KR20150069531A - 글리코시드­금 나노 복합체 및 이를 이용한 의학적 용도 - Google Patents

글리코시드­금 나노 복합체 및 이를 이용한 의학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리코시드-금 나노 복합체 및 이를 이용한 의학적 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 글리코시드-금 나노 복합체는 멜라닌 생성 억제와 티로시네이즈 억제 활성을 포함한 미백효과 및 항염효과를 나타내며, 이는 티로시네이즈의 억제제로 널리 알려진 알부틴과 비교하여 동등 또는 그 이상의 미백활성 및 항염증 활성을 나타내므로, 글리코시드-금 나노 복합체는 피부 미백용 화장료 조성물, 피부 질환 치료 또는 예방용 약제나 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

글리코시드­금 나노 복합체 및 이를 이용한 의학적 용도{Glycoside-gold nano complex and medical use thereof}
본 발명은 신규한 글리코시드-금 나노 복합체와, 이를 이용한 피부미백용 조성물 또는 피부질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
1857년 콜로이드 상태의 금 나노입자가 처음 소개(Faraday M, (1857) Philos Trans R Soc London. 147:145-181)된 이래로, 금 나노입자는 화장품(Sperling RA et al., (2008) Chem Soc Rev. 37:1896-1908; Boisselier E et al., (2009) Chem Soc Rev. 38:1759-1782), 임상진단(Hirsch LR et al., (2003) Anal Chem. 75:2377-2381; Sokolov K et al., (2003) Cancer Res. 63: 1999-2004; Huang XH et al., (2007) Future Nanomed. 2:681-693), 약물 수송체(Paciotti, GF et al., (2006) Drug Dev Res. 67:47-54; Gibson JD et al., (2007) J Am Chem Soc. 129:11653-11661; Dhar S et al., (2008) Chem Eur J. 14:10244-10250; Lin AY et al., (2013) PLoS One. 8:e63550) 등 다양한 생리활성 적용 가능성 때문에 각광받고 있다.
금 나노입자의 합성 전략 중 가장 일반적이고 전통적인 방법은 수용액 상에서 수산화제2금(auric acid)으로부터 구연산을 사용하여 환원시키는 방법(Turkevich J et al., (1951) Discuss Faraday Soc. 11:55-75; Kimling J et al., (2006) J Phys Chem B. 110:15700-15707)으로, 80℃ 이상의 열을 가해야만 금 나노입자 합성이 가능하다는 단점이 있다. 또 다른 잘 알려진 합성법은 독성물질인 NaBH4를 이용하여 환원하는 것(Brust M et al., (1994) J Chem Soc Chem Commun. 801-802)으로 물과 함께 유기용매를 사용해야만 한다는 단점이 있다.
최근 인체 적용 가능한 금 나노입자 합성을 위해 독성물질의 사용을 최소화 하기 위한 다양한 전략이 제시되고 있으며, 그 중 당 구조를 포함하는 화합물 또는 천연 식물 유래 추출물로부터 수산화제2금을 환원하여 금 나노입자를 합성하는 방법(Engelbrekt C et al., (2009) J Mater Chem. 19:7839-7847; Park Y et al., (2011) IET nanobiotechnol. 5:69-78; Shervani Z et al., (2011) Carbohydr Res. 346:651-658)이 보고되고 있다.
글리코시드는 당부와 비당부로 구성되어 있으며, 당부의 구조에 따라 글루코시드, 갈락토시드, 프락토시드, 글루코니드로 구분된다. 또한 글리코시드 결합의 종류에 따라, N, C, O, S의 글리코시드로 구분될 수 있다.
제 2상 대사과정 중 하나인, 글리코시드 결합 생성을 통해 글루코니드로 화합물을 변형하는 글루코니드화는 체내 독성물질 배출 기전(King CD et al., (2000) Curr Drug Metab. 1:143-161)으로 잘 알려져 있을 만큼, 글리코시드는 다른 물질보다 체내 적용 시 독성에 대한 염려가 적으며, 이 밖에도 대부분의 글리코시드는 수용성이므로, 수용액 상태에서의 금 나노입자 합성에 적용 가능한 장점이 있다.
그러나 현재까지 다양한 당류를 이용한 금 나노입자 합성이 보고되고 있지만, 글리코시드를 이용한 직접적인 금 나노입자 합성에 대해서는 보고된 바 없다.
한국공개특허 제2013-0043462호
본 발명은 글리코시드-금 나노 복합체와, 이를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물 또는 피부질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 글리코시드 화합물, 약학적으로 허용 가능한 염 및 금(Au)을 포함하는 글리코시드-금 나노 복합체를 제공한다:
[화학식 I]
Figure pat00001
상기 화학식 I에서,
R1은 수소, 퓨란, 이미다졸, 페닐, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 벤질 및 탄소수가 1 내지 5인 알킬로 이루어진 군에서 선택되거나,
R1은
Figure pat00002
이며, R3 내지 R7은 각각 독립적으로 수소, 나이트로, 할로겐, 시안, 히드록시, 디메틸아미노, 메틸설포닐아미드, 트리플루오르메틸, 탄소수가 1 내지 3인 알킬, 탄소수가 1 내지 3인 알콕시, 비닐, 아릴, 페녹시, 및 벤족시로 이루어진 군에서 선택되며;
R2는 CH2OH 또는 COOH 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 금염 용액을 준비하는 단계(제1단계); 및 화학식 I의 글리코시드와 약학적으로 허용 가능한 염을 용해시킨 용액을 상기 금염 용액에 첨가하는 단계(제2단계)를 포함하는, 글리코시드-금 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 금염 용액을 준비하는 단계(제1단계); 화학식 I의 글리코시드와 약학적으로 허용 가능한 염을 용해시킨 용액을 상기 금염 용액에 첨가하는 단계(제2단계); 및 원심분리 후 상층액을 제거하고, 화학식 I의 글리코시드를 재차 첨가하는 단계(제3단계)를 포함하는, 글리코시드-금 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 글리코시드-금 나노 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 글리코시드-금 나노 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 글리코시드, 약학적으로 허용 가능한 염 및 금(Au)을 이용하여 글리코시드-금 나노 복합체를 안전하면서도 손쉽게 제조할 수 있으며, 상기 제조된 글리코시드-금 나노 복합체는 멜라닌 생성 억제와 티로시네이즈 억제 활성을 포함한 미백효과 및 항염효과를 나타내며, 이는 티로시네이즈의 억제제로 널리 알려진 알부틴과 비교하여 동등 또는 그 이상의 미백활성 및 항염증 활성을 나타내므로, 글리코시드-금 나노 복합체는 피부 미백용 화장료 조성물, 피부 질환 치료 또는 예방용 약제나 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 글리코시드-금 나노 복합체 제조공정을 도시한 것이다.
도 2는 반응식 1과 반응식 2에 따라 합성된, 본 발명의 일실시예에 따른 글리코시드-금 나노 복합체의 광학 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 글리코시드-금 나노 복합체 중 GNPs 9 내지 14의 고효율 투과전자현미경 사진과 크기 통계를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 글리코시드-금 나노 복합체 중 GNPs 11의 13C-NMR 핵자기공명 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 제브라피쉬를 이용한 본 발명의 글리코시드-금 나노 복합체의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 흑색종 세포를 이용한 본 발명의 글리코시드-금 나노 복합체의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 글리코시드-금 나노 복합체의 인비보 버섯형 티로시네이즈 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 글리코시드-금 나노 복합체의 항염증 활성을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은, 기존에 알려진 피부미백 및 항염증 화학식 I의 글리코시드 화합물과 약학적으로 이용 가능한 염을 이용하여 얻은 글리코시드-금 나노 복합체가 피부미백 및 항염증 활성을 지닌다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성한 것이다.
이에, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 글리코시드 화합물, 약학적으로 허용 가능한 염 및 금(Au)을 포함하는 글리코시드-금 나노 복합체를 제공한다:
[화학식 I]
Figure pat00003
상기 화학식 I에서,
R1은 수소, 퓨란, 이미다졸, 페닐, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 벤질 및 탄소수가 1 내지 5인 알킬로 이루어진 군에서 선택되거나,
R1은
Figure pat00004
이며, R3 내지 R7은 각각 독립적으로 수소, 나이트로, 할로겐, 시안, 히드록시, 디메틸아미노, 메틸설포닐아미드, 트리플루오르메틸, 탄소수가 1 내지 3인 알킬, 탄소수가 1 내지 3인 알콕시, 비닐, 아릴, 페녹시, 및 벤족시로 이루어진 군에서 선택되며;
R2는 CH2OH 또는 COOH 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체는 용매인 물 1.0 mL 에 대하여, 화학식 I로 표시되는 글리코시드 화합물 0.1 mM 내지 50 mM 농도, 약학적으로 허용 가능한 염 1.0 mM 내지 10 mM 농도 및 금(Au) 0.1 mM 내지 2.0 mM 농도를 포함할 수 있다.
이때, 상기 글리코시드 화합물은 산화 금 (예: Au3+)를 Au0으로 환원시키는 환원제 역할을 수행하며, 상기 함량 범위를 벗어나면 콜로이드 상태의 금 나노입자가 전혀 형성되지 않거나 금염이 침전되는 문제가 야기될 수 있다.
그리고, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 수용액의 pH를 조절하는 역할을 수행하며, 상기 함량 범위를 벗어나면 콜로이드 상태의 금 나노입자가 전혀 형성되지 않거나 금염이 침전되는 문제가 야기될 수 있다.
또한, 상기 금(Au)은 산화 금 (예: Au3+)에서 Au0으로 환원되면서 나노입자를 형성하는 핵(seed) 원소로서의 역할을 수행하며, 상기 함량 범위를 벗어나면 콜로이드 상태의 금 나노입자가 전혀 형성되지 않거나 금염이 침전되는 문제가 야기될 수 있다.
본 발명에 기술된 "알킬"은 단일결합의 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소기를 말하며, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, tert-부틸, 1-메틸프로필, 1,1-디메틸에틸, 펜틸, 헥실 등일 수 있다.
본 발명에 기술된 "알콕시"는 단일결합의 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소가 결합된 산소기를 말하며, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, n-부톡시, tert-부톡시, 1-메틸프로폭시 등일 수 있다.
본 발명에 기술된 "아릴"은 방향족의 불포화 탄화수소를 말하며, 예를 들어 페닐, 나프틸 등일 수 있다.
본 발명에 기술된 "약학적으로 허용 가능한 염"은 나트륨, 칼륨 및 암모늄으로 이루어진 군에서 선택된 양이온 염; 또는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1, 4-디오에이트, 헥산-1, 6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 아스코베이트 및 만델레이트로 이루어진 군에서 선택된 음이온 염에서 선택되는 인체에 무독한 염일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 글리코시드-금 나노 복합체는 수용액 상태의 HAuCl4에 화학식 I의 글리코시드와 약학적으로 허용 가능한 염을 물에 녹인 용액을 첨가함으로써 HAuCl4의 환원을 통해 얻어지는 1-200 nm 크기의 금 나노입자를 포함한 글리코시드-금 나노 복합체일 수 있다.
본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체를 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:
1) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (1 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 1),
2) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 2),
3) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (40 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 3),
4) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM)을 첨가하여 40℃에서 합성한 복합체 (GNPs 4),
5) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM)을 첨가하여 60℃에서 합성한 복합체 (GNPs 5),
6) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM)을 첨가하여 80℃에서 합성한 복합체 (GNPs 6),
7) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (1.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 7),
8) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), Sodium ascorbate (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (5 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 8),
9) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (5 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 9),
10) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (0.1 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 10),
11) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (페닐 베타-D-글루코시드: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = Ph) (4 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 11),
12) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (메틸 베타-D-글루코시드: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = Me) (5 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 12),
13) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글루쿠론산 (당 = D-글루쿠론산, R = H) (5 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 복합체 (GNPs 13),
14) 물 최종 부피 1 mL에 대한 HAuCl4 (0.5 mM), NaOH (7 mM), 글리코시드 (페닐 베타-D-글루코시드: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = Ph) (4 mM)을 첨가하여 실온에서 합성한 뒤 원심분리 후 상층액을 제거하고 글리코시드 (알부틴: 당 = D-글루코즈, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (4 mM)의 첨가를 통해 최초 글리코시드를 치환한 복합체 (GNPs 14).
본 발명에 기술된 "아노머"는 환 구조의 D 입체이성질체 당의 C1 위치에서 하나의 원자 또는 원자단의 공간 배치가 다른 원자 또는 원자단의 공간 배치와 달라서 생기는 알파 또는 베타 이성질체를 말한다.
본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체의 광학 사진을 도 2에 나타내었으며, 이 중 대표적으로 GNPs 9 내지 14의 고효율 투과전자현미경 (high-resolution transmission electron microscopy, HRTEM) 사진 및 금 나노입자의 크기 통계를 도 3에 나타내었다.
일실시예에 따르면, 상기 글리코시드-금 나노 복합체는 금염 용액을 준비하는 단계(제1단계); 및 화학식 I의 글리코시드와 약학적으로 허용 가능한 염을 용해시킨 용액을 상기 금염 용액에 첨가하는 단계(제2단계)를 거쳐 제조될 수 있다. 그러나, 이는 단지 예시를 들기 위한 것으로서, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 금염은 사염화금산(HAuCl4), 염화금(AuCl) 및 수산화제2금(Au(OH)3)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 제1단계에서는 물에 금염을 용해시켜 금염 용액을 준비할 수 있으며, 상기 제2단계에서는 용매인 물 1.0 mL 에 대하여, 화학식 I로 표시되는 글리코시드 화합물 0.1 내지 50 mM 농도, 약학적으로 허용 가능한 염 1.0 내지 10 mM 농도 및 금(Au) 0.1 내지 2.0 mM 농도로 첨가할 수 있다. 이때 반응온도는 0 내지 30℃이며, pH는 3 내지 12인 것이 바람직하다.
[반응식1]
Figure pat00005
먼저, 상기 반응식 1과 같이, 글리코시드-금 나노 복합체는 빈 바이알에 최종 1 mL의 부피를 맞추기 위한 물 (0.01-0.5 mL)의 첨가, 최초 농도 5 mM의 HAuCl4 수용액 (0.01-0.5 mL)의 첨가, 최초 농도 100 mM의 NaOH 수용액 (0.001-0.5 mL)의 첨가, 최초 농도 100 mM의 화학식 I의 글리코시드 수용액 (0.001-0.5 mL)의 첨가의 4단계로 이루어져 있다. 4단계의 첨가 이후 수분 사이에 금 나노입자의 특징적인 옅은 분홍-적포도주색-보라색 변화가 관찰되며, 금 나노입자가 갖는 특징적인 현상인 540-600 nm 파장의 빛을 흡광하는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonances, SPRs)을 UV/Vis측정을 통해 확인할 수 있다. 이때, 화합물에 따라 반응식 1 중 순차적으로 4단계 반응에 의하여 제조될 수도 있고, 반응 순서가 뒤바뀌어서도 제조될 수도 있다.
또한, 다른 일실시예에 따르면, 상기 글리코시드-금 나노 복합체는 반응식 1에서 합성이 완료된 뒤 원심분리 후 다른 종류의 화학식 I에 해당하는 글리코시드를 첨가하여 처음 사용한 글리코시드를 치환하는 방식으로 제조할 수 있다.
상기 원심분리는 10,000 내지 15,000 rpm에서 20 내지 30 분 동안 수행하는 것이 바람직하다.
[반응식 2]
Figure pat00006
즉, 상기 반응식 2와 같이 글리코시드-금 나노 복합체는 반응식 1과 동일한 단계를 거치는 단계 1과, 단계 1에서 제조된 글리코시드-금 나노 복합체를 15,000 rpm에서 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 수용액 상의 또 다른 화학식 I에 해당하는 글리코시드를 첨가함으로써 글리코시드의 치환을 통해 제조할 수 있다.
반응식 1로부터 합성된 대표적인 글리코시드-금 나노 복합체는 GNPs 1 내지 13로 표기하였으며 반응식 2로부터 합성된 대표적인 글리코시드-금 나노 복합체는 GNPs 14로 표기하였다.
또한, 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체는 피부의 침착성 색소인 멜라닌의 생성을 억제하고 노화의 주원인 물질인 활성산소의 발생을 억제하며, 티로시네이즈 활성을 억제하므로, 본 발명은 글리코시드-금 나노 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 화장료 조성물, 약학조성물 또는 건강식품의 형태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체는 일산화질소(NO)의 생성을 억제하고 활성산소의 생성을 억제함으로써 항염증 및 항산화 효과를 지니므로, 본 발명은 글리코시드-금 나노 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 화장료 조성물, 약학조성물 또는 건강식품의 형태로 제공될 수 있다.
특히, 상기 피부질환으로는 피부염증, 피부노화, 피부색소침착증, 주름, 건선 및 습진으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 기술된 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 조성물이 증상 발생 전이나 초기에 투여할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 기술된 "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 관련 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하며, 치료는 완화 또는 개선을 포함한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한 의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 약학조성물은 유효성분 이외에 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 이때, "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 바람직한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 약학조성물 중 글리코시드-금 나노 복합체는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001∼10 중량%, 바람직하게는 0.001∼1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 약학조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로, 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 글리코시드-금 나노 복합체를 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질과 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 상기 글리코시드-금 나노 복합체를 1일 0.001∼100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01∼30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등의 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체는 일산화질소(NO)의 생성을 억제하고 활성산소의 생성을 억제함으로써 항염증 및 항산화 효과를 지니므로, 본 발명은 글리코시드-금 나노 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 화장료 조성물, 약학조성물 또는 건강식품의 형태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체를 함유하는 조성물, 특히 피부미백용 조성물은 특히 화장료 조성물로서 제공될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 유효성분인 글리코시드-금 나노 복합체 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체를 함유하는 조성물은 특히 건강식품으로서 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 유효성분인 글리코시드-금 나노 복합체 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<참조예 1> 실험 준비 및 기기
1. 분석 및 실험기기
본 실험에서 얻은 생성물의 구조 확인을 위해 사용된 기기는 하기와 같다. 금 나노입자의 전형적인 흡광 파장인 Surface plasmon resonances(SPRs)은 UV-1800, SHIMADZU UV 분광분석기를 이용하여 측정하였다. 합성된 글리코시드-금 나노 복합체에서 유기물질의 구조는 D2O를 용매로 하여 핵자기공명법(13C-NMR)을 이용하여 분석하였으며, VNMRS500 [125MHz (13C)] 기기를 사용하였다.
글리코시드-금 나노 복합체의 pH를 측정하기 위해서 Sevencompact pH/Ion S220, Mettler Toled를 사용하였다. 글리코시드-금 나노 복합체의 합성 수율을 얻기 위해 유도결합 플라스마 질량분석기(ICP-MS)를 이용하여 수용액 상의 Au 질량을 ppb 단위로 분석하였으며, ELAN6100, Perkin Elmer 기기를 사용하였다. 금 나노 입자의 형태와 크기를 관측하기 위해서 고효율 투과전자현미경 (HRTEM)을 측정하였으며, JEM-3010, JEOL 기기를 사용하였다.
또한, 원심분리기는 centrifuge 5424R/eppendorf를 사용하였다.
2. 사용 시약
본 실험에서 사용된 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 란캐스터(Lancaster), 플루카(Fluka), 티씨아이(TCI) 제품을 구입하여 사용하였으며, 반응에 사용된 용매는 Milli-Q Direct 8 (ZRO), Millipore Co. 제품으로 탈 이온화한 물을 사용하였다. HRTEM 사진을 얻기 위해서 샘플을 로딩한 copper grid는 01813-F 300 mesh copper grids, TED PELLA, Inc. 제품을 사용하였다.
<실시예 1> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 1) 제조
상업적으로 이용 가능한 사염화금산(HAuCl4) 19.8 mg을 탈 이온수 10 mL에 녹여 5 mM 농도의 스탁 용액을 제조하였다. NaOH 1599.6 mg을 탈 이온수 40 mL에 녹여 1 M 농도로 제조하였고, 이 중 2 mL을 취하여 탈 이온수 18 mL에 가하여 10배 희석하여 최종 100 mM의 농도로 스탁 용액을 제조하였다. 알부틴 1088.8 mg을 탈 이온수 40 mL에 녹여 100 mM 농도의 스탁 용액을 제조하였다.
상기 반응식 1에 따라 실온에서 빈 4 mL 용량의 바이알에 탈 이온수 0.39 mL을 가하고, 사염화금산(HAuCl4) 스탁 용액으로부터 0.1 mL을 취하여 첨가하였다. 여기에 NaOH 스탁 용액으로부터 0.01 mL을 취하여 가하고, 마지막으로 알부틴 스탁 용액으로부터 0.5 mL을 취하여 첨가하였다.
알부틴의 첨가와 동시에 즉시 반응이 일어나 무색의 용액이 보라색으로 색 변화가 일어나며 GNPs 1이 생성되었다. GNPs 1의 구성 물질 별 최종 농도는 HAuCl4(0.5 mM), NaOH(1 mM), 글리코시드(알부틴: sugar = D-glucose, 베타 아노머, R = 4-OH-Ph) (50 mM) 농도이었다.
UV/Vis spectra: λmax = 530 nm, absorbance = 1.36; pH: 3.30.
<실시예 2> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 2) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 50 mM 농도로 제조하여 GNPs 2를 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 552 nm, absorbance = 1.77; pH: 8.85.
<실시예 3> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 3) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 40 mM, 50 mM 농도로 제조하여 GNPs 3을 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 554 nm, absorbance = 1.63; pH:10.18.
<실시예 4> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 4) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 40℃에서 반응하여 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 50 mM 농도로 제조하여 GNPs 4를 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 508 nm, absorbance = 0.16; pH:8.86.
<실시예 5> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 5) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 60℃에서 반응하여 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 50 mM 농도로 제조하여 GNPs 5를 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 506 nm, absorbance = 0.19; pH: 8.86.
<실시예 6> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 6) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 80℃에서 반응하여 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 50 mM 농도로 제조하여 GNPs 6을 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 500 nm, absorbance = 0.25; pH: 8.86.
<실시예 7> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 7) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 1.5 mM, 7 mM, 50 mM 농도로 제조하여 GNPs 7을 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 534 nm, absorbance = 2.71; pH: 6.18.
<실시예 8> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 8) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, 소듐 아스코르베이트, 알부틴을 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 1.5 mM, 7 mM, 50 mM 농도로 제조하여 GNPs 8을 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 545 nm, absorbance = 2.054; pH: 4.99.
<실시예 9> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 9) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 5 mM 농도로 제조하여 GNPs 9 (98.6% 수율)를 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 544 nm, absorbance = 1.917; pH: 10.45.
<실시예 10> 알부틴을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 10) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 알부틴을 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 0.1 mM 농도로 제조하여 GNPs 10 (62.7% 수율)을 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 537 nm, absorbance = 0.595; pH: 11.46.
<실시예 11> 페닐 β-D 글루코시드를 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 11) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, AuCl4, NaOH, 페닐 β-D-글루코시드(sugar = D-glucose, 베타 아노머, R = Ph)를 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 4 mM 농도로 제조하여 GNPs 11 (99.7% 수율)을 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 547 nm, absorbance = 1.721; pH: 11.49.
<실시예 12> 메틸 β-D 글루코시드를 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 12) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 메틸 β-D-글루코시드를 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 7 mM, 5 mM 농도로 제조하여 GNPs 12 (99.4% 수율)를 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 541 nm, absorbance = 1.617; pH: 11.50.
<실시예 13> 글루쿠론산을 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 13) 제조
앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, HAuCl4, NaOH, 글루쿠론산을 사용하여 실온에서 물 최종 부피 1 mL에 대해 각각 0.5 mM, 14 mM, 5 mM 농도로 제조하여 GNPs 13을 얻었다.
UV/Vis spectra: λmax = 526 nm, absorbance = 1.796; pH: 11.47
<실시예 14> 페닐 β-D 글루코시드를 이용한 글리코시드-금 나노 복합체(GNPs 14) 제조
상기 반응식 2에 따라 단계 1을 통해 만들어지는 실시예 GNPs 11을 단계 2에 따라 원심분리 (15,000 rpm) 후 상층액을 제거하고, 수용액 상의 알부틴을 최종 농도 4 mM이 되도록 첨가하여 총 1mL의 GNPs 14를 합성하였다.
UV/Vis spectra: λmax = 527 nm, absorbance = 1.344; pH: 8.18.
<실험예 1> 글루코시드-금 나노 복합체의 멜라닌 생성 억제 효과
상기 실시예 1 내지 14에서 얻은 시료에 대하여 멜라닌 생성 억제 효과를 검증하기 위하여, 발달 과정 중에 멜라닌의 침착이 일어나는 제브라피쉬(Danio rerio)를 이용하였다.
성체 제브라피쉬는 아크릴 컨테이너에서 28℃, 14h/10h 광주기를 유지하면서 키웠고 배아는 자연 교배를 통해 얻었다. 상기 실시예 1 내지 14에서 얻은 시료를 수정 후 9시간 된 제브라피쉬 배아에 처리하여 수정 후 48시간이 되면 반응을 종결하였다. 반응이 끝난 제브라피쉬 유생을 stereomicroscope에서 디지털카메라로 촬영하였다.
색소의 침착 정도에 따라 점수를 부여하는데, 색소가 전혀 생기지 않은 군을 3점, 색소가 정상적으로 다 발생한 군을 0점으로 하여 0에서 3점까지 정수로 표시하였다. 이때 멜라닌의 생성을 억제하는 양성대조군으로 티로시네이즈의 억제제인 1-페닐-2-티오우레아 (PTU)를 사용하였다.
그 결과, 도 5와 같이 양성대조군인 PTU 처리군에서는 멜라닌 생성이 완전히 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예에 따른 시료를 처리한 시험군에서는 멜라닌의 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었고, 특히 GNPs2, GNPs8, GNPs14에서 알부틴과 동등하거나 우수한 저해효과를 나타내었다.
<실험예 2> 흑색종 세포에서의 글리코시드-금 나노 복합체의 멜라닌 생성 억제 효과
마우스 흑색종 B16F10 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES 완충액, 100 U/mL 페니실린 G, 100 mg/mL 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에 배양시키고, 5% CO2와 37℃의 습윤 환경에서 배양하였다. 세포 외 멜라닌 생성 실험에는 페놀레드(phenol red)가 들어있지 않은 배지를 사용하였다. 멜라닌 생성의 유도물질로100 μM의 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)을 처리하였다.
24 well plate에 각 well당 세포를 1x105 개씩 분주하였고 24시간 동안 배양하였다. 각 시료를 2 mM로 처리하였고 1시간 후 IBMX를 처리한 후 48시간 동안 더 배양하였다. 세포외 멜라닌의 함량은 Sunrise Microplate Reader를 이용하여 415 nm에서 분광광도계로 샘플링한 세포배양 배지로부터 직접 측정하였다.
세포 내 멜라닌 측정을 위하여, 부착 세포(B16F0 흑색종 세포)를 PBS로 세정하고 트립신 처리하여 분리한 후 배양배지에서 재현탁시켰다. 세포 현탁액 50 ㎕를 이용하여 현미경 하에서 혈구계수기를 이용하여 세포수를 카운팅하였다. 다른 세포 현탁액은 원심분리한 후, 1M NaOH에서 재현탁하고 80℃에서 30분 동안 배양한 후, 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였고, 이렇게 준비된 상등액의 흡광도를 415 nm에서 측정하였다. 멜라닌 함량은 세포 총 수로 노멀라이즈 하였으며 1x104 세포(㎍/104 cells) 당 마이크로그램으로 나타내었다.
그 결과, 도 6과 같이 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체 처리에 의해IBMX에 의해 유발된 세포 내 또는 세포 외 멜라닌이 감소됨을 확인하였다. 감소한 정도를 비교하였을 때 대조군인 알부틴과 동등하거나 유사한 활성을 보였다.
<실험예 3> 글리코시드-금 나노 복합체의 인비보 버섯형 티로시네이즈 억제 효과
기질로서 다양한 L-티로신 농도를 이용하였으며, 버섯형 티로시네이즈(EC 1.14.18.1) (2,100 U/ml) 및 0.1M 인산 완충액(pH 6.5)를 첨가하였고, 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체 처리하거나 처리하지 않고 총 부피 200 ㎕의 분석 혼합물을 96웰 플레이트 상에 준비하였다. 이러한 분석 혼합물에서 형성된 도파크롬(dopachrome)은 마이크로플레이트 리더(Sunrise, Tecan Instrument Inc., Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 490 nm의 파장에서 흡광도의 증가로서 측정하였다.
그 결과, 도 7과 같이 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체 처리에 의해 티로시네이즈 활성이 감소함을 확인하였다. 이때, 글리코시드-금 나노 복합체 처리에 의한 티로시네이즈 활성의 감소는 대조군인 알부틴과 동등하거나 유사한 억제 활성을 나타내었다.
<실험예 4> 글루코시드-금 나노 복합체의 항염증 효과
상기 실시예 1 내지 14에서 얻은 시료에 대하여 마우스 대식세포(murine macrophage cell line RAW264.7)로부터의 LPS 자극에 의한 NO의 형성억제 효과를 확인해 보았다.
RAW264.7 세포는 한국유전자은행(Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 100 units/㎖ 페니시린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4 일에 한번씩 시행하였다. 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS. E. coli serotype 0111:B4)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다. RAW264.7 세포를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0 x 105 cells/㎖로 조절한 후 48 well plate에 접종하고, 시험물질과 LPS(1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다.
생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 N2O 의 형태로 측정하였다. 즉, 세포배양 상등액 100㎕와 Griess시약 [1% (w/v) 설파닐아마이드, 0.1%(w/v) 나프틸에틸렌디아민 in 2.5% (v/v) 인산] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 소듐 나이트리트(NaNO2)를 표준으로 비교하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 도 8과 같이 본 발명의 시료들을 동시에 처리한 시험구에서는 NO 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었고, 특히 GNPs2, GNPs8, GNPs9, GNPs14는 알부틴과 동등하거나 우수한 NO 생성 저해효과를 나타내었다.
한편, 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기에서는 본 발명에 따른 글리코시드-금 나노 복합체를 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<제제예 1> 약학조성물의 처방예
<제제예 1-1> 산제의 제조
글리코시드-금 나노 복합체 2 g과 유당 1 g을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<제제예 1-2> 정제의 제조
글리코시드-금 나노 복합체 100 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<제제예 1-3> 캅셀제의 제조
글리코시드-금 나노 복합체 100 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제제예 1-4> 주사제의 제조
글리코시드-금 나노 복합체 100 mg, 만니톨 180 mg, Na2HPO4ㆍ2H2O 26 mg 및 주사용 멸균 증류수 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
<제제예 1-5> 연고제의 제조
글리코시드-금 나노 복합체 100mg, PEG-4000 250mg, PEG-400 650mg, 백색바셀린 10mg, 파라옥시안식향산메칠 1.44mg, 파라옥시안식향산프로필 0.18mg 및 잔량의 정제수를 혼합한 후 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.
<제제예 2> 화장료 조성물의 제제예
<제제예 2-1> 영양 로션의 제조
프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 글리코시드-금 나노 복합체를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
<제제예 2-2> 영양 크림의 제조
카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부 및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 글리코시드-금 나노 복합체를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
<제제예 2-3> 워시폼의 제조
TEA-코코일 글루타메이트 30.0 중량부, 디소듐 라우레스 설포숙시네이트글리세린 10.0 중량부, 글리세린 10.0 중량부, 코카마이드 DEA 2.0 중량부, PEG-120 메칠글루코오스 디올리에이트 1.0 중량부, 메칠글루세스-20 0.5 중량부, PEG-150 펜타에리트리틸 테트라 스테아레이트 0.5 중량부, 테트라소듐 EDTA 0.05 중량부 및 방부제 미량을 순차적으로 제조부에 투입하고 60 내지 65℃로 가열한 후 15분 동안 교반하였다. 교반이 끝나면 정제수의 일부를 투입하여 30분 동안 교분한 후, 다시 정제수의 일부를 천천히 투입하고 30분 동안 교반한 후 35℃까지 냉각하고, 글리코시드-금 나노 복합체와 향료를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
<제제예 3> 건강보조식품
<제제예 3-1> 건강식품의 제조
글리코시드-금 나노 복합체 10 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.
<제제예 3-2> 건강음료의 제조
글리코시드-금 나노 복합체 10 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 편입된다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 글리코시드 화합물, 약학적으로 허용 가능한 염 및 금(Au)을 포함하는 글리코시드-금 나노 복합체:
    [화학식 I]
    Figure pat00007

    상기 화학식 I에서,
    R1은 수소, 퓨란, 이미다졸, 페닐, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 벤질 및 탄소수가 1 내지 5인 알킬로 이루어진 군에서 선택되거나,
    R1은
    Figure pat00008
    이며, R3 내지 R7은 각각 독립적으로 수소, 나이트로, 할로겐, 시안, 히드록시, 디메틸아미노, 메틸설포닐아미드, 트리플루오르메틸, 탄소수가 1 내지 3인 알킬, 탄소수가 1 내지 3인 알콕시, 비닐, 아릴, 페녹시, 및 벤족시로 이루어진 군에서 선택되며;
    R2는 CH2OH 또는 COOH 중에서 선택됨.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 글리코시드-금 나노 복합체는 용매 1.0 mL 에 대하여, 화학식 I로 표시되는 글리코시드 화합물 0.1 mM 내지 50 mM, 약학적으로 허용 가능한 염 1.0 mM 내지 10 mM 및 금(Au) 0.1 mM 내지 2.0 mM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 글리코시드-금 나노 복합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨, 칼륨 및 암모늄으로 이루어진 군에서 선택된 양이온 염; 또는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1, 4-디오에이트, 헥산-1, 6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 아스코베이트 및 만델레이트로 이루어진 군에서 선택된 음이온 염에서 선택된 것을 특징으로 하는 글리코시드-금 나노 복합체.
  4. 금염 용액을 준비하는 단계(제1단계); 및
    화학식 I의 글리코시드 화합물과 약학적으로 허용 가능한 염을 용해시킨 용액을 상기 금염 용액에 첨가하는 단계(제2단계)
    를 포함하는, 글리코시드-금 나노 복합체의 제조방법:
    [화학식 I]
    Figure pat00009

    상기 화학식 I에서,
    R1은 수소, 퓨란, 이미다졸, 페닐, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 벤질 및 탄소수가 1 내지 5인 알킬로 이루어진 군에서 선택되거나,
    R1은
    Figure pat00010
    이며, R3 내지 R7은 각각 독립적으로 수소, 나이트로, 할로겐, 시안, 히드록시, 디메틸아미노, 메틸설포닐아미드, 트리플루오르메틸, 탄소수가 1 내지 3인 알킬, 탄소수가 1 내지 3인 알콕시, 비닐, 아릴, 페녹시, 및 벤족시로 이루어진 군에서 선택되며;
    R2는 CH2OH 또는 COOH 중에서 선택됨.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 제조방법은 제2단계 후 원심분리 후 상층액을 제거하고, 화학식 I의 글리코시드를 재차 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 글리코시드-금 나노 복합체의 제조방법.
  6. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서, 상기 금염은 사염화금산(HAuCl4), 염화금(AuCl) 및 수산화제2금(Au(OH)3)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 글리코시드-금 나노 복합체의 제조방법.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 글리코시드-금 나노 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물.
  8. 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 글리코시드-금 나노 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환 치료 또는 예방용 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 피부질환은 피부염증, 피부노화, 피부색소침착증, 주름, 건선 및 습진으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 피부질환 치료 또는 예방용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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