KR20150039130A - 유방 종양의 예방 및 치료를 위한 울리프리스탈 아세테이트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자, 바람직하게는 BRCA1 유전자에 돌연변이를 갖는 환자에서, 유방 종양의 예방 또는 치료에서의 울리프리스탈 아세테이트, 또는 이의 임의의 대사물의 용도에 관한 것이다.

Description

유방 종양의 예방 및 치료를 위한 울리프리스탈 아세테이트{ULIPRISTAL ACETATE FOR PREVENTION AND TREATMENT OF BREAST TUMORS}

본 발명은 울리프리스탈 아세테이트를 이용하는 유방 종양의 예방 및 치료법에 관한 것이다.

울리프리스탈 아세테이트(UPA)는 프로게스테론 표적 조직에서 프로게스테론 수용체에 효과적으로 결합하고 이를 억제하는 프로게스테론 수용체 조절제이다.

CDB-2914로 이미 알려진 UPA는 본 발명에서 하기 화학식 I의 17α-아세톡시-11β-[4-N,N-디메틸아미노-페닐)-19-노르프레그나-4,9-디엔-3,20-디온이며, 하기 화학식 I을 갖는다:

UPA 및 이의 제조방법은 예를 들어 미국특허 제4,954,490호; 제5,073,548호; 및 제5,929,262호와 국제특허출원 WO2004/065405 및 WO2004/078709에 개시되어 있다.

UPA는 긴급 피임용(상표명 EllaOne®), 및 자궁 섬유종의 치료(상표명 Esmya®)에 대해 승인되었다. 다양한 다른 잠재적인 임상적 적용이 문헌 [Chabbert-Buffet et al, Human Reproduction, 2005, 11(3): 293-307]에서 제안되어 있다.

기타 항프로게스틴, 예컨대 미페프리스톤(mifepristone) 및 오나프리스톤(onapristone)이 유방암 치료를 위해 개발되었다. 전이성 유방암이 있는 123명의 폐경기 여성에서, 2차 또는 3차 라인 치료인 미페프리스톤 또는 오나프리스톤의 투여는 각각, 환자의 11% 및 43%에서 객관적 반응 속도 및 질환 안정화를 유도하였다(Romieu et al. 1987, Bull Cancer 74(4): 455-461; Klijn, et al. 1989, Cancer Res 49(11): 2851-2856). 불행히도, 미페프리스톤 및 오나프리스 각각의 항-글루코코르티코이드 및 간독성 부작용 때문에 임상 연구는 지속되지 못했다.

장기간 UPA 노출은 호르몬-반응성 조직, 특히 유방 조직에도 영향을 미칠 수 있다. 그러나, T-47D 유방암 세포주에서의 유전자 리포터 전사활성화 연구만이 보고되어 있다(Attardi et al. 2002, Mol Cell Endocrinol 188(1-2): 111-123; Attardi et al. 2004, J Steroid Biochem Mol Biol 88(3): 277-288).

부작용이 없거나 또는 감소하면서, 유방 종양을 치료, 및 심지어 예방하기 위한 제제에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

본 출원인은 울리프리스탈 아세테이트(UPA) 또는 이의 임의의 대사물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 유방 종양을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제안한다.

따라서, 환자에서 유방 종양을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 울리프리스탈 아세테이트(UPA) 또는 이의 임의의 대사물이 제공된다.

바람직한 구현예에서, 환자는 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는다.

특히 바람직한 구현예에서, 울리프리스탈 아세테이트(UPA) 또는 이의 임의의 대사물은, BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 환자에서 유방 종양을 예방하는데 사용된다.

또다른 바람직한 구현예에서, 울리프리스탈 아세테이트(UPA) 또는 이의 임의의 대사물은 유방 종양이 바람직하게는 유방 암종인 환자의 유방 종양을 치료하는데 사용된다.

발명의 상세한 설명

"환자"는 본 발명의 예방적 또는 치유적 치료를 필요로 하는 임의의 대상, 바람직하게는 여성을 의미한다. 그러나 남성도 또한, 이들이 유방 종양을 가지기 쉽기 때문에 포함된다.

바람직하게는 환자는 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 것으로 진단되었다.

BRCA1 및 BRCA2는 종양 억제(suppressor) 유전자이다.

BRCA1 또는 BRCA2 유전자좌의 돌연변이 사건은 코딩 서열 및 비-코딩 서열 내에 결실, 삽입 및 지점 돌연변이를 수반할 수 있다. 결실은 전체 유전자 또는 유전자의 오직 일부일 수 있다. 지점 돌연변이는 중지 코돈, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 또는 아미노산 치환을 야기할 수 있다. 체세포 돌연변이는 오직 특정 조직에서, 예를 들어 종양 조직에서 일어날 수 있는 것이고, 생식세포에 유전되지 않는다. 생식세포 돌연변이는 신체의 조직 또는 세포 중 임의의 것에서 발견될 수 있으며 유전된다. 오직 단일 대립유전자(allele)만 돌연변이되는 경우에도, 유방암에 대한 소인(predisposition)이 나타난다.

특정 구현예에서, 환자는 BRCA1 또는 BRCA2 소인성 대립유전자의 하나의 카피 또는 두개의 카피를 가질 수 있다.

BRCA1 또는 BRCA2 소인성 대립유전자는 야생형 대립유전자에 대해 열성인 것으로 여겨진다; 즉, 하나 이상의 야생형 BRCA1 또는 BRCA2 대립유전자를 함유하는 세포가 암성은 아니다. 그러나, 하나의 야생형 BRCA1 또는 BRCA2 대립유전자, 및 하나의 소인성 대립유전자를 함유하는 세포는 세포 분열 동안 랜덤 돌연변이 또는 염색체 상실에 의해, 야생형 대립유전자의 상실을 종종 겪을 수 있다. 이러한 돌연변이체 세포의 모든 자손은 BRCA1 또는 BRCA2의 야생형 기능이 결핍되고, 종양으로 발달할 수 있다. 따라서, BRCA1 또는 BRCA2 의 소인성 대립유전자는 암이 되기 쉽고, 감수성은 우성 방식으로 유전된다.

대부분의 돌연변이체 대립유전자는 넌센스(nonsense) 또는 프레임시프트이고 전장 단백질의 5% 내지 99%의 길이로 다양한 것으로 예상되는 절단된 단백질을 생성한다. 많은 상기 돌연변이는 BRCA1 코딩 영역의 61%를 포함하는 BRCA1 유전자의 엑손 11에 존재한다. 전장 BRCA1 cDNA 서열 및 BRCA1 유전자의 코딩 영역은 미국특허 제5,747,282호에 기재되어 있다.

BRCA1 또는 BRCA2 내의 돌연변이는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다.

Myriad사의 현행 BRCA 진단 시험, BRACAnalysis®은 BRCA1 및 BRAC2 유전자에서 유방암의 유의한 위험과 관련된 돌연변이를 확인하기 위해 2가지 종래의 기술의 조합-Sanger 서열분석 및 PCR-을 사용한다.

BRCA1 및 BRCA2 돌연변이를 위한 서열분석을 위한 다른 방법에는 유전자 변이체의 단일 가닥 형태적 다형(SSCP) 분석 및 선택된 DNA 서열분석, 또는 유전자 변이체의 DHPLC 및 DNA 서열분석이 포함된다.

BRCA1 유전자에서 돌연변이를 검출하기 위한 단백질-기반 시스템을 비롯한 또 다른 방법도 기재되어 있다(미국특허 제5,965,377호; 제6,514,713호).

용어 "종양"은 통제불능 증식, 불멸성, 전이 잠재력, 빠른 성장 및 증식 속도, 및 특정한 형태학적 특징을 비롯한 비정형 성장 또는 형태학과 같은 세포 프로세싱 특징의 존재를 말한다. "종양"에는 양성 및 악성(즉, 암성) 신생물이 포함된다. 선종 및 낭종이 포함된다. 유방암에는 유방 암종이 포함된다. 유방암은 유방의 상이한 영역에서 시작될 수 있다(도관, 소엽, 또는 일부의 경우, 사이의 조직). 본 발명의 문맥에서, 비-침윤성, 침윤성, 재발 및 전이성 유방암을 비롯해, 임의의 유형의 유방 종양 또는 유방암이 포함된다.

특정 구현예에서, 환자는 유전적 유방 및 난소암(Hereditary Breast and Ovarian Cancer: HBOC)으로 진단되었다.

본원에서는 유방 종양에 대항하는 예방적 및 치료적 방법이 기재된다.

"예방" 또는 "예방하는"은 UPA 또는 임의의 이의 대사물을 무증상이거나 또는 유방 종양이 없는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 더욱 특히 환자는 예를 들어, 가족력 또는 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자 상태의 관점에서, 이러한 유방 종양을 발달시킬 위험이 있을 수 있다. 이러한 예방은 유방암의 발달 위험을 감소시키는 것을 목적으로 한다.

"치료적 치료" 또는 "치료하는"은 UPA 또는 임의의 이의 대사물을 유방 종양이 있는 것으로 진단된 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 치료는 질환의 증상을 경감시키고, 질환의 경과를 감속시키고, 질환의 차도 또는 완전한 치유를 야기할 수 있다.

특히, UPA는 특히 소엽 및 유관(또는 도관 세포), 특히 BRCA1 돌연변이체 세포에서, 종양 세포의 증식에 길항작용을 한다는 것이 제시되었다.

특정 구현예에서, 유방 종양이 발달될 위험이 있을 수 있는 환자는, 필수적이지는 않지만, 추가의 피임을 필요로 할 수 있다. 이것은 환자가 정규적 피임을 하지 않을 때 특히 유용하다. 이러한 경우, UPA 또는 이의 임의의 대사물은 정규적 피임 및 유방 종양 예방 모두를 제공하기에 적용된 형태 및 투여량으로 제안될 수 있다. 또다른 구현예에서, 환자는 자궁 섬유종을 가질 수 있고, 자궁 섬유종에 대항하는 치료의 필요성 및 유방 종양에 대항하는 치료적 또는 예방적 치료의 필요성 모두를 가질 수 있다. 이 경우, UPA 또는 이의 임의의 대사물은 또한 자궁 섬유종에 대항하는 치료 및 유방 종양의 예방 또는 치료 모두를 제공하기 위해 적용된 형태 및 투여량으로 제안될 수 있다.

울리프리스탈 아세테이트(UPA)가 바람직하게는 사용된다. 그러나, UPA의 대사물도 마찬가지로 사용될 수 있을 것이다. 울리프리스탈 아세테이트의 대사물에는 문헌 [Attardi et al, Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2004, 88: 277-288]에 기재된 것들, 예컨대 모노탈메틸화된(monodemethylated) CDB-2914 (CDB-3877); 디탈메틸화된(didemethylated) CDB-2914 (CDB-3963); 17알파-히드록시 CDB-2914 (CDB-3236); CDB-2914의 방향족 A-고리 유도체 (CDB-4183)가 포함된다. 바람직하게는 대사물은 모노탈메틸화된 CDB-2914 (CDB-3877)이다.

UPA 또는 이의 대사물은 다양한 경로를 통해, 예를 들어, 경구로, 정맥내로, 또는 경피로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 경구 경로이다. 종양 부위에의 주사가 또한 가능하다. 질내 또는 자궁내 경로를 비롯한, 기타 투여 경로가 포함된다. UPA 또는 이의 대사물의 지속된 방출을 가능하게 하는 장치, 특히 질내 또는 자궁내 장치가 특히 유용하다. 피하 이식물도 추가로 고려될 수 있다.

유용한 투여 단위의 제조 방법 및 이를 위한 조성물은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 유효 성분을 함유하는 정제 및 알약을 제조하기 위한 통상의 기술은 표준 참조 문헌 [Chase et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, (16th ed., Mack Publishing Co., Easton. Pa., U.S.A., 1980)("Remington's"), 페이지 1553 내지 1584] 에 기재되어 있다. 분말 제조를 위한 통상의 기술, 및 이들의 조성은 참조문헌의 페이지 1535 내지 1552에 기재되어 있다. 약학 투여 형태의 코팅을 위한 통상의 기술은 Remington 문헌의 페이지 1585 내지 1593에 기재되어 있다.

경구 고형 투여 형태는 바람직하게는, 코팅되거나 비코팅될 수 있는 압착 정제, 또는 캡슐이다.

캡슐은 유효 성분과 비활성 성분의 혼합물을 위한 용기로서 바람직하게는 경질 또는 연질 젤라틴 껍질을 사용하는 고형 투여 형태이다. 경질 젤라틴 및 연질 탄성 캡슐의 생산 및 제조 과정은 당업자에게 잘 알려져 있다.

압축 정제는 임의의 부형제를 포함할 수 있으며, 이는 유효 성분의 벌크를 증가시키는 희석제이며, 이에 따라 실용적인 크기의 압축 정제의 생산이 가능하다. 분말 형태의 물질에 응집의 성질을 부여하는 제제인 결합제가 또한 필요하다. 전분, 젤라틴, 당류, 예컨대 락토오스 또는 덱스트로스, 및 천연 및 합성 검이 사용된다. 붕해제는 정제의 붕괴를 촉진하기 위하여 정제에 필요하다. 붕해제에는 전분, 클레이, 셀룰로오스, 알긴, 검 및 가교결합된 중합체가 포함된다. 마지막으로, 윤활제 및 활택제로서 알려진 물질의 소량이 정제에 포함되며, 이는 제조 과정에서 정제 물질이 표면에 접착되는 것을 예방하고, 제조하는 동안 분말 물질의 유동 특성을 향상시킨다. 활택제로서 콜로이드 이산화규소가 가장 흔하게 사용되며, 윤활제로서 탈크 또는 스테아르산과 같은 화합물이 가장 흔하게 사용된다. 압축 정제의 생산 및 제조 과정은 당업자에게 잘 알려져 있다.

특정 구현예에서, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물은 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물이 락토스 일수화물, 포비돈(폴리비닐피롤리돈), 크로스카르멜로스 나트륨, 및 마그네슘 스테아레이트(예를 들어, 국제 특허 출원 WO2010/066749에 기재된 바와 같음)인 부형제와 혼합되는 비코팅된 정제의 형태로 사용된다.

장기간 치료(예를 들어 3개월 이상의 기간)가 바람직하다.

예방의 문맥에서, 치료는 수년간 지속될 수 있다.

치유적 치료의 문맥에서, UPA는 수일부터, 수개월 또는 수년, 예를 들어, 3개월 이상에서 약 5년 동안 투여될 수 있다.

투여량은 특정 조건 및 종양의 심각도, 및 환자의 성별 및 체중에 따라 조정될 수 있다. 전형적인 투여량은 0.1mg 내지 150mg, 바람직하게는 5 내지 80mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 50mg의 범위일 것이다. 매일 투여(들)이 바람직하다.

실시예 및 도면은 본 발명의 범주를 축소시키지 않으면서 본 발명을 설명한다.

도 1: MMTV 리포터 유전자 전사활성화에 대한 UPA 효과.
MMTV-Luc 리포터 유전자를 HBE 세포에 트랜스펙션하였다: (a) 단독, 또는 조합으로, (b) hPR-A 및 hPR-B, (c) hPR-A, 또는 (d) hPR-B 이소형 플라스미드. (e) T-47D 세포를 MMTV-Luc로 트랜스펙션하였다. 세포를 표시된 바와 같이 P를 100 nM 및/또는 UPA, 또는 RU를 1 내지 1 000 nM 또는 구체화되지 않은 경우 100 nM으로 처리하였다. 결과는 대조군 배 유도(fold induction)에 상응하였다(평균 ± SEM, HBE 및 T-47D의 경우 n = 3). *p < 0.05, **p < 0.001.
도 2: PR 표적 유전자 발현에 대한 UPA 효과.
HBE 및 T-47D 세포에서, mRNA 발현을 (a) FASN, (b) 사이클린 A, (c) BCL2 및 (d) ALPL에 대해 정량적 RT-PCR에 의해 분석하였다. 세포를 P 및/또는 UPA(100 nM), 및/또는 E2(10 nM)로 처리하였다. 결과는 대조군 배 유도에 상응하였다(평균 ± SEM, HBE의 경우 n = 5 및 T47D의 경우 n = 2). *p < 0.05, **p < 0.01.
도 3: GRE 리포터 유전자 전사활성화에 대한 UPA 효과.
GRE-Luc 리포터 유전자를 (a) HBE 세포 및 (b) MCF-7 세포에 트랜스펙션하였다. 세포를 DEX 및/또는 UPA(100 nM)로 처리하였다. 결과는 대조군 배 유도에 상응하였다(평균 ± SEM, HBE의 경우 n = 13 및 MCF-7의 경우 n = 3). *p < 0.01, **p < 0.001.
도 4: GR 표적 유전자 발현에 대한 UPA 효과.
HBE 및 MCF-7 세포에서, mRNA 발현을 (a) IEX-1, (b) G0S8, (c) 사이클린 A, (d) BCL2에 대해 정량적 RT-PCR에 의해 분석하였다. 세포를 DEX 및/또는 UPA(100 nM)로 처리하였다. 결과는 대조군 배 유도에 상응하였다(평균 ± SEM, HBE의 경우 n = 5 및 MCF-7의 경우 n = 2). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 5: 호르몬 매개 세포 1 증식에 대한 UPA 효과.
세포 증식을 (a) HBE 세포, (b) T-47D 세포 및 (c) MCF-7 세포에서 [3H] 티미딘 삽입에 의해 측정하였다. HBE 세포를 96h 동안 처리하고, T-47D 및 MCF-7 세포를 48h 동안 P, DEX, UPA의 경우 100 nM 및 E2의 경우 10 nM의 농도로 처리하였다. 결과는 대조군의 %로 표현된다(평균 ± SEM, HBE의 경우 n = 7, T47D의 경우 n = 4 및 MCF-7의 경우 n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 6: 호르몬 매개 세포 세포자멸사에 대한 UPA 효과.
세포 세포자멸사를 (a) HBE 세포, (b) T-47D 세포, 및 (c) MCF-7 세포에서 서브-G1 상의 유세포분석 정량에 의해 측정하였다. HBE 세포를 96h 동안, T-47D 및 MCF-7 세포를 48h 동안, P, DEX, UPA의 경우 100 nM 및 E2의 경우 10 nM의 농도로 처리하였다. 결과는 대조군의 %로 표현된다(평균 ± SEM, HBE의 경우 n = 9, T-47D의 경우 n = 3 및 MCF-7의 경우 n = 4). *p < 0.05, **p < 0.001.
도 7: 유방 조직 이종이식에서의 PR, ER 및 Ki67 발현.
ER, PR 및 Ki67 발현을 면역조직화학에 의해 분석하였다. (a) 마우스에서 이전의 본래 유방 조직에서의 및 처리된 이식편에서의 ER 및 PR 표지에 대한 대표 이미지. (b) 이식된 조직의 C, E2, E2+P, E2+P+UPA 처리 그룹에서의 Ki67 발현. 배율 x400. (c) 소엽 및 도관에서의 분열 지수(Ki67 양성 세포 백분율) 대조군 배 유도(평균 ± SEM, 소엽에서 n = 4 및 도관에서 n = 6). *p < 0.05.
도 8은 다양한 처리에 대해 반응하는, BRCA1 돌연변이를 가진(BRCA1^+/+) 또는 갖지 않은(BRCA1^+/-) 이식된 조직의 소엽 세포에서의 분열 지수(Ki67 양성 세포 백분율)의 유도를 보여준다. 평균 ± SEM.
도 9는 다양한 처리에 대해 반응하는, BRCA1 돌연변이를 가진(BRCA1^+/+) 또는 갖지 않은(BRCA1^+/-) 이식된 조직의 도관 세포에서의 분열 지수(Ki67 양성 세포 백분율)의 유도를 보여준다. 평균 ± SEM.

실시예:

실시예 1: 정상 유방 상피 세포( HBE )의 및 유방암 세포주에서의 증식 및 세포자멸사에 대한 UPA 의 영향.

재료 및 방법

스테로이드

프로게스테론 수용체 길항제 울리프리스탈 아세테이트(UPA) 및 이의 모노-N4 탈메틸화된 대사물 CDB-3877(CDB)을 HRA-Pharma(Paris, France)에 의해 제공받았다. 17β 에스트라디올(E2), 프로게스테론(P), 덱사메타손(DEX) 및 미페프리스톤/RU-486(RU)을 Sigma(St Quentin Fallavier, France)에서 구입하였다.

세포 배양 절차

T-47D 및 MCF-7 세포주를 10% 우태 혈청(PAA Laboratory, Les Mureaux,France)이 보충된 RPMI 1640 및 DMEM 배지에서 각각 유지하였다. T-47D 세포주는 인간 담관 유방 암종으로부터 유래되었고, 많은 양의 PR(프로게스테론 수용체) 및 ER(에스트라디올 수용체)을 지속적으로 발현하였다. 정상 인간 유방 상피 세포(HBE) 일차 배양물을 20명의 여성(연령 17-50세)으로부터 수득하였다. HBE 세포를 배양하는데 사용되는 절차는 Gompel and colleagues(Gompel, et al., 1986, J Clin Endocrinol Metab 63(5): 1174-1180)에 상세히 기재되어 있다. HBE 세포를 히드로코르티손(5 ng/ml), 트리요오도-L-티로닌(6.5 ng/ml), 콜레라톡신(10 ng/ml), 트랜스페린(5 mg/ml), 인슐린(0.016 U/ml), 표피 성장 인자(10 ng/ml)(Sigma, St Quentin Fallavier, France) 및 5% 인간 혈청(Etablissement Francais du Sang)을 함유하는 HAM F10 배지(PAA Laboratory, Les Mureaux, France)에서 유지시켰다. HBE 일차 배양물은 상피 마커 뿐 아니라 낮은 레벨의 에스트라디올 수용체(ER) 및 에스트라디올 유도 PR을 발현한다(Malet, et al., 1991. J Clin Endocrinol Metab 73(1): 8-17; Courtin, et al., 2011, Breast Cancer Res Treat.).

스테로이드 처리

파종 후, 세포를 혈청 및 페놀 레드가 없는 배지에서 24h 동안 배양하였다. 이후 5% 덱스트란-차콜 스트립(stripped) 혈청을 함유하는 페놀 레드가 없는 배지에서 처리를 실시하였다. 세포를 P 또는 DEX(100nM)로, 단독으로 또는 UPA, RU(1nM 내지 1μM) 또는 CDB-3877(100nM)과 조합으로 처리하였다. 대조군 세포는 에탄올을, 비히클로서 단독으로 10 1:1000 최종 에탄올 농도 또는 E2(10nM)로 처리되었다.

리포터 효소 어세이

세포를 글루코코르티코이드 및 프로게스테론 반응성 요소(GRE/PRE)를 함유하는 리포터 유전자 플라스미드로 트랜스펙션하였다: 1) MMTV-Luc는 pFC31 벡터에서 루시퍼라아제 유전자의 빛을 내기 위해 업스트림에 1개의 GRE/PRE 팔린드롬(palindrome) 및 3개의 GRE/PRE 헤미-팔린드롬(hemi-palindrome)을 함유하는 마우스 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복(Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat) 프로모터이다, 2) GRELuc는 pBL 벡터에서 루시퍼라아제 유전자의 빛을 내기 위해 업스트림에 6개 카피의 GRE/PRE 팔린드롬을 함유한다. 표시되는 경우, HBE 세포를 POP3 벡터 내에 제작된 인간 PR 이소형 hPR-A 및 hPR-B 발현 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 베타 갈락토시다아제 유전자(pRSV-β-Gal) 업스트림에 로우스 사르코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus) 프로모터를 대조군으로서 각 실험에서 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션을 유방암 세포주 또는 HBE 세포 각각에 대해, Lipofectamine 또는 Lipofectamine LTX Reagents(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 24h의 트랜스펙션 후, 유방암 및 HBE 세포를 각각 24h 또는 48h 동안 호르몬으로 처리하였다. 실험 종료시에, 세포를 용리하고, Luciferase Assay System(Promega, Charbonnieres-les-bains, France)을 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 루시퍼라아제 활성 데이터를 표준화하기 위해 베타 갈락토시다아제 활성을 Galacto Star 키트(Applied Biosystems, Courtaboeuf, France)를 사용하여 평가하였다.

실시간 정량 역전사 PCR(qRT-PCR)

TriZOL Reagent(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다.

2μg의 총 RNA를 동안 37℃에서 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사(RT)에 적용하였다. 2μl의 RT 생성물을 희석하고(1:10), Mx3000P 장치(Agilent Technologies, Massy, France)에서, 서열 특이적 프라이머(300 nM) 및 Brillant SYBR GREEN QPCR 마스터 믹스(Fermentas, Saint-Remy-les-Chevreuse, France)를 사용하여 정량 PCR에 적용하였다. 조건은 95℃에서 10분 동안의 1회 사이클에 이어, 95℃에서 30초 동안, 60℃에서 1분 동안 및 72℃에서 30초 동안의 40회 사이클이었다. 유전자 발현 값을 하우스키핑 유전자 36B4에 표준화하였다. 스테로이드 처리 시간은 제시된 유전자에 대해 최적의 자극을 얻기 위해 선택되었다. ALPL 및 G0S8 mRNA를 처리 6h 후에 분석하였다. IEX-1, FASN, 및 BCL2를 처리 24h 후에 분석하였다. 사이클린 A mRNA를 GR 반응에 대해 24h 후 또는 PR 반응에 대해 48h 후에 분석하였다.

삼중수소 티미딘 혼입

24h의 호르몬 처리 후, 세포를 [메틸-1 3H] 티미딘(Perkin Elmer, Courtaboeuf, France)과 함께 37℃에서 각각 HBE 또는 암 세포에 대해 48h 또는 20h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 세포를 PBS 1X로 2회 및 5% 트리클로로아세트산(TCA)으로 1회 세척하였다. 세포를 5% TCA 중에 15분 동안 4℃에서 인큐베이션하고, NaOH 0.1 N 중에 30분 동안 37℃에서 용리하였다. 총 세포 용리액을 5 ml의 Ecolite 섬광 액체(MP biomedical, Illkirch, France)에 첨가하고, 방사능을 β-계수기 HIDEX 300SL(ScienceTec, Courtaboeuf, France)를 이용해 계수하였다.

유세포측정 분석

HBE 또는 MCF-7 및 T-47D 세포에 대해, 각각 96h 또는 48h의 호르몬 처리 후, 세포를 PBS에서 세척하고, 아큐타아제 효소(PAA laboratory, Les Mureaux, France)로 매트릭스를 해리시키고, 5분 동안 1350 rpm에서 원심분리하였다. 세포를 고정시키고, -20℃에서 70% 에탄올 중에 동결시켰다. 분석 전, 세포를 PBS에서 세척하고, PBS 중의 10 μg/ml 프로피디움 요오다이드(0.835 U/ml RNase A 함유)(Sigma, St Quentin Fallavier, France)를 이용해 염색하였다. 각각의 샘플에 대해, 10 000개 이상의 세포를 BD LSR II 유세포측정기(BD Biosciences, Le Pont de Claix, France)에서 계수하였다. 더블릿(doublet) 및 잔해물을 내보낸 후, 사이클 분포를 ModFit LT 소프트웨어(Verity Software House,USA)를 사용하여 분석하였다.

통계 분석

결과를 평균 ± SEM로 표현하였다. 치료의 통계적 유의성을 측정하기 위해, One-way ANOVA 및 Tukey-Kramer 다중 비교 시험을, Instat 3 소프트웨어(GraphPad, USA)를 사용하는 각각의 처리의 상대적인 효율을 비교하기 위해 수행하였다. 오직 2개의 처리를 비교하는 경우, 짝없는 t 시험이 사용되었다. p < 0.05는 유의한 것으로 고려되었다.

결과

PR 유전자 전사활성화에 대한 UPA 영향

PR-유도된 유전자 전사활성화에 대한 UPA 길항제 특성을 분석하기 위해, 정상 인간 유방 상피 세포(HBE) 및 T-47D 유방암 세포주를 MMTV-Luc 리포터 유전자로 트랜스펙션하였다(도 1). 환자 중 PR의 낮고 다양한 양을 발현하는 HBE 세포에서(Malet, et al., 1991. J Clin Endocrinol Metab 73(1): 8-17), 프로게스테론(P)은 유의한 루시퍼라아제 발현을 유도하였다(1.38 ± 0.11 대조군 배 유도, p < 0.05)(도 1a). PR에 대한 UPA의 투여량 연구를 좀더 하기 위해, HBE 세포를 hPR-A 및 hPR-B 발현 플라스미드를 이용해 공동-트랜스펙션하였다(도 1b). UPA 및 RU-486(RU)은 1 000 내지 10 nM의 용량 의존적 방식으로 P 유도된 MMTV11 Luc 전사활성화를 억제하였다. 이후 HBE 세포를 또한, PR 이소형 사이의 UPA 작용을 구별하기 위해 오직 hPR-A 또는 hPR-B로 트랜스펙션하였다. UPA 길항제 성능에 대해서는 각각의 PR 이소형의 레벨을 증가시켜도 차이가 관찰되지 않았다(도 1 c, d). T-47D 세포주에서, UPA 및 RU는 1 000 내지 10 nM 의 유사하고 강력한 PR 길항제 작용을 나타내었다(도 1e). 부분적인 길항제 반응이 또한 1 nM에서 검출되었다(도 1e). HBE 및 T-47D 세포 모두에서, UPA 및 RU는 리포터 유전자 전사에 대해 프로게스테론 작동제 특성을 나타내지 않았다 (도 1 b-e). 상기 결과는 UPA가 정상 및 암성 유방 세포에서 강력한 P 길항제(antagonist)로서 작용하였다는 것을 나타내었다.

PR 표적 유전자의 mRNA 발현에 대한 UPA 활성

100 nM은 HBE 세포에서 완전한 길항제 활성을 발휘하는데 필요한 UPA의 최저 농도였다. 따라서 상기 농도는 HBE 및 T-47D 세포에서 특이적 P 표적 유전자에 대해 UPA의 영향을 추가로 연구하기 위해 선택되었다. 이전에 보고된 바와 같이 PR 발현을 증가시키기 위해, 에스트라디올(E2)을 HBE 세포에 첨가하였다.

지방산 신타아제(FASN)는 정상 유방 세포 분화 뿐 아니라 유선 종양 진행에 연루된다. PR을 통한 프로게스틴에 의한 FASN mRNA의 up3 조절은 시험관 내 및 생체 내에서, 정상 및 종양 유방 세포에서 이전에 입증되었다. 도 2a에 제시된 바와 같이, UPA는 T-47D 세포에서와 같이, HBE에서 FASN mRNA 발현의 P 유도를 예방할 수 있었다. PR에 의해 트랜스펙션된 MDA-MB-231 유방암 세포에서 이전에 보고된 바와 같이(Lin, et al., 2003, Endocrinology 144(12): 5650-5657.), 정상 유방 세포 및 T-47-D 세포에서 P가 사이클린 A mRNA 발현을 하향조절한다는 것을 관찰하였다(도 2b). UPA는 HBE 및 T-47D에서 P-유도된 사이클린 A mRNA 하향-조절을 역행시켰다(도 2b). 이전에, 정상 및 종양 유방 세포에서 프로게스틴 처리 하에 항-세포자멸사 B-세포 CLL/림프종 2(BCL2) 단백질 발현의 감소를 보고하였다(Kandouz, et al., 1996, Int J Cancer 68(1): 120-125; Gompel, et al., 2000, Steroids 65(10-11): 593-598). 도 2c에 제시되는 바와 같이, 또한 HBE 및 T-47D 세포에서 P에 의한 BCL2 mRNA 발현의 감소를 관찰하였다.

그럼에도 불구하고, UPA는 HBE 세포에서 P에 의해 유도되는 BCL2 mRNA 하향-조절을 역행시키지 않은 반면, UPA는 T-47D 세포에서 상기 전사체에 대한 P 억제 효과에 길항작용을 했다(p < 0.01)(도 2c). 조직 비-특이적 알칼리 포스포타아제(ALPL)는 유방암의 전이에 연루되는 P 반응성 유전자이다. T-47D에서, UPA는 ALPL 전사체의 강한 P 매개된 유도를 완전히 억제하였다(도 2d). HBE 세포에서, ALPL mRNA 발현은 P 처리에 의해 변경되지 않았다(데이터 제시되지 않음). UPA는 상기 유전자에 대해 임의의 PR 작동제(agonist) 활성을 나타내지 않았다.

GR 유전자 전사활성화에 대한 UPA 효과

이전에 보고된 바와 같이 많은 양의 GR을 발현하는 HBE 및 MCF-7 세포에서 연구를 수행하였다(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.). 세포를 GRE-Luc 리포터 유전자로 트랜스펙션하고, 덱사메타손(DEX), UPA, 및 UPA 보다 적은 항-글루코코르티코이드 활성을 발휘하는 것으로 알려진 이의 근접 모노-탈메틸화 대사물, CDB-3877(CDB)로 처리하였다(Attardi, et al., 2004, J Steroid Biochem Mol Biol 88(3): 277-288.). 상기 대사물의 감소된 항-글루코코르티코이드 활성을 확인했는데, UPA가 DEX 유도된 루시퍼라아제 전사활성화를 41.3 ± 5.8% 억제한 반면 이의 대사물은 HBE 세포에서 DEX 활성을 억제하는데 실패하였기 때문이다(18.1 ± 11.8%)(도 3a). 그러나, MCF-7 세포에서, UPA 및 CDB 모두는 DEX-유도된 루시퍼라아제 전사활성화에 각각 59 ± 3.4% 및 26.5 ± 9.1로 유의하게 길항작용을 하였다(도 3b). 상기 결과는 HBE에서보다 MCF-7 유방암 세포에서 UPA의 강한 항-글루코코르티코이드 효능을 암시한다.

GR 표적 유전자의 mRNA 발현에 대한 UPA 활성

HBE 및 MCF-7 세포에서 UPA 항-글루코코르티코이드 효과를 더욱 잘 정의하기 위해, 다양한 글루코코르티코이드 반응성 유전자의 mRNA 발현을 DEX 및 UPA 처리 후에 분석하였다. 즉시 초기 반응 3(IEX-1) 및 G-단백질 신호 2의 조절자(G0S8)는 스트레스 조건하에 세포 생존 및 G-단백질 신호에 각각 연루되었다. IEX-1 및 G0S8은 글루코코르티코이드 반응성 유전자로서 특징지어졌다. 도 4a에서 제시되는 바와 같이, IEX-1 mRNA 발현은 DEX에 의해 하향-조절되었고, UPA는 HBE 및 MCF-7 세포에서 상기 반응을 길항작용하지 않았다. 한편, UPA는 HBE 세포에서 G0S8 mRNA의 DEX-유도된 상향-조절에 대해 약하고 비-유의한 길항제 효과를 발휘한 반면, 이의 항-글루코코르티코이드 활성은 MCF-7 세포에서 강력했다(p < 0.001)(도 4b). 사이클린 A 및 BCL2 유전자는 시험관 내 골모세포 및 신경모세포종 각각에서 DEX에 의해 1 조절되는 것으로 이전에 제시되었다. 그러므로 DEX 및 UPA 작용을 HBE 및 MCF-7 세포에서 사이클린 A 및 BCL2 mRNA 발현에 대해 분석하였다. 사이클린 A는 mRNA 발현이 HBE 세포에서 유도되고 MCF-7 세포에서 억제되는 것과 같이, 2가지 유형의 세포에서 DEX에 의해 상이하게 조절되었다(도 4c)(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.). 두 세포 모델에서, UPA는 사이클린 A mRNA 발현에 대한 DEX 효과를 부분적으로 억제하였다. BCL2 mRNA는 HBE 및 MCF-7 세포에서 DEX에 의해 하향-조절되었다(도 4d). 그러나, UPA는 HBE 세포에서 BCL2 mRNA의 DEX 하향-조절을 역행시키지 않은 반면, 이것은 MCF-7 세포에서 상기 효과를 부분적으로 길항작용하였다. UPA는 상기 유전자에 대한 임의의 글루코코르티코이드 작동제 활성을 나타내지 않았다(도 4).

증식 및 세포자멸사에 대한 UPA 작용

P 및 글루코코르티코이드는 정상 및 종양 유방 세포에 대해 상이한 증식 및 생존 효과를 유도할 수 있다. 상기 세포 사건에 대한 UPA의 역할을 평가하기 위해, 3개의 세포 모델에서 증식 및 세포자멸사를 삼중수소 티미딘 삽입(도 5) 및 유세포분석(도 6)에 의해 각각 측정하였다. PR에 대한 UPA 효과를 HBE 및 T-47D에서 연구하고, MCF-7 세포에서는 연구하지 않았는데, 상기 세포주에서 PR 기능성의 결핍을 미리 입증했기 때문이다(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.). GR에 대한 UPA 작용을 HBE 및 MCF-7 세포에서만 연구했는데, 본원에서 사용된 T-47D 세포는 GR을 발현하지 않기 때문이다(Courtin, et al.; 2011, Breast Cancer Res Treat.). HBE 세포에서, UPA는 P에 의해 유도된 항-증식성 효과를 억제하지 않았다(도 5a). 반대로, UPA는 DEX에 의해 유도된 강한 증식 활성을 억제하였다(도 5a). T-47D 세포에서, UPA는 P 항-증식 활성을 역행시켰다(도 5b). MCF-7 세포에서, UPA는 DEX의 약한 항-증식성 효과를 예방하는 경향이 있었다(도 5c). UPA 처리 단독은 임의의 유형의 세포에서 증식에 대해 효과가 없었다(도 5). 세포자멸사는 유세포측정 분석에 의한 세포의 서브-G1 백분율 1의 정량에 의해 측정되었다. 항-세포자멸사 특성을 나타낸 DEX와는 반대로, P는 HBE 세포에서 강력한 프로-세포자멸사 효과를 발휘하였다(도 6a). UPA와 조합되는 경우, 두 호르몬 활성이 역행되었다. 유사하게는, P는 서브-G1 세포의 백분율을 증가시켰고, UPA는 T-47D 세포에서 상기 효과를 억제하는 경향을 보였다(도 6b). MCF-7에서, DEX는 UPA에 의해 완전히 억제되었던 프로-세포자멸사 능력을 보여주었다(도 6c). UPA는 그 자체에 의해 세포자멸사 또는 생존 특성을 갖지 않았으나, HBE, T-47D, 및 MCF-7 세포에서 P 및 DEX 효과의 대부분에 대항하였다.

실시예 2: 누드 마우스에 이종이식된 정상 인간 유방 조직을 가진, 생체 내 실험 모델에 대한 UPA 의 영향.

재료 및 방법

환자

유방 조직 샘플을 유방축소 성형수술을 위한 수술을 진행중인 6명의 여성(연령 29-42세)으로부터, 임상 실험에 대한 프랑스 법에 따라 서면 동의를 받고 수득하였다. 환자는 유방 질환의 병력이 없었고, 헤마톡실린-필록신-사프론(HPS) 염색을 포함하는 면역조직화학 연구로는 오직 정상 유방 조직만을 나타냈다.

마우스에서의 인간 유방 이종이식 및 펠릿 처리

4주령의 난소적출된 암컷 NMRInu/nu 20마리의 무흉선 마우스를 Janvier 연구소(Le Genest Saint Isle, France)에서 구입하였다. 유방 조직 샘플을 6명의 여성(연령 29-42세)으로부터 수득하였다. 인간 유선 샘 조직을 2x2x2 mm 단편으로 절단하고, 4개의 단편을 이후 그룹 당 4마리의 마우스의 등 상에 피하로 이종이식하였다. 4개의 처리 그룹을 수행하였다: 대조군, E2, E2+P 및 E2+P+UPA. 처리는 스테로이드 펠릿을 각각의 마우스의 목 상에 이식함으로써 투여되었다. 실험 조건은 펠릿 내로, 콜레스테롤과 혼합된 투여량 범위의 호르몬을 사용하여 초기에 결정되었다. 혈장 호르몬 농도를 측정하기 위해 치료 2주 및 4주 후에 혈액 샘플 어세이를 수행하였다. 최종적으로, E2의 경우 0.3mg 및 P 및 UPA의 경우 20 mg의 투여량을 사용하였는데, 이것이 예상된 혈액 농도를 제공하였기 때문이다. 대조 그룹의 경우, 오직 콜레스테롤 만을 함유하는 펠릿을 사용하였다. 생리 주기 조건을 재현하기 위해, 마우스에게 대조 및 E2 그룹에, 또는 E+P 및 E2+P+UPA 그룹 각각에, 실험 첫째날에 콜레스테롤, E2 및/또는 UPA 함유 펠릿을 이식하고, 14일째에는 콜레스테롤 또는 프로게스테론 함유 펠릿을 이식하였다. 실험 시작 후 28일에, 마우스를 희생시켰다. 각각의 마우스에 대해 혈액을 수집하였고, 혈청을 호르몬 농도까지 -20℃에 동결시켰다.

분석.

유방 조직 단편을 수집하고 면역조직화학 분석을 위해 파라포름알데히드 용액에 즉시 고정하였다. 모든 연구 프로토콜 및 동물 공간의 환경 조건은 Charles Darwin 실험실 동물의 취급 및 사용을 위한 프랑스 윤리위원회에 의해 승인을 받았다.

호르몬 농도 분석

에스트라디올을 Clinical Assays Estradiol-2(Sorin Biomedica Diagnostics SpA, Saluggia, Italia)를 사용하는 방사능면역어세이에 의해 측정하였다. 프로게스테론 레벨을 Acquity UPLC and Quattro Premier XE(Waters, Milford MA, USA)를 사용하는 UPLC-MSMS에 의해 평가하였다.

UPA 농도를 MPI Research(State College, Pennsylvania, USA)에 의한 LC-MS/MS 기술을 사용하여 측정하였다.

면역조직화학 분석

분열 지수를 Ki67 항체를 사용하여 계산하고, 마우스 내에 이식된 각각의 유방 조직에 대해 측정하였다. 면역조직화학 분석을 BOND-MAX workstation(Leica, Nanterre, France)을 사용하여 수행하였다. 유방 조직 이종이식의 파라핀 섹션을 탈-왁스화시키고 재수화시킨 후, Ki67 항체의 경우 트레이트 복구 용액(pH 6.0) 또는 PR 및 ERalpha 항체의 경우 EDTA 복구 용액(pH 9.0)을 사용하여, 30분 동안 항원 복구시켰다. 이후 섹션을 Ki67과 함께 1:100(Novocastra, NCL5 L-Ki67-MM1), PR과 함께 1:80(Biogenex, MU-328-UC) 또는 ER과 함께 1:300(Novocastra, NCL-L6 ER-6F11) 모노클로날 항체로 인큐베이션하였다. 신호 검출을 위해, Kit Bond Polymer Refire Detection을 사용하였다. 시약을 Menarini-Diagnostic(Rungis, France)에서 구입하였다. 음성 대조군(첫번째 항체 생략됨)을 각각의 세트에 포함시켰다. 각각의 마커의 경우, 양성 세포의 비율 측정은 각각의 마우스 내에 이식된 4개의 유방 조직 단편 내의 총 1 000 소엽 및 1 000 도관 내강 세포들에 대해 수행하였다. 각각의 실험의 경우, 각각의 처리에 대한 최종 백분율은 각 그룹 당 4마리의 마우스에서 수득된 백분율의 평균이었다.

결과

유방 조직 증식에 대한 UPA 작용

본 출원인은 유방 조직에 대한 장기간 투여시 UPA를 연구하기 위해 생체 내 모델을 개발하였다. 인간 정상 유방 조직 샘플을 E2, 또는 E2+P, 또는 E2+P+UPA, 또는 콜레스테롤(대조군)이 처리된 무흉선 마우스에 이종이식하였다(실험 절차 참조). 인간 여성 생리 주기에서 일어나는 E2 및 P 분비의 연대순을 재현하기 위해, E2 펠릿은 실험 시작시 이식한 반면, P 펠릿은 14일에 이식하였다. UPA 펠릿은 만성 치료를 모방하기 위해 실험 시작시에 이식하였다. 처리 방법을 입증하기 위해 마우스 혈청 중의 E2, P, 및 UPA 농도를 측정하였다. 마우스 혈청 중의 평균 E2 농도는 난포 상에서 보고된 낮은 범위의 생리학적 E2 레벨에 상응하는 36.88 ± 4.25 pg/ml(평균 ± SEM)이었다. P 레벨은 중간-황체상 동안 여성에서 평균 P 혈장 레벨에 상응하게 13.05 ± 1.14 ng/ml(평균 ± SEM) 이었다. UPA 농도는 임상 용도에서 관찰된 동일한 범위에서 63.49 ± 10.46 ng/ml(평균 ± SEM) 이었다. 호르몬 레벨은 대조 마우스에서 측정불가능하였다(E2 < 0.8pg/ml; P < 0.4 ng/ml; UPA < 0.5 ng/ml). 도 7a에 제시되는 바와 같이, 에스트라디올 수용체(ER) 및 PR 발현은 이식 전 본래 유방 조직과 비교하여 실험 종료시에 처리된 이식된 유방 단편에서 유지되었다. 치료에 따른 선상(glandular) 소엽 및 도관에서 유방 조직 증식 활성을 측정하기 위해 분열 Ki67발현 마커를 분석하였다(도 7 b, c). 이식된 조직의 대조 그룹에서, 분열 세포의 속도는 소엽에서 1.7 ± 0.4% 도관에서 1.8 ± 0.6%로, 낮고 균일하였다. 증식 활성은 약간 있었으나, 대조 그룹과 비교하였을 때 E2 처리된 그룹의 소엽에서 유의하게 증가하지 않았다(도 7 b, c). 그러나, 도관에서, 분열 지수는 E2 처리된 그룹에서 유의하게 상승하였다(대조 그룹과 비교한 3.1 ± 0.7 배 유도, p < 0.05). 소엽 및 도관 구조에서 E2 처리와 비교하여 E2+P 및 E2+P+UPA 그룹에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 7 b, c). 상기 결과는 유방 조직 중의 증식 활성이 E2에 의해 대부분 매개된다는 것을 강하게 암시한다. 또한 UPA가 정상 상피 유방 세포의 증식 속도에 크게 영향을 주지 않는다는 것을 보여주었다.

실시예 3: 누드 마우스 상에 이종이식된 BRCA1 인간 유방 조직에 대한 UPA 의 영향.

재료 및 방법

돌연변이된 유방 조직 샘플을 BRCA1 에 대한 돌연변이를 가지고 있는 5명의 여성(연령 36-57세)으로부터 수득하였다.

이종이식을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다(실시예 2). 통상, BRCA1 돌연변이를 갖지 않은 환자로부터 4개의 유방 조직 단편 및 BRCA1 돌연변이를 가진 환자로부터 4개의 유방 단편을 동일한 마우스에, 각각 척추의 왼편 및 오른편 상에 이식하였다. 동일한 그룹을 형성하였다.

결과

본 출원인은 BRCA1 돌연변이를 갖는 환자에서 수집된 인간 유방 조직의 증식에 대해 호르몬의 영향을 탐구하기 위해 상기 섹션에 기재된 바와 같은 동일한 모델을 사용하였다. ERα 발현과 관련하여 높은 가변성이 이식되기 전 BRCA1 돌연변이를 갖는 환자의 소엽 및 도관 구조 모두에서 관찰되었다. PR의 기본 발현 레벨은 소엽 구조에서 야생형 대립유전자를 가진 환자와 비교하여 BRCA1 돌연변이를 가진 환자에서 더욱 낮았다. 반대로, BRCA1 상태는 도관 구조에서 PR 발현 레벨에 영향을 주지 않았다. Ki67의 발현을 통한 증식 상태 측정은 야생형 환자와 비교하여, BRCA1 환자로부터 소엽 세포에서는 높았으나, 도관 세포에서는 낮았다.

이식 후, 그러나 처리의 부재하에, ERα 발현의 상당한 통계적 변화는 관찰되지 않은 반면, 소엽 및 도관 구조 모두에서 PR 발현 레벨은 이식 전보다 훨씬 낮은 경향이 있었다. 모든 구조에서, 호르몬 자극의 결핍은 증식 감소를 야기하였다.

E2, P, E2+P 또는 E2+P+UPA로의 28일 처리는 ERα 발현 레벨의 유의한 변화를 야기하지 않았다. 증가된 PR 발현에 대한 경향이 E2, 또는 E2+P 또는 E2+P+UPA를 받은 마우스에서 이식된 유방 단편에서 관찰되었다. 상기 증가는 BRCA1 돌연변이를 가진 3명의 환자의 소엽 구조에서 특히 관찰되었다.

증식이 E2+P 처리의 조합에 의해 촉진되었던 각 경우, UPA는 항증식 활성을 나타냈다(도 8 및 9 참조).

실시예 4: 누드 마우스 상에 이종이식된 인간 유선 유방 종양 성장에 대한 UPA의 영향

재료 및 방법

본 연구에 사용된 이종이식 모델은 HBCx-34였다. HBCx-34는 야생형 P53이 있는, HER2 과발현 및 PR 및 ERα 과발현은 없는 유선관(mammary ductal) 암종이다. 종양은 아드리아마이신/시클로포스파미드에 고도로 반응성이고, 독세탁셀 및 카펙시타빈에 반응성이다. HBCx-34는 악액질 특성은 없었다.

종양이식 모델 유도: 전처리 절차

HBCx-34 종양(P14.0.0/2)을 5-10마리 마우스(기증자 마우스, 계대(n-1), 암컷 무흉선 누드 마우스(Hsd:Athymic Nude-Fox1nu), 6 내지 9주령, Harlan Laboratories(Gannat, France)) 내에 피하 이식하였다. 상기 종양이 1000 내지 2000 ㎣(60 내지 78일)에 달할 때, 기증자 마우스를 자궁경부 탈구에 의해 희생시키고, 종양을 무균적으로 절단하고 절제하였다. 괴사 영역을 제거한 후, 종양을 대략 20 ㎣으로 측정되는 단편으로 절단하고 이식 전에, 임의의 부가적인 성분이 없는 무균 DMEM/F12 배양 배지에 최대 10분 동안 이동시켰다.

6 내지 9주령의 20 g 이상의 체중의 건강한 마우스를 연구에 포함시켰다. 마우스를 케타민/자일라진으로 마취하고, 피부를 클로르헥시딘 용액으로 살균하고, 견갑간 영역의 레벨에서 절개하고, 20 ㎣ 종양 단편을 피하 조직에 위치시켰다. 피부를 클립으로 봉했다.

종양이식 모델 유도: 처리 상

각각의 처리 부분에서 균질한 평균 및 중앙 종양 부피를 제공하도록 이들의 종양 부피에 따라 상이한 그룹으로 할당하였다. 75 내지 144 ㎣의 HBCx-34 종양이 있는 10마리의 마우스/그룹을 이들의 종양 부피에 따라 실험 그룹으로 랜덤화하고, 처리(UPA 130 mg/kg, p.o. 또는 대조 비히클)를 총 42일의 기간 동안 종양의 이식 후 33일에 개시하였다.

분석

마우스를 육체적 외양, 행동 및 임상적 변화에 대해 관찰하였다. 동물을 모든 실험 기간 동안 격주로 칭량하였다. 상이한 치료의 독성을 체중 손실로서 측정하였다.

종양 부피를 모든 실험 기간 동안 격주로 평가하였다. 종양을 처리 종료시 수집하고, 분석을 위해 칭량하고 가공하였다.

결과

UPA 처리는 잘 용인되었고, 유의한 체중 손실은 연구 동안 기록되지 않았다. 실험 기간 동안 처리에 관련된 임상적 관찰은 보고되지 않았다.

처리 개시시 평균 종양 부피(TV)는 대조군 및 UPA-처리된 그룹 각각에서 112.2 ± 7.1 및 102.4 ± 7.7 ㎣ 였다.

처리 종료시에, 625.0 ± 108.6 ㎣의 평균 종양 부피로, 종양 부피의 4.63-배 증가가 대조 그룹에서 측정되었다.

UPA는 항종양 활성을 발휘하였다; 평균 TV는 UPA 처리된 마우스에서 2.17-배 증가하였다(희생시 평균 TV: 332.0 ± 61.0 ㎣). 처리된 그룹 대 대조 그룹에서의 TV의 비(T/C)는 53%였다.

Claims (10)

1. 환자의 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 환자는 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 환자는 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 유방 종양은 유방 암종인 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물은 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물은 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물은 질 또는 자궁내 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 환자는 여성 환자인 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 유방 종양은 암종인 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유방 종양은 양성 종양인 것을 특징으로 하는, 유방 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 울리프리스탈 아세테이트 또는 이의 대사물.

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