KR20150020479A - 재조합 3D8 scFv 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 닭에서의 면역원성이 감소된 재조합 3D8 scFv(single chain variable fragment) 항체 및 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 항체 및 이의 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자와 상기의 항체 및/또는 이의 항원 결합부를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 닭에 쥐 유래 3D8 scFv 항체를 주입할 경우 발생할 수 있는 HAMA 유사 현상 등을 유발하지 않도록 면역원성이 감소되며, 핵산결합능, 핵산분해능 및 세포 침투능 등과 같은 기존 3D8 scFv 항체의 활성을 유지하는 재조합 항체가 제공된다.

Description

재조합 3D8 scFv 항체{Recombinant 3D8 scFv antibody}
본 발명은 닭에서의 면역원성이 감소된 재조합 3D8 scFv(single chain variable fragment) 항체 및 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 항체 및 이의 항원 결합부를 암호화하는 핵산 분자와 상기의 항체 및/또는 이의 항원 결합부를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
쥐로부터 유래된 항체를 인간의 몸에 주입할 경우 그 항체자체가 인간의 몸에서 항원으로 작용하게 되어 인간의 면역체계가 쥐 항체를 외래 항원으로 인식하여 면역반응이 일어나고, 그 결과로 쥐 항체는 체내에서 신속히 제거된다. 이는 쥐 항체 단백질 아미노산 서열이 인간이 생산해 내는 항체의 일반적인 아미노산 서열과 달라서, 인체 내에서 쥐 항체를 외부항원으로 인지하기 때문에 나타나는 현상이며, 이를 인간 항-쥐 항체(Human Anti-Mouse Antibodies; HAMA) 반응이라 한다(Arch Pathol Lab Med. 2000, 124: 921-923).
지금까지 인간을 제외한 다른 동물종에서 유래된 유용한 항체를 HAMA 유사 반응의 유도 없이 사람의 질병 진단 및 치료에 활용하고자 항체를 개량해왔으며, 그 대표적 방법이 항체의 인간화(humanization)이다. 이 방법의 기본원리는 기존의 동물유래 항체에서, 항원인식 기능에 중요한 기능을 하는 부위인 상보성 결정 영역(complementarity-determining region; CDR)만을 그대로 남겨둔 채, CDR에 인접하여 항체골격구조로서 기능을 하는 틀 영역(Framework region; FR)을 인간 항체에서 유래한 아미노산 서열로 교체하는 것이다. 현재까지 동물유래 항체 (주로 쥐 항체)를 인간화시키는 다양한 방법(CDRs-grafting, Resurfacing, superhumanization, Framework libraries construction, Guided selection 및 Framework shuffling)들이 이용되어 왔고, 실제로 이러한 방법으로 인간화시킨 항체가 치료용 항체로 개발되어 시장에 나와 있다.
한편, 어떤 종으로부터 유래된 항체가 인간을 비롯한 이종 동물에 주입될 때도 HAMA 유사 현상이 나타나는데 이는 이종 간의 항체 아미노산 서열이 다르기 때문이다. 즉 항체 수여동물의 면역체계가 주입된 이종항체단백질을 외부항원으로 인식하여 주입된 이종 항체단백질에 대한 항체를 생산함으로써, 투여된 이종항체가 체내에서 신속히 제거되는 것이다. 따라서, 투여된 이종항체에 대한 숙주면역반응을 회피 또는 감소시키기 위해서 이종항체의 CDR을 그대로 유지시키면서 FR을 숙주동물 항체에서 유래한 아미노산 서열로 교체해 주어야 한다. 상기와 같이 동물유래 항체를 성공적으로 인간화(humanization)시키는 방법은 보편화되었지만 이종동물 유래 항체를 다른 동물의 항체로 전환시키는 연구, 즉 예를 들어, 쥐 유래 항체를 닭화(chickenization)한 것에 대해서는 기존에 보고된 바가 없다.
미국특허공개공보 제2011-0201104호
본 발명은 닭에 쥐 유래 3D8 scFv 항체를 주입할 경우 발생할 수 있는 HAMA 유사 현상 등을 유발하지 않도록 면역원성이 감소되며, 핵산결합능, 핵산분해능 및 세포 침투능 등과 같은 기존 3D8 scFv 항체의 활성을 유지하는 재조합 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따르면 각각 서열번호 1 및 2의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 재조합 3D8 scFv 항체가 제공될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 1과는 다른 중쇄 가변 영역으로서 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 2와는 다른 경쇄 가변 영역으로서 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 재조합 3D8 scFv 항체가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 3D8 scFv 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 둘 다를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 제공될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 3D8 scFv 항체를 포함하는 항바이러스 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면 닭에 쥐 유래 3D8 scFv 항체를 주입할 경우 발생할 수 있는 HAMA 유사 현상 등을 유발하지 않도록 면역원성이 감소되며, 핵산결합능, 핵산분해능 및 세포 침투능 등과 같은 기존 3D8 scFv 항체의 활성을 유지하는 재조합 항체가 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 3D8 scFv 항체의 순도를 나타내기 위한 15% SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 3D8 scFv 항체의 이중가닥 핵산(dsDNA)에 대한 결합능을 나타내기 위한 ELISA 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 3D8 scFv 항체의 단일가닥 핵산(ssDNA)에 대한 분해활성이 항체 고유의 활성인지 여부를 나타내기 위한 FRET-기반 DNA 가수분해 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 3D8 scFv 항체의 세포 내로의 유입능력을 확인하기 위한 공촛점 현미경 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 3D8 scFv 항체의 세포 내로의 유입능력을 확인하기 위한 유세포 분석 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본원에서 달리 정의하지 않는한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 것이다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학, 그리고 혼성화와 관련되어 사용되는 명명법과 이와 관련된 기술들은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 것이며, 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되고 있는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면 각각 서열번호 1 및 2의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 재조합 3D8 scFv 항체가 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체" 는 무손상 면역글로불린, 또는 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁하는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소에 의한 절단 또는 화학 절단에 의해 생산될 수 있다. 항원 결합 부분에는, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 (dAb), 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 가변 영역 단편, scFv, 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 특이적 항원 결합을 폴리펩티드에 부여하는데 충분한 면역글로불린의 일부분을 적어도 함유하는 폴리펩티드가 특히 포함된다.
Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인이 있는 1가 단편이고; F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편이 있는 2가 단편이며; Fd 단편에는 VH 및 CH1 도메인이 있고; Fv 단편에는 항체의 한쪽팔의 VL 및 VH 도메인이 있고; dAb 단편에는 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 또는 VL 도메인의 항원-결합 단편이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "3D8" 은 세포침투성 항체의 일종으로, 이는 핵산가수분해능을 가지고 있어, 항바이러스 효과 및 항암 효과를 가지는 항체를 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "scFv(single chain variable fragment)" 는 연속적인 단백질 사슬을 형성하도록 링커 (예를 들어, 아미노산 잔기들의 합성 서열)를 통해 VL 및 VH 영역이 연결된 항체이고, 이때 링커는 단백질 사슬이 사슬 자체 상에서 폴딩되어 1가 항원 결합 부위를 형성하도록 하기에 충분히 길다(예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-26] 및 [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83] 참조). 디아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 2가 항체이고, 이때 각각의 폴리펩티드 사슬은 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍이 형성되도록 하기에는 너무 짧아서 각각의 도메인이 또 다른 폴리펩티드 사슬 상의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 하는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함한다(예를 들어, 문헌 [Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48] 및 [Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23] 참조). 디아바디의 2개의 폴리펩티드 사슬이 동일하면, 이들이 쌍을 이루는 것으로부터 초래된 디아바디에는 2개의 동일한 항원 결합 부위가 있을 것이다. 상이한 서열의 폴리펩티드 사슬들이 2개의 상이한 항원 결합 부위가 있는 디아바디를 제조하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 트리아바디 및 테트라바디는 각각 3개 및 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 각각 3개 및 4개의 항원 결합 부위 (동일하거나 상이할 수 있음)를 형성하는 항체이다.
[Kabat et al. 상기 문헌]; [Lefranc et al., 상기 문헌] 및/또는 [Honegger and Pluckthun, 상기 문헌]에 기술된 시스템을 사용하여, 소정의 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역 (FR)을 확인할 수 있다. 하나 이상의 CDR이 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 분자 내로 혼입되어 분자를 항원 결합 단백질로 만들 수 있다. 항원 결합 단백질은 더 큰 폴리펩티드 사슬의 일부분으로서 CDR(들)을 혼입시킬 수 있거나, 또 다른 폴리펩티드 사슬에 CDR(들)을 공유결합으로 연결시킬 수 있거나, 또는 CDR(들)을 비-공유결합으로 혼입시킬 수 있다. CDR은 항원 결합 단백질이 특정 관심 항원에 특이적으로 결합하도록 한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 재조합 3D8 scFv 항체는 "닭화 항체" 로 표현되기도 한다. 상기 "닭화 항체" 는 닭의 면역글로불린 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 및 불변 영역이 있는 모든 항체가 포함된다. 다른 실시예에 있어서, 모든 가변 및 불변 도메인이 닭의 면역글로불린 서열로부터 유래된다 (완전히 닭화된 항체). 또 다른 실시예에 있어서, 닭화 항체의 서열은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 이종 동물로부터 유래된 항체의 서열과 상이하여, 닭에게 투여되는 경우, 닭화 항체는 이종 동물의 항체와 비교하여 면역 응답을 유도할 가능성이 낮거나 덜 중증인 면역 응답을 유도한다.
일 실시예에 있어서, 서열번호 1의 중쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 1과는 다른 중쇄 가변 영역으로서 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 2의 경쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 2와는 다른 경쇄 가변 영역으로서 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 재조합 3D8 scFv 항체가 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "보존적 아미노산 치환"은 어떤 아미노산 잔기가 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R기를 가지는 다른 아미노산으로 치환되는 경우를 의미한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 실질적으로 단백질의 기능상 특성을 바꾸지는 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 달라진 경우, 서열 동일성 % 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 특성에 맞추어서 바로 상향 조정될 수 있다. 이와 같이 조정하기 위한 수단은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)]을 참조.
유사한 화학적 특성을 보유하는 측쇄를 가지는 아미노산 군의 예로서는, 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄:시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군으로서는 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이 있다. 또한, 보존적 치환은 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Gonnet외 다수, Science 256:1443-45(1992)]에 개시된 바와 같은, PAM250 로그-유사성 매트릭스(PAM250 log-likelihood matrix)에 있어서 양의 값을 가지는 임의의 변이이다.
단일 또는 다수 회의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환은 정상적으로 생성되는 서열 예를 들어, 분자들을 상호 접촉시키는 도메인(들)의 외부에 존재하는 폴리펩티드의 일부에서 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 또한 폴리펩티드의 활성을 개선할 수 있도록 분자들을 상호 접촉시키는 도메인(들) 내에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 실질적으로 모 서열의 구조적 특성을 변이시키지 않는데; 예를 들어, 아미노산 치환은 모 서열에 존재하는 면역 글로불린 결합 도메인을 구성하는 역-평형 β-시트를 변형시키지 않아야 하며, 또는 모 서열의 특징을 이루는 2차 구조의 다른 형태를 파괴하지 않아야 한다. 일반적으로, 글리신과 프롤린은 역-평형 β-시트에 사용되지 않을 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 인식되고 있는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조에 관하여는 본원에 참고용으로 인용되어 있는, 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); 및 Thornton외 다수, Nature 354:105 (1991)]에 개시되어 있다.
펩티드에 대한 서열 유사성(이를 서열 동일성이라고도 칭함)은 통상적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석용 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형 예를 들어, 보존적 아미노산 치환에 부여된 유사성의 측정치를 이용하여, 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG는 밀접하게 관련되어 있는 폴리펩티드 예를 들어, 상이한 유기체 종으로부터 유래하는 상동성 폴리펩티드 사이, 또는 야생형 단백질과 이의 돌연변이 단백질 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위한 디폴트 매개 변수와 함게 사용될 수 있는 프로그램 예를 들어, "Gap" 및 "Bestfit"을 포함한다. 예를 들어, GCG 버젼 6.1을 참조하시오. 폴리펩티드 서열은 또한 디폴트값 또는 추천 매개 변수를 이용하는, GCG 버젼 6.1의 프로그램을 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 의문 서열 및 검색 서열 사이에 가장 많이 겹쳐지는 부위의 서열 동일성%와 이 부위의 서열 배열을 제공한다[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol.Biol. 132:185-219 (2000)]. 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터 유래하는 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교할 때 사용되는 기타 바람직한 알고리즘으로서는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 구체적으로 blastp 또는 tblastn(디폴트 매개변수를 이용함)이 있다. 예를 들어, Altschul외 다수, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul외 다수, Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)을 참조.
상동성이 비교된 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 약 16개 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로는 약 20개 이상의 잔기, 더욱 일반적으로는 약 24개 이상의 잔기, 통상적으로는 약 28개 이상의 잔기, 그리고 바람직하게 는 약 35개 이상의 잔기일 것이다. 다수의 상이한 유기체로부터 유래하는 서열을 포함하는 데이터베이스를 검색할 때, 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유사체"란 용어는, 추론된 천연-생성 아미노산 서열의 일부와 실질적으로 동일한 25개 이상의 아미노산의 분절을 포함하며, 이 천연-생성 폴리펩티드의 특성들 중 하나 이상을 가지는 폴리펩티드를 의미하는 것이다. 통상적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연-생성 서열과 관련하여 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 통상적으로 그 길이가 20개 이상의 아미노산, 바람직하게는 50개 이상의 아미노산 또는 그 이상이며, 종종 전장의 천연-생성 폴리펩티드만큼 길 수도 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 3D8 scFv 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 둘 다를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 제공될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 대한 참조 기준으로서는 달리 특정하지 않는 한 그것의 상보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 가지는 핵산에 대한 참조 기준은 그것의 상보성 서열을 가지는 사슬을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터가 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열" 은 목적 유전자와 인접하여 존재하는 발현 제어 서열과 가로 질러 작용하거나 또는 멀리 떨어져서 작용하여 목적 유전자를 제어하는 발현 제어 서열 둘 다를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "발현 제어 서열" 은 암호화 서열이 결찰되어 이 암호화 서열을 발현 및 가공시키는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이다. 발현 제어 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증가시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질의 안정성을 증강시키는 서열을 포함하며; 원하는 경우에는, 단백질 분비를 촉진하는 서열도 포함한다. 이와 같은 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라서 상이한데; 원핵 생물의 경우, 이러한 제어 서열로서는 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 위치, 그리고 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵 생물의 경우, 이러한 제어 서열로서는 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "제어 서열" 은 최소한 그 존재가 발현 및 가공 과정에 필수적인 모든 성분들을 포함하는 것이며, 그 존재가 유리한 부가 성분 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "벡터" 는 그것이 결합되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 벡터로서는 플라스미드 즉, 부가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 DNA의 환형 이중 사슬 조각이 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 벡터로서는 바이러스 벡터 즉, 부가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 결찰될 수 있는 벡터가 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 벡터는 이 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제할 수 있다[예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터]. 다른 실시예에 있어서, 상기 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입됨에 따라서 이 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써, 숙주 세놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 임의의 벡터는 이 벡터에 작동 가능하도록 결합되어 있는 유전자를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 는 핵산, 예를 들어, 본 발명의 핵산을 발현시키는데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어, 대장균일 수 있거나, 또는 진핵생물, 예를 들어, 단세포 진핵생물 (예를 들어, 효모 또는 기타 진균류), 식물 세포 (예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 숙주 세포의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 (ATCC CRL 1651) (문헌 [Gluzman et al., 1981, Cell 23:175] 참조), L세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 이의 유도체 예컨대 무혈청 배지에서 성장하는 베지(Veggie) CHO 및 관련 세포주 (문헌 [Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31] 참조) 또는 DHFR 결핍성인 CHO 계통 DX-B11 (문헌 [Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20] 참조), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1로부터 유래된 CV1/EBNA 세포주 (ATCC CCL 70) (문헌 [McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821] 참조), 인간 배아 신장 세포 예컨대 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상적인 이배수체 세포, 1차 조직의 시험관내 배양물로부터 유래된 세포 계통, 1차 체외이식편, HL-60, U937, HaK 또는 유캇(Jurkat) 세포가 포함된다. 전형적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드-코딩 핵산으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 배양 세포이고, 그 후 상기 핵산이 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 3D8 scFv 항체를 포함하는 항바이러스 조성물이 제공될 수 있다. 일 실시예에 있어서 상기 항바이러스 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한 담체" 는 생리적으로 혼화 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항 박테리아 제제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 의미하는 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤 및 에탄올 등과 이들의 혼합물이 있다. 다수의 경우, 등장제 예를 들어, 당, 다가 알콜 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 물질의 부가 예로서는, 항체의 유통 기한 또는 효능을 연장 및 증강시키는 습윤제 또는 최소량의 보조 물질 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액이 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여형 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능하고, 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 형태는 의도로 하는 투여 방식과 치료 방법에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질 또는 수성 비이클 중 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전, 적당한 비이클 예를 들어, 멸균 무 발열원 물과 함께 사용될 분말형으로 존재할 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 기술하였다. 하기의 실시예는 오로지 예시를 위한 목적으로 기술한 것으로서, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 재조합 3D8 scFv 항체(CK6) 단백질의 제조
서열번호 1 및 2의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하도록 디자인한 3D8 scFv 유전자를 합성(대전, Bioneer 사)한 후, pIg20 박테리아 발현 벡터(phoA 리더 펩티드와 단백질 A tag을 가지고 있음)에 클로닝하였다. pIg20 벡터를 BL21 DE3 (pLysE) 박테리아에 형질전환한 후, IPTG (0.5 mM)를 첨가함으로써 항체 단백질 발현을 유도하였고, 박테리아 배양액으로부터 항체 단백질을 정제하였다. 상기 항체단백질은 기존의 방법에 따라 IgG-세파로오스 친화성 크로마토그라피에서 가용성으로 정제되었다. 단백질 농도는 상대적으로 280 nm에서 mgml-1cm-1 단위의 1.501의 흡광계수를 이용하여 결정되었다. 상기의 방법에 따라 제조된 재조합 항체의 순도를 분석한 SDS-PAGE 결과는 도 1에 나타나 있다.
실시예 2. 재조합 3D8 scFv 항체 단백질(CK6)의 핵산결합능
재조합된 3D8 scFv 항체 단백질의 DNA 결합능은 ELISA로 평가하였다. pUC19 플라스미드 DNA (200 ng/웰)로 96-웰 플레이트 웰을 코팅한 후, 5% 스킴 밀크/PBS로 상온에서 1시간 블로킹하였다. 각 웰에 단백질 (10 μg/ml)을 넣고 상온에서, 1시간 동안 반응시킨 후, 토끼 IgG 일차 항체 및 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)가 결합된 항-토끼 항체와 순차적으로 실온에서 1시간 반응시켰다. 기질 용액(0.1 M 글라이신 내의 p-니트로페닐 포스페이트 1 mg/ml, 1 mM ZnCl2, 1mM MgCl2, pH 10.3)을 각 웰에 넣고 발색정도를 405 nm 파장에서 분석하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 3D8 scFv 항체 단백질은 기존 쥐 유래 3D8 scFv 단백질만큼 DNA에 결합하는 능력이 있음이 확인되었다.
실시예 3. 재조합 3D8 scFv 항체 단백질(CK6)의 핵산 가수분해능
재조합 3D8 scFv 항체 단백질의 DNA 가수분해활성을 확인하기 위하여, 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 원리에 근거한 DNA 분해 분석법을 수행하였다. 재조합 3D8 scFv 항체 단백질 (10 uM)을 FRET 기질 (250 nM)을 블랙 96-웰 플레이트에 혼합하여 넣은 후, 형광 검출기로 실시간으로 (0 - 2시간까지) 형광 강도를 측정하였다. 반응은 TBSM 완충용액 (100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 2 mM MgCl2) 조건에서 진행되었다. 이때 사용된 FRET 기질은 5'-말단에는 형광물질 FAM으로, 3' 말단에는 black-hole quencher로 이중 표지된 24 염기 길이의 합성 DNA 단편 (5' FAM -CGATGAGTGCCATGG ATATAC- BHQ 3')을 말한다. 그 결과, 재조합 3D8 scFv 항체가 양성대조군인 쥐-유래 3D8 scFv 만큼 DNA 가수분해활성을 유지하고 있음을 확인하였다. 재조합 3D8 scFv 항체와 동일한 과정을 거쳐, 박테리아 배양액으로부터 정제한 HW6 scFv 단백질을 가수분해반응에 대한 음성대조군으로 사용한 웰에서는 DNA 가수분해활성이 검출되지 않았으며, 또 다른 양성대조인 DNase I은 DNA 가수분해활성을 나타내었다(도 3 참조). 또한 반응액에 3D8 scFv 또는 재조합 3D8 scFv 항체와 DNA와의 결합을 저해하는 헤파린(10 μg/ml)을 첨가했을때 재조합 3D8 scFv 항체 및 양성대조인 쥐-유래 3D8 scFv 단백질이 DNA 가수분해활성을 나타내지 못하였다.
이는 재조합 3D8 scFv 항체의 DNA 가수분해활성이 재조합 3D8 scFv 항체 단백질 고유의 활성이며, 박테리아 배양액으로부터 재조합 3D8 scFv 항체 정제 시, 함께 정제된 어떤 오염물질에 의한 활성이 아님을 나타내는 결과이다.
실시예 4. 재조합 3D8 scFv 항체 단백질(CK6)의 세포침투능
재조합 3D8 scFv 항체 단백질의 세포내 침투능 분석을 위하여 공촛점 현미경법을 이용하였다. HeLa 세포에 단백질 (10 μM)을 처리한 후 37 ℃에서 6시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS-2% FCS로 세 차례 세척한 후, 상온에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 고정화하였고, Perm-buffer (1 % BSA, 0.1 % 사포닌, 0.1 % 아자이드 나트륨/PBS)로 상온에서 10분 동안 처리하여 세포막이 비특이적 투과성을 갖도록 하였다(permeabilization). Perm-buffer를 처리한 세포에 토끼 IgG (1 μg/ml) 및 TRITC-표지된 항-토끼 IgG 이차 항체를 상온에서 1시간씩 연속적으로 처리함으로써, 세포내로 침투해 들어온 단백질을 검출하였다. HW6 scFv를 음성대조로 사용하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 재조합 3D8 scFv 항체 단백질은 쥐-유래 3D8 scFv 단백질만큼 세포질 내로 잘 이동할 수 있음을 확인하였다.
재조합 3D8 scFv 항체 단백질의 세포내 침투능을 확인하기 위한 유세포 분석 실험에서는 6-웰 플레이트에서 1106 세포/웰의 농도에서 성장한 세포를 37 ℃에서 6시간 동안 단백질로 펄싱하였다. Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수확한 후, 상기 언급한 공촛점 현미경에서와 같은 과정으로 세포를 처리하였다. 유세포 분석은 FACS Canto II (Bscton Dickinson, CA)으로 수행하였다. 유세포 분석 결과도 공촛점 현미경법에서와 같이, 재조합 3D8 scFv 항체가 세포내로 잘 유입된다는 것을 나타낸다(도 5 참조).
실시예 5. 재조합 3D8 scFv 항체 단백질(CK6)의 면역원성 분석
재조합 3D8 scFv 항체 단백질의 닭에서의 면역원성을 분석하기 위하여, 18주령 암탉의 목뒤 피하 및 다리 근육 2 곳에 150 g의 3D8 scFv 또는 150 g의 재조합 3D8 scFv 항체 단백질(CK6)을 2주 간격으로 4회 주사하였다. 이들 항원단백질 0.5 ml과 어쥬번트 0.5 ml을 혼합하여 주사하였으며, 1차면역 시에는 완전 프룬드 어쥬번트(Complete Freunds adjuvant)를 사용하였으며, 이후의 면역 시(2-4차)에는 불완전 프룬드 어쥬번트(Incomplete Freunds adjuvant)를 사용하였다. 4차 면역된 닭으로부터 혈액을 채취하여, ELISA 실험에 사용하였다.
ELISA 사용한 항원은 pSecTag 동물세포 발현벡터를 사용하여 3D8 scFv-인간 Fc 및 CK6 scFv-인간 Fc 형태로, Hek293f 세포에서 발현시킨 후, Protein A 컬럼을 이용하여 정제하였다.
ELISA 실험은 하기와 같이 수행하였다. 3D8 scFv-human Fc (5 g/ml) 및 CK6 scFv-human Fc 단백질(5 g/ml)을 96-웰 플레이트에 코팅한 후, 3% BSA/PBS로 상온에서 1시간 블로킹하였다. 각 웰에 1,000, 1:10,000, 및 1:100,000 배로 희석한 닭의 혈액을 넣고, 1시간 동안 반응시킨 후, 항-닭 IgY 일차 항체 및 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase)가 결합된 항-염소 항체를 순차적으로 실온에서 1시간 반응시켰다. 기질 용액(0.1 M 글라이신 내의 p-니트로페닐 포스페이트 1 mg/ml, 1 mM ZnCl2, 1mM MgCl2, pH 10.3)을 각 웰에 넣고 발색정도를 405 nm 파장에서 흡광도를 분석하였다. 분석 결과는 면역 전 닭의 혈청(Pre-sera)과 4차 면역후 닭의 혈청(Immune-sera)에서 나타나는 흡광도의 비율로서 해석하였다. 상기 분석 결과는 하기의 표 1에 기재되어 있다.
닭 혈청 희석액 CK6-Fc 3D8-Fc
1:1,000 5.57 8.8
1:10,000 2.9 5.6
1:100,000 1.3 1.98
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 3D8 scFv 항체 단백질(CK6)은 기존 쥐 유래 3D8 scFv의 닭에서의 면역원성과 비교하여, 면역원성이 감소된 항체 단백질임을 확인하였다.
결국, 본 발명에 따르면 닭에 쥐 유래 3D8 scFv 항체를 주입할 경우 발생할 수 있는 HAMA 유사 현상 등을 유발하지 않도록 면역원성이 감소되며, 핵산결합능, 핵산분해능 및 세포 침투능 등과 같은 기존 3D8 scFv 항체의 활성을 유지하는 재조합 항체가 제공될 수 있다.
상기에서는 본 발명의 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 전술한 실시예 외의 많은 실시예들이 본 발명의 특허청구범위 내에 존재한다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Recombinant 3D8 scFv antibody <130> NPF-23554 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VH domain of Recombinant 3D8 scFv antibody <400> 1 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Arg Ala Thr Ile Ser 50 55 60 Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg 65 70 75 80 Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg 85 90 95 Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL domain of Recombinant 3D8 scFv antibody <400> 2 Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg 20 25 30 Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro 35 40 45 Val Thr Val Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Asn Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr 65 70 75 80 Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr 85 90 95 Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 3 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> necleotide sequence of Recombinant 3D8 scFv antibody <400> 3 gcggttacat tagatgaaag cgggggtggt ttacaaactc ctggcggtgc gctctcgctg 60 gtgtgcaaag catctggctt tacgtttagt tcgtacgtta tgcattgggt gcggcaggct 120 ccaggaaaag gtttggaatg ggtagcctat atcaacccgt ataacgatgg aacaaaaaga 180 gctactatta gtcgtgacaa tggtcagtcc acagtccgcc ttcagctgaa taatctgcgc 240 gcagaagata ctggtaccta ctattgtgcg cgaggtgcct ataaacgtgg atatgcgatg 300 gattatgatg cctggggcca cggcactgag gtaattgtta gctctagagg tggaggtggg 360 tctggtggcg ggggtagtgg cgggggtggt tcagatcttg ctctaaccca gccaagttct 420 gttagcgcaa atccgggtga gacagttaag atcacgtgca aatcatcaca atccctgttt 480 aattcacgca cacgtaagaa ctatttagcc tggtatcaac agaagagtcc tggttcagct 540 cccgtcaccg taatatattg ggcgagcact agggagagta atattccgtc acgtttcagc 600 ggttcgaaaa gcggctccac cgcaacattg accattaccg gagtgcaagc agaagacgaa 660 gctgtgtatt attgtaaaca gtcttattat cacatgtaca ccttcggagc aggtacgacg 720 ctgacggtcc tg 732

Claims (7)

  1. 각각 서열번호 1 및 2의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 재조합 3D8 scFv 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 중쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 1과는 다른 중쇄 가변 영역으로서 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 2의 경쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 2와는 다른 경쇄 가변 영역으로서 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 재조합 3D8 scFv 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 3D8 scFv 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 둘 다를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  5. 제3항에 따른 핵산에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 3D8 scFv 항체를 포함하는 항바이러스 조성물.
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