KR20150017533A

KR20150017533A - 해캄에서 유래한 티오레독신 타입-h와 이를 이용한 산화적 스트레스 내성이 증가한 형질전환체

Info

Publication number: KR20150017533A
Application number: KR1020130093583A
Authority: KR
Inventors: 최종일
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2013-08-07
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2015-02-17
Also published as: KR101500986B1

Abstract

본 발명은 미세조류 해캄에서 유래한 티오레독신 타입-h와 이를 이용하여 얻은 형질전환체에 관한 것이다. 티오레독신은 생물체의 산화 환원에 중요한 역할을 하는 효소시스템으로, 본 발명에서는 해캄으로부터 티오레독신 타입-h를 확보하였으며, 이를 포함하는 형질전환체로부터 산화적 스트레스에 대한 내성이 높은 형질전환체임을 확인하였다.

Description

해캄에서 유래한 티오레독신 타입-h와 이를 이용한 산화적 스트레스 내성이 증가한 형질전환체 {Thioredoxin type-h from Spirogyra varians and transformant with increased oxidative-stress tolerance using the same}

본 발명은 해캄(Spirogyra varians)에서 유래한 티오레독신 타입-h (Trxh)와 이를 이용한 산화적 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명은 미세조류에서 새롭게 확보한 티오레독신 타입-h를 이용하여 유전자 분석과 발현을 수행함으로써 얻은 산화적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환체에 관한 것이다.

해캄은 접합조목 접합조과 녹조식물로 물이끼라고도 한다. 몸체는 가늘고 긴 원통 모양으로 가지가 갈라지지 않는 1렬 사상체이다. 세포 내에 내선 모양으로 감긴 가늘고 긴 엽록체가 있으며, 세포는 실처럼 1렬로 연결되어 있다. 엽록체 수는 1인 것이 많지만, 2-3개 또는 그 이상인 것도 있다. 세포막 바깥층은 펙틴질로 싸여 있어 미끈거린다. 다른 녹조류와 달리 접합으로 생식하므로 별해캄, 모우게오티아 등과 함께 접합조류라고도 한다.

산화 환원의 조절은 다양한 생물학적 반응에서 중요한 역할을 한다. 이러한 산화환원의 균형 유지를 위해서 세포는 다양하게 짜인 효소적, 비효소적 항산화 체계를 가지고 있다. 티오레독신(thioredoxin, Trx)은 목적 단백질의 이황화(disulfide) 결합을 환원시킬 수 있는 단백질로 미생물에서 고등동물에까지 널리 분포되어 있는 단백질이다. 식물체에서는 지금까지 티오레독신 타입이 5가지가 보고되어 있으며, 이들 각각은 타입-f, 타입-m, 타입-x, 타입-o, 타입-h로 명명되어 있다. 이 중 티오레독신 타입-h (Trxh)는 티오레독신 리덕타제(thioredoxin reductase)에 의해 활성화되며 세포질 내 곳곳에 위치해 있다고 알려져 있다.

이러한 티오레독신은 현재까지 대장균(Escherichia coli)과 같은 미생물이나 애기장대(Arabidopsis thaliana)와 같은 일부 식물체에서 그 염기서열이 밝혀져 있으나, 그 종류가 다양하지 못하여 충분한 연구가 되어 있지 못하였다. 또한 주로 애기장대에서 유래한 티오레독신 리덕타제를 이용한 일부 미생물과 식물의 형질전환체의 개발만이 이루어졌기 때문에 생물체 내의 다양한 티오레독신 시스템의 연구를 위해서는 새로운 티오레독신 유전자의 확보와 이의 특성에 관한 연구가 진행되어야 한다.

최근 산화적 스트레스에 의한 손상을 억제하기 위한 다양한 소재들이 개발되어 식품 및 화장품 분야에 이용되거나 미생물 및 식물의 성장 개량을 위하여 활용되고 있다. 이 중에서 티오레독신 시스템은 생물체 내의 산화환원에 관여하는 중요한 효소 시스템으로서 이를 이용한 화장품의, 식물 형질전환체의 개발이 많은 관심을 받고 있다. 하지만 현재까지는 대장균이나 애기장대와 같은 몇 종에서만 일부 티오레독신 효소가 확보되어 그 활용이 제한되어 있다. 특히 가장 널리 사용되고 있는 애기장대 유래 티오레독신 시스템은 유사 식물체 이외에는 발현이 제한되어 다양한 종 유래 티오레독신의 확보가 필요한 실정이다. 특히 현재 활발한 연구가 진행 중인 미세조류의 개발에서는 산화적 스트레스를 해결할 수 있는 형질전환체의 개발이 필요한 상황이다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 해캄(Spirogyra varians) 유래 티오레독신 타입-h (Trxh)에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 티오레독신 타입-h를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

상세하게 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 벡터로 형질 전환된 형질전환체에 관한 것이다.

상세하게 상기 형질전환체는 박테리아 또는 미세조류인 것을 특징으로 하는 형질전환체에 관한 것이다.

상세하게 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환체에 관한 것이다.

상세하게 상기 미세조류는 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonads reinhardtii)인 것을 특징으로 하는 형질전환체에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 티오레독신 타입-h를 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 티오레독신 타입-h 유전자가 삽입된 도 4의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pET28b(+):Trxh에 관한 것이다.

본 발명에서 얻은 해캄 유래 티오레독신 타입-h를 대량으로 생산할 수 있는 대장균을 통하여 최근 화장품 소재 등으로 연구되고 있는 티오레독신의 대량 생산이 가능하게 되었으며, 특히 해캄에서 유래한 티오레독신 타입-h 유전자는 다른 미세조류에도 사용될 수 있기 때문에 기능성 소재와 바이오디젤 등의 생산에 활용되고 있는 미세조류의 개량에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 해캄 유래 티오레독신 타입-h의 염기서열과 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 도면에 표기된 상자는 기존에 보고된 다른 티오레독신에서 확인된 활성 부위를 표시한 것이다.
도 2는 해캄 유래 티오레독신 타입-h가 과다 발현된 대장균의 산화적 스트레스에 대한 내성을 비교한 것으로, (A)는 방사선 조사에 따른 생존율을 (B)는 과산화수소 첨가에 따른 생존율을 비교한 것이다. 컨트롤(control)은 벡터(vector)만으로 형질 전환된 대장균, SvTrxh는 해캄 유래 티오레독신 타입-h가 과다 발현된 대장균을 나타낸 것이다.
도 3은 해캄 유래 티오레독신 타입-h가 과다 발현된 클라미도모나스 레인하드티의 산화적 스트레스에 대한 내성을 비교한 것으로, 컨트롤은 벡터만으로 형질 전환된 클라미도모나스 레인하드티, SvTrxh는 해캄 유래 티오레독신 타입-h가 과다 발현된 클라미도모나스 레인하드티를 나타낸 것이다.
도 4는 해캄 유래 티오레독신 타입-h (Trxh)를 갖는 형질전환체를 개발하기 위한 벡터 pET28b(+):Trxh를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 상기 종래기술의 한계의 극복을 위해 담수조류인 해캄에서 산화적 스트레스에 대한 대응 기작으로 티오레독신 효소를 연구하였고 그 염기서열과 이를 이용한 형질전환체를 개발하여, 티오레독신이 다량 발현된 형질전환체에서는 산화적 스트레스에 대한 저항성이 증가한다는 사실을 발견하였다. 특히 미세조류에서 유래한 티오레독신을 확보함으로써 신규 티오레독신 효소의 대량 생산 뿐만 아니라, 기능성 소재나 바이오 연료 물질의 생산 균주로서 관심의 대상이 되고 있는 미세조류의 개량에 활용이 가능하다.

본 발명은 해캄에서 유래한 티오레독신 타입-h와 이를 이용한 산화적 스트레스에 대한 저항성이 증가한 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명에서는 해캄에 산화적 스트레스의 일종인 감마선을 조사할 경우 높게 발현되는 단백질들 중에서 산화적 환경에 대응하는 티오레독신 타입-h를 확보하였다. 확보된 티오레독신 타입-h의 염기서열을 확인하였으며, 이를 이용하여 티오레독신 타입-h의 대량 발현이 가능한 대장균을 개발하였고, 또한 본 발명에서 확보한 티오레독신 타입-h로 형질 전환된 미세조류가 산화적 스트레스에 대한 내성이 증가한다는 결과를 얻어 본 발명을 완성하였다.

티오레독신(thioredoxin, Trx)은 12 kDa 정도의 작은 단백질이며, 진핵생물과 원핵생물 모두가 보유하고 있다. 티오레독신은 -Cys-Gly-Pro-Cys-라고 하는 활성 부위를 갖고 있어 2개의 시스테인 잔기의 사이에서 이황화(S-S) 결합을 만드는 산화형과 디티올(-SH-SH-)을 만드는 환원형이 존재하는 세포 내의 산화 환원 제어 인자이다.

티오레독신은 자외선, 방사선, 산화제, 바이러스 감염, 허혈 재관류 상해, 및 항암제 투여 등에 유도되는 것이 밝혀지고 있다. 각종 스트레스에 의해 유도된 티오레독신은 단독으로 일중항 산소나 히드록실 라디칼을 소거하는 것 이외에, 퍼옥시레독신과의 협조 작용에 의해서 활성 산소종을 소거하는 항산화 물질로서 생체 내에서 작용하는 것이 보고되고 있고, 각종 유전자 발현을 조절하는 전사 인자나 세포 내의 시그널 전달 분자의 활성을 제어하고 있다.

본 발명에서는 상기 티오레독신 타입-h의 유전자를 클로닝하여 자동서열분석기로 서열 결정을 하였으며, 그 염기서열을 서열번호 1로 표시하였다.

본 발명에서 상기 티오레독신 타입-h로 형질전환된 대장균과 벡터로만 형질전환된 대장균 대조군을 배양한 후 산화적 스트레스를 야기할 수 있는 방사선 조사 및 과산화수소의 첨가에 따른 성장률을 측정하였고, 그 결과 산화적 스트레스 환경에서 해캄의 티오레독신 타입-h 유전자가 과다 발현된 대장균 형질전환체가 높은 저항성을 갖는다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 상기 티오레독신 타입-h로 형질전환된 클라미도모나스 레인하드티와 벡터로만 형질전환된 클라미도모나스 레인하드티 대조군을 배양한 후 산화적 스트레스를 야기할 수 있는 과산화수소의 첨가에 따른 성장률을 측정하였고, 그 결과 산화적 스트레스 환경에서 해캄의 티오레독신 타입-h 유전자가 과다 발현된 클라미도모나스 레인하드티 형질전환체가 높은 저항성을 갖는다는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 해캄으로부터 티오레독신 타입-h의 확보

(1) 해캄의 배양

해캄은 공주대학교에서 분양을 받아 사용하였다. 해캄의 배양은 Modified Bold's Basal Medium(MBBM)을 사용하였으며, MBBM 배지 1 리터(liter)의 조성은 NaNO₃ 0.2465 g, CaCl₂·2H₂O 0.0249 g, MgSO₄·7H₂O 0.07395 g, K₂HPO₄ 0.07490 g, KH₂PO₄ 0.175 g, NaCl 0.02513 g, C₁₀H₁₆N₂O₈(EDTA) 0.04968 g, KOH 30.86 mg, FeSO₄·7H₂O 4.98 mg, H₂SO₄ 0.98 mg, H₃BO₃ 11.13 mg, ZnSO₄·7H₂O 8.83 mg, MnCl₂·4H₂O 1.44 mg, MoO₃ 6.06 mg, CuSO₄·5H₂O 1.57 mg, Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49 mg, Na₂MoO₄2H₂O 1.19 mg과 같다. 해캄을 MBBM 배지에 넣은 다음 식물배양 접시(plant culture dish, 100ㅧ40 mm)에 100 mL를 넣고 20 μmol photon m^-2s^-1이상의 광도에서, 12:12 Light:Dark cycle과 25 ℃의 온도를 유지하며 4일마다 계대 배양하였다.

(2) 방사선 조사

해캄에 대한 방사선 조사는 전라북도 정읍에 위치한 한국 원자력연구원 첨단방사선연구소의 코발트-60 조사장치(point source, AECL, IR-79, Nordion, Canada)를 이용하여 1 kGy의 흡수선량으로 조사하였다. 방사선의 선량측정(dosimetry)은 알라닌 도시메터(alanine dosimeter, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 이용하여 Bruker EMS 104 EPR Analyzer로 분석하였다.

(3) 방사선 조사에 의하여 발현량이 크게 증가한 단백질의 분리

방사선 조사된 해캄과 대조구인 비조사된 해캄은 다음과 같은 방법으로 단백질을 분리하였다.

단백질의 용출은 0.5 g의 해캄을 액체질소에서 급속 냉동시킨 후 막자와 막자사발을 이용하여 세포벽을 파쇄하고, 파쇄된 시료에 5배 부피의 용해용액(8 M urea, 4 % CHAPS, 35 mM Tris [pH 7.2])을 첨가한 후 1시간 동안 배양(incubation)하였다. 이를 4 ℃에서 17,000 x g 로 30 분간 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 상층액은 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 침전법을 통해 농축한 후 -70 ℃ 초저온 냉동고에 보관하여 실험에 사용하였다.

등전점 전기영동(isoelectic focusing, IEF)은 400 μl의 재수화 용액[8 M urea, 4 % CHAPS, 10 mM DTT, 0.2 % 양성물질(ampholite), pH 6.5]에 농축된 단백질을 첨가하여 재수화한 후 브래드포드(Bradford) 방법으로 단백질을 정량하여 1 mg을 기포가 생기지 않도록 IEF 트레이(tray)에 옮겼다. -20 ℃에 보관하였던 고정화 pH 구배(immobilized pH gradient, IPG) 스트립(strip)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)의 젤 표면의 보호막을 제거한 후 젤을 시료 위에 얹었다. 젤 위에 미네랄 오일(mineral oil) 3 mL를 얹어서 젤이 마르지 않도록 한 후 단백질 등전점 전기영동 셀(Bio-Rad) 안에서 20 ℃로 15 시간 동안 재수화시켰다. 재수화된 젤을 증류수로 조심스럽게 씻은 후 포화 여과지를 이용하여 과다한 물을 제거하였다.

두 개의 지지배양(paper wick)을 증류수로 적신 후 IEF 셀 트레이(tray)의 (+)와 (-) 양 극 전선에 올린 후 미네랄 오일 5 mL를 덮었다. 스트립을 윅(wick) 위에 올리고, 스트립 위에 전류가 흐를 수 있도록 미네랄 오일을 덮었다. 단백질 등전점 전기영동 셀의 프로그램은 다음과 같이 작동시켰다. 염을 제거하고 전하를 띤 오염물질(charged contaminants)을 3시간 동안 10,000 volts에 두어 조절(conditioning) 단계가 끝나면 전류가 스트립에 50 μA를 넘지 않도록 선형 전압(linear voltage) 단계를 12 시간 동안 실시하였다. 마지막 포커싱(focusing) 단계로 90,000 volt/hour 단계가 될 때까지 최대 전압을 걸어주었다. IEF가 완료된 젤을 -70 ℃에 보관하였다. IEF가 완료된 젤의 평형화는 2차원 전기영동을 시행하기 전 IPG 스트립을 SDS(sodiumdodecylsulfate)가 들어 있는 완충액으로 평형화시켰다.

스크립을 첫 번째 평형 완충액(6 M urea, 0.375 M Tris-HCl [pH 8.8], 2 % SDS, 20 % 글리세롤, 2 % (w/v) DTT) 15 mL이 들어 있는 코니칼 튜브(conical tube)에 넣은 후 교반하였다. 20 분 후 스크립을 두 번째 평형 완충액(6 M urea, 0.375 M Tris-HCl [pH 8.8], 2 % SDS, 20 % 글리세롤, 2.5 % (w/v) 요오드아세트아미드)을 넣어서 20분간 교반하였다.

2차원 전기영동은 평형화된 스트립을 증류수로 씻고 건조시킨 후 12.5% 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 젤 위에 올렸다. 나머지 공간은 러닝 버퍼(running buffer)에 녹인 0.7 % 로우 멜팅 아가로스(low melting agarose)로 채웠다. 러닝 버퍼로 채운 후 20 mA에서 15 분간, 다음 30 mA에서 브로모페놀블루(bromophenol blue, BPB) 마커(marker)가 젤의 아래에 닿을 때까지 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤은 쿠마씨블루(coomassie blue)로 염색한 후 탈염 용액(메탄올, 아세트산, 증류수)으로 탈염하였다. 젤 이미지는 Fluor-S Multi Images(Bio-Rad)로 스캔하여 얻었다. 방사선 조사한 개체와 비조사한 대조구에서 얻은 이미지를 PDQuest (Version 8, Bio-Rad) 프로그램을 사용하여 분석 하였다.

방사선 조사에 의하여 발현량이 크게 증가한 단백질들을 MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectroscopy) 분석을 통하여 펩타이드 동정(peptide identification)을 수행하였으며, 이로부터 티오레독신과 높은 유사성을 갖는 단백질을 확인할 수 있었다.

(4) 티오레독신 타입-h의 서열 분석

상기 확보한 단백질(티오레독신 타입-h)의 전체 길이(full length) cDNA 서열을 얻기 위해 펩타이드 동정 결과를 토대로 펩타이드 서열에 대한 degenerate primer를 디자인하여 cDNA 라이브러리와 함께 PCR을 수행하였다. 디자인된 프라이머를 통해 3' RACE(rapid amplification of cDNA ends), 5' RACE를 수행하여 개시 코돈(start codon)과 종료 코돈(stop codon)을 포함한 약 340 bp의 티오레독신 타입-h의 전사해석틀(open reading frame, ORF)을 확인하였다. 염기서열 결과를 도 1에 나타내었다. ORF 상에서 티오레독신 타입-h의 활성부위(뉴클레오티드 서열 TGGTGTGGACCGTGT; 아미노산 서열 WCGPC)를 포함하고 있음을 확인하였다. 티오레독신 타입-h와 다른 종의 티오레독신 아미노산 서열을 다중정렬(multiple alignment)한 결과 공통적으로 활성부위인 아미노산 서열 WCGPC를 공유하고 있음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에서 얻은 해캄 유래 티오레독신 타입-h 역시 다른 종의 티오레독신과 유사한 기능을 수행하는 단백질임을 예상할 수 있다.

(실시예 2) 해캄의 티오레독신 타입-h를 갖는 형질전환체

(1) 해캄의 티오레독신 타입-h를 갖는 대장균 형질전환체 개발

해캄의 티오레독신 타입-h를 갖는 대장균 형질전환체를 개발하기 위하여 다음과 같은 염기서열을 갖는 프라이머를 제작하여 PCR 단편을 확보하였다.

정방향 프라이머 (5'-TT CAT ATG GCT GAC CAC GGC AGA GTA-3');

역방향 프라이머 (5'-CG GG ATC CGT ATT TGC GTG TTT CTC AA-3').

확보한 PCR 단편은 NdeI과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)로 절단하였으며, 같은 제한효소로 절단된 벡터(vector) pET28b(+)(Novagen)와 라이게즈(ligase)를 이용하여 삽입하였다. 플라스미드(plasmid)는 E. coli BL21 (DE3)에 형질전환 되었다.

해캄의 티오레독신 타입-h로 형질 전환된 대장균과 pET28b(+)만으로 형질 전환된 대장균은 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양한 후 산화적 스트레스를 야기할 수 있는 방사선 조사 및 과산화수소의 첨가에 따른 생장률을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 그 결과 산화적 스트레스 환경에서 해캄의 티오레독신 타입-h 유전자가 과다 발현된 대장균 형질전환체가 높은 저항성을 갖는다는 것을 확인하였다.

(2) 해캄의 티오레독신 타입-h를 갖는 클라미도모나스 레인하드티 형질전환체 개발

또한, 해캄 유래 티오레독신-h가 다른 미세조류에서도 항산화 스트레스 내성을 증가시키는지를 확인하기 위하여 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonads reinhardtii) 형질전환체를 제작하였다.

상기 실시예에서 확보한 해캄유래 티오레독신 타입-h 유전자 DNA는 GeneArtㄾ Chlamydomonas TOPO® vector set(Invitrogen)로 서브복사(subcloning)를 하였다. 전기영동(electrophoration)을 이용한 클라미도모나스 레인하드티 형질전환을 위하여 조류배양챔버(alga growth chamber)에 배양중인 클라미도모나스 레인하드티를 최종 OD₇₅₀값이 0.3이 되게 하여 15 mL 코니칼튜브(conical tube)에 옮겨 담은 후 2,500 rpm으로 10 분간 원심 분리하였다. 상층액은 버리고 250 μl의 TAP-40 mM 자당용액(sucrose solution)으로 세포를 피펫팅(pipetting)하여 풀어준다. 제한효소 SacI 처리한 2 μg 플라스미드 DNA를 재부유 세포(resuspend cell)에 넣어 플리킹(flicking)하여 섞어준다. 형질전환 혼합물 250 μl를 전기영동 큐벳(cuvett)에 옮긴 후 실온에서 5분간 방치한다. Gene Pulser X Cell Total Electroporation System(Bio-Rad)에 큐벳을 끼워 넣고 600 볼트(volts), 용량 50 μF, 저항 무한대 조건 하에서 전기영동을 수행하였다. 형질전환 혼합물은 히그로마이신-B(hygromycin-B)가 함유된 TAP 아가 플레이트(agar plate)에 도말한 후 28 ℃ 조류배양챔버에 배양(incubation)하였다. 5일 후에 자란 콜로니(colony)를 TAP 배지에 배양하였다. 선별된 해캄 유래 티오레독신 타입-h와 TOPO 벡터만으로 형질 전환된 클라미도모나스 레인하드티 형질전환체들의 과산화수소 첨가에 대한 내성은 도 3에 나타내었다. 결과에서와 같이 해캄 유래 티오레독신 타입-h로 형질 전환된 클라미도모나스 레인하드티 형질전환체가 높은 내성을 갖는 것을 확인하였다.

본 발명을 통해 개발한 해캄 유래 티오레독신 타입-h를 대량으로 생산할 수 있는 대장균을 통하여 최근 화장품 소재로 연구되고 있는 티오레독신의 대량 생산이 가능하게 되었으며, 특히 해캄에서 유래한 티오레독신 타입-h 유전자는 다른 미세조류에서도 발현될 수 있기 때문에 최근 기능성 소재와 바이오 디젤 등의 생산에 활용되고 있는 미세조류의 개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.

<110> University Industry Liaison Office of Chonnam National University <120> Thioredoxin type-h from Spirogyra varians and transformant with increased oxidative-stress tolerance using the same <130> P13071801049 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 608 <212> DNA <213> Spirogyra varians <400> 1 cgctctagaa ctagtggatc ccccgggctg caggaattcg gcacgaggca tcaatggctg 60 accacggcag agtacacatt gtcacctcaa aacaagattg ggactctaag cttctagagg 120 cgcaggcgtc gaaacaagtc gtggtcgtag attttactgc cgtttggtgt ggaccgtgta 180 agcgaatagc ccccgaattt gccaagtttt cagaacaatt ccctaaaatc attttcttaa 240 aagtggacgt ggatgaagtt ccagaagttg cagagaaatg tgggattgaa gctatgccta 300 ctttccaagt ctatataaat aatgaaatgg ctgatcaatt agttggagct agcattgata 360 aactcaaaca gcttattgag aaacacgcaa attaaataag tctctagcca gtttagattg 420 catcctttca ctgaatattt tttctatata tactacgcct aaacgtctct ccacacattt 480 ctttgtcttt aatttttttt ctgtccaagt taactaattt tcctagggac aatccatttt 540 tgtgagaaat tgtatgtttt tgtttagaaa ttctattttt gcatcttcaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaa 608 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Spirogyra varians <400> 2 Met Ala Asp His Gly Arg Val His Ile Val Thr Ser Lys Gln Asp Trp 1 5 10 15 Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ala Gln Ala Ser Lys Gln Val Val Val Val 20 25 30 Asp Phe Thr Ala Val Trp Cys Gly Pro Cys Lys Arg Ile Ala Pro Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Phe Ser Glu Gln Phe Pro Lys Ile Ile Phe Leu Lys Val 50 55 60 Asp Val Asp Glu Val Pro Glu Val Ala Glu Lys Cys Gly Ile Glu Ala 65 70 75 80 Met Pro Thr Phe Gln Val Tyr Ile Asn Asn Glu Met Ala Asp Gln Leu 85 90 95 Val Gly Ala Ser Ile Asp Lys Leu Lys Gln Leu Ile Glu Lys His Ala 100 105 110 Asn

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 해캄(Spirogyra varians) 유래 티오레독신 타입-h.
제 1항의 티오레독신 타입-h를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제 2항에 있어서,
상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 2항 또는 제 3항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제 4항의 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
제 5항에 있어서,
상기 형질 전환체는 박테리아 또는 미세조류인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 6항에 있어서,
상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 6항에 있어서,
상기 미세조류는 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonads reinhardtii)인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 1항에 따른 티오레독신 타입-h를 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물.
서열번호 1의 염기서열을 포함하는 티오레독신 타입-h 유전자가 삽입된 도 4의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pET28b(+):Trxh.