는 하나 또는 다수의 CTL 에피토프에 무차별 T 핼퍼 에피토프가 공유결합될 수 있는 융합 펩티드의 사용이다. 예로써, 무차별 T 핼퍼 에피토프는 PADRE 펩티드, 파상풍 독소 펩티드(830-843) 또는 인플루엔자 헤마글루티닌, HA (307-319)일 수 있다. 대안적으로, 펩티드 서열은 두 개 또는 그 이상의 에피토프를 포함할 수 있으며, 이들은 오버랩핑되어 밀집 배치 다중-특이 에피토프의 클러스터를 생성하거나 아미노산의 신장에 의해 연속되거나 분리된다.
그러므로 추가 양상에서, 본 발명은 R이 서로 연결된 하나 이상의 에피토프 또는 항원인 벡터-항원 구조를 제공한다. 에피토프는 또한 선형 오버랩핑되어 밀집 배치 다중-특이 에피토프의 클러스터를 생성할 수 있다.
*플루오로카본에 대한 강한 비-공유 분자 상호작용에 기인하여, 항원은 또한 벡터와 비-공유적으로 결합할 수 있으며 항원-제시 세포에 의해 유리하게 채택되도록 하는 목적을 여전히 이루었다.
그러므로 추가 양상에서, 본 발명은 항원이 플루오로카본 벡터와 비-공유적으로 결합하는 벡터/항원 구조를 제공한다.
하나 또는 그 이상의 B-세포 에피토프를 나타내는 항원은 또한 하나 또는 그 이상의 T-세포 에피토프 없이 또는 이와 함께 플루오로카본 벡터에 결합할 수 있다. B 세포 에피토프는 인실리코 접근법을 사용하여 예상할 수 있다(Bublil EM, Freund NT, Mayrose I, Penn O, Roitburd-Berman A, Rubinstein ND,Pupko T, Gershoni JM. "Stepwise prediction of conformational discontinuous B-cell epitopes using the Mapitope algorithm." Proteins. 2007 Jul 1;68(1):294-304.Greenbaum JA, Andersen PH, Blythe M, Bui HH, Cachau RE, Crowe J, Davies M,Kolaskar AS, Lund O, Morrison S, Mumey B, Ofran Y, Pellequer JL, Pinilla C, Ponomarenko JV, Raghava GP, van Regenmortel MH, Roggen EL, Sette A, Schlessinger A, Sollner J, Zand M, Peters B. "Towards a consensus on datasets and evaluation metrics for developing B-cell epitope prediction tools" J Mol Recognit. 2007 Mar-Apr;20(2):75-82).
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 플루오로카본 벡터-항원 구조를 포함하는 백신 및 면역치료제를 제공한다. 이러한 유형의 다중-성분 산물은 이들이 좀더 많은 환자의 적합한 면역 반응을 야기하는데 좀더 효과적일 수 있기 때문에 바람직하다. 인간의 과도한 HLA 다형성에 기인하여, 단일 플루오로펩티드가 주어진 집단에서 높은 비율로 다중에피토프 면역 반응을 유도할 것으로 여겨지지는 않는다. 그러므로, 집단 전체에 백신 산물이 효능을 나타내기 위해서는 많은 플루오로펩티드가 더 광범위하게 적용되기 위한 백신 제형에서 필수적일 수 있다. 게다가, 인플루엔자 백신 또는 면역치료제의 최적 제형은 상이한 인플루엔자 바이러스 항원으로부터의 많은 상이한 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 경우에 펩티드들은 단일 플루오로카본 벡터에 함께 부착되어 결합될 수 있거나 각 펩티드 항원이 전용 벡터에 결합될 수 있다.
다중-성분 산물은 하나 또는 그 이상의 벡터-항원 구조물, 좀더 바람직하게는 2 내지 20개, 더 바람직하게는 3 내지 10개의 벡터-항원 구조물을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서 다중 성분 백신은 5, 6, 7 또는 8개 구조물을 포함할 수 있다. 이는 다중-에피토프 T-세포 반응이 광범위한 집단 범위(즉, HLA 다양성을 나타냄)에서 일어나도록 한다. 예를 들어, 다중 플루오로펩티드의 제형은 인플루엔자 A 유래 펩티드 단독, 인플루엔자 B 유래 펩티드 단독 또는 인플루엔자 C 유래 펩티드 단독으로 구성되거나 인플루엔자 유형의 조합, 가장 바람직하게는 인플루엔자 A 및 B로 구성될 수 있다.
한 실시형태에서 산물은 적어도 2개의 벡터-항원 구조를 포함하며, 첫 번째 구조는 하기의 인플루엔자 펩티드 서열을 포함하며:
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
두 번째 구조는 하기의 인플루엔자 펩티드 서열을 포함한다:
YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
추가 실시형태에서 산물은 하기 인플루엔자 펩티드 서열을 포함하는 8개 벡터-항원 구조를 포함한다:
구조 1 HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
구조 2 VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG
구조 3 YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
구조 4 APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA
구조 5 SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
구조 6 KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG
구조 7 DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS
구조 8 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
대안적으로, 다중 에피토프는 병원체 범위에 대한 면역을 부여하기 위해 제형에 추가될 수 있는데, 병원체 중 하나는 인플루엔자 바이러스이다. 예를 들어 호흡기 감염 백신은 인플루엔자 바이러스 및 호흡기 신시티아 바이러스로부터의 항원을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 항원에 결합된 플루오로카본 벡터 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 용인가능한 담체 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 이러한 아쥬반트 및/또는 약학적으로 용인가능한 담체는 중요성 및/또는 사이토카인 프로필의 관점에서 면역 반응을 증가시킬 것이나 이에 한정되지는 않는다;
(1) 프로인트 아쥬반트 및 이의 유도체, 무라밀디펩티드(muramyldipeptide; MDP) 유도체, CpG, 모노포스포릴 지질(monophosphoryl lipid) A와 같은 박테리아의 천연 성분의 천연 또는 합성 유도 정제물;
(2) 사포닌, 알루미늄염 및 사이토카인과 같은 그외 공지된 아쥬반트 또는 증강제;
(3) 수중유(oil in water) 아쥬반트, 유중수(water-in-oil) 아쥬반트, 면역자극 복합체(immunostimulating complex; ISCOMs), 리포솜, 제형화된 나노- 및 마이크로-입자와 같은 외래 아쥬반트((1) 및 (2) 참조)와 함께 또는 외래 아쥬반트 없이 항원을 제형화하는 방법;
(4) 박테리아 독소 및 톡소이드; 및
(5) 본 분야의 숙련자에게 널리 공지된 그외 유용한 아쥬반트.
만약 요구된다면 담체는 조성물의 수송 경로에서의 작용에 따라 자주 선택된다. 본 발명 내에서, 조성물은 투여에 적합한 경로 및 수단으로 제형화될 수 있다. 약학적으로 용인가능한 담체 또는 희석액은 경구, 안구, 직장. 비강, 국소(구강 및 설하 포함), 질내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내, 경피 포함) 투여에 적합한 제형에서 사용되는 것을 포함한다.
제형은 적절한 형태, 예를 들어 액체, 고체, 에어로졸 또는 가스의 형태로 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 제형은 유탁액, 시럽이나 용액 또는 정제나 캡슐의 형태일 수 있으며, 이들은 위에서 유효성분이 분해되는 것을 방지하기 위해 장용 코팅(enterically coated)될 수 있다. 비강 제형은 스프레이 또는 용액의 형태일 수 있다. 경피 제형은 그들의 특정 수송 시스템에 적용시킬 수 있으며 패치를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 증류수 또는 그외 약학적으로 용인가능한 용매 또는 현탁제 내의 현탁물 또는 용액일 수 있다.
그러므로 추가 양상에서, 본 발명은 적합한 담체 및/또는 아쥬반트와 함께 또는 이들 없이 벡터-항원 구성을 포함하는 예방용 또는 치료용 제형을 제공한다.
환자에게 투여될 백신 또는 면역치료제의 적합한 투여량이 임상에서 결정될 것이다. 그러나, 지침으로서, 바람직한 경로의 투여에 따른 적절한 인간 투여량은 1 내지 1000㎍일 수 있다. 다중 투여량이 면역학적 또는 임상학적 효과를 달성하기 위해 요구될 수 있으며, 만일 요구된다면 2 내지 12주 간격으로 통상적으로 투여할 것이다. 장기간에 걸친 면역 반응의 부스팅(boosting)이 요구되면 1달 내지 5년 간격의 반복된 투여량이 적용될 수 있다.
제형은 하나 이상의 백신 또는 약물의 투여를 달성하기 위해 다른 유효 성분과 벡터-항원 구조를 병용할 수 있다. 시너지 효과 또한 둘 또는 그 이상의 유효 성분의 공동-투여를 통해 관찰되었다.
하나 또는 그 이상의 플루오로펩티드를 포함하는 본 발명의 백신 제형을 Fluzone®, Agrippal™,Begrivac™, Fluvax®, Enzira®, Fluarix™, Flulaval™, FluAd®, Influvac®, Fluvirin®, FluBlok®과 같은 체액 반응-기저 인플루엔자 백신 또는 유효 성분으로 헤마글루티닌을 포함하는 인플루엔자 백신 또는 Flumist®와 같은 한랭-적응 균주를 포함하는 약독화된 생 인플루엔자 바이러스과 병용하여 사용할 수 있다. 조합된 혼합물 형태로 또는 동시에 투여되거나 시간을 달리해 분리 투여되는 분리 백신 제제 형태로 투여할 수 있다.
추가 양상에서, 인플루엔자 백신 제형은 아만티딘(amantidine), 리만티딘(rimantidine), 자나미비르(zanamivir) 또는 오셀타미비르(oseltamivir)와 같은 뉴라미니다제 저해제 치료를 포함하는 항-바이러스 치료용 조성물과 병용하여 투여할 수 있다. 동시에 또는 시간차를 두어 분리하여 투여할 수 있다.
다른 양상에서 본 발명은 다음을 제공한다:
i) 질환 또는 이의 증상을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조시 본원에 기재된 바와 같은 면역성 구조의 용도.
ii) 본원에 기재된 제형의 투여 후 면역 반응의 유도를 통한 치료 방법.
본 발명은 하기 시료에 관련하여 기술할 것이다. 이러한 실시예들은 상응하는 비-플루오르화 항원과 비교되는 항원으로의 플루오로카본 벡터의 부착에 의해 수득되는 상이한 T-세포 면역 반응을 강조한다. 실험한 8개 항원을 본원에서 언급된 인플루엔자 서열 목록으로부터 선택했다. 이러한 일시적인 선택은 다음을 포함하는 파라미터의 조합을 포함하는 독점 선택 알고리즘을 사용했다; 면역정보학(immunoinformatics) 선택, 생체외 결합 검정, 인플루엔자에 미리 감염된 인간 PBMC를 사용한 탈체 재자극(restimulation) 검정, 제조 및 제형화 파라미터. 최종적으로 마우스에서의 평가로 개별적으로 또는 조합으로 선택된 플루오로펩티드가 면역성이 있으며 수득된 반응이 천연 펩티드 항원보다 우수함을 확인했다. 항원 선택은 바이러스 유전자 및 인간 HLA 다양성이 합리적인 백신 설계를 해결하는 것과 같은 백신 원형에서 항원 조합을 사용하는 것에 초점을 맞추고 바라고 있다. 이는 펩티드 백신 분야에서 주요 실패한 것 중 하나이다. 플루오로펩티드 백신에서 단일 항원을 사용하는 것이 가능하나 이는 이종 교배 인간(또는 그외) 집단에서 백신의 면역원성 가능성을 제한할 수 있으므로 다중 펩티드의 선택이 광범위한 효과적인 백신에 필수적이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "플루오로펩티드"는 항원에 기초한 펩티드에 결합된 플루오로카본 벡터(사슬)를 의미한다.
본 발명은 플루오로카본 벡터를 사용하여 면역 반응 세포로 인플루엔자 항원을 수송하는 문제를 해결함으로써 면역원성을 증가시키는 효과가 있다.
도 1: 탈체 IFN-γ ELIspot 검정에 의해 평가된, 프라임 또는 프라임-부스트 후에 BALB/c 및 CBF6 마우스에서 다가 플루오로펩티드 백신과 이의 천연 펩티드 등가물의 면역원성을 비교한 것이다. 그룹 당 7 또는 8마리의 마우스를 플루오로펩티드 백신(100㎕에서 플루오로펩티드 당 1 nmol의 투여량의 8개 제형화 플루오로펩티드로 구성됨) 또는 등가의 천연 펩티드(100 ㎕에서 펩티드 당 1nmol의 투여량의 8개 제형화 천연 펩티드로 구성됨)로 피하 투여해 면역화시켰다. 대조군에는 부형제만을 포함하는 제형을 투여했다. 최종 주입 후 10일째에 마우스를 경추탈골시켜 희생시켰다. 각각의 마우스로부터 비장을 제거하여 단일 비장 세포 현탁액을 제조했다. 마우스 IFN-γ ELISpot 검정(Mabtech, Sweden)을 제조업자의 지침에 따라 실행했다. 비장 세포(5x105)를 200㎕의 총 부피로 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 완전 배양 배지(10% 우태아혈청을 보충한 RPMI)에서 펩티드 당 10㎍/ml의 농도로 8개의 개별 천연 펩티드로 2회 자극시켰다. CTL-면역스팟 판독기 유닛으로 스팟을 계수했다. 각 마우스에서, 총 스팟의 수를 8개 펩티드에 대해 축적하고 대조 웰(배지만 있음)의 수치를 8회 공제했다. 결과는 백만 입력 비장세포 당 스팟 형성 세포(spot forming cells; SFC)의 평균±표준 편차에 상응한다.
도 2: 탈체 IFN-γ ELIspot 검정에 의해 평가된, 프라임 또는 프라임-부스트 후에 BALB/c 및 CBF6 마우스에서 다가 플루오로펩티드 백신과 이의 펩티드 등가물의 면역원성을 비교한 것이다. 그룹 당 7 또는 8마리의 마우스를 플루오로펩티드 백신(100㎕에서 플루오로펩티드 당 1 nmol의 투여량의 8개 제형화 플루오로펩티드로 구성됨) 또는 등가의 천연 펩티드(100 ㎕에서 펩티드 당 1nmol의 투여량의 8개 제형화 천연 펩티드로 구성됨)로 피하 투여해 면역화시켰다. 대조군에는 부형제만을 포함하는 제형을 투여했다. 최종 주입 후 10일째에 마우스를 경추탈골시켜 희생시켰다. 각각의 마우스로부터 비장을 제거하여 단일 비장 세포 현탁액을 제조했다. 마우스 IFN-γELISpot 검정(Mabtech, Sweden)을 제조업자의 지침에 따라 실행했다. 비장 세포(5x105)를 200㎕의 총 부피로 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 완전 배양 배지(10% 우태아혈청을 보충한 RPMI)에서 펩티드 당 10㎍/ml의 농도로 8개의 개별 천연 펩티드로 2회 자극시켰다. CTL-면역스팟 판독기 유닛으로 스팟을 계수했다. 각 마우스에서, 총 스팟의 수를 8개 펩티드에 대해 축적하고 대조 웰(배지만 있음)의 수치를 8회 공제했다. 결과는 백만 입력 비장세포 당 스팟 형성 세포(spot forming cells; SFC)의 평균±표준 편차에 상응한다.
도 3: 탈체 IFN-γ ELIspot 검정에 의해 평가된, 프라임 또는 프라임-부스트 후에 BALB/c 및 CBF6 마우스에서 다가 플루오로펩티드 백신과 천연 펩티드 등가물의 면역원성을 비교한 것이다. 그룹 당 7 또는 8마리의 마우스를 플루오로펩티드 백신(100㎕에서 플루오로펩티드 당 1 nmol의 투여량의 8개 제형화 플루오로펩티드로 구성됨) 또는 등가의 천연 펩티드(100 ㎕에서 펩티드 당 1nmol의 투여량의 8개 제형화 천연 펩티드로 구성됨)로 피하 투여해 면역화시켰다. 대조군에는 부형제만을 포함하는 제형을 투여했다. 최종 주입 후 10일째에 마우스를 경추탈골시켜 희생시켰다. 각각의 마우스로부터 비장을 제거하여 단일 비장 세포 현탁액을 제조했다. 마우스 IFN-γ ELISpot 검정(Mabtech, Sweden)을 제조업자의 지침에 따라 실행했다. 비장 세포(5x105)를 200㎕의 총 부피로 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 완전 배양 배지(10% 우태아혈청을 보충한 RPMI)에서 펩티드 당 10㎍/ml의 농도로 8개의 개별 천연 펩티드로 2회 자극시켰다. CTL-면역스팟 판독기 유닛으로 스팟을 계수했다. 결과는 백만 입력 비장세포 당 스팟 형성 세포(spot forming cells; SFC)의 평균±표준 편차에 상응한다.
도 4: 프라임-부스트 면역화 후에 BALB/c 및 CBF6 마우스에서 다가 플루오로펩티드 백신과 천연 펩티드 등가물의 면역원성을 비교한 것이다; 사이토카인 프로필 평가. 그룹 당 8마리의 마우스를 플루오로펩티드 백신(100㎕에서 플루오로펩티드 당 1 nmol의 투여량의 8개 제형화 플루오로펩티드로 구성됨) 또는 등가의 천연 펩티드(100 ㎕에서 펩티드 당 1nmol의 투여량의 8개 제형화 천연 펩티드로 구성됨)로 피하 투여해 면역화시켰다. 대조군에는 부형제만을 포함하는 제형을 투여했다. 마우스를 15일 간격으로 면역화시켰다. 최종 주입 후 10일째에 마우스를 경추탈골시켜 희생시켰다. 각각의 마우스로부터 비장을 제거하여 단일 비장 세포 현탁액을 제조했다. 비장 세포를 200㎕의 총 부피로 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 완전 배양 배지(10% 우태아혈청을 보충한 RPMI)에서 펩티드 당 1㎍/ml의 농도로 8개의 천연 펩티드의 혼합물로 2회 자극시켰다. 자극된 세포의 배양 상청액으로부터의 사이토카인 농도(인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자(TNF))를 마우스 세포계측 비드 검정 키트(CBA; BD Biosciences, UK)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 분석하였으며 FacsCanto II 유동 세포계측기를 사용하여 분석했다. 표준 곡선을 210-2500 pg/ml 범위로 각 사이토카인에 대해 결정하였다. 제조업자의 지시에 따라, CBA에 대한 검출의 하한은 분석물에 따라 2.5-3.2 pg/ml이다. 결과는 각 사이토카인에 대해 각각의 마우스 그룹에서 계산된 평균값 및 표준 편차에 상응한다. 결과는 pg/ml의 사이토카인 농도로 나타냈다.
도 5: CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 둘 다를 BALB/c 마우스 내에서 플루오로펩티드 백신으로 자극했다. 그룹 당 4마리 마우스를 플루오로펩티드 백신(100㎕에서 플루오로펩티드 당 1nmol의 투여량의 8개 제형화 플루오로펩티드로 구성됨)으로 피하 투여하여 면역화시켰다. 15일 간격으로 마우스에게 2회 투여했다(프라임-부스트). 마지막 주입 후 10일째에 마우스를 경추탈골하여 희생시켰다. 비장을 제거하여 단일 비장 세포 현탁액을 개별 마우스로부터 제조했다. 세포를 0.5x106/웰로 재현탁시키고 배지 단독으로 또는 8개 천연 펩티드(백신)의 혼합물로 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 자극시켰다. 양성 대조 배양(PMA/I)에 배양시간 중 최후 5시간 동안 50ng/ml PMA 및 0.5㎍/ml 이오노마이신(ionomycin)을 첨가했다. 모든 배양물에 배양기간 중 최후 5시간 동안 10㎕/ml 브레펠딘(Brefeldin) A를 첨가했다. 세포를 CD4 및 CD8에 대해 세포외적으로 IFN-γ에 대해 세포내 염색하고, D FACSCanto II 세포계산기를 사용하여 유동세포계측법으로 분석했다. 각각의 마우스에 대한 결과를 세포내 IFN-γ를 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 비율로 나타냈다.
도 6: 단일 면역 후 BALB/c 마우스에서 CFA에 에멀젼화시킨 백신과 다가 플로오로펩티드 백신의 면역원성을 비교했다; 사이토카인 프로필의 평가. 그룹 당 10마리 마우스를 플루오로펩티드 백신(100㎕에서 플루오로펩티드 당 1nmol의 투여량의 8개 제형화 플루오로펩티드로 구성됨) 또는 완전 프로인트 아쥬반트(complete Freund's adjuvant; CFA)에 에멀젼화시킨 플루오로펩티드 백신으로 피하내 투여하여 면역화시켰다. 대조군 마우스에게는 부형제만을 포함한 제형을 주입했다. 10일 gn에 마우스를 경추탈골로 희생시켰다. 비장을 제거하여 단일 비장 세포 현탁액을 개별 마우스로부터 제조했다. 비장 세포를 200㎕의 총 부피로 완전 배양 배지(10% 우태아혈청을 보충한 RPMI)에서 펩티드 당 1㎍/ml의 농도의 8개 천연 펩티드 혼합물로 5% CO2 대기 하의 37℃에서 48시간 동안 자극시켰다. 자극된 세포의 배양 상청액으로부터의 사이토카인 농도의 분석(인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF))을 제조업자의 지침에 따라 마우스 세포계측 비드 어레이 키트(CBA; BD Biosciences, UK)를 사용하여 실행하고 FacsCanto II 유동 세포계측기를 사용하여 분석했다. 표준 곡선을 2.5-2500 pg/ml 범위로부터 각 사이토카인에 대해 결정했다. 제조업자에 따른 CBA에 대한 더 낮게 제한된 검출은 분석물에 따라 2.5-3.2 pg/ml이다. 결과는 각 사이토카인에 대한 각 그룹의 마우스에 대해 계산된 평균치±표준오차에 상응한다. 결과는 pg/ml의 평균 사이토카인 농도로서 표현했다.
도 7: 단일 면역화 후 BALB/c 마우스에서 플루오로펩티드 백신 투여의 피하 경로와 피내 경로를 비교한 것이다: 탈체 IFN-γ ELISpot 검정. 그룹 당 10마리 마우스를 플루오로펩티드 백신(100㎕에서 플루오로펩티드 당 1nmol의 투여량의 8개 제형화 플루오로펩티드로 구성됨)로 피하(s.c.) 또는 피내(i.d.) 투여하여 면역화시켰다. 대조군에는 부형제만을 포함하는 제형을 피하로 투여했다. 10일 후 마우스를 경추탈골하여 희생시켰다. 각각의 마우스로부터 비장을 제거하여 단일 비장 ㅅ세포 현탁액을 제조했다. 마우스 IFN-γ ELISpot 검정(Mabtech, Sweden)을 제조업자의 지시에 따라 실행했다. 비장 세포(5x105)를 200㎕의 총 부피로 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 완전 배양 배지(10% 우태아혈청을 보충한 RPMI)에서 펩티드 당 10㎍/ml의 농도로 8개의 개별 천연 펩티드로 2회 자극시켰다. CTL-면역스팟 판독기 유닛으로 스팟을 계수했다. 각 마우스에서, 총 스팟의 수를 8개 펩티드에 대해 축적하고 대조 웰(배지만 있음)의 수치를 8회 공제했다. 결과는 백만 입력 비장세포 당 스팟 형성 세포(spot forming cells; SFC)의 평균±표준 오차에 상응한다.
실시예 1
예시 펩티드
인플루엔자 예방용 또는 치료용 백신에 포함되는 플루오로카본 벡터 후보물질은 하기의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 그 단편, 또는 상동체(Los Alamos National Laboratory 인플루엔자 서열 데이터베이스(Macken, C., Lu, H., Goodman, J., & Boykin, L., "The value of a database in surveillance and vaccine selection." in Options for the Control of Influenza IV. A.D.M.E. Osterhaus, N. Cox & A.W. Hampson (Eds.) 2001, 103-106.) 또는 NCBI에서의 인플루엔자 바이러스 자원에서 언급된 바와 같은 상응하는 콘센서스, 조상 또는 중심의 3개 서열 포함) 또는 그 천연 또는 비천연 변이체를 포함할 수 있으나 이에 필수적으로 제한되지 않는다. 적합한 펩티드의 실시예는 하나의 표준 문자 코드를 사용하여 하기에 나타냈다. 상동체는 참조 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는다. 바람직하게는 상동체는 자연적으로 발생한 서열에 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일성을 갖는다. 비-천연 아미노산의 사용은 MHC 클래스 I 또는 II 수용체에 결합하는 펩티드의 능력을 방해하지 않아야 한다. 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 이러한 서열의 단편 또한 플루오로카본 벡터에 부착되는 후보 펩티드이다.
이러한 서열들을 인플루엔자 A 콘센서스 서열로부터 선택했다. 인플루엔자 바이러스 단백질 및 이 단백질 내의 펩티드의 위치를 명시했다. 단백질 서열을 인플루엔자 바이러스 소스http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/로부터 선택했다.
서열 번호 1
PB2 위치 027 내지 061
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
서열 번호 2
PB2 위치 123 내지 157
ERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDINPGHADLSAK
서열 번호 3
B2 위치 155 내지 189
SAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEK
서열 번호 4
PB2 위치 203 내지 237
VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG
서열 번호 5
PB2 위치 249 내지 283
EVRNDDVDQSLIIAARNIVRRAAVSADPLASLLEM
서열 번호 6
PB2 위치 358 내지 392
EGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQ
서열 번호 7
PB2 위치 370 내지 404
ATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVF
서열 번호 8
PB2 위치 415 내지 449
RGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNW
서열 번호 9
PB2 위치 532 내지 566
SSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWETVKIQWSQ
서열 번호 10
PB2 위치 592 내지 626
YSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTVQIIKLLPFAAAPP
서열 번호 11
PB2 위치 607 내지 641
LGTFDTVQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVR
서열 번호 12
PB2 위치 627 내지 659
QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNK
서열 번호 13
*PB1 위치 012 내지 046
VPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRT
서열 번호 14
PB1 위치 114 내지 148
VQQTRVDKLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIE
서열 번호 15
PB1 위치 216 내지 250
SYLIRALTLNTMTKDAERGKLKRRAIATPGMQIRG
서열 번호 16
PB1 위치 267 내지 301
EQSGLPVGGNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTELSFT
서열 번호 17
PB1 위치 324 내지 358
YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
서열 번호 18
PB1 위치 340 내지 374
APIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLA
서열 번호 19
PB1 위치 404 내지 436
SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
서열 번호 20
PB1 위치 479 내지 513
KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG
서열 번호 21
PB1 위치 486 내지 520
KTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINES
서열 번호 22
PB1 위치 526 내지 560
GVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYR
서열 번호 23
PB1 위치 656 내지 690
EYDAVATTHSWIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQ
서열 번호 24
PB1 위치 700 내지 734
FPSSSYRRPVGISSMVEAMVSRARIDARIDFESGR
서열 번호 25
PA 위치 107 내지 141
PDLYDYKENRFIEIGVTRREVHIYYLEKANKIKSE
서열 번호 26
PA 위치 122 내지 156
VTRREVHIYYLEKANKIKSEKTHIHIFSFTGEEMA
서열 번호 27
PA 위치 145 내지 179
IHIFSFTGEEMATKADYTLDEESRARIKTRLFTIR
서열 번호 28
PA 위치 166 내지 200
ESRARIKTRLFTIRQEMASRGLWDSFRQSERGEET
서열 번호 29
PA 위치 495 내지 529
RRKTNLYGFIIKGRSHLRNDTDVVNFVSMEFSLTD
서열 번호 30
PA 위치 642 내지 676
AKSVFNSLYASPQLEGFSAESRKLLLIVQALRDNL
서열 번호 31
PA 위치 173 내지 207
PRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFW
서열 번호 32
NP 위치 240 내지 274
DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS
서열 번호 33
M1 위치 002 내지 026
SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKN
서열 번호 34
M1 위치 023 내지 057
EIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTK
서열 번호 35
M1 위치 038 내지 072
DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
서열 번호 36
M1 위치 055 내지 089
LTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGD
서열 번호 37
M1 위치 166 내지 200
ATTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAA
서열 번호 38
NS1 위치 128 내지 162
IILKANFSVIFDRLETLILLRAFTEEGAIVGEISP
서열 번호 39
NS2 위치 026 내지 060
EDLNGMITQFESLKLYRDSLGEAVMRMGDLHSLQN
하기 서열은 인플루엔자 바이러스 B 콘센서스 서열로부터 선택된 것이다. 이플루엔자 바이러스 단백질 및 이 단백질 내의 펩티드의 위치를 명시했다. 단백질 서열을 인플루엔자 바이러스 자원 http://www.ncbi.nlm.nih.gov.genomes/FLU/으로부터 수집했다.
서열 번호 40
PB2 위치 016 내지 050
NEAKTVLKQTTVDQYNIIRKFNTSRIEKNPSLRMK
서열 번호 41
PB2 위치 117 내지 151
YESFFLRKMRLDNATWGRITFGPVERVRKRVLLNP
서열 번호 42
PB2 위치 141 내지 175
ERVRKRVLLNPLTKEMPPDEASNVIMEILFPKEAG
서열 번호 43
PB2 위치 197 내지 231
GTMITPIVLAYMLERELVARRRFLPVAGATSAEFI
서열 번호 44
PB2 위치 311 내지 345
DIIRAALGLKIRQRQRFGRLELKRISGRGFKNDEE
서열 번호 45
PB2 위치 404 내지 438
MVFSQDTRMFQGVRGEINFLNRAGQLLSPMYQLQR
서열 번호 46
PB2 위치 519 내지 553
VSELESQAQLMITYDTPKMWEMGTTKELVQNTYQW
서열 번호 47
PB2 위치 537 내지 571
MWEMGTTKELVQNTYQWVLKNLVTLKAQFLLGKED
서열 번호 48
PB2 위치 572 내지 606
MFQWDAFEAFESIIPQKMAGQYSGFARAVLKQMRD
서열 번호 49
PB2 위치 717 내지 751
LEKLKPGEKANILLYQGKPVKVVKRKRYSALSNDI
서열 번호 50
PB1 위치 001 내지 035
MNINPYFLFIDVPIQAAISTTFPYTGVPPYSHGTG
서열 번호 51
PB1 위치 097 내지 131
EEHPGLFQAASQNAMEALMVTTVDKLTQGRQTFDW
서열 번호 52
PB1 위치 227 내지 261
MTKDAERGKLKRRAIATAGIQIRGFVLVVENLAKN
서열 번호 53
PB1 위치 393 내지 427
KPFFNEEGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVAALGI
서열 번호 54
PB1 위치 616 내지 650
DPEYKGRLLHPQNPFVGHLSIEGIKEADITPAHGP
서열 번호 55
PB1 위치 701 내지 735
SASYRKPVGQHSMLEAMAHRLRMDARLDYESGRMS
서열 번호 56
PA 위치 160 내지 194
SSLDEEGKGRVLSRLTELQAELSLKNLWQVLIGEE
서열 번호 57
PA 위치 491 내지 525
ESFDMLYGLAVKGQSHLRGDTDVVTVVTFEFSSTD
서열 번호 58
PA 위치 696 내지 723
VIQSAYWFNEWLGFEKEGSKVLESVDEIMDE
서열 번호 59
NP 위치 173 내지 207
FLKEEVKTMYKTTMGSDGFSGLNHIMIGHSQMNDV
서열 번호 60
NP 위치 253 내지 287
EAIRFIGRAMADRGLLRDIKAKTAYEKILLNLKNK
서열 번호 61
NP 위치 308 내지 342
IADIEDLTLLARSMVVVRPSVASKVVLPISIYAKI
서열 번호 62
NP 위치 338 내지 372
IYAKIPQLGFNVEEYSMVGYEAMALYNMATPVSIL
서열 번호 63
NP 위치 418 내지 452
GFHVPAKEQVEGMGAALMSIKLQFWAPMTRSGGNE
서열 번호 64
M1 위치 166 내지 300
ARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQK
서열 번호 65
M1 위치 209 내지 237
IGVLRSLGASQKNGEGIAKDVMEVLKQSS
인플루엔자 예방용 또는 치료용 백신에 포함되는 후보 펩티드는 조합 형태의 바이러스 단백질 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 매트릭스(M1) 단백질, M2, 핵단백질(NP), PA, PB1, PB2, NS1 또는 NS2일 수 있다.
플루오로펩티드 및 천연 펩티드( 비변이 펩티드)의 합성
8개 천연 펩티드 및 8개 플루오로펩티드(본원에 포함된 펩티드 서열 중에서 선택; 서열번호 1 내지 65)를 고형상 펩티드 합성(solid phase peptide synthesis; SPPS)으로 수득했다. 모든 팹티드를 표준 9-플루오레닌 에톡시카르보닐(fluorenyhnethoxycarbonyl; Fmoc) 화학을 사용하여 링크 아미드 PEG 수지 상에서 합성했다. 펩티드 사슬을 30분 동안 20% 피페리딘/ N,N-디메틸포름아미드로 처리하고 120분 동안 1,3-디이소프로필카르보디이미드 / 1-히드록시-벤조트리아졸 / N-메틸모르폴린을 사용하여 보호된 아미노산을 결합시켜 Fmoc 보호기를 제거하여 수지 상에서 조립했다. 닌히드린 테스트를 결합 후 결합 효능을 조사하여 실행했다. N-말단 리시닐(Lysinyl) 잔기의 첨가 후, 수지 블록을 (1) 수지의 첫 번째 절반에서, N-말단 리신의 엡실론-사슬에서 2H,2H,3H,3H-퍼플루오로운데칸산 플루오로카본 사슬의 첨가로 플루오로펩티드를 유도해내며 (2) 수지의 두 번째 절반에서, N-말단 리신의 엡실론-사슬의 아세틸화로 천연 펩티드를 유도해내어 분리했다. 수지를 세척하고 건조시킨 후 측쇄 보호기의 절단 및 제거를 위해 시약 K로 처리했다. 조펩티드를 냉 에티르로부터 침전시키고 여과하여 수집했다. RP-HPLC로 순도를 측정하였으며 순도는 모든 펩티드에서 92%보다 우세하다. 동결-건조 플루오로펩티드를 질소 하에서 준비하고 -20℃에서 보관했다. 보관 조건 하에서 플루오로펩티드의 안정성을 6개월에 거쳐 RP-HPLC 및 LC-MS로 확인했다.
백신 투여 조제
8개 동결-건조 플루오로펩티드(플루오로펩티드 1, 플루오로펩티드 2, 플루오로펩티드 3, 플루오로펩티드 4, 플루오로펩티드 5, 플루오로펩티드 6, 플루오로펩티드 7 & 플루오로펩티드 8) 또는 동결-건조 등가 물 천연 펩티드(펩티드1, 펩티드2, 펩티드3, 펩티드4, 펩티드5, 펩티드6, 펩티드7 & 펩티드8)을 비경구적 수송을 위한 광범위한 중성 pH을 나타내는 아이소몰(isomolar) 제형으로 제형화했다.
구성의 인풀루엔자 펩티드 부분의 서열은 다음과 같다:
플루오로펩티드 1 HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK-NH2
플루오로펩티드 2 VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG-NH2
플루오로펩티드 3 YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-NH2
플루오로펩티드 4 APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA-NH2
플루오로펩티드 5 SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY-NH2
플루오로펩티드 6 KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG-NH2
플루오로펩티드 7 DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS-NH2
플루오로펩티드 8 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER-NH2
동물 및 면역화
6-8주령의 암컷 BALB/c 또는 CB6F1 (BALB/c x C57BL/6J) 마우스를 Charles River (UK) &/or Harlan (UK)에서 구입했다. 1ml 주사기 및 22-G 바늘을 사용하여 피하로 주입했다. 단일 면역화(프라임) 또는 2회 면역화(프라임/부스트) 중 하나로 면역화를 실시했다. 각 주입 사이에 14일 간격으로 면역화를 실시했다.
플루오로펩티드 백신은 강한 면역원성을 나타내며 BALB /c 및 CB6F1 마우스 둘 다에서 천연 펩티드에 비해 우수하다
BALB/c 및 CB6F1 마우스에서 플루오로펩티드 백신(상기와 같은 8개 플루오로펩티드의 혼합물)의 면역원성을 천연 펩티드 등가물(상기와 같이 천연 펩티드로 불리는 8개 비변이 펩티드의 혼합물)과 비교했다. 연구는 프라임 또는 프라임-부스트 양생법을 사용하여 두 제형의 면역원성을 비교했다. 두 제형을 BALB/c 및 CBF6 마우스에서 아쥬반트 없이 피하로 주입했다. 1nmol/플루오로펩티드(8개 플루오로펩티드에서 총 8 nmol)를 포함하는 플루오로펩티드 백신 또는 1nmol/펩티드(8개 천연 펩티드에서 총 8 nmol)의 천연 펩티드 백신 등가물로 마우스를 면역화시켰다. 백신 제형은 어느 아쥬반트도 포함하지 않았다. 최종 면역화 후 10일째에 비장 세포를 10 ㎍/ml의 각각의 개별 천연 펩티드로 재자극하고 IFN-γ ELISpot 검정을 사용해서 평가했다. 탈체 IFN-γ ELISpot 검정(도 1 및 2)에 따라, 플루오로펩티드 백신의 면역원성은 프라임-부스트 면역화 양생법 후에 부형제 단독 및 천연 펩티드 백신 등가물 둘 다보다 우수했다(P<0.001). 결과는 플루오로펩티드 백신 그룹 단독으로의 단일 면역화에 비해 프라임-부스트 양생법을 사용하여 스팟 형성 세포의 수가 매우 증가함을 증명했다(도 1 및 2). 이러한 결과는 펩티드 서열에 결합된 플루오로카본 사슬의 자가-아쥬반트성 특성을 증명한다.
플루오로펩티드 백신은 BALB /c 및 CB6F1 마우스 둘 다에서 로버스트 다가에피토프 T 세포 반응을 유도했다
BALB/c 및 CB6F1 마우스에서 플루오로펩티드 백신(상기와 같은 8개 플루오로펩티드의 혼합물)의 면역원성을 이의 천연 펩티드 등가물(상기와 같이 "천연 펩티드"로 언급된 8개 비변이 펩티드의 혼합물)과 비교했다. 연구는 또한 프라임 및 프라임-부스트 양생법으로 두 제형 모두의 면역원성을 비교했다. 두 제형 모두를 BALB/c 및 CB6F1 마우스에 아쥬반트 없이 피하내 투여했다. 1nmol/플루오로펩티드(8개 플루오로펩티드에서 8 nmol)를 포함하는 플루오로펩티드 백신 투여량 또는 1nmol/펩티드(8개 천연 펩티드에서 8 nmol)의 천연 펩티드 백신 등가물로 마우스를 면역화시켰다. 백신 제형 중 어느 것도 어떠한 아쥬반트를 포함하지 않았다. 대조군은 부형제만으로 면역화된 마우스로 구성했다. 면역화 후 10일째에, 비장 세포를 10 ㎍/ml의 각각의 개별 천연 펩티드로 재자극시키고 IFN-γ ELISpot 검정으로 측정했다. 플루오로펩티드 백신은 BALB/c 마우스에서 8개 펩티드 중 5개 및 CB6F1 마우스에서 8개 펩티드 중 7개에서 펩티드-특이 반응을 유도하며 이는 백신 등가물(비변이 펩티드)에 의해 유도된 반응보다 우수하다. 이는 플루오로펩티드로의 백신화는 천연 펩티드 등가물에 비해 정성적 및 정량적으로 우수한 면역학적 반응을 유도할 수 있음을 증명한다.
플루오로펩티드 백신은 실험한 마우스 종족에 따른 Th1 사이토카인 프로필을 유도한다
BALB/c 및 CB6F1 마우스에서 플루오로펩티드 백신(상기와 같은 8개 플루오로펩티드의 혼합물)의 면역원성을 천연 펩티드 등가물(상기와 같은 8개 비변이 펩티드의 혼합물)과 비교했다. 제형을 BALB/c 및 CB6F1 마우스에 아쥬반트 없이 피하내로 투여했다. 1nmol/플루오로펩티드(8개 플루오로펩티드에서 총 8 nmol)를 포함하는 플루오로펩티드 백신 투여량, 1nmol/펩티드(8개 천연 펩티드에서 8 nmol)의 천연 펩티드 백신 등가물로 마우스를 면역화시켰다. 백신 제형 모두 어떠한 아쥬반트도 포함하지 않았다. 마지막 면역화 후 10일째에, 비장 세포를 펩티드 당 1 ㎍/ml의 8개 천연 펩티드의 혼합물로 재자극시켰다. 48시간 자극 후에 배양 상청액을 다중 비드 검정(CBA)으로 사이토카인에 대해 평가했다. 결과는 CBF6 마우스에서의 사이토카인 프로필이 IFN-γ의 생성 및 Th1 프로필을 강조하는 TNF-α의 상당한 생성에 의해 조절됨을 증명했다(도 4). 이러한 Th1-조절 사이토카인 프로필은 CB6F1 마우스에 비교된 이러한 더 낮은 강도의Th1 반응에 기인하여(IFN-γ ELISpot에 의해 또한 관찰된 바와 같음-도 1 및 2에 언급됨) BALB/c 마우스에 비해 더 현저하며 Th2 사이토카인에서 증가한다. 그럼에도 불구하고, 증가된 Th1 반응이 천연 펩티드 등가물에 비해 플루오로펩티드로 면역화한 BALB/c 마우스에서 관찰됐다.
플루오로펩티드 백신은 IFN -γ를 생산하는 펩티드-특이 CD4 + 및 CD8 + T 세포 둘 다를 자극한다
IFN-γ에 대해 세포내 사이토카인 염색을 IFN-γ를 생산하는 펩티드-특이 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도에 대한 정보를 제공하는데 사용했다. 마우스를 플루오로펩티드 백신(상기와 같은 8개 플루오로펩티드의 혼합물)로 면역화시키고 CD4+ 또는 CD8+ 비장세포를 8개 천연 펩티드의 혼합물(백신)로 단기간 자극시킨 후 유동 세포계측기로 세포내 사이토카인 염색하여 평가했다. 결과는 플루오로펩티드 백신으로 마우스를 면역화시키면 0.5-2.6%의 빈도로 IFN-γ를 생산하는 펩티드-특이 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다를 유도할 수 있음을 증명한다(도 5). 이는 펩티드가 관련된 MHC 클래스I 및 II 에피토프를 포함한다면 MHC 클래스I 및 II 항원 프로세싱 펩티드 둘 다에 관여함을 확인해준다.
실시예 2. 플루오로펩티드 백신화에 의해 유도된 면역 반응은 아쥬반트와의 조합에 의해 증가된다
플루오로펩티드 백신(상기와 같은 8개 플루오로펩티드의 혼합물)의 면역원성을 프로인트 완전 아쥬반트(CFA)인 아쥬반트의 존재 하에 플루오로펩티드 백신의 면역원성과 비교했다. CFA에 의해 에멀젼화된 플루오로펩티드 백신(1 nmol/펩티드) 또는 플루오로펩티드 백신(1 nmol/펩티드)를 BALB/c 마우스를 면역화시키는데 사용했다. 면역화한 후 10일째에, 비장세포를 10㎍/ml의 개별 펩티드로 자극시켰다. 48시간 후 배양 상청액을 수집하여 다중 사이토카인 검정(CBA)을 사용하여 사이토카인에 대해 실험했다. 결과는 추가 아쥬반트로서 CFA를 사용하는 것이 Th2 사이토카인(IL-4, IL-5)의 생산에 영향을 미치지 않고 Th1 사이토카인 생산(IFN-γ 및 IL-2)을 상당히 증가시킴을 보여준다(도 6). 그러므로 플루오로펩티드 백신화에 의해 유도된 Th1 반응은 면역화 동안에 아쥬반트와 함께 병용되어 우선적으로 증가된다.
플루오로펩티드 백신의 피하 및 피내 경로 투여 둘 다는 면역 반응을 유도할 수 있다
플루오로펩티드 백신(상기와 같은 8개 플루오포펩티드의 혼합물)의 면역원성을 BALB/c 마우스에서 피내 또는 피하 경로로 투여하여 비교했다. 면역화한 후 10일째에, 비장세포를 10㎍/ml의 개별 펩티드로 자극하고 ELISPOT로 탈체 IFN-γ의 생산에 대해 평가했다. 결과는 플루오로펩티드의 피하 및 피내 경로 투여 둘 다 로버스트 항원-특이 반응을 유도하는데 적합함을 보여준다(도 7).
<110> IMMUNE TARGETING SYSTEMS (ITS) LTD. 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Glu Lys Ala Asn Ile Leu Leu Tyr Gln 1 5 10 15 Gly Lys Pro Val Lys Val Val Lys Arg Lys Arg Tyr Ser Ala Leu Ser 20 25 30 Asn Asp Ile 35 <210> 50 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 50 Met Asn Ile Asn Pro Tyr Phe Leu Phe Ile Asp Val Pro Ile Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Val Pro Pro Tyr Ser His 20 25 30 Gly Thr Gly 35 <210> 51 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 51 Glu Glu His Pro Gly Leu Phe Gln Ala Ala Ser Gln Asn Ala Met Glu 1 5 10 15 Ala Leu Met Val Thr Thr Val Asp Lys Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr 20 25 30 Phe Asp Trp 35 <210> 52 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 52 Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala Ile Ala 1 5 10 15 Thr Ala Gly Ile Gln Ile Arg Gly Phe Val Leu Val Val Glu Asn Leu 20 25 30 Ala Lys Asn 35 <210> 53 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 53 Lys Pro Phe Phe Asn Glu Glu Gly Thr Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met 1 5 10 15 Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val Leu Gly Val Ala Ala 20 25 30 Leu Gly Ile 35 <210> 54 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 54 Asp Pro Glu Tyr Lys Gly Arg Leu Leu His Pro Gln Asn Pro Phe Val 1 5 10 15 Gly His Leu Ser Ile Glu Gly Ile Lys Glu Ala Asp Ile Thr Pro Ala 20 25 30 His Gly Pro 35 <210> 55 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 55 Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Pro Val Gly Gln His Ser Met Leu Glu Ala 1 5 10 15 Met Ala His Arg Leu Arg Met Asp Ala Arg Leu Asp Tyr Glu Ser Gly 20 25 30 Arg Met Ser 35 <210> 56 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 56 Ser Ser Leu Asp Glu Glu Gly Lys Gly Arg Val Leu Ser Arg Leu Thr 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Glu Leu Ser Leu Lys Asn Leu Trp Gln Val Leu Ile 20 25 30 Gly Glu Glu 35 <210> 57 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 57 Glu Ser Phe Asp Met Leu Tyr Gly Leu Ala Val Lys Gly Gln Ser His 1 5 10 15 Leu Arg Gly Asp Thr Asp Val Val Thr Val Val Thr Phe Glu Phe Ser 20 25 30 Ser Thr Asp 35 <210> 58 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 58 Val Ile Gln Ser Ala Tyr Trp Phe Asn Glu Trp Leu Gly Phe Glu Lys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Lys Val Leu Glu Ser Val Asp Glu Ile Met Asp Glu 20 25 30 <210> 59 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 59 Phe Leu Lys Glu Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser 1 5 10 15 Asp Gly Phe Ser Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met 20 25 30 Asn Asp Val 35 <210> 60 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 60 Glu Ala Ile Arg Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ile Lys Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu 20 25 30 Lys Asn Lys 35 <210> 61 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 61 Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser Met Val Val 1 5 10 15 Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Ala Lys Ile 35 <210> 62 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 62 Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro Val 20 25 30 Ser Ile Leu 35 <210> 63 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 63 Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala Ala 1 5 10 15 Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser Gly 20 25 30 Gly Asn Glu 35 <210> 64 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 64 Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu Met Gln Met Val Ser 1 5 10 15 Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met Gly Lys Gly Glu Asp 20 25 30 Val Gln Lys 35 <210> 65 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 65 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 1 5 10 15 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser 20 25 <210> 66 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 66 Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly Lys Gly Tyr 1 5 10 15 Met Phe Glu Ser Lys Arg Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile Pro Ala Glu 20 25 30 Met Leu Ala 35

Claims (33)

  1. CmFn --CyHx-(Sp)-R 의 구조식을 갖는 플루오로카본 벡터-항원 구조물 또는 이의 유도체로서, 상기 식에서 m은 3 내지 30, n은 2m +1 이하, y는 0 내지 15, x는 2y 이하, (m + y)는 3 내지 30이고, Sp는 선택적 화학 스페이서 성분이며, R은 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 항원임을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  2. 하기의 구조식을 갖는 플루오로카본 벡터-항원 구조물로서,
    Figure pat00003

    상기 식에서 Sp는 선택적인 화학 스페이서이고 R은 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 항원임을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R은 인플루엔자 바이러스 단백질 유래의 하나 이상의 에피토프를 포함함을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  4. 제3항에 있어서, R은 A형 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 B형 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 C형 인플루엔자 바이러스 단백질 유래의 하나 이상의 에피토프를 포함함을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 펩티드임을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 면역원성 펩티드임을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, R은 7 내지 100개의 아미노산으로 구성된 펩티드임을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R은 하나 이상의 MHC 클래스 I 또는 II 결합 에피토프 또는 B 세포 결합 에피토프 또는 이의 조합을 포함함을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R은 둘 이상의 오버랩핑 에피토프를 포함함을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R은 NCBI 및 로스 알라모스 네셔널 라보라토리 (Los Alamos National Laboratory) 인플루엔자 서열 데이터베이스 중에서 선택된 펩티드 또는 이의 단편, 유도체, 상동체 또는 이들의 조합임을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  11. 제1항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65로부터 선택된 펩티드, 이의 단편, 유도체, 상동체 또는 이들의 조합임을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  12. 플루오로카본 벡터가 항원과 비공유적으로 결합된 제1항의 플루오로카본 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R은 다중 에피토프 및/또는 융합 펨티드를 포함함을 특징으로 하는 플루오로카본 벡터-항원 구조물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플루오로카본 벡터-항원 구조물 하나 이상과 선택적으로 하나 또는 그 이상의 약학적으로 용인가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 아쥬반트를 함께 포함하는 약학적 조성물.
  15. 비경구, 경구, 안구, 직장, 비강, 경피, 국소 또는 질내 투여를 위해 제형화된, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플루오로카본 벡터-항원 구조물을 하나 이상 포함하는 약학적 조성물.
  16. 액상, 에멀젼, 고형, 에어로졸 또는 가스의 형태인, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플루오로카본 벡터-항원 구조물을 하나 이상 포함하는 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플루오로카본 벡터-항원 구조물 하나 이상과 아쥬반트를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 아쥬반트는
    (1)프로인트 아쥬반트 및 이의 유도체, 뮤라밀디펩티드(muramyldipeptide: MDP) 유도체, CpG, 모노포스포릴 지질 A 중에서 선택된 박테리아의 천연 성분의 자연적 또는 합성적 유도 정제물;
    (2)사포닌, 알루미늄염 및 사이토카인 중에서 선택된 아쥬반트 또는 증강제;
    (3)수중유 아쥬반트, 유중수 아쥬반트, 면역자극 복합체(immunostimulating complex:ISCOMs), 리포솜, 제형화된 나노-입자 및 마이크로-입자; 및
    (4)박테리아 독소 및 톡소이드
    중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 벡터-항원 구조물을 포함하며
    첫 번째 구조물은 다음 서열의 인플루엔자 펩티드
    HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
    를 포함하고,
    두 번째 구조물은 다음 서열의 인플루엔자 펩티드
    YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
    를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 8개의 벡터-항원 구조물을 포함하며 상기 구조물이 다음 서열의 인플루엔자 펩티드
    구조물 1 HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK
    구조물 2 VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG
    구조물 3 YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE
    구조물 4 APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA
    구조물 5 SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY
    구조물 6 KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG
    구조물 7 DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS
    구조물 8 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER
    를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 예방용 백신 또는 면역치료학적 약학 제품의 제조시 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플루오로카본 벡터-항원 구조물의 용도.
  21. 비경구, 점막, 경구, 비강, 국소, 안구, 직장, 경피 또는 질내 투여를 위한 예방용 백신 또는 면역치료학적 약학 제품의 제조시 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플루오로카본 벡터-항원 구조물의 용도.
  22. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 동시에 또는 분리하여 체액성 반응-기저 인플루엔자 백신과 병용하여 투여함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 백신은 헤마글루티닌 함유 인플루엔자 백신임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  24. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 사용한 치료 또는 면역화 방법.
  25. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 동물에게 투여함을 특징으로 하는 면역 반응을 자극하기 위한 방법.
  26. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 조류에게 투여함을 특징으로 하는 면역 반응을 자극하기 위한 방법.
  27. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물에게 투여함을 특징으로 하는 면역 반응을 자극하기 위한 방법.
  28. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 인간에게 투여함을 특징으로 하는 면역 반응을 자극하기 위한 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물을 항-인플루엔자 치료와 병용함을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 항-인플루엔자 치료는 뉴라미니다제 저해제임을 특징으로 하는 방법.
  31. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항의 예방용 또는 치료용 조성물을 헤마글루티닌 함유 인플루엔자 백신과 병용하여 동시에 또는 분리하여 투여하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  32. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 플루오로카본 벡터-항원 구조물을 하나 또는 그 이상의 약학적으로 용인가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 아쥬반트와 병용하여 포함하는 예방용 또는 치료용 약학 제품의 제조 방법.
  33. 제32항에 있어서, 백신 또는 제품이 비경구적, 점막, 경구, 비강, 국소, 안구, 직장, 경피 또는 질내 투여용임을 특징으로 하는 방법.
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