KR20150028936A - Pai-1 매개 질환 진단 마커인 hdac11 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HDAC11(histone deacetylase 11) 유전자 또는 이의 단백질의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 HDAC11의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 허혈/재관류(Ischemia/reperfusion) 손상 진단용 조성물 및 키트; HDAC11 발현 수준을 측정하여 신장 허혈/재관류 손상 진단을 위한 정보를 제공하는 방법; PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 HDAC11을 이용하여 PAI-1 매개 질환에 대한 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 HDAC11(histone deacetylase 11) 유전자 또는 이의 단백질의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 HDAC11의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 허혈/재관류(Ischemia/reperfusion) 손상 진단용 조성물 및 키트; HDAC11 발현 수준을 측정하여 신장 허혈/재관류 손상 진단을 위한 정보를 제공하는 방법; PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 HDAC11을 이용하여 PAI-1 매개 질환에 대한 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
플라스미노겐 활성인자 억제제-1(PAI-1)은 효소 전구체인 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 제제인, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA) 및 유로키나제 플라스미노겐 활성인자(uPA)의 세린 프로테아제 억제제이다. 피브린의 축적이 혈액 응고를 이끌 수 있는 반면, 피브린의 과도한 감소는 출혈을 이끌 수 있으므로, 섬유소용해의 조절 작용을 하는 PAI-1은 정상적인 혈관 작용의 중요한 조절 요소이다. PAI-1는 또한 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 플라스민 생성을 불활성화시킴으로써 조직 섬유증과 암세포의 전이에 있어서 중요한 역활을 담당하는 것으로 알려져 있다(Takeshita, K, et al., American Journal of Physiology, 2004(2):449-456; Eur J Med Res. 2013 Aug 28;18(1):28.). PAI-1은 또한 신장, 폐, 심혈관 및 대사 질환, 및 암의 병태생리학과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 특히, PAI-1을 억제시키는 경우, 안지오텐신-II-유도된 대동맥 리모델링에 대해 보호 효과를 나타내는 것으로 보고된바 있다(Weisberg. AD et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2005, 25:365-371). 특히, PAI-1은 피브린이 조직 내에 축척된 염증상태에서 섬유화를 촉진시키는 역할을 하고 있어, PAI-1의 감소가 허혈/재관류에 의한 장기 손상에 있어 중요함이 알려져 있다(J Thorac Cardiovasc Surg. 2009 May;137(5):1241-8.). 또한 PAI-1은 uPA형 수용체의 활성을 억제하여, 암세포의 이동, 증식 및 생존을 억제해 항암인자로 작용함이 알려져 있다(Cardiovas Hematol Disord Drug Targets, 2013 Aug; 3(2):123-132).
허혈(Ischemia)이란 생리적 기능에 요구되는 산소 요구량보다 산소공급이 부족한 상태로서 국소적 혈류의 감소를 말한다. 재관류(Reperfusion)란 혈액이 다시 조직에 공급되는 것으로, 허혈성 조직의 생존에 필수적이나, 허혈 동안 산화성 손상에 매우 민감한 경향이 있는 조직들의 재산화로 인해 조직의 손상을 더욱 가속화시킨다. 이를 ‘허혈 및 재관류 (I/R) 손상’이라고 부른다. 허혈 및 재관류의 결과는 가역적 및 비가역적 세포조직 손상, 세포 치사 및 기관 기능의 효율감소 등으로 나타난다. 허혈 및 재관류는 인간의 생명과 직결되는 질병 즉, 심장관련사망의 주원인인 허혈성 심질환, 뇌졸중, 쇼크뿐만 아니라 암 및 노화 등과 밀접하게 관련된다. 그 중 신장 허혈/재관류 손상은 급성신부전의 중요한 원인이며, 이는 조직학적 손상, 기능 저하 및 사망에까지 이르게 할 수도 있다. 허혈/재관류 손상은 다양한 염증 유발 인자와 산화 스트레스 관련 신호 전달계와 관련이 있으며, 이를 억제하면 허혈/재관류 손상을 줄일 수 있다. 여기에 더하여 혈관 내피세포의 부종과 미세혈관의 응고에 의한 재관류의 지연 또한 허혈/재관류 손상에 중요한 원인 중 하나이다. 신장 질환에서 성적 다양성과 성호르몬의 역할에 대한 연구는 지난 수십 년 동안 계속되어 왔다. 이전 여러 연구들에서 여성호르몬의 보호효과가 보고되어 왔으나, 허혈/재관류 손상과 같은 신장 손상의 경우, 남성의 감수성이 증가하는 것에 남성 호르몬이 매우 중요한 역할을 한다는 것이 보고된 바 있다. 다만, 이와 관련된 기전에 대해서는 구체적으로 알려진 바 없었다.
HDAC(histone deacetylase)은 히스톤의 ε-N-아세틸 라이신 아미노산으로부터 아세틸 기(O=C-CH3)를 제거하는 활성을 가진 효소의 한 종류이다. HDAC은 히스톤의 탈아세틸화를 가져와 DNA를 감싸고 있는 히스톤이 빽빽하게 배열되도록 하고, 이에 따라 전사인자 등의 접근이 제한되어 유전자 발현 감소를 가져올 수 있다. 따라서, 유전자 발현에 있어 아세틸화 또는 탈아세틸화 조절은 중요한 문제이며, 아세틸화의 경우 히스톤 아세틸전이효소에 의해 매개된다. 이러한 HDAC은 크게 클래스 I, IIA, IIB, III 및 IV로 나뉘며 현재까지 19 여종이 알려져 있다.
또한, HDAC 억제제가 항염증 효과와 항섬유화 효과를 가지므로 HDAC을 타겟으로 하는 신장 기능저하 치료제 개발이 좋은 전략이 될 수 있음이 최근 제안된 바 있으나, 동물실험에서 사용된 이들 HDAC 억제제들은 HDAC의 특정 아형에 특이적이지 않은 광범위 HDAC 억제제여서, 신장 질환에서의 개별적인 HDAC의 역할을 알기 어려워 신장 질환에 적용하기에 제한점이 많다. 대식세포를 이용한 실험관 시험 또한 이를 뒷받침하는데, HDAC을 전체적으로 억제하는 약물과 HDAC1 만을 억제하는 약물을 처리하였을 때 endothelin-1(Edn)-1, chemokine ligand 7(Ccl-7), monocyte chemotactic protein-3(MCP-3), IL12p40과 같은 염증 유발 인자의 발현은 억제된 반면 다른 염증 매개 인자인 PAI-1은 오히려 증가되었다. 그러므로 염증 반응에 있어 HDAC 억제제들의 임상 적용을 확립하기 위해서는 각각의 염증 유발 인자의 발현에 대한 HDAC의 특정 아형의 개별적인 역할과 조절 기전을 명확히 밝히는 것이 중요하다. 이러한 결과들은 허혈/재관류 손상으로 유도되는 염증성 질환의 효과적인 제어를 위한 기초자료로 이용될 것이다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 신장 허혈/재관류 손상을 효과적으로 진단할 수 있으며, PAI-1의 발현을 조절하여 PAI-매개 질환에 대한 치료 타겟을 규명하고자 예의 노력한 결과, HDAC11이 신장 허혈/재관류 손상시 정상 대조군에 비하여 그 발현이 현저하게 감소하며, 이의 발현 감소를 통하여 PAI-1 단백질 발현이 유도되어 신장 손상을 가져옴을 확인하였다. 이때, HDAC11이 PAI-1 단백질의 발현을 직접적으로 조절함을 확인하여, HDAC11이 신장 허혈/재관류 손상에 대한 바이오 마커로서 사용될 수 있으며, 나아가 PAI-1 매개 질환의 치료에 있어 직접적인 표적이 될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 HDAC11(histone deacetylase 11) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 허혈/재관류(Ischemia/reperfusion) 손상 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단용 키트을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장 허혈/재관류 손상이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 HDAC11(Histone deacetylase 11) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 HDAC11의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제를 포함하는, PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환 의심 개체의 분리된 신장 시료, 또는 PAI-1 매개 질환을 가진 동물 모델에 시험후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험후보물질이 처리된 시료 또는 동물 모델에서 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 HDAC11 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, PAI-1 매개 질환에 대한 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 HDAC11(histone deacetylase 11) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, 신장 허혈/재관류 손상이 유발된 남성의 경우, 정상 대조군에 비하여 HDAC1, 5, 8, 9 및 11의 발현이 감소하며, 특히 HDAC11의 발현 감소로 PAI-1 발현을 증가시킴을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에서는 HDAC11은 PAI-1 유전자의 프로모터 부위에 직접적으로 결합하여 이의 탈아세틸화를 가져와, PAI-1 유전자의 발현을 감소시키는 역할을 수행하여, PAI-1에 대한 직접적인 발현 조절자로 작용함을 확인하였다. 또한, 허혈/재관류가 유발된 경우, HDAC11의 발현 감소가 PAI-1 증가에 따른 신장 허혈/재관류 손상의 주요한 원인임을 규명하여, 신장 허혈/재관류 손상이 의심되는 개체에서 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정함으로써, 신장 허혈/재관류 손상을 진단할 수 있음을 규명하였다.
본 발명에서 용어, "신장 허혈/재관류 손상"은 허혈/재관류에 의하여 발생한 신장 손상을 의미한다. 허혈(ischemia)이란, 조직, 장기의 산소 수요에 대해 그 공급원인 혈류가 절대적 또는 상대적으로 부족한 상태로서 국소적 혈류의 감소를 말하며, 재관류(reperfusion)란 혈액이 다시 조직에 공급되는 것으로, 허혈성 조직의 생존에 필수적이나, 허혈 동안 산화성 손상에 매우 민감해진 조직에 재산화를 가져와 조직의 손상을 더욱 가속화시킬 수 있다. 이를 허혈 및 재관류 손상이라 부른다. 보통, 신장 이식 수술에서 기증자로부터 적출된 장기는 혈류공급을 받지 못하는 허혈 상태에 있다가, 수혜자의 혈관을 이어주게 되면 수혜자의 따뜻한 피가 흐르게 되는 재관류 상태가 되면서 수혜자의 면역세포에 의한 염증반응과 면역반응이 증폭되어 장기의 손상과 장기의 수명 단축을 가져올 수 있다. 본 발명에서는 남성에서 허혈/재관류에 의하여 신장 손상이 야기되는 경우, HDAC11 유전자의 발현 수준이 낮아지고 이에 따라 PAI-1 유전자의 프로모터의 아세틸화가 야기되어 PAI-1 발현 수준이 높아짐으로 인해, 신장 허혈/재관류 손상이 야기되는 것을 확인하였다. 따라서, HDAC11 유전자는 신장 허혈/재관류 손상에 있어 새로운 바이오마커로서, 이의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하여 신장 허혈/재관류 손상을 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어, "HDAC11(histone deacetylase 11)"은 히스톤 단백질 상의 ε-N-아세틸 라이신 아미노산에서 아세틸 기를 제거하는 활성, 즉 탈아세틸화 활성을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 HDAC11은 HDAC Ⅰ 내지 Ⅳ 클래스 중 Ⅳ 클래스에 속하며, 본 클래스에 현재까지 알려진 다른 HDAC은 속하지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 HDAC11은 PAI-1 발현 억제능을 지니며, 신장 허혈/재관류 손상 여부를 구분할 수 있는 바이오마커를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따르면, 허혈/재관류가 일어나는 경우 남성 호르몬의 영향으로 HDAC11의 발현이 현격히 감소하고 이에 따라 PAI-1 발현이 증가되어 신장 손상이 야기된다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 진단은 신장 허혈/재관류 손상의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 특히 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질을 특이적으로 인지하는 제제를 이용하여 상기 유전자의 발현 수준을 확인함으로써, 신장 허혈/재관류 손상 여부를 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제"는 신장 허혈/재관류 손상을 가지는 경우 그 발현이 감소하는 마커인 HDAC11의 발현 수준을 확인함으로써, 신장 허혈/재관류 손상 진단에 사용할 수 있는 분자를 의미한다.
이와 같은 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "mRNA 수준 측정"이란 신장 허혈/재관류 손상을 진단하기 위하여, 생물학적 시료에서 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 HDAC11 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, HDAC11 등의 유전자에 대한 서열정보는 미국국립보건원 GenBank로부터 쉽게 얻을 수 있어, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 개의 염기 내지는 수백 개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링이 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자 및 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 용어, "단백질 수준측정"이란 신장 허혈/재관류 손상 정도를 탐지하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머 등을 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
이 중에서 항체를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "앱타머"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)을 의미한다. 앱타머는 작은 사이즈 및 낮은 면역원성을 가지며 항체에 비하여 원하는 앱타머를 개발하는데 걸리는 시간이 짧으므로, HDAC11에 특이적인 앱타머를 이용하여 HDAC11 발현 정도를 검출함으로써 신장 허혈/재관류 손상을 진단할 수 있다(Int J Biochem Mol Biol 2013;4(1):27-40).
또한, 상기 조성물은 HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는, HDAC11 외에도 HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9 유전자의 발현이 신장 허혈/재관류 손상을 가진 수컷 개체에서 감소된 것을 확인하였다(도 3). 따라서, 상기 HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)"은 조직 플라스미노겐 활성화 효소와 결합하여 그 작용을 저지하는 물질로서, 지방세포와 같은 다른 조직에서도 분비되기는 하나, 주로 내피세포에서 생성된다. PAI-1은 다양한 종류의 암, 비만, 당뇨병, 염증성 질환 및 대사성 신드롬과 같은 여러 질병 상태에서 증가된 수준으로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 혈전증의 발병 빈도 증가, 만성신부전, 급성신부전 및 동맥경화와도 연관된 것으로 알려져 있다. 특히, PAI-1은 피브린이 조직 내에 축척된 염증상태에서 섬유화를 촉진시키는 역할을 하고 있어, PAI-1의 감소가 허혈/재관류에 의한 장기 손상에 있어 중요함이 알려져 있다(J Thorac Cardiovasc Surg. 2009 May;137(5):1241-8.). 본 발명에서는, 신장 허혈/재관류 손상에서 HDAC11 유전자의 발현이 감소됨을 확인함과 동시에, PAI-1 유전자의 프로모터에 HDAC11이 결합하여 PAI-1 유전자의 발현을 음성적으로 조절하는 역할을 수행함을 확인함으로써 감소된 HDAC11 유전자의 발현이 PAI-1 유전자의 발현 증가를 가져올 수 있음을 확인하였다. 따라서, HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 때, PAI-1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출하는 제제를 추가로 포함하는 경우, 신장 허혈/재관류 손상을 보다 더 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 허헐/재관류 수술을 받은 수컷 쥐의 경우, 정상 대조군과 비교하였을 때, PAI-1 유전자의 발현이 증가하며, 이러한 현상은 암컷 및 정소 적출을 받은 수컷 쥐에서는 나타나지 않음을 확인하였다(도 1). 또한, PAI-1 억제제를 처리한 경우, 허혈/재관류에 의해 현저히 상승한 혈장 크레아틴 농도가 감소하며 조직 형태학적으로 관찰하였을 때도 신장 허혈/재관류 손상이 현저히 개선되는 효과를 나타내었다(도 2). 또한, 허혈/재관류에 따른 신장 조직에서의 HDAC 유전자의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과, 허혈/재관류 수술을 받은 수컷 쥐의 경우, HDAC1, 5, 7, 9 및 11 유전자의 mRNA 발현이 감소하며, 특히 HDAC11의 발현 감소 정도가 컸다(도 3). 또한, LPS로 활성화된 대식세포주를 이용하여, 신장 허혈/재관류에 의해 유도되는 염증 반응에 대한 in vitro 실험 모델로 확인한 결과, LPS를 처리하였을 때, PAI-1 발현은 10배 이상 증가하였고, 이때 HDAC11의 발현은 현저히 감소한 반면, 다른 HDAC1, 5, 8 및 9의 발현은 변화를 나타내지 않아, HDAC11 유전자가 신장 허혈/재관류 손상에 대한 우수한 바이오마커 및 나아가 염증성 질환에 대한 치료 표적이 될 수 있음을 확인하였다(도 4). 또한, 보다 구체적으로 HDAC11이 PAI-1 유전자의 직접적인 발현 조절자인지 여부를 확인한 결과, HDAC11을 Knock-down 시킨 경우, 반대로 PAI-1 유전자의 발현이 증가하였으며(도 5), HDAC11이 PAI-1 유전자의 프로모터 부위에 결합하며 히스톤의 아세틸화 조절을 통하여 PAI-1 유전자의 발현 조절을 매개함을 확인하였다(도 6 및 7). 종합하면, HDAC11은 신장 허혈/재관류 손상에 대한 바이오마커이며, 이의 발현 또는 활성 증가를 통하여 신장 허혈/재관류 손상을 치료할 수 있음을 나타낸다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 조성물, 신장 허혈/재관류 손상 및 진단에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 마커 검출용 키트에는 증식배지에서 배양함에 따라 발현이 증가 또는 감소하는 마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구 및 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소의 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 마커 검출용 키트는 바람직하게는 RT-PCR 키트, DNA 키트, 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩에 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체가 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 지방유래 줄기세포의 분화능력 탐지에 있어 보다 유리하다.
상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있으며, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 신장 허혈/재관류 손상이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 HDAC11(Histone deacetylase 11) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 허혈/재관류, HDAC11 및 진단에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"는 HDAC11 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, HDAC11은 신장 허혈/재관류 손상이 유도된 개체에서는 정상 대조군에 비하여 HDAC11의 발현이 감소하므로, 상기에서 측정된 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군보다 감소하면 신장 허혈/재관류 손상으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 신장 허혈/재관류 수술을 받아, 손상이 유도된 수컷 개체의 경우, HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9 유전자의 발현이 감소되는 경향을 보였으므로, 추가로 HDAC1, 5, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이때, 측정된 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군보다 감소하고, HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군보다 감소하면, 신장 허혈/재관류 손상으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 추가로 PAI-1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에서는, HDAC11 유전자의 발현 감소를 통하여 HDAC11에 의한 PAI 유전자의 탈아세틸화가 감소하여 PAI-1 유전자의 발현이 증가함을 확인하였으므로, HDAC11 유전자의 발현 감소와 함께 PAI-1 유전자의 발현 증가를 확인함으로써, 신장 허혈/재관류 손상을 진단할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 HDAC11의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제를 포함하는, PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 HDAC11 및 PAI-1에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서는, PAI-1의 발현 조절에 있어 HDAC11이 직접적인 조절자임을 규명하였다. 구체적으로, PAI-1의 프로모터 부위에 HDAC11이 결합하여 히스톤의 탈아세틸화를 가져옴으로써, PAI-1의 발현을 감소시키는 역할을 수행함을 규명하였다. 따라서, HDAC11의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제는 PAI-1의 발현 또는 활성 증가로 인하여 발병 또는 진행되는 다양한 PAI-1 매개 질환에서, 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "PAI-1 매개 질환"은 PAI-1의 발현 또는 활성 증가가 질병의 발병 또는 진행에 주요한 요인으로 관계하는 질환으로서, 특별히 이에 제한되지는 않으나, 그 예로 신장 허혈/재관류 손상, 만성신부전, 급성신부전, 섬유증, 비만, 당뇨병, 혈전증, 염증성 질환 또는 동맥경화일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 염증 세포에서 HDAC11을 Knock-down 시킨 경우, PAI-1 발현이 현저하게 증가함을 확인하여, PAI-1 발현이 중요하게 관여하는 염증성 질환에서 HDAC11의 관련성을 확인하였다(도 5).
본 발명에서 용어, "HDAC11의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질"은 HDAC11에 직접적 또는 간접적으로 작용하는 방식을 통하여 이의 발현을 증가시키거나 활성을 증가시키는 물질을 의미한다. 이러한 HDAC11의 활성 또는 발현을 증가시키는 물질은, 화합물, HDAC11 단백질을 코딩하는 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 포함할 수 있다. 여기서, 단백질은 세포 내에 단백질을 도입시킬 수 있는 세포 투과성 펩타이드과 같은 전달체를 융합 단백질 또는 접합체(conjugate) 등의 형태로 존재할 수 있다. HDAC11의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질은 PAI-1의 발현 감소를 가져오므로, 이에 따라 PAI-1 매개 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 PAI-1 매개 질환의 발병을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 PAI-1 매개 질환 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한 없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환 의심 개체의 분리된 신장 시료, 또는 PAI-1 매개 질환을 가진 동물 모델에 시험후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험후보물질이 처리된 시료 또는 동물 모델에서 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 HDAC11 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, PAI-1 매개 질환에 대한 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 PAI-1 매개 질환 및 HDAC11에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서는, PAI-1 발현이 HDAC11에 의하여 음성적으로 조절되며, 이는 HDAC11이 PAI-1 프로모터에 결합하여 탈아세틸화를 가져오는 역할을 수행하는 것에 기인하는 것임을 확인하였다. 특히, PAI-1 매개 질환 중 대표적으로 PAI-1 발현이 증가되어 있는 질환인 신장 허혈/재관류 손상에서, PAI-1 발현이 HDAC11에 의하여 조절되며, PAI-1 활성이 억제되는 경우, 신장 허혈/재관류 손상이 치료될 수 있음을 확인하여, PAI-1의 직접적인 조절자인 HDAC11의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 PAI-1 매개 질환에 대한 치료제로 스크리닝할 수 있음을 규명하였다.
따라서, 상기 방법은 (c) 시험후보물질이 처리된 시료에서 측정된 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 HDAC11 단백질의 활성이 시험후보물질이 처리되지 않은 대조군에 비하여 증가한 경우, PAI-1 매개 질환에 대한 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 신장 허혈/재관류 손상 진단 마커인 HDAC11은 허혈/재관류에 따른 신장 손상에 특이적으로 발현이 감소하며, 신장 허혈/재관류 손상을 가져오는 주요 매개자인 PAI-1의 발현에 직접적으로 관여하므로, 이를 허혈/재관류에 따른 신장 손상의 진단 및 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, HDAC11은 PAI-1 발현에 대한 직접적인 조절자로 작용하므로, 이의 활성 또는 발현을 증가시키는 물질은 PAI-1 발현 증가에 의한 질환, 즉 PAI-1 매개 질환에 대한 치료제로서 사용될 수 있다.
도 1은, 신장 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-I 발현은 남성 성별에 영향을 받으며, 특히 남성 호르몬에 영향을 받음을 나타내는 것으로, PAI-1 프라이머를 이용한 PCR 전기영동 결과를 나타낸다. (a) 정상 수컷, 정소절제 수컷, 정상 암컷, 그리고 난소절제 암컷 군에서의 sham 또는 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1의 mRNA양. (c) DHT를 처리 또는 처리하지 않은 정상 수컷, 정소절제 수컷 군에서의 sham 또는 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1의 mRNA양. (b 및 d) 18sRNA로 보정된 PAI-1의 mRNA양. (e) 허혈/재관류 수술 후 명시된 시간에 취한 조직 샘플에서 행한 PAI-1 특이적 항체를 이용한 면역 블롯 결과. (f) β-actin으로 보정한 PAI-1 단백질 양. 결과는 평균 ± 표준오차 (개체수 = 4)로 표기하였다.
*P<0.05,**P<0.01vs.각각의 sham 군. #P<0.05,##P<0.01.NS,유의성 없음; S, sham 군; I/R, 허혈/재관류 수술 24시간 후; Veh, vehicle; DHT, dihydrotestosterone; Int, intact; Orch, orchiectomy (정소절제술); Ovx, ovariectomy (난소절제술).
도 2는, 신장 허혈/재관류에 의해 유도되는 신장 손상이 PAI-1억제제에 의해 염증반응이 억제됨으로써 완화됨을 나타내는 도이다. (a) 각 군에서의 혈장 크레아티닌 농도. 결과는 평균 ± 표준오차 (개체수 = 4) 로 표기하였다. **P<0.01 vs. 각각의 sham군. ##P<0.01 vs. 위약을 처리한 허혈/재관류 수술군 (b) 신장조직에서 과요오드산 쉬프 염색한 대표적인 도로서, 스케일 바는 50㎛이다. (c) 손상 지수를 나타낸 것으로, 결과는 평균 ± 표준오차 (개체수 = 4) 로 표기하였다. **P<0.01 vs. 각각의 sham군. ##P<0.01 vs. vehicle을 처리한 허혈/재관류 수술군. (d) PAI-1 억제제를 전처리 또는 처리하지 않은 군에서 sham 또는 신장 허혈/재관류 수술한 다음, 각 군에서의 신장 조직의 종단면을 대표적으로 나타낸 도이다. (e) PAI-1 억제제를 전처리 또는 처리하지 않은 군에서 sham 또는 신장 허혈/재관류 수술한 다음, 각 군에서의 F4/80 또는 Ly6G 특이적 항체를 이용하여 면역 블롯한 대표적인 결과이다. (f,g) PAI-1 억제제를 전처리 또는 처리하지 않은 군에서 sham 또는 신장 허혈/재관류 수술한 다음, 각 군에서의 F4/80, Ly6G 단백질 발현양을 β-actin으로 보정하여 면역 블롯 결과를 나타낸 것이다. 결과는 평균 ± 표준오차(개체수 = 4)로 표기하였다.
*P<0.05,**P<0.01 vs. 각각의 sham군. #P<0.05 vs. vehicle을 처리한 허혈/재관류 수술 군.
도 3은, 허혈/재관류 수술로 유도되는 신장에서의 HDAC9과 HDAC11의 억제는 남성 성별에 의존적이고 특히 남성 호르몬에 의존적임을 보여주는 도이다. (a) HDAC 1-11 프라이머를 이용한 PCR 전기영동 결과이며, (b 내지 l) 정상 수컷 , 정소절제 수컷, 정상 암컷, 그리고 난소절제 암컷 군에서의 sham 또는 허혈/재관류 수술로 유도되는 HDAC 1-11 mRNA양을 18sRNA로 보정한 값을 나타낸 것이다. 결과는 평균 ± 표준오차(개체수 = 4)로 표기하였다.
*P<0.05,**P<0.01vs.각각의 sham군. *P<0.05 vs. its own sham.**P<0.01vs.각각의 sham군. ##P<0.01.vs.허혈/재관류 수술을 한 정상군. S, sham군; I/R, 허혈/재관류 수술 24시간 후; Veh, 위약; DHT, dihydrotestosterone; Int, intact; Orch, 정소절제술; Ovx, 난소절제술.
도 4는, RAW264.7 세포의 지질 다당류(lipopolysaccharide) 자극 시 PAI-1 발현 양상이 HDAC11 발현양상과 반대되는 결과를 보임을 나타내는 도이다. 구체적으로, LPS 처리한 RAW264.7 세포에서 PAI-1과 HDAC1, 5, 8, 9 및 11 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. (a) PCR 산물의 전기영동 사진이며, (b 내지 g)는 각각 (b) PAI-1, (c) HDAC1, (d) HDAC5, (e) HDAC8, (f) HDAC9, (g) HDAC11 mRNA양을 18sRNA로 보정한 결과를 나타낸 것이다. 3개의 개별적 실험에서부터 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
*P<0.05 vs 위약군. **P<0.01 vs. 위약군. Veh, 위약; LPS, 지질다당류.
도 5는, RAW264.7 세포에서 HDAC11은 PAI-1 발현을 억제하는 결과를 나타냄을 보이는 것이다. 구체적으로, RAW 264.7에 세포에 HDAC11의 siRNA를 처리한 후 PAI-1의 발현을 조사하였다. (a) PAI-1과 HDAC 11 프라이머를 이용한 PCR 전기영동 사진. (b) HDAC11과 (c) PAI-1 mRNA량을 18sRNA로 보정한 그래프이다(n=3). 결과는 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
*P<0.05 vs. 실험군. (d) HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 그리고 10 프라이머를 이용한 PCR 전기영동. Ctr, 대조군; KD, HDAC11 knock-down.
도 6은, 허혈/재관류 수술 후 HDAC11의 감소는 남성 호르몬 의존적임을 나타내는 도이다. 실험군 생쥐들에 허혈/재관류 수술을 시행한 후에 (a,b) HDAC11 mRNA와 (c,d) 단백질의 발현을 각각 PCR과 웨스턴 블롯으로 조사한 결과이다.
**P<0.01 vs. its own sham,^^P<0.01vs.허혈 /재관류 수술한 위약 처리 정상 수컷군. $$P<0.01 vs. 허혈/재관류 수술한 위약 처리 수컷 정소절제술군. 결과는 평균 ± 표준오차 (개체수 = 4) 로 표기함. S, Sham (개복수술)군; I/R, 허혈 / 재관류 수술군; Veh, 위약; DHT, dihydrotestosterone.
도 7은, PAI-1 프로모터로의 HDAC11의 결합과 분리는 히스톤 H3의 아세틸화를 조절함을 나타내는 도이다. PAI-1 프로모터를 분석하여 각 부위별 프라이머를 디자인하고, RAW 세포와 신장 조직을 이용하여 ChIP assay를 실시하였다. (a) PAI-1의 프로모터 분석 결과 얻은, 전사 조절인자 결합 부위. (b,c) 두 번의 ChIP 분석으로부터 얻은, 각각의 특이적인 PAI-1 프로모터 프라이머를 이용한 ChIP PCR 전기영동 결과. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G(negative;N) 또는 HDAC11 항체 (HD)를 이용하여 실시하였다. (b) RAW264.7 세포에 위약 또는 LPS를 4시간 동안 처리하였고, (c) 정상 또는 정소절제 수컷 생쥐를 sham 또는 허혈/재관류 수술하였다. (d) 두 번의 ChIP 분석으로부터 얻은 각각의 특이적인 PAI-1 프로모터 프라이머를 이용한 ChIP PCR 전기영동 결과를 나타낸 것이다. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G(negative;N) 또는 아세틸화 히스톤 H3(AcH) 항체를 이용하여 실시하였다. (e) 정상 암컷, 난소절제 암컷 군의 sham, 허혈/재관류 수술군의 신장 조직에서 PAI-1 pm 2 프라이머를 이용하여 행한 두 번의 ChIP PCR 전기영동 중 대표적인 결과이다. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G(negative;N) 또는 HDAC11 항체(HD)를 이용하여 실시하였다. (f) 정상 암컷, 난소절제 암컷 군의 sham, 허혈/재관류 수술군의 신장 조직에서 PAI-1 pm 3 프라이머를 이용하여 행한 두 번의 ChIP PCR 전기영동 중 대표적인 결과이다. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G (negative;N) 또는 아세틸화 히스톤 H3 (AcH) 항체를 이용하여 실시하였다. LPS, 지질다당류; I, input; N, 정상 토끼 면역글로불린G; HD, HDAC11; AcH, 아세틸화 히스톤 H3; pm, promoter.
*P<0.05,**P<0.01vs.각각의 sham 군. #P<0.05,##P<0.01.NS,유의성 없음; S, sham 군; I/R, 허혈/재관류 수술 24시간 후; Veh, vehicle; DHT, dihydrotestosterone; Int, intact; Orch, orchiectomy (정소절제술); Ovx, ovariectomy (난소절제술).
도 2는, 신장 허혈/재관류에 의해 유도되는 신장 손상이 PAI-1억제제에 의해 염증반응이 억제됨으로써 완화됨을 나타내는 도이다. (a) 각 군에서의 혈장 크레아티닌 농도. 결과는 평균 ± 표준오차 (개체수 = 4) 로 표기하였다. **P<0.01 vs. 각각의 sham군. ##P<0.01 vs. 위약을 처리한 허혈/재관류 수술군 (b) 신장조직에서 과요오드산 쉬프 염색한 대표적인 도로서, 스케일 바는 50㎛이다. (c) 손상 지수를 나타낸 것으로, 결과는 평균 ± 표준오차 (개체수 = 4) 로 표기하였다. **P<0.01 vs. 각각의 sham군. ##P<0.01 vs. vehicle을 처리한 허혈/재관류 수술군. (d) PAI-1 억제제를 전처리 또는 처리하지 않은 군에서 sham 또는 신장 허혈/재관류 수술한 다음, 각 군에서의 신장 조직의 종단면을 대표적으로 나타낸 도이다. (e) PAI-1 억제제를 전처리 또는 처리하지 않은 군에서 sham 또는 신장 허혈/재관류 수술한 다음, 각 군에서의 F4/80 또는 Ly6G 특이적 항체를 이용하여 면역 블롯한 대표적인 결과이다. (f,g) PAI-1 억제제를 전처리 또는 처리하지 않은 군에서 sham 또는 신장 허혈/재관류 수술한 다음, 각 군에서의 F4/80, Ly6G 단백질 발현양을 β-actin으로 보정하여 면역 블롯 결과를 나타낸 것이다. 결과는 평균 ± 표준오차(개체수 = 4)로 표기하였다.
*P<0.05,**P<0.01 vs. 각각의 sham군. #P<0.05 vs. vehicle을 처리한 허혈/재관류 수술 군.
도 3은, 허혈/재관류 수술로 유도되는 신장에서의 HDAC9과 HDAC11의 억제는 남성 성별에 의존적이고 특히 남성 호르몬에 의존적임을 보여주는 도이다. (a) HDAC 1-11 프라이머를 이용한 PCR 전기영동 결과이며, (b 내지 l) 정상 수컷 , 정소절제 수컷, 정상 암컷, 그리고 난소절제 암컷 군에서의 sham 또는 허혈/재관류 수술로 유도되는 HDAC 1-11 mRNA양을 18sRNA로 보정한 값을 나타낸 것이다. 결과는 평균 ± 표준오차(개체수 = 4)로 표기하였다.
*P<0.05,**P<0.01vs.각각의 sham군. *P<0.05 vs. its own sham.**P<0.01vs.각각의 sham군. ##P<0.01.vs.허혈/재관류 수술을 한 정상군. S, sham군; I/R, 허혈/재관류 수술 24시간 후; Veh, 위약; DHT, dihydrotestosterone; Int, intact; Orch, 정소절제술; Ovx, 난소절제술.
도 4는, RAW264.7 세포의 지질 다당류(lipopolysaccharide) 자극 시 PAI-1 발현 양상이 HDAC11 발현양상과 반대되는 결과를 보임을 나타내는 도이다. 구체적으로, LPS 처리한 RAW264.7 세포에서 PAI-1과 HDAC1, 5, 8, 9 및 11 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. (a) PCR 산물의 전기영동 사진이며, (b 내지 g)는 각각 (b) PAI-1, (c) HDAC1, (d) HDAC5, (e) HDAC8, (f) HDAC9, (g) HDAC11 mRNA양을 18sRNA로 보정한 결과를 나타낸 것이다. 3개의 개별적 실험에서부터 결과를 얻었으며, 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
*P<0.05 vs 위약군. **P<0.01 vs. 위약군. Veh, 위약; LPS, 지질다당류.
도 5는, RAW264.7 세포에서 HDAC11은 PAI-1 발현을 억제하는 결과를 나타냄을 보이는 것이다. 구체적으로, RAW 264.7에 세포에 HDAC11의 siRNA를 처리한 후 PAI-1의 발현을 조사하였다. (a) PAI-1과 HDAC 11 프라이머를 이용한 PCR 전기영동 사진. (b) HDAC11과 (c) PAI-1 mRNA량을 18sRNA로 보정한 그래프이다(n=3). 결과는 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
*P<0.05 vs. 실험군. (d) HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 그리고 10 프라이머를 이용한 PCR 전기영동. Ctr, 대조군; KD, HDAC11 knock-down.
도 6은, 허혈/재관류 수술 후 HDAC11의 감소는 남성 호르몬 의존적임을 나타내는 도이다. 실험군 생쥐들에 허혈/재관류 수술을 시행한 후에 (a,b) HDAC11 mRNA와 (c,d) 단백질의 발현을 각각 PCR과 웨스턴 블롯으로 조사한 결과이다.
**P<0.01 vs. its own sham,^^P<0.01vs.허혈 /재관류 수술한 위약 처리 정상 수컷군. $$P<0.01 vs. 허혈/재관류 수술한 위약 처리 수컷 정소절제술군. 결과는 평균 ± 표준오차 (개체수 = 4) 로 표기함. S, Sham (개복수술)군; I/R, 허혈 / 재관류 수술군; Veh, 위약; DHT, dihydrotestosterone.
도 7은, PAI-1 프로모터로의 HDAC11의 결합과 분리는 히스톤 H3의 아세틸화를 조절함을 나타내는 도이다. PAI-1 프로모터를 분석하여 각 부위별 프라이머를 디자인하고, RAW 세포와 신장 조직을 이용하여 ChIP assay를 실시하였다. (a) PAI-1의 프로모터 분석 결과 얻은, 전사 조절인자 결합 부위. (b,c) 두 번의 ChIP 분석으로부터 얻은, 각각의 특이적인 PAI-1 프로모터 프라이머를 이용한 ChIP PCR 전기영동 결과. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G(negative;N) 또는 HDAC11 항체 (HD)를 이용하여 실시하였다. (b) RAW264.7 세포에 위약 또는 LPS를 4시간 동안 처리하였고, (c) 정상 또는 정소절제 수컷 생쥐를 sham 또는 허혈/재관류 수술하였다. (d) 두 번의 ChIP 분석으로부터 얻은 각각의 특이적인 PAI-1 프로모터 프라이머를 이용한 ChIP PCR 전기영동 결과를 나타낸 것이다. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G(negative;N) 또는 아세틸화 히스톤 H3(AcH) 항체를 이용하여 실시하였다. (e) 정상 암컷, 난소절제 암컷 군의 sham, 허혈/재관류 수술군의 신장 조직에서 PAI-1 pm 2 프라이머를 이용하여 행한 두 번의 ChIP PCR 전기영동 중 대표적인 결과이다. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G(negative;N) 또는 HDAC11 항체(HD)를 이용하여 실시하였다. (f) 정상 암컷, 난소절제 암컷 군의 sham, 허혈/재관류 수술군의 신장 조직에서 PAI-1 pm 3 프라이머를 이용하여 행한 두 번의 ChIP PCR 전기영동 중 대표적인 결과이다. ChIP 분석은 정상 토끼 면역글로불린 G (negative;N) 또는 아세틸화 히스톤 H3 (AcH) 항체를 이용하여 실시하였다. LPS, 지질다당류; I, input; N, 정상 토끼 면역글로불린G; HD, HDAC11; AcH, 아세틸화 히스톤 H3; pm, promoter.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예
1: 실험 재료 및 방법
(1) 실험동물의 준비
모든 동물실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 지침에 부합하여 진행되었다. 8~9주령의 BALB/c 쥐를 연구에 사용하였다. 쥐들은 30분 동안의 양측성 신장 허혈 및 sham(수술에서의 대조군) 수술을 받았다. 일부 수컷 쥐나 암컷 쥐에는 정소 적출이나 난소 적출을 각각 신장 허혈 자극 15일 전에 행하였다. 그리고 일부 쥐에는 DHT(dihydorotestosterone: 500μg/kg BW)를 수술 14일 전부터 매일 피하에 주입하였다. 또 어떤 쥐에는 penta-O-galloyl-β-D-glucose(15mg/kg BW)를 수술 2시간 전과 직후에 주입하였다.
(2) 세미-정량적
역전사
RT
-
PCR
RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)로 추출한 RNA로 RevertAid First Strand cDNA 합성 키트(Fermentas, Glen Burnie, Maryland)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Taq DNA 중합효소(Fermentas, Glen Burnie, Maryland)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)을 하였으며, 사용한 프라이머의 서열은 하기와 같았다.
| 유전자 | 서열(5'->3') | 서열번호 |
| PAI-1 |
GCTGTAGACGAGCTGACACG | 1 |
| ACGTCATACTCGAGCCCATC | 2 | |
| HDAC1 |
ACAAACGCTTTGCCTGTGAGGAAG | 3 |
| TTTGGCTTCTGGCTTCTCCTCCTT | 4 | |
| HDAC2 |
TAGGCCTCATAAAGCCACTGCTGA | 5 |
| ACCGGACAATCTTCTCCGACGTTA | 6 | |
| HDAC3 |
TTCGAGTTCTGCTCCCGTTACACA | 7 |
| TAGCAGAAGCCAGAGGCCTCAAAT | 8 | |
| HDAC4 |
AACTTCTTCCCAGGAAGTGGAGCA | 9 |
| GGGCAAACTCATTTGCGATAGGCA | 10 | |
| HDAC5 |
ACAGTGACACGGTGTGGAATGAGA | 11 |
| AGCTGTGATGGCTACGGAGTTGAA | 12 | |
| HDAC6 |
AACCCTGAGACAAGAGTGCCAGTT | 13 |
| TCAGTTGCTCTCTGATGGCATGGA | 14 | |
| HDAC7 |
GCTGAAGAATGGCTTTGCTGTGGT | 15 |
| AATGAGGATCTTGCTGGCTTTGCC | 16 | |
| HDAC8 |
AGTGCCTGATTGACGGGAAGTGTA | 17 |
| CGGTCAAATTTCCGTCGCAATCGT | 18 | |
| HDAC9 |
AGGATGATGATGCCTGTGGTGGAT | 19 |
| TCCTTGATGTGCTCCTGGAGTTGT | 20 | |
| HDAC10 | AAGGTGCCTGTGTTTGTCAGCTTG | 21 |
| ACAGTGCGTGGAGCTCCTCTTTAT | 22 | |
| HDAC11 | TCTCAACGAGCTGAAGTGGTCCTT | 23 |
| TTGTCACCCATGAAGTCTCGCTCA | 24 | |
| 18SrRNA |
GTAACCCGTTGAACCCCATT | 25 |
| CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 26 |
(3)
웨스턴
블롯
분석법
단백질 샘플의 준비와 웨스턴 블롯 분석의 방법은 하기와 같이 진행하였다. 구체적으로, PAI-1, F4/80, Ly6G와 β-액틴 항체들을 이용하여 면역 블롯팅을 시행하였다. Horseradish peroxidase(HRP)가 결합된 이차 항체를 앞서 사용된 일차 항체와 결합하게 한 후, 화학발광 물질을 이용하여 면역 블롯을 확인하였다. 면역 블롯 결과를 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ(NIH)를 이용하여 측정하였다.
(4) 세포 배양 및 siRNA(
small
interfering
RNA
)
3-5 계대의 RAW264.7 세포를 10% FBS(소태아혈청)와 스트렙토마이신/페니실린(S/P) 100U/ml이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 지질다당류(Lipopolysaccharide)를 90% 정도로 차있는 RAW264.7 세포에 5ng/ml 농도로 4시간 동안 처리하였다. HDAC11의 발현억제를 위해서 50% 차 있는 RAW 세포에 20nM의 HDAC11 siRNA와 비특이 siRNA를 리포펙타민 2000을 이용하여 48시간 동안 처리하였다.
(5)
크로마틴
면역 침강 어세이(
Chromatin
Immune
Precipitation
(
ChIP
)
Assay
)
ChIP 분석법은 Upstate Biotech의 ChIP 분석 키트를 이용하여 사용설명서에 따라 진행하였다. RAW264.7 세포를 1% 포름알데히드로 10분간 처리하였으며, 신장조직은 1% 포름알데히드 용액으로 1분간 균질화 과정을 거쳐 9분간 상온에서 보관하였다. 균질화된 세포나 신장조직 용해물을 원심 분리하고, 침전물을 세포 용해 완충액에 용해시켰다. 또한 침전물은 핵을 용해시킬 수 있도록 재부유한 뒤, DNA 절편이 200~500bp 크기로 조각날 수 있도록 30초 간격으로 10초간 11회씩 초음파 처리를 하였다. 조각난 DNA는 정상 래빗 IgG나 HDAC11, 아세틸화된 히스톤 H3와 함께 단백질 A 아가로스 비드를 이용하여 4℃에서 밤새 회전시키며 면역 침강시켰다. bead-항체/염색질(chromatin) 복합체는 씻어낸 뒤 항체-염색질 복합체를 비드로부터 분리하였다.
ChIP 분석법을 위한 PCR의 프라이머를 디자인하기 위해 쥐의 PAI-1 유전자서열 중에서 5' UTR(Untranslated Region)의 1390bp를 NIH와 교토대에서 제공하는 웹 프로모터 스캔 서비스를 이용하여 분석하였다. 산화적 스트레스 혹은 염증에 의해 조절되는 전사조절인자 결합부위와 PAI-1의 발현을 조절한다고 이미 알려진 전사조절인자 결합부위들을 포함하는 프로모터 부위를 무작위로 4 부분으로 나누어 PCR 프라이머를 디자인하였다. 각 사이즈와 위치는 다음과 같았다:
TATA 사이트를 0으로 정했을 때,
1) PAI-1 promoter (pm) region (PAI-1 pm1):-289~+45; 5'-AGGCTCGAGGAAGGGAATTCCAAA-3'(sense, 서열번호 27) 및 5'-TGATCCAGCTGTGCTCCGTT-3' (antisense, 서열번호 28);
2) PAI-1 pm 2:-596~-507; 5'-ACACCAGGAGAGTCTGGCCCATGT-3' (sense, 서열번호 29) 및 5'-ACTTCAAGTCCTTTCCTCCTCCCT-3' (antisense, 서열번호 30);
3) PAI-1 pm 3: -895~-611; 5'-AGCTGCAGATTGAGTTCCAGGCTA-3' (sense, 서열번호 31) 및 5'-TTTGTGTCAATAGCCCTTGTGCGG-3' (antisense, 서열번호 32);
4) PAI-1 pm 4: -1130~-930; 5'-AACTTCCATTCCCAACACCCACGA-3' (sense, 서열번호 33) 과 5'-TTCTGCCTCCTGAGTGCTCGATTA-3' (antisense, 서열번호 34)
였다.
(6)
조직절편
제조
PLP 용액(2% paraformaldehyde, 75 mM L-lysine, 10 mM sodium periodate)을 좌심실을 통해 신장에 15분간 주입하였고, 적출된 신장은 PLP 용액에 4℃에서 하룻밤 보관하였다. PLP에 고정한 신장은 파라핀으로 고형화한 뒤, 마이크로톰(microtome)을 이용하여 2 ㎛ 두께로 잘랐다. 파라핀 단편을 PAS 염색하였으며, 외수질(outer medulla) 부분의 10군데를 현미경(Nikon Microphot-Fx)으로 촬영하였다. 세관 손상의 정도를 측정하기 위해 각 부분 당 50개의 세관을 분석하여 아래의 기준으로 측정하였다.
0, 손상 관찰안됨; 1, 모양이 둥글어진 상피세포와 확장된 루멘 소견을 보이는 약한 정도의 손상; 2, 납작한 상피세포와 확장된 루멘, 울혈이 일어난 루멘 소견을 보이는 중간 정도의 손상; 3, 핵 염색이 되지 않은 핵을 유실한 상피세포와 울혈이 일어난 루멘 손상을 보이는 심한 손상.
(7) 통계처리
결과는 평균값 ±표준오차(SE)로 나타내었다. 집단들 간의 통계적 차이는 ANOVA를 이용하여 계산하였으며, 각 집단 사이의 통계적 차이는 Student의 t-검정을 이용해 분산분석으로 평가하였다. 집단 간의 차이는 p 값이 0.05 미만인 경우 통계학적으로 유의하다고 판단하였다.
실시예
2: 실험 결과
(1) 신장 허혈/
재관류에
의해 유도되는
PAI
-1 발현은 성별에 영향을 받으며, 특히 남성 호르몬에 영향을 받는다.
본 발명자들은, 기존에 허혈/재관류에 의해 유도되는 신장 손상에 있어서 남성이 여성에 비해 더욱 취약하며, 이러한 결과는 남성호르몬에 의해 야기됨을 보고한 바 있다.
이에, 허혈/재관류 수술로 유도되는 손상에서의 성별차이에 대한 근본적인 기작을 알아보기 위해, 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1 단백질과 mRNA 발현 정도를 정상 수컷, 정소 절제술을 받은 수컷, 정상 암컷, 난소 절제술을 받은 암컷 쥐들에서 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, PAI-1 단백질 발현은 정상 수컷 허혈/재관류 수술을 실시한 군에서 높게 나타났으며(P=0.001 vs. 정상 수컷 sham), 정소절제술을 실시한 허혈/재관류 수술을 받은 군에서는 PAI-1 발현이 유의적으로 억제되는 결과를 나타내었다(P<0.003 vs 허혈/재관류 수술을 받은 정상 수컷). 그러나, 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1 발현은 암컷에서 유의적으로 낮았으며(P<0.001), 난소 절제술을 실시한 군과의 발현 차이는 없었다(도 1a 및 c).
이러한 결과는 남성 호르몬이 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1 발현에 중요한 역할을 함을 시사하는 것이다. 즉, PAI-1 발현을 통하여 남성에서 허혈/재관류 수술로 유도되는 손상이 야기됨을 시사하는 것이다.
이후, 정상 수컷 군과 정소절제술 수컷 군에게 허혈/재관류 수술 후 DHT를 처리하였다. 정상 수컷 군에서 DHT 처리한 결과, PAI-1이 증가하는 경향을 보였으나, 통계적으로 유의성은 없었다. 그러나, 허혈/재관류 수술을 받은 정소절제술 군의 경우 DHT를 처리한 경우, 정상군에서만큼 PAI-1을 크게 증가시키는 결과를 나타내었다(도 1b 및 d). 이러한 결과로부터 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1 발현이 테스토스테론에 매우 의존적임을 확인할 수 있었다.
PAI-1의 단백질 발현 또한 허혈/재관류 수술 24시간 후에 정상 수컷군에서 매우 증가하였다(P=0.001 vs 정상 수컷 sham). 정소 절제술은 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1 발현을 억제하였고(P=0.005 vs. 정상 수컷 허혈/재관류 수술군) DHT는 정소절제술을 받은 수컷 쥐의 허혈/재관류에 의한 PAI-1 발현을 정상 수컷군에서만큼 증가시키는 결과를 나타내었다(도 1e 및 f).
(2) 신장 허혈/재 관류에 의해 유도되는 염증 반응과 신장 손상은
PAI
-
1억제
제에 의해 완화되었다.
한편, 본 발명에서는 신장 허혈/재관류에 의해 유도되는 염증 반응 및 신장 손상이 PAI-1 억제제에 의해 완화될 수 있는지를 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
구체적으로, PAI-1 억제제를 허혈/재관류 수술 전에 수컷 생쥐에 미리 처리하였고, 혈장 크레아티닌(Pcr) 수치와 조직학적 손상 정도 그리고 신장 세뇨관 막힘(congestion)을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, PAI-1 억제제는 신기능 손상을 57% 줄이는 결과를 나타내었으며(도 2a)(P=0.004 vs. vehicle 처리군), PAI-1 억제제는 허혈/재관류로 유도되는 조직학적 손상과(도 2b,c)(P=0.002 vs. vehicle 처리군), 신장 congestion을 현저하게 줄였다(도 2d).
또한, 웨스턴 블롯 결과는 허혈/재관류 수술로 유도되는 F4/80(대식세포 표지자) 및 Ly6G(호중구 표지자)의 발현을 PAI-1 억제제가 유의하게 감소시킨다는 것을 보여주었다(도 2e, f 및 g)(P=0.046, P=0.032 vs. vehicle 처리군).
이러한 결과들은 PAI-1 억제제에 의한 허혈/재관류로 유도되는 신장 손상의 완화가 염증반응 억제를 통해 이루어짐을 제시하는 것이다.
(3) 허혈/
재관류에
의해 유도되는
HDAC9
과
HDAC11
의 신장에서의 발현 억제는 남성 성별에 의존적이고 특히 남성 호르몬에 의존적이다.
허혈/재관류에 의해 유도되는 PAI-1 발현의 후성 유전학적 조절을 확인하기 위해 허혈/재관류 수술 후 어느 타입의 HDAC의 발현이 성별에 의존적인지 시험하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 허혈/재관류 수술 후 HDAC1, 5, 8, 9, 및 11이 신장에서 발현이 감소하였다(61±9%, 56±17%, 86±2%, 54±11%, 21±7%, P=0.012, P=0.033, P=0.042, P=0.009, P=0.003 vs. sham) (도 3 a, b, f, i, j 및 l). 그리고 이들 중 HDAC9과 HDAC11의 발현이 정소절제술에 의해 sham 수준으로 회복되었으며, 이는 HDAC9과 HDAC11의 발현 감소가 남성 호르몬에 의존적임을 나타내었다. 대조적으로 암컷에서 난소절제술군과 비난소절제술군 간의 HDAC 발현의 유의적인 차이는 없었다(도 3)
상기와 같은 결과는, 허혈/재관류 손상에 있어 HDAC1, 5, 8, 9 및 11이 바이오마커가 될 수 있음을 나타내는 것으로, 특히 HDAC 9 및 11, 그 중에서도 발현 변화가 가장 큰 HDAC11이 허혈/재관류 손상 진단에 있어 유용한 진단 마커가 될 수 있음을 시사하였다.
(4)
HDAC11
은 생쥐 대식세포/단핵구 세포주인
RAW264
.7에서
PAI
-1 발현을 억제하였다.
대식세포의 침윤이 신장 허혈/재관류에 의해 유도되는 염증반응의 주요인이기 때문에, LPS로 활성화된 대식세포주를 허혈/재관류 수술의 in vitro 실험 모델로 사용하였다. RAW264.7을 LPS로 활성화시키고 PAI-1과 HDAC1, 5, 8, 9 및 11의 mRNA 정도를 확인하였다. 특이적인 HDAC1 억제제를 처리하였을 때 RAW264.7 세포에서 PAI-1 발현이 증가했다는 보고가 있기 때문에 HDAC1을 포함시켰으며, 허혈/재관류 수술을 시행한 신장 조직에서 HDAC5, 8, 9 그리고 11의 발현이 감소했기 때문에 이들도 포함시켰다(도 3 f, i, j, l). 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, LPS 자극은 PAI-1 발현을 10배 이상 증가시켰으며(도 4a, b) 동시에 HDAC11의 발현을 감소시켰다(도 4a, g). 반면 HDAC1, 5, 8 및 9의 발현은 변화가 없었다(도 4a, c, d, e, f). 상기와 같은 결과는, PAI-1 발현이 HDAC11에 의해 억제적으로 조절됨을 나타내는 것이다.
이러한 결과를 토대로, 본 발명에서는 HDAC11에 의한 PAI-1 발현의 직접적인 역할을 확인하기 위해 RAW264.7 세포에서 HDAC11 유전자를 억제시켰다. 구체적으로, HDAC11에 대한 siRNA를 사용하여 HDAC11 mRNA를 대조군의 30%로 knock-down시켰고(도 5a, b) (P=0.018 vs 대조군), HDAC11 knock-down은 다른 HDAC의 발현에 영향을 주지 않았으며(도 5d), PAI-1의 발현을 7배 정도로 크게 증가시켰다(도 5a, c) (P=0.019 vs 대조군). 이러한 결과는 HDAC11이 PAI-1 발현의 직접적인 조절자임을 시사하는 것이다.
(5)
DHT
를
처리 하면
정소절제
군에서 나타났던 허혈/
재관류에
의한
HDAC11
발현 감소 억제효과가 없어졌다.
정소 절제 군에서 신장 허혈/재관류 수술 후에 HDAC11의 발현이 유지되는 것이 남성 호르몬의 부재에 의한 것임을 확인하기 위해서, 정상군, 정소 절제 군에 DHT를 투여한 후 허혈/재관류 수술을 실시하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 허혈/재관류 수술 후, 정상 수컷 생쥐와 비교하였을 때 정소 절제 수컷 생쥐 군에서 HDAC11의 발현 감소폭이 적어, 그 발현이 높게 유지되는 결과를 나타내었다. 반면, DHT를 처리한 정소 절제 수술 군에서는 HDAC11의 발현이 허혈/재관류 자극을 받은 정상 쥐 수준으로 감소하는 결과를 나타내었다(P<0.001 vs. DHT 미처리 허혈/재관류 실시한 정소절제 수컷군, P<0.158 vs DHT 미처리 허혈/재관류 실시한 정상 수컷 군). 반면, 정상군에서의 DHT 처리 효과는 미미하였다.
이러한 결과는 허혈/재관류에 의한 신장손상에 있어 HDAC11의 발현이 남성 호르몬에 의하여 조절되는 것임을 의미하는 것이다.
(6) 특정
PAI
-1 프로모터 부위에의
HDAC11
결합감소가, 남성호르몬 의존적으로 일어나는 허혈/
재관류에
의한
PAI
-1 발현증가의 주요인이다.
상기 결과로부터 HDAC11이 PAI-1의 직접적인 발현 조절자임을 확인하였기 때문에, 이러한 결과를 기초로 RAW264.7 세포와 신장조직에서 HDAC11이 PAI-1 프로모터에 결합하는지 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7b에서 보는 바와 같이, RAW264.7세포에서는 HDAC11이 PAI-1 pm2, 3 및 4에, 신장 조직에서는 HDAC11이 PAI-1 pm1, 2 및 4에 결합하는 것을 ChIP 어세이를 통해 확인하였다. 이 결합들은 LPS 자극이나 신장 허혈/재관류 자극에 의해 감소되는 결과를 나타내었다. 정소절제 군에서는 허혈/재관류 지극 후에도 HDAC11이 PAI-1 pm2에 결합되는 결과를 나타내었다(도 7c). 정상 암컷, 난소 절제군 암컷에서는 허혈/재관류 수술이 이 부위에로의 HDAC11 결합에 영향을 주지는 않았다(도 7e).
또한, PAI-1 전사에 있어 PAI-1 프로모터 부위에서 HDAC11의 결합과 분리의 영향을 확인하기 위해 PAI-1 프로모터의 아세틸화된 히스톤 H3 정도를 측정하였다.
그 결과, 허혈/재관류 수술 수컷 쥐의 경우, 히스톤 H3의 아세틸화가 증가한 반면, 정소 절제 수컷 군, 정상 암컷, 난소 절제 암켯군에서는 변화가 없었다(도 7 d 내지 f). 이 결과들은 이 부위에서의 HDAC11 분리가 허혈/재관류 수술로 유도되는 PAI-1 발현과 남성 호르몬 의존성에 중요한 역할을 함을 나타내는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<160> 34
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1
<400> 1
gctgtagacg agctgacacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1
<400> 2
acgtcatact cgagcccatc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC1
<400> 3
acaaacgctt tgcctgtgag gaag 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC1
<400> 4
tttggcttct ggcttctcct cctt 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC2
<400> 5
taggcctcat aaagccactg ctga 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC2
<400> 6
accggacaat cttctccgac gtta 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC3
<400> 7
ttcgagttct gctcccgtta caca 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC3
<400> 8
tagcagaagc cagaggcctc aaat 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC4
<400> 9
aacttcttcc caggaagtgg agca 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC4
<400> 10
gggcaaactc atttgcgata ggca 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC5
<400> 11
acagtgacac ggtgtggaat gaga 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC5
<400> 12
agctgtgatg gctacggagt tgaa 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC6
<400> 13
aaccctgaga caagagtgcc agtt 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC6
<400> 14
tcagttgctc tctgatggca tgga 24
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC7
<400> 15
gctgaagaat ggctttgctg tggt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC7
<400> 16
aatgaggatc ttgctggctt tgcc 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC8
<400> 17
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<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC8
<400> 18
cggtcaaatt tccgtcgcaa tcgt 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC9
<400> 19
aggatgatga tgcctgtggt ggat 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC9
<400> 20
tccttgatgt gctcctggag ttgt 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC10
<400> 21
aaggtgcctg tgtttgtcag cttg 24
<210> 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer for HDAC10
<400> 22
acagtgcgtg gagctcctct ttat 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC11
<400> 23
tctcaacgag ctgaagtggt cctt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for HDAC11
<400> 24
ttgtcaccca tgaagtctcg ctca 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for 18SrRNA
<400> 25
gtaacccgtt gaaccccatt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for 18SrRNA
<400> 26
ccatccaatc ggtagtagcg 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1 pm1
<400> 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer for PAI-1 pm1
<400> 28
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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<223> Primer for PAI-1 pm2
<400> 29
acaccaggag agtctggccc atgt 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1 pm2
<400> 30
acttcaagtc ctttcctcct ccct 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1 pm3
<400> 31
agctgcagat tgagttccag gcta 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1 pm3
<400> 32
tttgtgtcaa tagcccttgt gcgg 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1 pm4
<400> 33
aacttccatt cccaacaccc acga 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PAI-1 pm4
<400> 34
ttctgcctcc tgagtgctcg atta 24
Claims (18)
- HDAC11(histone deacetylase 11) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 제제는 HDAC11에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단용 키트.
- 신장 허혈/재관류(Ischemia/reperfusion) 손상이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 HDAC11(Histone deacetylase 11) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장 허혈/재관류 손상 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 제6항에 있어서,
상기에서 측정된 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군보다 감소하면 신장 허혈/재관류 손상으로 판정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 방법은 HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 방법은 측정된 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군보다 감소하고, HDAC1, HDAC5, HDAC8 및 HDAC9로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군보다 감소하면, 신장 허혈/재관류 손상으로 판정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 방법은 PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 방법은 측정된 PAI-1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군보다 증가하면, 신장 허혈/재관류 손상으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- HDAC11(histone deacetylase 11)의 발현 또는 활성을 증가시키는 제제를 포함하는, PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 PAI-1 매개 질환은 신장 허혈/재관류 손상, 만성신부전, 급성신부전, 섬유증(fibrosis), 비만, 당뇨병, 염증성 질환, 혈전증(thrombosis) 및 동맥경화(artherosclerosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것인 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 HDAC11의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질은, HDAC11 단백질을 코딩하는 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 포함하는 것인, 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 HDAC11은 PAI-1의 발현을 억제하는 것인, 조성물.
- (a) PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1) 매개 질환 의심 개체의 분리된 신장 시료, 또는 PAI-1 매개 질환을 가진 동물 모델에 시험후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시험후보물질이 처리된 시료 또는 동물 모델에서 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 HDAC11 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, PAI-1 매개 질환에 대한 치료제를 스크리닝하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 방법은 (c) 시험후보물질이 처리된 시료 또는 동물모델에서 측정된 HDAC11 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 또는 HDAC11 단백질의 활성이 시험후보물질이 처리되지 않은 대조군에 비하여 증가한 경우, PAI-1 매개 질환에 대한 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 PAI-1 매개 질환은 신장 허혈/재관류 손상, 만성신부전, 급성신부전, 섬유증(fibrosis), 비만, 당뇨병, 염증성 질환, 혈전증(thrombosis) 및 동맥경화(artherosclerosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것인 방법.
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