KR20150072217A - 광 반응성 암세포 표적화 리포솜 - Google Patents

광 반응성 암세포 표적화 리포솜 Download PDF

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김진철
서희진
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강원대학교산학협력단
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Abstract

광 반응성 화합물을 리포솜 막에 삽입시키고 암세포 인지 리간드를 리포솜 표면에 수식하여 제조된 광 반응성 암세포 표적화 리포솜(photo-responsive and cancer cell-targetable liposome)에 관한 것으로, 암세포를 표적화한 후, 광 조사(photo-irradiation)에 반응하여 목적물질(예로서, 항암물질)을 방출할 수 있다. 이와 같은 작용에 의해 항암제로 인한 정상세포의 파괴 및 그로 인한 부작용 등을 예방할 수 있으며, 궁극적으로 항암치료의 효과를 극대화할 수 있다.

Description

광 반응성 암세포 표적화 리포솜 {photo-responsive and cancer cell-targetable liposome}
본 발명은 광 조사(photo-irradiation)에 반응하여 목적물질을 방출하고 암세포를 타겟팅(targeting) 할 수 있을 목적으로, 광 반응성 화합물을 리포솜 막에 삽입시키고 암세포 인지 리간드를 리포솜 표면에 수식하여 제조된 광 반응성 암세포 표적화 리포솜(photo-responsive and cancer cell-targetable liposome)에 관한 것이다.
리포솜(liposome)이란 인지질 이중층 소포체로 정의되는데, 리포솜의 다양한 기능성으로 인하여 지난 수십 년 동안 약물 전달체로 응용하려는 연구가 많이 진행되어 왔다.
리포솜은 여러 가지 방법들로 쉽게 제조될 수 있고, 인체에 무해하고, 친수성 화합물과 소수성 화합물을 동시에 포접할 수 있는 것으로 알려져 있다(Spuch C, Navarro C. Liposomes for targeted delivery of active agents against neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease and parkinson's disease). J Drug Deliv 2011; 12: Article ID 469679).
리포솜의 생체분포 및 특성은 조성과 크기를 변화시킴으로써 조절될 수 있는데, 온도 변화, pH 변화와 같은 외부자극에 반응하여 내용물을 방출할 수 있도록 리포솜을 설계할 수 있다. 또한, 리포솜 표면을 리간드로 수식함으로써 리포솜을 표적부위(target site)에 집중화(localization)시킬 수도 있다 (Spuch C, Navarro C. Liposomes for targeted delivery of active agents against neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease and parkinson's disease). J Drug Deliv 2011; 12: Article ID 469679).
한편, 약물의 독성을 감소시키면서 치료효능을 증가시키기 위해서는, 약물 전달체(drug carriers)는 목적부위(target sites)를 표적화(targeting)하고, 목적부위에서 약물을 선택적으로 방출시켜야 하는데, 상기에서 살펴본 바와 같은 우수한 특성을 갖는 리포좀을 이용하여 관련 연구들을 많이 진행할 필요가 있다.
대한민국 특허공개번호 제10-2010-0083632호(2010. 07. 22)에는, 항암제, 암세포에서 과다분비되는 표적 단백질 분해효소에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 및 암 부위에 특이적으로 축적가능한 고분자로 결합된 표적 단백질 분해효소 감응형 항암제 전구체가 기재되어 있다.
현재까지 광 조사(photo-irradiation)에 응답하여 목적물질을 방출하고 암세포를 표적화(targeting)하는 리포솜은 전무하다. 본 발명에서는 광 반응성 화합물을 리포솜 막에 삽입시키고, 암세포 인지 리간드를 리포솜 표면에 부착(경우에 따라, '부착'은 논문 등의 여러 문헌에서 '수식'이라는 말로 대용되어 사용되기도 함)함으로써, 광 조사(photo-irradiation)에 응답하여 목적물질을 방출하고 암세포를 표적화하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜(photo-responsive and cancer cell-targetable liposome)을 개발하고자 한다.
본 발명은 광 반응성 화합물을 리포솜 막에 삽입시키고 암세포 인지 리간드를 리포솜 표면에 부착하여 제조되는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜을 제공한다. 광 반응성 화합물을 리포솜 막에 삽입시키고 암세포 인지 리간드를 리포솜 표면에 부착함으로써 광 조사(photo-irradiation)에 응답하여 목적물질을 방출하고, 암세포를 표적화하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜(photo-responsive and cancer cell-targetable liposome)을 제공하는 것이다.
본 발명에서는, 광 반응성 화합물(photo-responsive compound)을 리포솜 막에 삽입하고 리포솜 표면을 암세포 특이성 리간드(cancer cell-specific ligand)로 수식함으로써 광 반응성 암세포 표적화 리포솜 (photo-responsive and cancer cell-targetable liposome)을 개발하였다.
광 반응성 암세포 표적화 리포솜은 리포솜 표면에 수식된 리간드(ligand)와 암세포 표면의 리셉터(receptor)사이의 특이적 상호작용으로 암세포를 표적화할 수 있는데, 리포솜이 암세포를 표적화한 이후에 광(자외선을 포함하는 빛)을 조사하면 광 반응성 화합물의 광 반응으로 인하여 리포솜 막은 교란되기 때문에 리포솜은 암세포에서 항암제를 방출하는 것이다.
상기 광 반응성 암세포 표적화 리소좀에 있어서, 광 반응성 화합물은 일 예로, 쿠마린(coumarin), 쿠마린 이량체(coumarin dimer) 및 그 유도체, 신남산(cinnamic acid), 신남산 이량체(cinnamic acid dimer) 및 그 유도체, 파이렌(pyrene) 및 그 유도체, 살리실리덴아닐린(salicylideneaniline) 및 그 유도체, 아조벤젠(azobenzene) 및 그 유도체 중 어느 하나 이상이 사용될 수 있다.
또한, 상기 광 반응성 암세포 표적화 리소좀에 있어서, 암세포 인지 리간드(ligand)는 일 예로 폴레이트(folate), 히알루론산(hyaluronic acid) 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 광 반응성 암세포 표적화 리소좀에 있어서, 리포솜을 구성하는 인지질은 일 예로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 중 어느 하나 이상이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 인지질, 광 반응성 화합물, 암세포 인지 리간드를 혼합하여 건조필름을 제조하는 단계; 상기 건조필름을 항암성 약물이 용해되어 있는 수용액으로 수화 및 분산시켜 현택액을 제조하고, 균질화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜의 제조방법을 제공한다. 상기에서 특징적으로 기재하고 있는 사항 외의 리포솜 제조에 관한 구체적인 세부 기술은 리포솜 제조시 사용되는 필름 수화법(film hydration)을 참조하면 용이하게 실시할 수 있으므로 세세한 기재는 생략하기로 한다.
상기 광 반응성 암세포 표적화 리포솜의 제조방법에 있어서, 인지질과 광 반응성 화합물의 중량비는 바람직하게는 1:0.01-1:0.3인 것이 좋다. 이 범위보다 낮은 중량 비에서는 광 반응성 화합물의 양이 너무 적어서 광 조사(photo-irradiation)를 하여도 리포솜 막이 목적물질을 방출할 만큼 충분히 교란되지 못하고 이 범위보다 높은 중량 비에서는 광 반응성 화합물의 양이 너무 많아서 리포솜 막이 형성되지 못하기 때문이다. 더욱 바람직하게는 1:0.02-1:0.2, 가장 바람직하게는 1:0.03-1:0.1이 좋다.
또한, 상기 광 반응성 암세포 표적화 리포솜의 제조방법에 있어서, 인지질과 리간드의 중량비는 바람직하게는 1:0.0001-1:0.05인 것이 좋다. 이 범위보다 낮은 중량 비에서는 리간드의 양이 너무 적어서 리포솜이 암세포를 충분히 인지하지 못하여 표적화할 수 없고, 이 범위보다 높은 중량 비에서는 리간드의 양이 너무 많아서 리포솜 막이 형성되지 못하기 때문이다. 더욱 바람직하게는 1:0.0005-1:0.02, 가장 바람직하게는 1:0.001-1:0.01인 것이 좋다.
본 발명에 의할 경우, 암세포를 표적화한 후, 광 조사(photo-irradiation)에 반응하여 목적물질(예로서, 항암물질)을 방출할 수 있다. 이와 같은 작용에 의해 항암제로 인한 정상세포의 파괴 및 그로 인한 부작용 등을 예방할 수 있으며, 궁극적으로 항암치료의 효과를 극대화할 수 있다.
도 1a는 7-아세트옥시쿠마린 모노머(7-Acetoxycoumarin monomer)의 1H NMR 스펙트럼이다
도 1b는 7-아세트옥시쿠마린 다이머(7-Acetoxycoumarin dimmer)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 1c는 DSPE-PEG2000-폴레이트의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 EPC 리포솜, EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜의 TEM 사진이다.
도 3a는 자외선(254nm, 6W)을 60분 조사하는 동안 EPC 리포솜, EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜, 그리고 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로부터의 방출%이다.
도 3b는 자외선을 조사하지 않았을 때 60분 동안 EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/ PSE-PEG2000-아민 리포솜, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로부터의 방출%이다.
도 4는 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로 처리된 KB 세포들의 공초점 레이저 현미경 사진이다.
도 5는 리포솜으로 처리되지 않은 KB세포와 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜과 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로 처리된 KB 세포들에 대한 유세포 분석 결과이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1. 7- 아세트옥시쿠마린 이량체 ( ACD ) 제조]
7-아세트옥시쿠마린(7-Acetoxycoumarin)을 아래와 같이 제조하여 광 반응성 화합물로 사용하였다. 7-하이드로옥시쿠마린(7-Hydroxycoumarin) 12.5 g과 소디움 아세테이트(sodium acetate) 9.5 g을 250ml의 삼구 플라스크(3-neck flask)에 담겨져 있는 아세틱 안하드라이드(acetic anhydride) 45 ml에 용해시킨 다음, 그 용액에 피리딘 2-3방울을 첨가하였다. 반응 혼합물을 천천히 144 ℃로 가열하여 동일한 온도에서 7시간 동안 교반, 환류시키면서 반응시켰다. 상온으로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 여과지(Whatman No.2)를 통과시켜 여과하였다. 여과된 케익(cake)을 1L의 증류수와 1L의 에탄올로 세척하였다. 세척한 생성물(7-acetoxycoumarin)을 에탄올에서 재결정화하여 정제하였다. 상온에서 건조한 후에 7-아세트옥시쿠마린 0.5 g을 유리 접시(Ø100ｘ10mm) 위에 펼치고, 커버글라스로 덮었다. 그리고 7-아세트옥시쿠마린을 한 시간마다 뒤집어 주면서 12시간 동안 자외선(365nm, 400 W)을 조사하였다. 자외선 조사를 한 7-아세트옥시쿠마린을 다이에틸 에테르(diethyl ether) 1L로 세정하고 아세트산(acetic acid)에서 재결정화한 후 건조하였다 (1. Chen, Y., Chen, K.-H., 1997. Synthesis and reversible photocleavage of novel polyurethanes containing coumarin dimer components. J. Polym. Sci. Pol. Chem. 35, 613-624, 2. Seo HJ, Kim J-C. Characteristics and photo-responsive release property of liposome containing 7-acetoxy coumarin. J Nanosci Nanotechnol 2011; 11:10262-10270).
도 1a는 7-아세트옥시쿠마린 모노머(7-acetoxycoumarin monomer, ACM)의 1H NMR 스펙트럼이다. 아로마틱 프로톤의 신호가 6.47 ppm - 8.09 ppm에서 관찰되었고, 아세톡시 프로톤의 신호가 2.32 ppm 근처에서 관찰되었다. 아로마틱 프로톤 시그날의 면적이 5.06이었고, 아세톡시 그룹 시그널의 면적이 3.15이었다. 따라서, 아세톡시 그룹에 대한 아로마틱 링의 몰비가 1:1.04로 계산되었는데, 이것은 AC의 모든 수산기가 아세톡시 그룹으로 대체되었다는 것을 의미한다.
도 1b는 7-아세트옥시쿠마린 다이머(7-acetoxycoumarin dimer, ACD)의 1H NMR 스펙트럼이다. 아로마틱 프로톤의 신호가 6.68 ppm - 6.79 ppm에서 관찰되었고, 사이클로 부탄 다리의 프로톤 신호가 4.07 ppm과 4.18 ppm에서 관찰되었으며, 아세톡시 프로톤의 신호가 2.26 ppm에서 관찰되었다. 아세톡시 그룹 신호의 면적이 3.41이었고, 사이클로 부탄 신호의 면적이 2.31이었고, 아로마틱 링 신호의 면적이 3.34이었다. 따라서, 아세톡시 그룹/아로마틱 고리/사이클로부탄 다리의 몰비는 1.00:1.01:0.98으로 계산되었는데, 이것은 ACD가 성공적으로 제조되었다는 것을 의미한다.
[ 실시예 2. DSPE - PEG 2000 -폴레이트 제조]
폴레이트(folate) 12.5 mg을 25 ml 둥근플라스크에 담겨져 있는 무수 DMSO 1ml에 용해시켰다. 동시에, DSPE-PEG2000-아민(DSPE-PEG2000-amine) 50 mg과 다이사이클로헥실 카르보다이미드(dicyclohexyl carbodiimide) 16.3 mg을 10ml 바이알에 담겨져 있는 피리딘(pyridine) 0.25 ml에 용해시켰다. 후자의 용액을 전자의 용액에 한 방울씩 떨구어 준 후에 반응 혼합물을 상온에서 4시간 동안 천천히 혼합시키면서 반응시켰다. 실리카 겔 TLC 플레이트 위에서 닌히드린-양성(ninhydrin-positive) DSPE-PEG2000-아민 스팟을 확인함으로써 DSPE-PEG2000-폴레이트(DSPE-PEG2000-Folate)가 합성되었음을 확인하였다. 회전 증발기에서 피리딘을 제거한 후에, 증류수 6.25 ml을 반응혼합물에 첨가하여 불순물을 석출시켰다. 그 다음 주사기용 필터 (syringe filter, 0.22 ㎛ PTFE membrane)를 이용하여 여과하였다. 여과 액을 소디움 크롤라이드 수용액(50 mM) 2L에서 투석액을 2번 교체하면서 12시간 동안 투석한 후에 증류수 2L에서 투석액을 3번 교체하면서 18시간 동안 투석하였다. 투석시킨 용액을 동결 건조하여 DSPE-PEG2000-폴레이트를 얻었다.
도 1c는 DSPE-PEG2000-폴레이트의 1H NMR 스펙트럼이다. 폴레이트의 아로마틱 프로톤의 신호는 6.62 ppm, 6.92 ppm, 7.66 ppm, 8.64 ppm에서 관찰되었고, DSPE의 메틸 프로톤 신호는 0.85 ppm에서 관찰되었다. 아로마틱 고리 신호의 면적이 2.47이었고, 메틸 그룹 시그날의 면적이 3이었다. 따라서, DSPE에 대한 폴레이트의 몰비는 0.99:1로 계산되었는데, 이것은 대부분의 DSPE-PEG2000-아민이 폴레이트와 결합되었다는 것을 의미한다.
[ 실시예 3. 리포솜 제조]
리포솜을 필름 수화법(film hydration)으로 제조하였다. 클로로포름에 용해되어 있는 에그 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine) 용액 (100mg/ml, EPC), ACD 용액 (1mg/ml), DSPE-PEG2000-아민 용액 (10mg/ml) 그리고 DSPE-PEG2000-폴레이트 용액 (1mg/ml)을 30ml 둥근 바닥 플라스크에 넣는다. 이때 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-아민/DSPE-PEG2000-폴레이트의 몰 비가 10/0/0/0, 9/1/0/0, 9/1/0/0.05, 9/1/0.05/0, 9/0/0/0.05 그리고 9/0/0.05/0이 되게 하였다.
혼합용액의 용매를 40 ℃, 감압으로 작동되고 있는 회전 증발기에서 증발시켜서 둥근 바닥 플라스크 벽 위에 인지질 혼합막을 형성시켰다. HEPES 버퍼(pH 8.0)에 용해되어 있는 5(6)-카르복시플루오레스세인{5(6)-carboxyfluorescein, 5(6)-CF} 용액 (100 mM) 2 ml을 건조 인지질 혼합막이 형성되어 있는 플라스크에 넣고 인지질 혼합막이 플라스크 벽에서 완전히 떨어져 나올 때까지 플라스크를 손으로 빙빙 돌려주어 리포솜 현탁액을 제조하였다.
그 후에 초음파 분쇄기(bath type sonicator, Sonics & Materials, USA)를 이용하여 20분 동안 상온에서 리포솜을 균질화시켰다. 현탁액을 4 ℃에서 12시간 정도 보관하여 리포솜 막을 어닐링(annealing)시켰다. 리포솜에 포접되지 않은 형광성 물질인 CF는 리포솜 현택액을 Sephadex G-100 column (1.8 cm × 40 cm)을 통과시켜서 제거하였다.
EPC 리포솜, EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜, EPC/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜, EPC/ACD/DSPE-PEG2000-아민 리포솜, 그리고 EPC/DSPE-PEG2000-아민 리포솜의 모양과 구조를 포스포퉁스틱 에시드(phosphotungstic acid)로 염색된 리포솜의 TEM 사진들을 통해서 관찰하였다.
염색을 하기 위하여 리포솜 현탁액을 포스포퉁스틱 에시드 용액 (2 %, pH 6.8)과 동일한 부피 비로 혼합한 후에 혼합액을 상온에서 3시간 동안 방치하였다 (Dayan, N., Touitou, E., 2000. Carriers for skin deliveryof trihexyphenidyl HCl: Ethosomes vs. Liposomes. Biomaterials 21, 1879-1885). 그리고 나서, 일정량의 염색된 리포솜 현탁액을 포름바르/쿠퍼-코팅 그리드(formvar/copper-coated grid, 200 mesh, Electron Microscopy Sciences)에 침적시킨 후에 자연 건조시켰다. TEM 사진들은 트랜스미션 일렉트론 마이크로스코프(transmission electron microscope, JEOL JEM-2010 Luminography (Fuji FDL-5000) Ultramicrotome(CRX))에서 촬영하였다.
도 2는 EPC 리포솜, EPC/ACD 리포솜 그리고 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜의 TEM 사진이다. EPC 리포솜의 막은 다중 라멜라 구조였고, 크기는 수백 나노미터였다(도 2에서 A). 본 발명에서 이용한 필름 수화법은 다중 라멜라 베시클을 생성시킨다고 알려져 있다 (Hope M.J., Bally M.B., Mayer L.D., Janoff A.S., Cullis P.R., 1986. Generation of multilamellar and unilamellar phospholipid vesicles. Chem. Phys. Lipids 40, 89-107). ACD를 리포솜 막에 함유시켜도 리포솜의 구조와 크기에 거의 영향을 미치지 않았다 (도 2에서 B). ACD는 극성이 낮아서 수상에 거의 용해되지 않기 때문에 대부분의 ACD는 비극성의 리포솜 막에 삽입된다. 리포솜 막에 삽입된 ACD는 리포솜 막의 팩킹을 교란시킬 수 있지만 그 양이 많지 않기 때문에 (EPC/ACD의 몰비는 9/1) 리포솜 막을 교란시키지 못한 것이다. DSPE-PEG2000-폴레이트가 리포솜 막에 삽입되어도 리포솜의 구조와 크기에 영향을 거의 미치지 못하였다 (도 2에서 C).
DSPE-PEG2000-폴레이트는 DSPE의 두 개의 아실 체인(acyl chain)들이 소수성이고, PEG2000-폴레이트 부분이 친수성이기 때문에 양친매성 분자(amphiphilic molecule)이다. 따라서, 아실 체인들이 리포솜 막에 삽입되어서 PEG2000-폴레이트는 수상으로 배향한다. DSPE는 인지질이고 그것의 팩킹 파라미터 (packing parameter)가 EPC의 팩킹 파라미터와 큰 차이가 없기 때문에, EPC 리포솜 막에 DSPE가 삽입되어도 인지질 이중층 구조는 크게 변하지 않는다. 게다가 리포솜에 삽입된 DSPE-PEG2000-폴레이트의 양도 EPC리포솜 막을 교란시킬 만큼 충분하지 않았다.
[ 실시예 4. 리포솜의 광 반응성 방출]
EPC 리포솜, EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/DSPE-PEG2000-아민 리포솜, 그리고 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로부터 광 반응성 방출(photo-responsive release)을 관찰하였다.
HEPES 버퍼(pH 8.0)로 리포솜 현탁액을 희석하여 리포솜 현탁액에서 EPC의 농도가 0.01mg/ml이 되게 하였다. 자외선 (254nm, 6W)을 60분 동안 리포솜 현탁액에 조사하였고, 방출 정도는 다음과 같은 수학식 1을 이용하여 결정하였다 (1. Seo HJ, Cha HJ, Kim TS, Kim J-C. Photo-responsive liposomes decorated with hydrophobically modified poly(vinyl alcohol)-coumarin conjugate. J Ind Eng Chem 2013; 19:310-315, 2. Seo HJ, Kim J-C. Characteristics and photo-responsive release property of liposome containing 7-acetoxy coumarin. J Nanosci Nanotechnol 2011; 11:10262-10270, 3. Seo HJ, Kim J-C. Light-sensitive liposomes containing coumarin-proteinoid conjugate. J Nanosci Nanotechnol 2012; 12:4044-4050).
[수학식 1]
% release = (Ft - Fi)/(Ff - Fi) X 100
(여기서, Ft 는 자외선(254nm, 6W)을 리포솜 현탁액에 특정 시간 동안 조사한 후 리포솜 현탁액의 형광세기이고, Fi는 자외선을 조사하기 전에 측정한 리포솜의 형광세기이다. Ff는 리포솜을 Triton X-100으로 완전히 용해시킨 후 측정한 형광세기이다)
형광세기는 형광분광기(F-2500, HITACHI, Japan)를 이용하여 492 nm에서 여기(excitation)시키고, 517 nm에서 측정하였다. 대조 시료로서, 자외선을 조사하지 않은 리포솜으로 부터의 방출 %를 관찰하였다.
도 3a는 자외선(254nm, 6W)을 60분 조사하는 동안 EPC 리포솜, EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/DSPE-PEG2000-아민 리포솜, 그리고 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로부터의 방출%이다.
EPC 리포솜은 60분 동안 내용물을 3.7% 방출하였다. EPC/ACD 리포솜은 동일한 기간 동안 10.9%를 방출하였다. EPC 리포솜보다 방출%가 높게 관찰된 것은 리포솜 막에 삽입되어 있는 ACD가 광 분해되었기 때문이다. 자외선 조사에 의해서, ACD는 AC 단량체로 광분해된다. 단량체는 크기와 극성에 있어서 이량체와는 완전히 다르기 때문에 리포솜 막에서 단량체(AC)의 배향은 이량체(ACD)의 배향과 다르게 된다. 따라서, 자외선을 조사받으면, 리포솜 막은 AC잔기들의 재배향(re-orientation)에 의해서 교란되고, 그 결과 리포솜으로 부터의 방출이 촉진된다.
EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜과 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로부터의 방출은 EPC/ACD 리포솜으로부터의 방출보다 자외선 조사(UV irradiation)에 의해서 더욱더 촉진되었다. 예를 들면, 60분 동안 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-아민 리포솜의 방출%와 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜의 방출%는 각각 21.4% 와 20.3%였는데 이것은 EPC/ACD 리포솜의 방출% (10.9%)보다 훨씬 높은 값이다.
DSPE-PEG2000-아민과 DSPE-PEG2000-폴레이트는 일종의 계면활성제이고 리포솜 막을 유동화시킬 수 있다. 따라서, DSPE-PEG2000-아민 또는 DSPE-PEG2000-폴레이트를 함유한 리포솜 막에서 AC잔기들의 자외선 유발 재배향 (UV-induced reorientation)이 그들을 함유하고 있지 않은 리포솜 막에서의 재배향보다 더 유리하다. 이것이 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-아민 리포솜의 방출%와 EPC/ACD/DSPE-PEG2000-폴레이트 리포솜의 방출%가 EPC/ACD 리포솜의 방출%보다 더 높은 이유이다.
도 3b는 자외선을 조사하지 않았을 때 60분 동안 EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜, 그리고 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로부터의 방출%이다. 60분 동안 리포솜의 방출 %는 4%보다 적었고, 이 값은 자외선을 조사하였을 때의 방출 %보다 훨씬 낮았다. 따라서, 도 3a에서와 같이 EPC/ACD 리포솜, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜, 그리고 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로부터 방출%가 촉진되어 높은 것은 ACD가 자외선에 의해서 광분해 되었기 때문이다.
[ 실시예 5. 리포솜의 시험관 내( in vitro ) 표적화 ]
암세포의 일종인 KB 세포(Human epidermal carcinoma, KCLB, Korea)를 세포 밀도가 3 x 105 cells/well가 되게 24-웰 플레이트에 시딩(seeding)한 후, 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 배양 세포를 PBS (pH 7.4)로 조심스레 두 번 세척한다. 그리고, 리포솜 현탁액 100 ㎕를 웰(well)에 담겨져 있는 세포에 첨가한 후에 배양 혼합물을 37 ℃에서 3 시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션 하였다. 인큐베이션을 마친 후, KB 세포들을 PBS로 두 번 세척하여 암 세포에 결합되지 않은 리포솜을 제거하였다. 암세포들을 트립신/EDTA 처리로 떼어내고, 세포의 형광세기를 유세포 분석기 (flow cytometry, FACSCalibur, USA, in the Central Laboratory Center of Kangwon National University)를 이용하여 492 nm에서 여기(excitation)시키고 517nm에서 측정하였다. 세포의 형광 이미지는 공초점 레이져 현미경 (confocal laser scanning microscope, FV1000 SPD, Olympus Co.)으로 관찰하였다.
도 4는 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로 처리된 KB 세포들의 공초점 레이저 현미경 사진이다. EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜으로 처리된 KB 세포들은 CF 형광성을 나타내지 않았는데, 이것은 폴레이트가 수식되지 않은 리포솜과 암세포는 서로 상호작용을 하지 않는다는 것을 의미한다.
한편, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로 처리된 KB 세포들은 세포핵의 DAPI(4’6-diamidino-2-phenylindole) 형광성이 나타나는 위치에서 리포솜의 CF형광성을 나타내었는데, 이것은 리간드인 폴레이트가 수식된 리포솜이 암세포에 결합되었다는 것을 의미한다. 리포솜이 암세포와 결합하는 것은 리포솜 표면에 수식된 폴레이트와 암세포 위의 수용체 사이의 특이적 상호작용 때문이다 (1. Pradhan P, Giri J, Rieken F, Koch C, Mykhaylyk O, Doblinger M, Banerjee R, Bahadur D, Plank C. Targeted temperature sensitive magnetic liposomes for thermo-chemotherapy Journal of Controlled Release. J Control Release 2011; 142:108-121, 2. Gabizon, A., Horowitz, A.T., Goren, D., Tzemach, D., Mandelbaum-Shavit F, Qazen MM, Zalipsky S. Targeting folate receptor with folate linked to extremities of poly(ethylene glycol)-grafted liposomes: in vitro studies. Bioconjugate Chem 1999; 10:289-298).
도 5는 리포솜으로 처리되지 않은 KB세포와 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜과 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로 처리된 KB세포들에 대한 유세포 분석 결과이다. EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜으로 처리된 암세포들은 처리되지 않은 암세포보다 약간 높은 형광성을 나타내었다. 이것은 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜이 암세포와 비 특이적으로 상호작용하였거나 리포솜이 암세포로 내재화(endocytosis)되었기 때문이다.
그런데, EPC/ACD/DPSE-PEG2000-폴레이트 리포솜으로 처리된 암세포는 리포솜으로 처리되지 않은 암세포와 EPC/ACD/DPSE-PEG2000-아민 리포솜으로 처리된 암세포보다 더욱 더 강한 형광성을 나타내었다. 폴레이트(folate)가 수식된 리포솜은 암세포에 단단하게 결합할 수 있는데 이것은 리포솜 표면의 리간드(폴레이트)와 암세포 표면의 리셉터 사이의 특이적 상호작용 때문이다. 이로 인하여 폴레이트가 수식된 리포솜으로 처리된 암세포가 더 높은 형광성을 나타내는 것이다.
상기 실시예에서 보여진 바와 같이, 광 반응성 화합물을 리포솜 막에 삽입시키고 암세포 인지 리간드를 리포솜 표면에 수식하여 제조된 광 반응성 암세포 표적화 리포솜(photo-responsive and cancer cell-targetable liposome)은 광 조사(photo-irradiation)에 반응하여 목적물질을 방출하고 암세포를 표적화하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 광 반응성 화합물을 리포솜 막에 삽입시키고 암세포 인지 리간드를 리포솜 표면에 부착하여 제조되는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 광 반응성 화합물은,
    쿠마린 (coumarin), 쿠마린 이량체 (coumarin dimer) 및 그 유도체, 신남산(cinnamic acid), 신남산 이량체 (cinnamic acid dimer) 및 그 유도체, 파이렌(pyrene) 및 그 유도체, 살리실리덴아닐린(salicylideneaniline) 및 그 유도체, 아조벤젠 (azobenzene) 및 그 유도체 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 암세포 인지 리간드(ligand)는,
    폴레이트(folate) 또는 히알루론산(hyaluronic acid)인 것을 특징으로 하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 리포솜은,
    리포솜을 구성하는 인지질로서 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 중 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것으로 특징으로 하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜.
  5. 인지질, 광 반응성 화합물, 암세포 인지 리간드를 혼합하여 건조필름을 제조하는 단계;
    상기 건조필름을 항암성 약물이 용해되어 있는 수용액으로 수화 및 분산시켜 현택액을 제조하고, 균질화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 인지질과 상기 광 반응성 화합물의 중량비는,
    1:0.01-1:0.3인 것을 특징으로 하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 인지질과 상기 암세포 인지 리간드의 중량비는,
    1:0.0001-1:0.05인 것을 특징으로 하는 광 반응성 암세포 표적화 리포솜의 제조방법.
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