KR20150045002A - 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드 및 그의 제조방법 - Google Patents
폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드 및 그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지질펩타이드는 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유함으로써 다양한 약물을 적재하여 시간의 흐름에 따라 약물을 서서히 방출시키며, pH 감응성으로 인해 약산성 환경에서 높은 세포 독성을 나타내고, 약산성의 세포에 선택적 및 효율적으로 작용하여 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병에 대해 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 암세포 및 종양에 특이적으로 작용할 수 있어 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드, 그의 제조방법 및 이를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.
많은 약물들이 질환 부위에 적절한 약효를 나타내기 위해 필요로 하는 양보다 많은 양을 투약하여 약효를 나타내지만, 적절치 않은 약물의 양으로 인해 그 이외의 부분에서는 부작용을 일으키기도 한다. 이로 인해, 많은 제약회사들은 상기 부작용을 줄이고, 약효를 극대화하도록 하는 제형에 대한 필요성을 갖게 되었다.
상기 문제점을 해결하기 위해 약물전달시스템(drug delivery system, 이하 DDS)에 대한 활용도가 높아지고 있는데, 상기 DDS란, 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시키는 방법이며, 이것은 이전보다 낮은 농도 또는 투약하기 곤란한 약물의 선택성을 개선하는데 유용하다. 투여되는 약물이 물리화학적으로나 약동학적으로 특별한 특성, 예를 들면 높은 수용성, 높은 지용성, 불용해성 등을 보인다면, 특별한 전달체계의 사용이 요구된다.
또한, 특별한 요구사항을 갖는 약물들, 예를 들면, 독성이 심한 일회 투여되는 주사용 약물, 세포독성을 갖는 불안정한 약물, 고청소율을 갖는 약물, 생체내에서 쉽게 불활성화되는 약물, 국소적 적용이 요구되는 약물 등은 적절한 DDS를 갖도록 고려되어야 한다. 상기 DDS기술은 70년대부터 선진국들이 첨단기술을 동원해 활발히 연구되고 있는 분야이다. 87년 물질특허제도가 도입됨에 따라 위기의식을 느낀 국내 제약회사들이 평균 15년의 기간과 2억 달러 이상의 비용이 소요되는 신약개발보다는 기존 약물의 단점을 개선한 DDS를 응용한 제품 개발이 새로운 신약 개발에 필요한 기간과 비용이 약 1/3로 단축되고 성공 확률도 매우 높다는 것을 알게 되었고, 이에 많은 제약회사에서 DDS에 대한 연구가 본격화되었다. 국내에서는 90년부터 본격적인 연구가 시작되었으며, 이와 관련된 특허출원은 92년 이후 지속적인 증가세를 보이고 있다.
이러한 DDS 기술, 및 진단과 치료를 포함한 각종 의료행위 및 신체의 일부를 대신하기 위해 생체 적합성 고분자가 사용되는데, 최근 이를 이용한 약물전달체에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 약물 전달에 있어 가장 편리한 방법인 경구투여는 주사제 투여의 고통으로부터 해방시켜 줄 수 있기 때문에 가장 선호되어오고 있다. 경구투여를 위한 약물 전달 체계로서 에멀젼(emulsion), 나노(nano) 입자, 리포좀(liposome)이 많이 사용되고 있다. 그 중에서도 생체 막에 존재하는 인지질로 만들어진 리포좀은 생체적합성이 우수하고 생분해성을 가지고 있으며 독성을 줄일 수 있다는 장점을 가지고 있으므로 약물전달 제제로 널리 사용되고 있다. 이전에는 PEG-공액 리포좀 내의 캡슐화 된 약물의 생체 내 순환시간이 상당히 증가했기 때문에 EPR 효과를 통해 종양에 흡수될 수 있는 더 많은 기회를 가졌다. 그럼에도 불구하고, 페길화(PEGylation)는 종양 세포로의 리포좀 흡수를 심각하게 방해한다. 이 문제를 극복하기 위해 pH 감응형, MMP 감응형, 에스터 가수 분해 효소 감응형 또는 환원 전위 감응형 화학 결합을 통해 PEG를 리포좀 표면에 컨쥬게이션하고 이것이 종양 조직에 도착한 후 PEG가 세포 밖으로 분열되는 방법이 보고되고 있다.
기존의 항암제를 이용한 화학요법의 가장 큰 문제점은 항암제가 암세포뿐만 아니라 정상 세포까지 죽게 만들어 인체에 심각한 손상을 준다는 것이었다. 그러나, 마이셀, 리포좀과 같은 나노 입자들은 수십 내지 수백 나노 크기로 매우 작기 때문에 인체내로 주입될 수 있고 세포의 인식 및 흡수가 용이하며, 인체 내의 혈관을 따라 이동하다가 EPR(enhanced permeation and retention)이라 불리는 현상에 의해 암세포 주위로 생성된 부실한 혈관 구멍을 통하여 비교적 선택적으로 암세포 주변에 오래 머무르면서 내부에 봉입된 항암제를 서서히 방출시킴으로써 주위에 분포하는 정상 세포의 파괴를 막으면서도 암세포만 골라 사멸시키는 효과를 나타낼 수 있다고 알려져 있다 (H. Maeda, et al., Bioconjugate Chem. 3 (1992) 351-362; R.K. Jain, Adv. Drug Deliv. Rev. 46(2001) 149168).
또한, 일반적으로 정상조직 및 혈액의 pH가 7.4인 반면, 암세포의 pH는 평균 7.0-6.5 사이에 있다고 알려져 있다. 따라서, 대부분 고형암이 그 세포 주변 pH가 약산성인 것을 주목할 때, 암세포의 pH를 집중 타켓할 수 있는 pH-민감성 고분자 소재의 개발은 암의 진단 및 치료 등에 널리 활용되어질 수 있으며, 암세포 이외에도 세포 외 pH가 약산성인 병소 및 류마티스 관절염의 진단 및 치료를 위한 의약품 개발에 필요한 소재로서 활용될 가능성이 있다.
이에 본 발명자들은 지질펩타이드를 이용한 새로운 약물전달체를 제조하기 위하여 연구, 노력한 결과, 인지질과 pH 감응형 폴리펩타이드인 폴리히스티딘(poly(His))이 결합된 지질펩타이드를 제조하였으며, 상기 지질펩타이드가 pH 감응성을 나타내는 약물전달체로서 기능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드 및 그의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 pH 감응형 지질펩타이드를 포함하는 약물전달체를 제공함을 목적으로 한다.
본 발명은 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드 및 그의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 pH 감응형 지질펩타이드를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
본 발명에 따른 지질펩타이드는 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유함으로써 다양한 약물을 적재하여 시간의 흐름에 따라 약물을 서서히 방출시키며, pH 감응성으로 인해 약산성 환경에서 높은 세포 독성을 나타내고, 약산성의 세포에 선택적 및 효율적으로 작용하여 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병에 대해 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 암세포 및 종양에 특이적으로 작용할 수 있어 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 DPPE-p(His)n을 근-적외선 형광 프로브로 확인한 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 독소루비신을 적재한 DPPE-p(His)n 미셀에서 시간의 흐름에 따른 독소루비신의 체외 방출 프로파일을 나타낸 도이다.
도 3은 독소루비신을 적재한 DPPE-p(His)n 미셀(a, b) 및 독소루비신만(c)을 처리한 경우 pH의 변화에 따른 세포 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀의 세포 내재화를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀의 세포 내재화를 유세포 분석(flow cytometer analysis)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀 용액을 마우스에 정맥 주사한 경우 약물 전달 효과를 NIR 영상을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀 용액을 마우스에 정맥 주사한 경우 마우스의 각 기관에 미치는 약물 전달 효과를 백색광 및 NIR 영상을 통해 확인한 결과(a) 및 이를 그래프(b)로 나타낸 도이다.
도 2는 독소루비신을 적재한 DPPE-p(His)n 미셀에서 시간의 흐름에 따른 독소루비신의 체외 방출 프로파일을 나타낸 도이다.
도 3은 독소루비신을 적재한 DPPE-p(His)n 미셀(a, b) 및 독소루비신만(c)을 처리한 경우 pH의 변화에 따른 세포 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀의 세포 내재화를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀의 세포 내재화를 유세포 분석(flow cytometer analysis)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀 용액을 마우스에 정맥 주사한 경우 약물 전달 효과를 NIR 영상을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀 용액을 마우스에 정맥 주사한 경우 마우스의 각 기관에 미치는 약물 전달 효과를 백색광 및 NIR 영상을 통해 확인한 결과(a) 및 이를 그래프(b)로 나타낸 도이다.
본 발명은 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 지질펩타이드는 pH 감응성을 나타내기 위하여, 폴리펩타이드 중 산도가 낮아지면 팽창하는 성질을 보이는 히스티딘(histidine)과 인지질이 결합된 결합체 형태로 포함되는 것을 특징으로 한다.
히스티딘은 산성에서 잘 녹는 성질을 가지고 있으므로 약산성 조건에 적합하며, Poly(His)는 이미다졸 그룹의 양성자 스펀지 메커니즘에 의해 생체적합성과 생분해성을 나타내며 엔도솜 융합 조절 기작시 막분해에 뛰어난 효과를 보인다.
인지질로는 디스테로일-sn-포스파티딜에탄올 아민(DSPE; Distearoyl-sn-Gylcero-3-phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올 아민(DPPE; Dipalmitoyl phosphatidylethanol amine), 포스파티딜에탄올 아민(PPEA; Phosphatidylethanol amine), 포스파티딜 세린(PPS; Phospatidyl serine), 포스파티딜 글리세롤(PPG; Phosphatidyl glycerol), 포스파티딜 콜린(PPC; Phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜 세린(DPPS; Dipalmitoyl phosphatidyl serine), 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤(DPPG; Dipalmitoyl phosphatidyl glycerol), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC; Dipalmitoyl phosphatidylcholine) 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 가장 바람직하게는 pH 감응형 물질인 디팔미토일 포스파티딜에탄올 아민(DPPE)이다.
본 발명에 따른 지질펩타이드는 하기 화학식 1로 표시되는 DPPE와 폴리히스티딘이 결합한 DPPE-p(His)일 수 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, n은 25~100의 정수이다.
또한, 본 발명은
(a) 히스티딘에 벤질 보호기를 도입하는 단계;
(b) 상기 벤질 보호기가 도입된 히스티딘에 인지질-NH2 용액을 첨가하고 중합시켜 인지질-p(Bn-His)n을 얻는 단계; 및
(c) 상기 인지질-p(Bn-His)n에 과량의 산성 용액을 첨가하고 교반하여 탈보호된 인지질-p(His)n을 얻는 단계를 포함하는, pH 감응형 지질펩타이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 pH 감응형 지질펩타이드의 제조과정을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 (a) 단계는 히스티딘에 벤질 보호기를 도입하는 단계로, 디옥산 내에서 PCl5와 Boc-L-His(Bn)-OH를 반응시켜 벤질 보호기가 도입된 히스티딘을 제조한다.
상기 (b) 단계는 인지질과 히스티딘을 결합하는 단계로, 질소 대기하에서 이루어진다. 반응은 일차 아미노기에 의해 시작된 벤질 보호기가 도입된 히스티딘의 개환중합(ROP)을 통해 진행된다. 즉, 15~35℃에서 60~90시간 동안 중합이 진행되며, 바람직하게는 25℃에서 72시간 동안 진행된다. 중합 반응 이후, 용매를 농축시키고, 농축된 용액을 침전 및 건조시켜 인지질-p(Bn-His)n을 얻는다.
상기 (c) 단계는 벤질 보호기를 탈보호화하는 단계로, 상기 인지질-p(Bn-His)n을 트리플루오로아세트산에 녹이고, 여기에 과량의 몰량, 바람직하게는 3~5배 몰량, 더욱 바람직하게는 4배 몰량의 산성 용액을 첨가한다. 이때 산성 용액으로는HBr 용액, HCl 용액, H2SO4 용액 등이 사용될 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 반응 용액을 20~40℃에서 10~20시간 동안, 바람직하게는 30℃에서 16시간 동안 교반하여 벤질 보호기가 탈보호된 인지질-p(Bn-His)n을 제조한다.
또한 본 발명은 약물이 적재된, 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 지질펩타이드를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
상기 적재 가능한 약물은 항암제, 항바이러스제, 스테로이드계 소염제(steroidal antiinflammatory drugs), 항생제, 항진균제, 마취제, 진통제, 동화성 스테로이드제, 면역 억제제 및 면역 촉진제를 포함할 수 있다.
항암제로는 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin) 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달체의 대표적인 구조는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
상기 화학식 2는 독소루비신을 적재한 폴리히스티딘과 DPPE의 결합체를 나타낸다.
본 발명에 따른 항암제를 포함한 다양한 약물을 적재한 지질펩타이드는 시간의 흐름에 따라 약물을 서서히 방출시키며, pH 감응성으로 인해 약산성 환경에서 높은 세포 독성을 나타내고 약산성의 세포에 선택적 및 효율적으로 작용하여 약산성 조건의 환경 변화를 가지는 특정 질병에 대해 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 암세포 및 종양에 특이적으로 작용할 수 있어 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(L-히스티딘)
n
(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(L-Histidine)
n
) [DPPE-p(His)
n
] 의 제조
모든 시약 및 용매는 상업적인 공급회사로부터 구매하였고, 특별히 명시된 바 없는 경우에는 일반적으로 인정되는 것을 사용하였다. 아미노카프론산(Aminocaproic acid) (99%), 트리에틸아민(Triethylamine) (TEA, 99.5%), 염산 독소루비신(Doxorubicin hydrochloride) (Dox, 98.5%), IR-820 염료 (80% 염료 함유량), N-히드록시 석신이미드(N-hydroxy succinimide) (NHS, 99%), 디시클로헥실 카보디미드(Dicyclohexyl carbodimide) (DCC, 99%)는 은 Sigma-Aldrich Co.(USA)에서 구입하였으며 추가 정제 없이 사용하였다. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) (DPPE, 99%)은 avanti polar Lipids에서 구입하였다. N-α-t-부틸록시카보닐-N-im-벤질-L-히스티딘(N-α-t-butyloxycarbonyl-N-im-benzyl-L-histidine) (Boc-L-His-(Bzl)-OH)은 Bachem에서 구입하였다. N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide) (DMF), 디클로로메탄(Dichloromethane), 디에틸에테르(Diethyl ether) 및 n-헥산(n-Hexane)은 각각 수소화 나트륨 및 칼슘으로 증류하였다. 1,4-디옥산(1,4-dioxane)은 불순물이 섞인 과산화물을 제거하기 위해 활성Al2O3로 컬럼 크로마토그래피하여 정제한 후, 증류하였다. 다른 모든 화학물질의 시약은 TCI로부터 구입하였으며 추가 정제 없이 사용하였다.
1-1. 벤질-N-카복시-L-히스티딘 무수물(benzyl-N-carboxy-L-histidine anhydride)[Bn-His-NCA]의 제조
Bn-His-NCA 를 제조하기 위하여 1,4-디옥산(1,4-dioxane) 20mL 내에 PCl5 1.8g이 첨가된 용액 10 mL에 Boc-L-His(Bn)-OH (2.5g)를 25℃에서 교반하에 현탁하였다. 몇 분 이내에, 이로부터 유리 필터(glass filter)를 통해 여과된 맑은 용액을 얻었다. 과량의 디에틸 에테르(diethyl ether)에 여과액을 첨가한 후 Bn-His-NCA의 결정을 얻었다. 그 후 생성물을 헹구고 50℃ 진공에서 건조하였다.
1-2. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-벤질-N-카복시-L-히스티딘 무수물(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-benzyl-N-carboxy-L-histidine anhydride) [DPPE-p(Bn-His)
n
] 의 제조
질소가 제거된 건조된 쉬링크 튜브(schlenk tube)에 0.68g(0.36mmoL)의 DPPE-NH2를 질소 대기 하에서 첨가한 후, 5mL의 무수 DMF/클로로포름(3:2)을 첨가하여 지질 개시제(lipid initiator)를 용해시켰다. 미리 결정된 양의 Bn-His-NCA를 포함하는 DMF 용액 5 mL를 질소 대기 하에서 트랜스퍼 니들(transfer needle)을 이용하여 DPPE-NH2 용액에 첨가하였다. 혼합물을 질소 대기 하에서 실온에서 72시간동안 반응시켰다. 중합 반응 이후, 용매를 고진공(high vacuum) 하에서 농축하였다. 농축된 반응 용액을 차가운 디에틸 에테르에서 침전시키고 진공에서 건조시켜 DPPE-p(Bn-His)n (n=10, 25, 50, 100)를 얻었다.
1-3. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(L-히스티딘)
n
(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(L-Histidine)
n
) [DPPE-p(His)
n
] 의 제조
벤질 보호기를 제거하기 위해, 트리플루오로 아세트산(trifluoroacetic acid) (100 mg, 10 mL) 내의 DPPE-p(Bn-His)n 용액을 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 그 다음, 아세트산에 4배 몰량의 HBr 33wt% 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 교반하였다. 끝으로, 반응 혼합물을 차가운 디에틸 에테르에서 침전시켜 DPPE-p(His)n (n=10, 25, 50, 100)를 얻었다. 얻어진 옅은 노란색의 고체를 10 mL의 DMF에 재용해하고 탈이온수(deionized water)로 대량 투석하여 더 정제하였다. 동결-건조에 의해 물을 제거하고 흰색 고체의 생성물을 얻었다(70% 수율).
제조된 DPPE-p(Bn-His)n을 근-적외선 형광 프로브를 통하여 확인하였으며, 이를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 독소루비신이 적재된 미셀의 제조
2-1. IR-820 염료가 접합된 아미노카프론산의 제조
IR-820 염료(150mg, 0.17mmol) 및 6-아미노카프론산(6-aminocaproic acid) (30mg, 0.23mmol)을 5mL의 DMF에 첨가한 후, 30μL의 TEA (22mg, 0.17mmol)을 첨가하였다. 반응 용액을 70℃에서 가열하고 12시간동안 암조건 하에서 교반하였다. 용매를 진공 하에서 제거한 다음, 얻어진 진한 파란색의 고체를 에테르로 헹구고 에틸 아세테이트(ethyl acetate)에서 에틸 아세테이트/메탄올 (5:1)까지의 기울기 용리(gradient elution)가 있는 컬럼 크로마토그래피로 더 정제하였다. 진공 하에 용매를 제거한 뒤, 진한 파란색 고체의 생성물을 얻었다(52% 수율).
2-2. NIRF 전구약물(prodrug) DPPE-p(His)의 제조
IR-820 염료(5.0mg, 5.1mmol)가 결합된 아미노 카프론산을 1mL의 DMF 용액에 녹인 후, 0.69mg의 HOSu (6.0mmol) 및 1.5mg DCC (7.3mmol)를 포함하는 1mL의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 암조건 하에서 교반하였다. DMF에 DPPE-p(His)(30mg, 4.6mmol)을 넣고 교반하면서 90μL의 상기 염료 용액을 한방울씩 첨가하였다. 혼합된 용액을 밤새 교반한 다음, NIRF 전구약물(prodrug)을 분리하기 위해 차가운 에테르에서 침전시켰다. NIRF 전구약물의 DMF 용액을 암조건하에서 투석하여 추가로 정제하였다. 투석 이후 동결-건조에 의해 물을 제거하여 회색 고체의 생성물을 얻었다(72% 수율).
2-3
.
DPPE-p(His)
n
지질펩타이드(lipopeptide) 미셀의 제조
모든 과정은 암조건 하에서 수행하였다. DPPE-p(His)n 지질펩타이드(lipopeptide) 미셀을 다음와 같이 자기 조립(self-assembly)에 의해 제조하였다. 구체적으로는, 10 mg의 DPPE-p(His)n를 5mL의 DMF에 녹이고 탈이온수 3mL를 고분자 용액에 매우 천천히 교반하면서 첨가하였다. 그 후 용액을 60℃로 가열하고 냉각시켰다. 그 후 결과물인 혼탁 용액을 투석 튜브(Spectra/Por, MWCO=3000)로 옮기고 물을 자주 갈아주며 48시간동안 탈이온수로 완전히 투석하였다. 이렇게 얻은 미셀 현탁액을 0.45nm의 맴브레인 필터(membrane filter) (Millipore)를 이용하여 여과하였다.
2-4. 독소루비신이 적재된 미셀의 제조
독소루비신·HCl을 DMSO에서 과량의 TEA(1.2×DOX.HCl)와 밤새 교반하여 독소루비신 염기를 얻었다. NIRF 전구약물 DPPE-p(His)75 (80 mg)를 유리 바이알 내의 DMSO (5mL)에 녹이고, 여기에 독소루비신 염기 용액 (3 mL DMSO 내에 20mg 독소루비신)을 가하여 혼합하고, 1시간동안 교반하였다. 반응 용액을 탈이온수(10 mL)에 한방울씩 첨가하였다. 그 후 반응 용액을 투석 튜브(Spectra/Por, MWCO=3000)로 옮기고 물을 자주 갈아주며 36시간동안 실온에서 탈이온수로 완전히 투석하였다. 그 다음, 투석 튜브 내의 혼합물을 0.45nm의 시린지 필터(syringe filter)(Millipore)를 통해 여과하여 독소루비신 응집물을 제거하였다. 독소루비신이 적재된 미셀 용액을 수거하고 4℃를 유지하였다. 평균 입자 크기, 미셀 및 독소루비신이 적재된 미셀의 크기 분포 및 형태는 동적 광 산란법(dynamic light scattering) 및 투과 전자 현미경(transmission electronic microscopy)으로 측정하였다.
2-5. 독소루비신이 적재된 미셀의 약물 적재량, 약물 적재 효율 및 독소루비신의 체외 방출 프로파일 측정
약물 적재량 및 약물 적재 효율은 다른 독소루비신 농도를 갖는 독소루비신/DMSO 용액에서 얻은 검정 곡선(calibration curve)을 이용하여 DMSO에서 자외선 분광 측정(485nm에서 여기)에 의해 판단하였다. 약물 적재량(DLC) 및 약물 적재 효율(DLE)은 하기 식에 따라 계산하였다:
약물 적재량(DLC) (wt%) = [적재된 약물의 무게/약물-결합된 미셀의 무게] × 100%
약물 적재 효율(DLE) (wt%) = [적재된 약물의 무게/투여한 약물의 무게] × 100%
5 mL의 미셀 현탁액(2.35 mg의 독소루비신이 결합된 미셀, DLC 17 wt%, 400 mg의 독소루비신 포함)을 30mL의 PBS 완충용액(Spectra/Por, MWCO 3000)으로 투석하였다. 일정 시간 간격으로, 투석 튜브 외부의 2mL 배지를 주기적으로 제거하고 새로운 PBS 완충 용액으로 교체하였다. 독소루비신 농도는 자외선 가시 분광법을 이용하여 485nm에서 흡수 강도에 기초하여 계산하였다.
약물이 적재된 미셀에서 독소루비신의 체외 방출 프로파일은 pH 7.4 및 5.5의 PBS 완충 용액 내의 독소루비신이 결합된 미셀 현택액을 투석함으로써 관찰하였으며, 관찰 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 시간의 흐름에 따라 미셀에서 방출되는 독소루비신 양이 증가함을 확인하였다.
실험예 1. 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)
n
미셀의 세포독성 분석
인간의 배아 신장 293T 세포, 인간의 결장암(HCT)-116 세포, 및 인간의 유방암(MCF7) 정상 세포를 DPPE-p(His)n의 나노크기 미셀의 세포독성을 평가하는데 사용하였다. 구체적으로는, 1×106 개의 세포를 100μL의 RPMI1640 및 10% FBS와 함께 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃의 온도와 5% CO2 농도에서 밤새 배양하였다. DMSO에 용해된 DPPE-p(His)n 미셀을 무혈청 배지(serum free media)에서 100배 희석한 다음, 세포에 첨가하였다. 대조군은 1% DMSO로 처리하였다. 2일 후, 생존 세포는 MTT 세포 증식 분석으로 측정하였다. 30μL의 MTT (5 mg/mL)를 96-웰 플레이트에 첨가하고 CO2 배양기에서 4시간 동안 추가적으로 배양하였다. 생존 세포에 의해 MTT가 감소하여 포르마잔(formazan)으로 환원되며, 세포 내에 형성된 포르마잔 결정이 SDS 용액 (100μl의 SDS-HCl 용액(SDS 10% w/v, 0.01M HCl))에 용해되고 흡광도(560nm 시료/630nm 표준)는 자동으로 컴퓨터 연결된 마이크로플레이트리더(microplate reader) (Molecular Device Company, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다. 8개의 웰에서 각각의 처리를 평균내었다. 결과는 약물 처리된 세포 내의 흡광도를 대조군 세포 내의 흡광도와 비교하여 백분율로 표시하였으며, 이를 도 3에 나타내었다. 도 3a는 독소루비신을 적재한 DPPE-p(His)n을 처리한 경우를 나타내며, 도 3b는 독소루비신만을 처리한 경우를 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 독소루비신을 적재한 DPPE-p(His)n을 처리한 경우(a, b) 약산성에서 세포 활성이 떨어지는 것으로 보아 약산성에서 세포 독성이 높음을 확인하였으며, 독소루비신만을 처리한 경우(c) 약산성에서 세포 독성이 높지 않음을 확인하였다.
실험예 2. 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)
n
의 in vitro 항암 효과 측정
독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀 및 독소루비신이 없는 미셀의 항암 효과를 MCF 7 인간 유방암 세포주를 가지고 평가하였다. 구체적으로는, 3×104 개의 MCF 7 세포를 100μL의 RPMI1640 및 10% FBS와 함께 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃의 온도와5 % CO2 농도의 대기에서 24시간 동안 밤새 배양하였다. 그다음 배지를 무혈청 배지 내의 독소루비신 또는 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀을 요구되는 pH에서 처리하였다. 24시간 후, 생존 세포는 상기 실험예 1에서 설명한 바와 같이, MTT 세포 증식 분석에 의해 평가하였다.
독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)n 미셀의 세포 내재화를 공초점 현미경(confocal microscopy) 및 유세포 분석(flow cytometer analysis)에 의해 확인하였다. MCF 7 세포를 커버-글라스가 내재된 6-웰 플레이트에 접종하고 12시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 그 후, 무혈청 배지 내의 독소루비신 또는 DPPE-p(His)n 미셀을 요구되는 pH 에서 MCF 7 세포로 1시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 PBS(pH 7.4, 0.1M)로 헹구고 4%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 처리하였다. 그 후, 세포를 다시 PBS로 세척하고 부동화 용액(immobilization solution) (ImmuMount, Thermo Electron Corporation, Pittsburgh, PA)으로 고정하였다. 세포를 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscope) (CLSM, TCS-SP2; Leica, Wetzlar, 독일)로 관찰하였으며, 관찰 결과를 도 4에 나타내었다.
유세포 분석을 위해, MCF 7 (1×106) 세포로 처리된 독소루비신 또는 독소루비신이 적재된 미셀을 6-웰 플레이트에 접종하고 서로 다른 pH에서 독소루비신이 없는 나노입자 또는 독소루비신과 결합된 나노입자에 1시간동안 노출시켰다. 그다음 세포를 PBS로 세척하고 원심분리로 수거하였다. 세포의 형광 강도는 유세포 분석기로 측정하였으며, 측정 결과를 도 5에 나타내었다.
(도 4 및 도 5의 간단한 설명을 요청합니다)
실험예 3. 마우스에 독소루비신이 적재된 DPPE-p(His)
n
투여에 의한
항암 효과 측정
모든 동물은 부산대학교에서 실험동물 사용 및 관리 위원회에서 승인된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 설명서에 설명된 지침을 준수하여 관리되었다. 동물 실험은 암컷 BALB/c 누드 마우스 (나이:5 주령, 무게:18-22g)를 사용하여 수행하였다. MCF7 암 세포(1×106개의 세포/마우스)를 마우스의 등에 피하 투여 하였다. 종양의 부피가 3mm×3mm가 되는 종양 이식 마우스를 사용하였으며, 100mL의 독소루비신이 적재된 미셀 용액을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다.
마우스는 하기와 같이 네 그룹으로 나누어 처리하였다:
(1) PBS(phosphate buffered saline)를 주입한 대조군; (2) 독소루비신만을 처리한 그룹(독소루비신은 PBS에 녹인 후 마우스 주입); (3) 빈 미셀 처리 그룹(DPPE-p(His)50미셀을 탈 이온수에 분산한 후 주입); (4) 독소루비신이 적재된 미셀 처리 그룹(독소루비신이 적재된 미셀을 각 마우스에 주입).
독소루비신의 주입 용량은 마우스 1kg 당 5mg이었다. 모든 그룹은 귀에 태그된 5마리의 종양 이식 마우스로 구성되며, 전체 연구 기간 동안 이들 마우스는 개별적으로 후속 조치하였다. 종양 크기의 변화를 기록하였으며, 그 후 종양 부피는 다음 식으로 계산하였다 : 종양 부피 (mm3) = (길이×너비2)/2.
상기 (4) 그룹의 독소루비신이 적재된 미셀을 주입한 마우스의 시간에 따른 약물 전달 효과를 NIR(Near Infrared) 영상을 통하여 확인하였으며, 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 24시간 후, 독소루비신이 적재된 미셀이 종양으로 이동하였으며, 72시간 후에도 계속해서 종양에 특이적으로 작용하고 있음을 확인하였다.
또한, DPPE-p(His)50 미셀을 마우스에 정맥 주입한 후, 절개한 마우스에서 각 기관을 채취하여 약물 전달 효과를 확인하였으며, 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7a는 백색광 및 NIR 영상을 통하여 확인한 것이며, 도 7b는 이를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7에서 나타낸 바와 같이, 독소루비신이 적재된 미셀이 약산성의 종양에만 특이적으로 작용하고 있음을 확인하였다.
Claims (9)
- 폴리히스티딘과 인지질의 결합체를 함유한 pH 감응형 지질펩타이드.
- 제1항에 있어서, 인지질은 디스테로일-에스엔-포스파티딜에탄올 아민(DSPE; Distearoyl-sn-Gylcero-3-phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올 아민(DPPE; Dipalmitoyl phosphatidylethanol amine), 포스파티딜에탄올 아민(PPEA; Phosphatidylethanol amine), 포스파티딜 세린(PPS; Phospatidyl serine), 포스파티딜 글리세롤(PPG; Phosphatidyl glycerol), 포스파티딜 콜린(PPC; Phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜 세린(DPPS; Dipalmitoyl phosphatidyl serine), 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤(DPPG; Dipalmitoyl phosphatidyl glycerol) 및 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC; Dipalmitoyl phosphatidylcholine)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 pH 감응형 지질펩타이드.
- 제2항에 있어서, 인지질이 디팔미토일-글리세로-포스포에탄올아민(dipalmitoyl-glycero-phosphoethanolamine, DPPE)인 것을 특징으로 하는 pH 감응형 지질펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 지질펩타이드는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 pH 감응형 지질펩타이드;
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, n은 25~100의 정수이다. - (a) 히스티딘에 벤질 보호기를 도입하는 단계;
(b) 상기 벤질 보호기가 도입된 히스티딘에 인지질-NH2 용액을 첨가하고 중합시켜 인지질-p(Bn-His)n을 얻는 단계; 및
(c) 상기 인지질-p(Bn-His)n에 과량의 산성 용액을 첨가하고 교반하여 탈보호된 인지질-p(His)n을 얻는 단계를 포함하는 pH 감응형 지질펩타이드의 제조방법. - 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 산성 용액은 HBr 용액, HCl 용액 및 H2SO4 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 약물이 적재된, 제1항 내지 제4항에 따른 pH 감응형 지질펩타이드를 포함하는 약물전달체.
- 제7항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 항바이러스제, 스테로이드계 소염제(steroidal antiinflammatory drugs), 항생제, 항진균제, 마취제, 진통제, 동화성 스테로이드제, 면역 억제제 및 면역 촉진제로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
- 제8항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
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| EP2703411B1 (en) * | 2011-04-25 | 2017-10-11 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Nanoparticles containing ph-responsive peptide |
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