KR20150068713A

KR20150068713A - 정향의 효소처리 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 방지용 조성물

Info

Publication number: KR20150068713A
Application number: KR1020130154703A
Authority: KR
Inventors: 권진혁; 윤만석; 임재연; 김국환; 이재경; 김태종
Original assignee: (주) 뉴트리바이오텍
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2015-06-22

Abstract

본 발명은 정향 용매추출물을 가수분해처리한 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 정향의 용매추출물에 가수분해 효소를 처리한 정향추출물의 제조방법 및 상기 방법을 이용하여 추출된 정향추출물을 함유하는 병원성 균주의 바이오필름 형성 방지용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 정향추출물을 함유하는 조성물은 Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Streptococcus mutans 또는 Aeromonas hydrophila의 바이오필름의 형성을 억제하여 벼의 흰잎마른병의 방제 및 식중독, 치아우식증 또는 장염의 예방 및 치료에 효과적이다.

Description

정향의 효소처리 추출물을 함유하는 바이오필름 형성 방지용 조성물{Composition for Preveting Biofilm Formation Containing Enzyme Treated Extract of Clove}

본 발명은 정향 용매추출물을 가수분해처리한 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 정향의 용매추출물에 가수분해 효소를 처리한 정향추출물의 제조방법 및 상기 방법을 이용하여 추출된 정향추출물을 함유하는 병원성 균주의 바이오필름 형성 방지용 조성물에 관한 것이다.

바이오필름(biofilm)은 미생물에 의하여 형성된 막 모양 구조체이며, 표면에 연결된 미생물 세포층으로 이루어진 잘 구성된 미생물계로 복잡한 구조적 기능적 특징을 가지고 있다. 생체막은 미생물의 대사 과정에 영향을 주는 물리 화학적 구배를 갖는다. 바이오필름을 형성하는 세포는 부유세포보다 항생제에 대한 저향성이 1000배 이상 높으며, 바이오필름 형성은 여러 질병의 발병(pathogenesis)에 중요한 역할을 한다. (Rasmussen and Givskov 2006).

바이오필름의 형성 억제효과는 미생물의 생육, 증식을 억제하거나 사멸시키는 효과와는 무관하게 고체 표면에 들러붙는 혼합체의 형성을 저해하는 효과를 의미한다. 특히, Streptococcus mutans와 같은 구강 미생물은 구강 내의 침에 의해 미생물이 씻겨 없어질 수 있기 때문에 바이오필름을 형성하여 씻겨 나가지 않도록하는 작용을 하고 있다. 이러한 구강 미생물은 바이오필름의 형성 없이는 미생물이 구강 내에 머무를 수 없다. 따라서 구강 미생물을 제거하기 위한 방법으로 양치질과 같은 물리적 제거 방법과 바이오필름의 형성을 억제하는 물질을 이용하여 미생물을 제거하는 방법을 사용할 수 있다.

한편, 장 출혈성 병원성 대장균은 식품의 오염이나 출혈성 대장염 즉, 용혈성 요독증후군를 이끌 수 있는 혈변으로 인해 장관 내에 침투하는 인체 병원균이다. 최근 들어, 이들 병원균이 일반 부유상태가 아닌 표면에 부착하여 생존할 수 있다는 것이 알려지게 되었다. 따라서 잠재적인 병원균에 의해 생성되는 바이오필름 (biofilm)은 고질적이고 재발되는 감염의 중요한 원인으로 생각되며, 특히 의료 장비의 표면이나 인체 내부의 유치 장치에서도 바이오필름을 형성하고 견디는 능력 때문이라고 생각된다. 최근에 바이오필름에 관련된 조사가 늘어나고 있는 가운데, 대부분은 근본적인 바이오필름의 예방, 조절, 근절 등을 목적으로 하고 있다. 그동안 아주 소수의 연구만이 병원성 대장균 계통을 포함하여 E. coli 등에 의해 형성되는 바이오필름을 억제하는, 천연 물질을 밝히고 특성을 기술하였다. 해조류 Delisea pulchra 로부터 생성된 (5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-fu ranone과, 가봉의 흑단나무인 Diospyrosdendo로부터 생성되는 우르솔릭산 (ursolic acid, 3 베타-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 비병원성 대장균군에 의해 생성되는 그룹 캡슐모양의 다당류 등의 화합물이, 바이오필름의 형성을 유의적으로 억제하였다. 그러나 이 화합물들의 독성과, 물에 잘 녹지 않는 특성 때문에 식품 및 약학산업에의 이용에 한계가 있다.

또한, X. oryzae가 생산하는 바이오필름은 벼에 감염되었을 때, 도관의 통로를 막게 되고, 이를 통해 영양분의 전달이나 물의 전달이 원활하지 않아서 잎이 죽기 시작하여 벼가 죽거나 살아남더라도 쌀을 정상적으로 생산할 수 없게 되는 흰잎마름병을 일으키게 된다.

따라서, 인체에 독성이 없이 안정하고 세포의 성장을 저해하여 약제저항성을 나타내지 않으면서, 바이오필름 억제 효과가 뛰어난 새로운 천연물질의 개발이 시급하다.

이에, 본 발명자들은 인체에 독성이 없이 안정하고 세포의 성장을 저해하여 약제저항성을 나타내지 않으면서, 바이오필름 억제 효과가 뛰어난 천연물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 정향추출물이 벼 흰입마른병 원인균인 Xanthomonas oryzae와 장질환 원인균인 Yersinia enterocolitica 와 치아우식 원인균인 Streptococcus mutans와 식중독 원인균인 Aeromonas hydrophila의 바이오필름 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 미생물의 바이오필름 형성을 효과적으로 억제할 수 있는 천연물 유래 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 바이오필름 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 정향을 에탄올로 추출하여 정향 용매추출물을 수득하는 단계; (b) 상기 정향 용매추출물에서 용매를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 에탄올이 제거된 추출물을 가수분해효소로 처리하여, 효소처리된 정향추출물을 수득하는 단계.를 포함하는 정향추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되는 정향 용매추출물을 가수분해처리한 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 벼의 흰잎마른병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica 에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 치아우식예방용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 Aeromonas hydrophila 에 의해 발생하는 식중독 또는 장염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 정향추출물을 함유하는 조성물은 Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Streptococcus mutans 또는 Aeromonas hydrophila의 바이오필름의 형성을 억제하여 벼의 흰잎마른병의 방제 및 식중독, 치아우식증 또는 장염의 예방 및 치료에 효과적이다.

도 1은 본 발명에 따른 정향추출물의 효소처리방법을 나타낸 것이다.
도 2는 정향의 효소처리 추출물처리에 따른 Xanthomonas oryzae 의 바이오필름 형성방지 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 정향의 효소처리 추출물처리에 따른 Yersinia enterocolitica 의 바이오필름 형성방지 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 정향의 효소처리 추출물처리에 따른 Streptococcus mutans의 바이오필름 형성방지 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 정향의 효소처리 추출물처리에 따른 Aeromonas hydrophila의 바이오필름 형성방지 효과를 나타낸 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 (a) 정향을 에탄올로 추출하여 정향 용매추출물을 수득하는 단계; (b) 상기 정향 용매추출물에서 용매를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 에탄올이 제거된 추출물을 가수분해효소로 처리하여, 효소처리된 정향추출물을 수득하는 단계.를 포함하는 정향추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조되는 정향 용매추출물을 가수분해처리한 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 가수분해효소는 α-아밀라아제, β-글루코시다아제, 펙티나아제 및 펩티다아제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 미생물은 바이오필름을 형성하는 미생물이라면 모두 해당되나, 바람직하게는 Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Stereptococcus mutans, Aeromonas hydrophila 등이 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서, 용매는 정향의 바이오필름 형성억제 유효성분을 추출할 수 있는 용매라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 물, 에탄올, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 일 양태에서, 정향은 10~70% 에탄올로 추출한 후 농축 후 효소 처리하고 이를 다시 여과시켜 추출하는 것을 특징으로 하는 바이오 필름을 억제하는 정향 추출물의 제조하고 있다.

본 발명에 따라 효소처리된 정향 추출물은 효소처리되지 않은 에탄올 추출물보다 현저히 높은 바이오필름 형성 억제능을 나타내고 있다(표 4 참조).

본 발명의 일양태에 따른 정향 추출물의 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

제1단계: 에탄올 추출

정향에 10~70% 에탄올을 첨가한 다음 가열하여 에탄올 추출한다. 이때, 정향은 수확한 후 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사 용할 수 있다. 정향의 건조는 양건, 음건, 풍건조 및 자연건조 등의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시 키기 위해 정향 또는 그 건체를 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다. 바람직하게는, 정향의 건체를 10∼100mesh, 보 다 바람직하게는 20∼40mesh의 크기로 분쇄하여 사용한다.

에탄올 추출시의 정향과 물의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 정향 생체중 1g 에 대하여 액량을 3배∼20배(중량기준)로 첨가한다. 바람직하게는, 정향의 생체중 1g에 대하여 액량을 5배∼10배(중량기준)로 첨가한다.

에탄올 추출시의 추출온도는 50∼80℃, 바람직하게는 70∼80℃의 범위에서 수행한다, 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 1시간 내지 6시간, 바람직하게는 3시간 내지 4시간 추출한다. 또한, 추출시 교반기(shaker)로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.

제2단계: 에탄올 추출액의 여과 및 침전물 제거

상기 제1단계에서 제조한 에탄올 추출액을 침전물이 부유하지 않도록 충분히 냉각 한 다음 여과하여 침전물을 제거한다. 에탄올 추출액의 냉각은 40∼60℃, 바람직하게는 50∼55℃의 온도가 되도록 수행한다. 냉각한 에탄올 추출액의 여과는 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 멤브레인 필터 및 여과포를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 여과포를 이용하여 여과한다. 가장 바람직하게는 상기 냉각한 에탄올 추출액을 100mesh 여과포를 사용하여 여과한 후 다시 200mesh 여과포를 사용하여 여과하여 불용성 침전물을 제거한다.

제3단계: 에탄올 제거를 위한 농축 단계

상기 제2단계에서 제조한 에탄올 추출액의 에탄올을 제거 하기위하여 농축하여 에탄올을 제거한다.

다. 농축은 2~4배, 바람직하게는 1∼2 배 농축 되도록 수행한다. 농축된 추출물은 에탄올이 남아 있는지 확인하고 남아있지 않을때까지 농축한다.

제4단계: 효소 처리

정향 추출물의 제조시 정향에 포함된 플라보노이드 등의 불순물을 제거하기위하여 상기 제3단계의 여과액에 효소를 처리하여 플라보노이드 등이 물에 녹지 않도록 가수 분해 한다. 상기 효소로는 α-아밀라아제, β-글루코시다아제 및 펙티나아제를 사용할 수 있다.

효소 처리시에는 상기 농축액을 가온하여 효소반응에 적합한 온도가 되도록 한다. 농축액의 온도는 40∼60℃, 바람직하게는 52ㅁ3℃로 조정한다. 상기 온도를 조정한 농축액에 효소를 0.01∼1%(v/v), 바람직하게는 0.1∼0.5%(v/v)가 되도록 첨가한다. 상기 효소를 첨가한 농축액을 교반하면서 4∼24시간, 바람직하게는 12∼16시간 동안 가수분해 반응을 수행한다.

제5단계: 에탄올 첨가액의 원심분리 및 상등액 회수

상기 제4단계의 효소처리액을 원심분리하여 침전물은 폐기하고 바이오필름 억제 효과를 가지는 상등액을 회수한다. 상기에서 수득한 상등액은 농축 한 후 분무 건조하여 분말화할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 벼의 흰잎마른병 방제용 조성물을 제공한다.

Xanthomonas oryzae에 의해 발생되는 벼의 흰잎마름병은 쌀의 생산에 가장 많은 경제적 손실을 야기시키는 벼의 질병으로 세계적으로 광범위하게 발생한다. 질병을 일으키는 기작의 하나로 벼의 도관에 X. oryzae이 흡착하여 바이오 필름을 형성하여 도관의 통로를 막게 되고, 이를 통해 영양분의 전달이나 물의 전달이 원활하지 않아서 잎이 죽기 시작하여 벼가 죽거나 살아남더라도 쌀을 정상적으로 생산할 수 없게 된다. 따라서 X. oryzae의 바이오필름의 형성을 억제하면 벼 도관의 막힘 현상을 억제하여 X. oryzae가 감염되어도 벼가 정상적인 생육을 할 수 있으며 벼의 수확량을 정상적으로 유지할 수 있다.

본 발명의 일양태에서는 정향의 에탄올 추출물 및 효소처리 추출물을 X. oryzae의 배양액에 처리하는 경우, 효율적으로 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 정향추출물을 유효성분으로 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica 에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Y. enterocolitica는 장내세균과에 속하며 gastroenteritis (식중독, 장염)을 일으키는 Gram-negative균이다. 사람에서 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반 등 다양한 질병을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 이 균은 매우 넓은 범위의 온도에서 생육하며, 바이오 필름을 형성함으로써 외부의 자극이나 항생제 처리에 대해 저항을 지녀 관리가 어렵다.

본 발명의 일양태에서는 정향의 에탄올 추출물 및 효소처리 추출물을 Y. enterocolitica의 배양액에 처리하는 경우, 효율적으로 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 정향추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식예방용 조성물에 관한 것이다.

Stereptococcus mutans 등의 구강 미생물은 구강내의 침에 의해 미생물이 씻겨 없어질 수 있기 때문에 바이오필름을 형성하여 씻겨 나가는 현상을 극복하고 있다. 이러한 구강 미생물은 바이오필름의 형성 없이는 미생물이 구강 내에 머무를 수 없다. 따라서 구강 미생물을 제거하기 위한 방법으로 양치질과 같은 물리적 제거 방법과 biofilm의 형성을 억제하는 물질을 이용하여 미생물을 제거하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일양태에서는 정향의 에탄올추출물 및 효소처리 추출물을 Stereptococcus mutans 의 배양액에 처리하는 경우, 효율적으로 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 정향추출물을 유효성분으로 함유하는 Aeromonas hydrophila에 의해 발생하는 식중독 및 장염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

A. hydrophila는 통성 혐기성 Gram-negative 균으로 강, 하천, 연못 등의 담수에 분포되어 있으며 냉혈 및 온혈 동물에 정착화하여 질병을 발생하는 세균이다. 이 균은 식수원, 식료품, 육류 제품 등에서 여름철에 폭발적으로 증가하기 때문에 늦봄에서 초가을 사이에 감염률이 높으며 모든 연령층이 감염될 수 있으나, 주로 2세 이하에서 발병하며 정수하지 않은 물을 마신 후 급성 설사를 일으키는 경우가 많다.

본 발명의 일양태에서는 정향의 에탄올 추출물 및 효소처리 추출물을 A. hydrophila의 배양액에 처리하는 경우, 효율적으로 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 기능성 식품을 포함할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은, 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 바이오필름 형성 균주에 의해 발생하는 질병의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 조성물은 바이오필름 형성 억제효과를 필요로 하는 화장료 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 추가로 사용가능한 유용 물질에는 항산화제, 결합제, 벌크화제(bulking agent), 킬레이트제, 색소, 연화제, 에멀션 안정제, 막형성제, 충전재, 방향 성분, 젤화제, 두발 조절제, 헤어 고정제, 습윤제, 가소제, 보존제, 피부 조절제, 용매, 햇빛차단제, 계면활성제, 자외선 흡수제, 점도조절제, 왁스 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 미용상 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 물과 같은 수용액 또는극성 유기 용매, 에탄올과 같은 알콜 또는 그 밖의 극성 용매, 천연 또는 합성 오일; 수중유 에멀션; 유중수 에멀션; 또는 왁스 등이 될 수 있다. 상기 담체는 분명히 무독성이다. 본 발명 조성물의 양호한 담체는 수용액이다.

기능에 따라, 본 발명의 화장료 조성물은 용액(로션형 조성물), 농축 용액, 젤, 연고, 에멀션(크림, 유제), 소포 분산, 파우더, 조밀 파우더(dense powder), 페이스트 또는 고형제 등의 다양한 형태로 제공될 수 있다. 더 자세히 설명하자면, 본 발명의 화장품 조성물은 볼연지, 크림(안면 크림, 핸드 크림, 보습 크림, 햇빛 차단 크림), 크림 파우더, 아이 라이너, 아이 셰도우, 아이브로우 펜슬, 파운데이션, 로션, 마스카라, 마이크로에멀션, 연고, 포마드 및 루즈 등의 다양한 형태 내에서 분산될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이들은 거품 또는 스프레이의 형태로 적용할 수 있는 충진제를 포함한 압착 팩으로 포장될 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 천연 또는 인공 왁스가 함유될 수 있다. 천연 왁스에는 라놀린, 밀랍, 스퍼마세티(spermaceti) 또는 라놀린 알콜, 경화 또는 아세틸화 라놀린, 라놀린 지방산 또는 아세틸화 라놀린 알콜 등의 라놀린 유도체와 같은 동물성과 카나우바(carnauba), 칸델릴라(candelilla), 카폭(kapok), 쌀, 경화 호호바(jojoba), 알파(alfa) 또는 야판(yapan)왁스 또는 코르크(cork)섬유, 사탕수수 왁스, 코코아 버터 등의 식물성이 있다. 대안적으로, 무기 왁스에는 파라핀, 몬탄, 리그나이트, 페트로라툼, 페트로라툼 왁스 또는 미소결정화 왁스, 세레신, 또는 오조케라이트 등이 포함될 수 있다. 사용되는 합성 왁스의 예에는 피셔-트롭쉬 합성에 의해 얻은 폴리에틸렌 왁스 및 포화 C10-C40 카르복실산 및 포화 C10-C40 알콜의반응 산물인 미리스틸 미리스테이트와 같은 선형 에스테르가 포함된다. 사용되는 그 밖의 왁스에는 칼슘 라놀레이트 또는 스테아레이트 또는 경화 코코넛유 등이 포함된다.

상기 화장품 조성물에는 식물성 또는 동물성 오일의 개질 또는 비개질 오일이 포함될 수 있다. 예를 들어, 스위트 아몬드오일, 아보카도 오일, 캐스터 오일올리브 오일, 조조바 오일, 해바라기 오일, 밀눈 오일, 참깨 오일, 땅콩 오일, 포도씨 오일, 두유, 홍화 오일, 코코넛 오일, 메이즈 오일, 헤즐넛 오일, 카라이트 버터, 팜 오일, 살구씨 오일, 칼로필럼 오일 또는 퍼하이드로스쿠알렌 등이 있다. 더욱이, 오일 상은 액체 파라핀, 액체 페트로라툼 등과 같은 무기 오일일 수 있다. 상기 오일은 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 2-에틸헥실 팔미테이트, 페니실린 오일(스테아릴 옥토네이트)와 같은 지방산 에스테르, 올레, 팔미트, 스테아르, 베헨, 리놀레, 라놀레산과 같은 불포화 지방산 또는 C8-C16의 이소파라핀과 같은 휘발성 또는 비휘발성 이소파라핀 등일 수 있다.

더욱이, 상기 오일은 올레일 알콜, 세틸 알콜 및 스테아릴 알콜과 같은 C12-C18의 지방 알콜 등일 수 있다.

에멀션으로 제공된다면, 본 발명의 유화된 조성물은 오일 상 및 수성 상을 포함한다. 상기 오일 상은 조성물 총 중량에 대하여 약 1 내지 약 75 중량%의 범위로 제공되는 것이 좋으며, 더 좋기로는 약 5 내지 약 60 중량%, 가장 좋기로는 약 40 내지 약 60 중량%로 제공되는 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물에 사용된 담체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 의약조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

경구 및 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

의약조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.

본 발명의 의약조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.

본 발명의 의약조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

본 발명에 따른 의약조성물의 경구 투여는 목적하는 치료가 국소 적용으로 접근이 용이한 부위 또는 기관과 관련이 있을 때 특히 유용하다. 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 의약조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 다른 방도로서, 의약조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 의약조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 의약조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.

특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물을 어류의 피하세포에 투입할 경우 새낭 또는 소화관에 투여할 수 있다. 주사는 근육조직내의 근육세포 또는 다른 세포에 주사할 수 있으며 복강내의 내장세포에 주사할 수 있다.

바람직한 양태로서, 구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 세룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.

바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

이상과 같은 안정화제, 완충제 혹은 흡착방지제를 가하여 본 발명 제제를 조제할 수 있지만, 특히 의료용 또는 동물약용 주사제로서 이용하는 경우는 삼투압비로서 허용되는 삼투압비는 1 내지 2가 좋다. 삼투압비는 약제화시에 염화나트륨의 증감에 의해 조제할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 정향추출물의 제조

제1단계: 에탄올 추출

건조된 정향(원산지: 중국)을 경동시장에서 구입하여 1mm이하의 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 정향을 에탄올로 추출하였다. 이때 사용한 정향은 200g에 대하여,

50% 에탄올을 2000mL 첨가하여 추출하였으며, 추출시 80℃의 물 중탕을 이용하여 4시간 추출하였다.

제2단계: 에탄올 추출액의 여과 및 침전물 제거

상기 제1단계에서 제조한 에탄올 추출액을 침전물이 부유하지 않도록 충분히 냉각 한 다음 여과하여 침전물을 제거한다. 에탄올 추출액의 냉각은 50℃로 자연 냉각 하였으며, 에탄올 추출액은 100mesh 여과포를 사용하여 여과한 후 다시 200mesh 여과포를 사용하여 여과하여 불용성 침전물을 제거하였다.

제3단계: 에탄올 제거를 위한 농축 단계

상기 제2단계에서 제조한 에탄올 추출액의 에탄올을 제거하기 위하여 회전농축기를 이용하여 농축하였다. 농축은 1∼2 배 농축되도록 수행하였으며, 농축된 추출물은 에탄올이 남아 있는지 확인하고 남아있지 않을 때까지 농축하였다.

제4단계: 효소 처리

정향 추출물의 제조시 정향에 포함된 플라보노이드 등의 불순물을 제거하기위하여 상기 제3단계의 여과액에 β-글루코시다아제 효소(비전바이오켐, 한국)를 처리하여 플라보노이드 등이 물에 녹지 않도록 가수 분해하였다.

효소 처리시에는 상기 농축액을 가온하여 효소반응에 적합한 온도가 되도록 한다. 농축액의 온도는 52℃로 조정하였으며, 농축액에 β-글루코시다아제를 질량대비 0.1% (w/w)이 되도록 첨가하였다. 상기 효소를 첨가한 농축액을 교반하면서 12시간 동안 가수분해 반응을 수행하였다.

제5단계: 에탄올 첨가액의 원심분리 및 상등액 회수

상기 제4단계의 효소처리액을 원심분리하여 침전물은 폐기하고 바이오필름 억제 효과를 가지는 상등액을 회수하였다. 수득한 상등액은 농축한 후 분무 건조하여 분말화하였다.

정향 에탄올 추출물의 수율

수율	침전분말	분리액 분말
# 1 추출	2.4%	21.8%
# 2 추출	2.3%	18.7%

실시예 2: 정향추출물의 Xanthomonas oryzae 의 바이오 필름 형성억제 효과 분석

X. oryzae(KACC 10331)은 농촌진흥청 농업유전자원정보센터에서 분양받아 사용하였다. -80℃에서 보관되어 있던 X. oryzae 균주를 고체배양 배지인 YGC 배지(v표 2)에서 도말하여, 28℃에서 2일간 배양하여, 활발한 생육상태 균주로 배양하였다.

YGC 배지 (100 ml)의 구성

성분	함량
Glucose	5 g
Yeast extracts	0.5 g
CaCO₃	1.25 g
Agar	1.5 g
Water	총부피를 100ml로 맞춤

YGC 배지에서 배양된 X. oryzae 균주는 액체 배지인 210 배지 5ml에 접종한 후, 28℃, 250rpm에서 2일간 배양하였다. 배양에 사용된 210 배지의 조성은 표 3에 나타내었다.

YGC 배지 (100 ml)의 구성

YGC 배지에서 배양된 X. oryzae 균주는 액체 배지인 210 배지 5ml에 접종한 후, 28℃, 250rpm에서 2일간 배양하였다.

210배지에서 배양된 X. oryzae 균주의 바이오필름 형성을 정향추출물이 억제하는지 확인하기 위하여, 바이오필름 형성용 배지인 XOM2 배지를 사용하였다.

XOM2 배지의 조성은 표 4에 나타내었다.

XOM2 배지의 조성지(pH 6.5)

성분	함량
L-methionine	670 μM
Na-glutamate·H₂O	10 mM
KH₂PO₄	14.7mM
MnSO₄	40μM
Fe(III)-EDTA	240 μM
MgCl₂	5mM
D-xylose	0.18%

96웰의 PVC 마이크로플레이트에 XOM2 배지를 100μl씩 분주하고, 실시예 1 에서 제조된 정향추출물(20g/L)을 5μl씩 추가로 분주하였다. 상기 분주된 각 웰에 210배지에서 배양된 X. oryzae 균주을 세포농도 Abs600=0.05가 되도록 접종하고, 28℃에서 24시간 동안 배양하였다.

배양액을 제거한 후, 물로 3번 세척하고, 1% crystal violet 용액 100μl를 각각의 웰에 넣고 15분간 상온에서 정치하여 반응시켰다. 반응이 끝난 용액을 제거하고 물러 3번 부드럽게 세척한 후, 95% 에탄올 100μl를 각각의 웰에 넣고 15분간 정치시킨 후, Abs595에서 마이크로플레이트 리더로 바이오필름의 형성정도를 측정하였다.

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 정향추출물이 X. oryzae 균주의 바이오필름의 형성을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 효소처리 분획이 에탄올만으로 추출한 추출물보다 현저히 높은 바이오필름 억제효과를 나타내는 것으로 나타났다.

정향 추출물의 바이오필름 억제능

바이오필름 형성 억제 능력	S. mutans	X. oryzae	Y.enterocolitica	A. hydrophila
정향 추출물 (50% 에탄올)	23.3	69.92	26.9	37.99
정향 추출물 (물)	-	84.31	-	54.29
정향 추출물 (에탄올)	-	-	-	-
정향추출물 (효소처리)	29.85	97.48	29.76	55.16
정향 불순물	-	30.48	-	-

추가적으로, 상기와 동일한 방법으로 정향추출물(80g/L)을 이용하여, 희석하여 정향추출물 농도별 X. oryzae 균주의 바이오필름의 형성을 억제능을 확인하였다(도 3).

실시예 3: 정향추출물의 Yersinia enterocolitica 의 바이오 필름 형성억제 효과 분석

본 실시예에서 사용한 Y. enterocolitica (KCCM 41657)는 한국미생물보존센터에서 분양받아 사용하였다.

-80℃에서 보관되어 있던 Y. enterocolitica 균주를 활발한 생육 상태로 만들기 위하여, LB 고체배지에 도말한 후, 26℃ 에서 2일간 배양하였다. 배양된 균주는 5ml의 TYE 액체배지에 접종한 후, test tube에서 26℃, 250rpm으로 1일간 배양하였다.

TYE 배지의 조성은 표 6에 나타내었다.

TYE 배지(100 ml)의 조성

성분	함량
Tryptone	1 g
Yeast extracts	0.5 g
Water	총부피를 100ml로 맞춤

TYE 배지에서 배양된 Y. enterocolitica 균주의 바이오필름 형성을 정향추출물이 억제하는지 확인하기 위하여, 바이오필름 형성용 배지인 M63 배지를 사용하였다.

M63 배지의 조성은 표 7에 나타내었다.

M63 배지의 조성

성분	함량
5x M63 medium(국민대학교)	80 ml
20% Glucose	1 ml
20% MgSO₄	0.1 ml
Water	총부피를 100ml로 맞춤

96웰의 PVC 마이크로플레이트에 M63 배지를 100μl씩 분주하고, 실시예 1 에서 제조된 정향추출물(20g/L)을 5μl씩 추가로 분주하였다. 상기 분주된 각 웰에 TYE 배지에서 배양된 Y. enterocolitica균주을 세포농도 Abs600=0.05가 되도록 접종하고, 26℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 정향추출물에서, Y. enterocolitica 균주의 바이오필름의 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 효소처리한 정량추출물에서 더 높은 바이오필름 형성억제능을 확인할 수 있었다.

추가적으로, 상기와 동일한 방법으로 정향추출물(80g/L)을 이용하여, 희석하여 정향추출물 농도별 Y. enterocolitica균주의 바이오필름의 형성을 억제능을 확인하였다(도 4).

실시예 4: 정향추출물의 Streptococcus mutans 의 바이오 필름 형성억제 효과 분석

-80℃에서 보관되어 있던 Sterptococcus mutans (ATCC 25175)균주를 활발한 생육 상태로 만들기 위하여, BHI 고체배지(Gibco, BRL, 미국)에 도말한 후, 37℃에서 2일간 배양하였다. 배양된 균주는 5ml의 BHI 액체배지에 접종한 후, test tube에서 37℃에서 1일간 배양하였다.

BHI 배지에서 배양된 S. mutans 균주의 바이오필름 형성을 정향추출물이 억제하는지 확인하기 위하여, 바이오필름 형성용 배지인 BHI+1%Sucrose 배지를 사용하였다.

96웰의 PVC 마이크로플레이트에 M63 배지를 100μl씩 분주하고, 실시예 1 에서 제조된 정향추출물(20g/L)을 5μl씩 추가로 분주하였다. 상기 분주된 각 웰에 TYE 배지에서 배양된 S. mutans 균주을 세포농도 Abs600=0.05가 되도록 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 정향추출물에서, S. mutans 균주의 바이오필름의 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 효소처리한 정량추출물에서 더 높은 바이오필름 형성억제능을 확인할 수 있었다.

추가적으로, 상기와 동일한 방법으로 정향추출물(80g/L)을 이용하여, 희석하여 정향추출물 농도별 S. mutan 균주의 바이오필름의 형성을 억제능을 확인하였다(도 5).

실시예 5: 정향추출물의 Aeromonas hydrophila 의 바이오 필름 형성억제 효과 분석

-80℃에서 보관되어 있던 A. hydrophila 균주(ATCC14715)를 활발한 생육 상태로 만들기 위하여, LB 고체배지에 도말한 후, 30℃ 에서 1일간 배양하였다. 배양된 균주는 5ml의 LB 액체배지에 접종한 후, test tube에서 30℃에서 1일간 정치 배양하였다.

LB 배지에서 배양된 A. hydrophila 균주의 바이오필름 형성을 정향추출물이 억제하는지 확인하기 위하여, 바이오필름 형성용 배지인 TSBY 배지를 사용하였다.

TSBY 배지의 조성은 표 8에 나타내었다.

TSBY 배지의 조성

성분	함량
Tryptic Soy Broth	3 g
Yeast extract	1.6 g
Water	총부피를 100ml로 맞춤

96웰의 PVC 마이크로플레이트에 TSBY 배지를 100μl씩 분주하고, 실시예 1 에서 제조된 정향추출물(20g/L)을 5μl씩 추가로 분주하였다. 상기 분주된 각 웰에 LB 배지에서 배양된 A. hydrophila 균주을 세포농도 Abs 600=0.05가 되도록 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 정향추출물에서, A. hydrophila 균주의 바이오필름의 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 효소처리한 정량추출물에서 현저히 높은 바이오필름 형성억제능을 확인할 수 있었다.

추가적으로, 상기와 동일한 방법으로 정향추출물(80g/L)을 이용하여, 희석하여 정향추출물 농도별 A. hydrophila 균주의 바이오필름의 형성을 억제능을 확인하였다(도 5).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 정향추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물의 제조방법:
(a) 정향을 에탄올로 추출하여 정향 용매추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 정향 용매추출물에서 용매를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 에탄올이 제거된 추출물을 가수분해효소로 처리하여, 효소처리된 정향추출물을 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 가수분해효소는 α-아밀라아제, β-글루코시다아제, 펙티나아제 및 펩티다아제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 미생물은 Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Stereptococcus mutans 및 Aeromonas hydrophila로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 용매는 물, 에탄올, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법으로 제조되는 정향 용매추출물을 가수분해처리한 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물의 바이오필름 형성 방지용 조성물.
제6항에 있어서, 가수분해효소는 α-아밀라아제, β-글루코시다아제, 펙티나아제 및 펩티다아제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 미생물은 Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Stereptococcus mutans 및 Aeromonas hydrophila로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 용매는 물, 에탄올, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서, 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 벼의 흰잎마른병 방제용 조성물.
제6항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica 에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 치아우식예방용 조성물.
제6항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 Aeromonas hydrophila 에 의해 발생하는 식중독 또는 장염의 예방 또는 치료용 조성물.