KR20150004800A - H5n1 및 h1n1 인플루엔자 바이러스를 위한 계산적으로 최적화된 넓게 반응하는 항원 - Google Patents

H5n1 및 h1n1 인플루엔자 바이러스를 위한 계산적으로 최적화된 넓게 반응하는 항원 Download PDF

Info

Publication number
KR20150004800A
KR20150004800A KR1020147027594A KR20147027594A KR20150004800A KR 20150004800 A KR20150004800 A KR 20150004800A KR 1020147027594 A KR1020147027594 A KR 1020147027594A KR 20147027594 A KR20147027594 A KR 20147027594A KR 20150004800 A KR20150004800 A KR 20150004800A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
influenza
virus
protein
vlps
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020147027594A
Other languages
English (en)
Inventor
테드 엠. 로스
코레이 제이. 크리버
도날드 엠. 카터
Original Assignee
유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 filed Critical 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Publication of KR20150004800A publication Critical patent/KR20150004800A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 명세서는 인플루엔자 바이러스 분리체에 넓게 반응하는 면역반응을 유도하기 위한 최적화된 H5N1 및 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드 생성을 설명하고 있다. 인최적화된 HA 폴리펩타이드는, H5N1 및 H1N1 인플루엔자 분리체 상에 기반하여, 일련의 HA 단백질 서열, 및 후속의 컨센서스 서열의 생성을 통하여 발달되었다. 본 명세서는 최적화된 H5N1 및 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드, 및 조성물, 융합 단백질 및 HA 폴리펩타이드를 포함하는 VLPs를 제공한다. 추가적으로 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 제공한다. 개체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 본 개시에 의해 또한 제공한다.

Description

H5N1 및 H1N1 인플루엔자 바이러스를 위한 계산적으로 최적화된 넓게 반응하는 항원{COMPUTATIONALLY OPTIMIZED BROADLY REACTIVE ANTIGENS FOR H5N1 AND H1N1 INFLUENZA VIRUSES}
본 개시는 H5N1 및 H1N1인플루엔자 바이러스에 넓게 반응하는 면역반응을 유발하는 최적화된 인플루엔자 적혈구응집소(hemagglutinin) 단백질 및 백신으로서 이의 용도에 관한 것이다
인플루엔자 바이러스는 오르쏘믹소비리대 페밀리(Orthomyxoviridae family)의 구성원이다. 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 및 인플루엔자 C라고 지명된 인플루엔자 바이러스의 3가지 아류형(subtypes)이 있다. 인플루엔자 바이러스 입자(virion)는 하기의 단백질을 암호화하는, 부분으로된(segmented) 음성-센스 RNA 게놈을 포함한다: 적혈구응집소(hemagglutinin)(HA), 뉴라미니다제(neuraminidase) (NA), 매트릭스(matrix)(M1), 양성자 이온-채널 단백질(M2), 핵산단백질(NP), 폴리머라제 염기 단백질 1(PB1), 폴리머라제 염기 단백질 2(PB2), 폴리머라제 산성 단백질 (PA), 및 비구조적 단백질 2 (NS2). HA, NA, M1, 및 M2 단백질은 막과 연관되어 있고, 반면에 NP, PB1, PB2, PA, 및 NS2는 단백질과 연관된 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)이다. M1 단백질은 인플루엔자 입자에서 가장 풍부한 단백질이다. HA 및 NA 단백질은 글리코단백질을 둘러싸고, 세포로 바이러스 부착 및 바이러스 입자의 침투, 및 바이러스 중화 및 방어 면역을 위한 주요 면역우세 항원결정기(immunodominant epitopes)의 원천에 대해 책임을 맡는다. HA 및 NA 단백질 모두는 인플루엔자 백신 예방을 위해 가장 중요한 구성요소로 간주된다.
매년, 계절적 인플루엔자는 U.S. 단독에서 300,000명의 입원환자 및 36,000 명 이상의 사망자의 원인이 된다(Simonsen et al ., Lancet Infect Dis 7:658-66, 2007). 2009년에 신규 H1N1 인플루엔자 바이러스의 출현은 어떻게 빨리 새로운 인플루엔자 범유행이 전 세계를 휩슬어 버릴 수 있는지를 나타낸다.
현재 2 개의 인플루엔자 백신 접근법이 미국에서 허가되었다-비활성화된, 스플릿 백신(split vaccine) 및 백신균주(live attenuated virus vaccine). 비활성화된 백신은 효과적으로 체액 면역반응을 유도하나 일반적으로 단지 세포내 면역반응이 약하다. 생 바이러스 백신은 그들의 증가된 감염위험에 때문에 면역력이 약화거나 임산부 환자에게 투여될 수 없다. 따라서, 넓게 방어하는 인플루엔자 바이러스 백신을 위한 필요가 존재한다.
도 1은 "PATH H5N1 COBRA" HA로서 본 명세서에서 언급된, 분기군(clades) 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 및 7로부터 426 인간 H5N1 분리체를 사용하여 COBRA HA 서열을 생성하기 위한 과정을 요약한 도식도이다.
도 2는 "PATH H1N1 COBRA" HA로서 본 명세서에서 언급된, 205 인간 및 돼지 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리체를 사용하여 COBRA HA 서열을 생성하기 위한 과정을 요약한 도식도이다.
도 3는 분기군 1 및 분기군 2 감염 균주에 대한 HAI 적정농도 다음에 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1)을 포함하는 VLPs, 인간 분기군 2 인플루엔자 바이러스 COBRA HA 서열 (인간 COBRA-2)을 포함하는 VLPs, 또는 큰 고니(Whooper Swan) (A/큰 고니(Whooper Swan)/Mongolia/244/2005) 인플루엔자 바이러스 HA를 포함하는 VLPs를 갖는 백신접종을 나타내는 그래프이다. 백신접종 (3 ㎍)은 보조제 (ImjectTM)로 0 및 3 주에 수행될 수 있다.
도 4는 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1)를 포함하는 VLPs, 인간 COBRA-2 HA 서열을 포함하는 VLPs, 또는 큰 고니(Whooper Swan) VLPs 및 5000 PFU 인도네시아 분기군 2.1 바이러스 (A/인도네시아/5/2005)를 갖는 후속적 감염을 포함하는 VLPs를 갖는 백신화된 동물 체중을 나타내는 그래프이다. 백신접종(3 ㎍)은 보조제 (ImjectTM)로 0 및 3 주에 수행되었다; 바이러스 감염은 5 주 동안에 발생하였다.
도 5는 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1) 및 5000 PFU 베트남 분기군 1 바이러스 (A/베트남/1203/2004)로 후속적 감염으로 백신화된 동물의 체중을 나타내는 그래프이다. 백신접종 (3 ㎍)은 보조제 (ImjectTM)로 0 및 3 주에 수행되었다; 바이러스 감염은 5 주 동안에 발생하였다.
도 6은 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1)를 포함하는 VLPs, 인간 COBRA-2 HA 서열을 포함하는 VLPs, 또는 큰 고니(Whooper Swan) VLPs, 및 후속적 베트남 분기군 1 바이러스를 갖는 감염을 갖는 감염을 갖는 백신화된 동물의 체중을 나타내는 그래프이다. 단일 백신접종 (3 ㎍)은 보조제 (ImjectTM)로 0 주에서 수행되었고, 4 주 동안에 바이러스 감염을 실행하였다.
도 7은 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1)을 포함하는 VLPs, 인간 COBRA-2 HA 서열, 또는 큰 고니(Whooper Swan)를 포함하는 VLPs, 및 후속적 베트남 분기군 1 바이러스를 갖는 감염을 갖는 백신화된 동물의 퍼센트 생존을 나타내는 그래프이다. 단일 백신접종 (3 ㎍)은 보조제 (ImjectTM)로 0 주에서 수행되었고, 4 주 동안에 바이러스 감염을 실행하였다.
도 8은 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1)을 포함하는 VLPs, 인간 COBRA-2 HA 서열을 포함하는 VLPs, 및 베트남 분기군 1 바이러스를 갖는 후속적 감염으로 백신화된 동물의 체중을 나타내는 그래프이다. 0.6 ㎍의 복용량에서 단일 백신접종은 보조제 (ImjectTM)로 0 주에서 수행되었고, 4 주 동안에 바이러스 감염을 실행하였다.
관련된 적용에 교차 참조( CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS )
상기 적용은 2012, 3월 30일에 파일된 자체의 전문에서 참조로서 본 명세서에 혼합된 미국 가출원 번호(U.S. Provisional Application No.) 61/617,815의 혜택을 청구한다.
요약( SUMMARY )
본 개시는 인플루엔자 바이러스에 대해 넓게 반응하는 면역반응을 유도하기 위한 계산적으로-최적화된 H5N1 및 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 생성하는 것이다. 최적화된 HA 폴리펩타이드는 선별된 H5N1 및 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리체에 기반하여 일련의 HA 단백질 정렬, 및 컨센서스 서열의 후속 생성을 통하여 발달되었다.
본 명세서는 H5N1 또는 H1N1인플루엔자에 대한 넓게 반응하는 면역반응을 유도하는 최적화된 아미노산 서열을 갖는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드에 관한 것이고, 여기서 HA 폴리펩타이드는 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열를 포함하거나 구성한다. 일부실시형태에서, 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌(methionine) 잔기가 부족하다.
재조합 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자 및 벡터는 또한 본 개시에 의해 제공된다. 추가적으로 상기 벡터를 포함하는 분리된 세포를 포함한다.
또한 개시된 본 명세서는 최적화된 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 바이러스-같은 입자 (VLPs) 및 융합 단백질을 제공한다.
추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체로서 본 명세서에 개시된 최적화된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 VLPs를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 개시된 조성물, 융합 단백질 또는 VLPs의 투여에 의해 개체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또한 최적화된 HA 폴리펩타이드를 포함하는 VLP를 포함하는 조성물을 개체에투여함으로써 인플루엔자 바이러스에 대해 개체를 면역하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이전 및 다른 목적, 특징, 및 장점은 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이고, 수반하는 도면에 대한 참조로써 진행된다.
서열 목록
수반하는 서열 목록에 열거된 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에 정의된 바와 같이, 아미노산을 위한 세 개의 글자 코드를 사용하여 나타낸다. 서열 목록은 본 명세서에서 참조로써 포함된, 10.0 KB, 2013, 2원 7일에 만들어진, SCII 텍스트 파일로서 제시된다. 수반하는 서열목록에서:
서열번호: 1은 H5N1 인플루엔자 HA("PATH H5N1 COBRA")을 위한 COBRA 아미노산 서열이다.
서열번호: 2는 H1N1 인플루엔자 HA("PATH H1N1 COBRA")을 위한 COBRA 아미노산 서열이다.
상세한 설명
I. 약어
COBRA: 계산적으로 최적화된 넓게 반응하는 항원
HA: 적혈구응집소(hemagglutinin)
HAI: 적혈구 응집 억제
HRP: 호스래디쉬 퍼옥시다제
M1: 매트릭스(matrix) 단백질 1
NA: 뉴라미니다제(neuraminidase)
PFU: 플라크 형성 유닛(plaque form unit)
VLP: 바이러스-같은 입자
II . 용어 및 방법
달리 명시하지 않는 한, 기술 용어는 종래의 사용에 따라 사용된다.
생물 분자학에서 일반 용어의 정의는 옥스퍼드 대학 출판사(Oxford University Press), 1994 (ISBN 0-19-854287-9)에 위해 출판된 Benjamin Lewin, Genes V; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에 의해 출판된 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology 및 Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference에서 발견될 수 있다.
본 개시의 다양한 실시형태의 검토(review)를 용이하게 하기 위하여, 특정 용어의 하기 설명을 제공한다:
보조제(Adjuvant): 항원에 대한 면역반응을 비특정적으로 증강시키는 물질 또는 비히클. 보조제는 항원이 흡착된 상의 광물(백반(alum), 알루미늄 하이드록사이드(aluminium hydroxide), 또는 포스페이트)의 현탁액; 또는 추가적으로 항원성을 증강시키기 위해 때때로 사멸된 마이코박테리아(mycobacteria)의 포함과 함께 (프륜드(Freund)의 불충분한 보조제), 항원 용액이 미네랄 오일(예를 들면, 프륜드(Freund)의 불충분한 보조제)에 유화되어 있는 물-인-오일 에멀젼(water-in-oil emulsion)을 포함한다. 면역자극 올리고뉴클레오티드(Immunostimulatory oligonucleotides)(CpG 모티프를 포함하는 것과 같은)는 또한 보조제 (예를 들면, 미국특허번호. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; 6,339,068; 6,406,705; 및 6,429,199를 참조하시오)로서 사용될 수 있다. 보조제는 공동자극 분자(costimulatory molecules)와 같은, 생물학적 분자를 포함한다. 생물학적 보조제의 예로는 IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L 및 41 BBL을 포함한다.
투약( Administer ): 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 개체에게 조성물을 투여하는 것은 조성물을 개체와 같이 접촉으로 주거나 적용하거나 또는 가져오는 것을 의미한다. 투여는 예를 들면, 국소, 경구, 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 경막내(intrathecal), 및 진피내(intradermal)와 같은, 임의 다양한 경로에 의하여 완성될 수 있다.
항체( Antibody ): 특정 아미노산 서열을 갖는 B 림포이드(lymphoid) 세포에 의해 생성된 면역글로불린 분자. 항체는 특정 항원(면역원)에 의해 인간 또는 다른 동물에서 유발된다. 항체는 일부 증명할 수 있는 방식에서 항원, 다른 부분의 용어에서 각각 정의된 항체 및 항원으로 특정적으로 반응하여 특징이 된다. "항체 반응 유도(Eliciting an antibody response)"는 항체 생성을 유도하기 위한 항원 또는 다른 분자의 능력을 의미한다.
항원: 동물로 주사 또는 흡수되는 조성물을 포함하여, 동물에서 항체 또는 T-세포 반응의 생성을 촉진할 수 있는 화합물, 조성물,또는 물질. 항원은 이종 면역원에 의해 유도된 것을 포함하여, 특정 체액 또는 세포 내 면역의 생성물과 반응한다. 본 개시된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 항원은 인플루엔자 HA 단백질이다.
코돈-최적화( codon - optimized ): "코돈-최적화(codon-optimized)"핵산은 코돈이 특정 시스템(특정 종 또는 종의 군과 같은)에서 발현에 최적인 것과 같은 변형된 핵산 서열을 의미한다. 예를 들면, 핵산 서열은 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는다.
융합 단백질( Fusion protein ): 적어도 2개의 상이한 (이종기원의) 단백질의 부분을 암호화하는 핵산 서열로부터 기술된(engineered) 핵산 서열의 발현에 의해 생성되는 단백질. 융합 단백질을 만들기 위해, 상기 핵산 서열은 동일한 리딩 프레임 내에 있어야만 하고 내부 종결 코돈을 포함하지 않는다. 예를 들면, 융합 단백질은 이종 단백질에 융합된 인플루엔자 HA를 포함할 수 있다.
적혈구응집소( hemagglutinin ) ( HA ): 인플루엔자 바이러스 표면 글리코단백질. HA는 숙주세포에 바이러스 입자의 결합 및 숙주세포로 후속의 바이러스 진입을 매개한다. 다수의 인플루엔자 HA 단백질의 뉴클레오티드및 아미노산 서열은 당업계에 알려져 있고 예를 들면 NCBI 인플루엔자 바이러스 자원 데이타베이스(Resource database)를 통하여, 공개적으로 활용된다(Bao et al., J Virol 82:596-.601, 2008). HA(NA를 따라서)는 두 개의 주요 인플루엔자 바이러스 항원 결정인자(virus abtigeni mmune responsedeterminants) 중의 하나이다.
면역반응( Immune response ): 항원 또는 백신과 같은 자극에 대한, B-세포, T-세포, 대식세포 또는 다형핵(polymorphonucleocyte)과 같은 면역 시스템의 세포의 반응. 면역반응은 예를 들면, 인터페론(interferon) 또는 사이토카인(cytokine)을 분비하는 상피(epithelial) 세포를 포함하여, 숙주 방어반응에 관련된 신체의 임의 세포를 포함할 수 있다. 면역반응은 선천 면역반응(innate immune response) 또는 염증(inflammation)을 포함하나, 제한된 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 방어 면역반응(pretective immune response)은 감염 (감염을 방지하거나 또는 감염과 관련된 질환의 발달을 방지)으로부터 개체를 보호하는 면역반응을 의미한다. 면역반응 측정 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 림프구(lymphocytes)(B 또는 T 세포와 같은)의 증식 및/또는 활성, 사이토카인 또는 케모카인(chemokines)의 분비, 염증, 항체생성 등을 측정을 포함한다.
면역원( Immunogen ): 적절한 조건하에서, 동물로 주사되거나 흡수된 조성물을 포함하여, 동물에서 항체 생성 또는 T-세포 반응과 같은, 면역반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "면역원 조성물(immunogenic composition)"은 면역원(HA 폴리펩타이드와 같은)을 포함하는 조성물이다.
면역성을 주다( immunize ): 예방접종(vaccination)에 의해, 감염성 질환으로부터 보호되는 개체가 되게하는 것.
인플루엔자 바이러스( Influenza v irus ):오르쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae ) 페밀리에 속하는 부분으로 된(segmented) 역-가닥(negative-strand) RNA 바이러스. 세 가지 유형의 인플루엔자 바이러스, A, B 및 C가 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 말, 해양 포유동물, 돼지, 흰족제비(ferrets), 및 닭을 포함하여, 광범위한 다양한 조류 및 포유류를 감염시킨다. 동물에서, 대부분의 인플루엔자 A 바이러스는 호흡기관 및 장관(intestinal tract)의 약한 국지적 감염을 일으킨다. 그러나, H5N1과 같은 고병원성의 인플루엔자 A 균주는 사망률이 100%에 도달할 수 있는 가금에서 시스테믹 감염을 일으킨다. 2009년에, H1N1 인플루엔자는 인간 인플루엔자의 대부분의 일반적인 원인이었다. 2009년에 돼지-기원 H1N1의 새로운 균주는 세계 보건기구(World Health Organization)에 의해 범유행성(pandemic)으로 선언되었다. 상기 균주는 "돼지유행감기(swine flu)"로 언급되었다. H1N1 인플루엔자 A 바이러스는 1918년 스페인 감기 범유행(Spanish flu pandemic), 1976년에 포트 딕스 아웃브레이크(Fort Dix outbreak), 및 1977-1978년에 러시아 감기 범유행( Russian flu epidemic)에 또한 책임이 있다.
분리된( Isolated ): "분리된(isolated)" 생물학적 구성요소 (핵산, 단백질 또는 바이러스와 같은) 는 다른 생물학적 구성요소(세포 파편, 또는 다른 단백질 또는 핵산과 같은)로부터 상당히 떨어지거나 또는 정제되어 왔다. "분리"되어온 생물학적 구성요소는 표준 정제 방법에 의해 정제된 상기 구성요소를 포함한다. 또한 상기 용어는 화학적으로 합성된 핵산 또는 펩타이드 뿐만 아니라, 재조합 핵산, 단백질 또는 바이러스(또는 VLPs)를 포용한다.
링커( Linker ): 융합 단백질의 2개의 폴리펩타이드 사이에서 스페이서(spacer)로서 제공되는 하나 또는 이상의 아미노산.
매트릭스( matrix ) ( M1 ) 단백질: 바이러스 외피(envelope) 내에서 발견된 인플루엔자 바이러스 구조 단백질. M1은 모집(assembly) 및 버딩(budding)에서 기능하는 것으로 여겨진다.
뉴라미니다제 ( NA ): 인플루엔자 바이러스 막(membrane) 글리코단백질. NA는 감염된 세포 표면 상에 카보하이드레이트 일부분(carbohydrate moieties)으로부터 말단 시알산(sialic acid) 잔기를 절단하여 바이러스 HA에 대하여 세포 내 수용체의 파괴에 관여되어 있다. NA는 바이러스 응집을 방지하는, 바이러스 단백질로부터 시알산 잔기를 또한 절단한다. NA (along with HA)는 두 개의 인플루엔자 바이러스 항원 결정인자(virus antigenic determinants)의 하나이다.
실시가능하게 연결됨( Operably linked ): 첫 번째 핵산 서열이 두 번째 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 첫 번째 핵산 서열은 두 번째 핵산 서열과 실시가능하게 연결된다. 예를 들면, 만약 프로모터가 코딩서열의 전사 또는 발현에 영향을 준다면 프로모터는 코딩서열과 실시가능하게 연결된다. 유전적으로, 실시가능하게 연결된 DNA 서열은, 2개의 단백질 코딩 영역을 결합시키는 것이 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임(reading frame)에서 연속적(contiguous)이다.
최적화된 인플루엔자 HA 단백질: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "최적화된 인플루엔자 HA 단백질"은 H5N1 및 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리체의 서열 정렬에 의해 생성되는 HA 단백질 컨센서스(consensus) 서열을 의미한다(하기의 실시예 1 및 2에서 설명된 바와 같이). 최적화된 HA 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화 및 RNA 최적화(예를 들면 RNA 안정성을 증가시켜)를 경유하여 포유동물 세포에서 발현을 위해 추가적으로 최적화된다. 본 명세서에 개시된 최적화된 인플루엔자 HA 단백질(서열번호: 1 및 서열번호: 2로서 설명됨)은 "COBRA"(계산적으로-최적화된 넓게 반응하는 항원(computationally-optimized broadly reactive antigen))서열로 또한 언급된다. 최적화된 HA 폴리펩타이드는 개체에서 넓게 반응하는 면역반응을 이끌어내도록 디자인되었다. 본 개시의 문맥에서, "넓게 반응(broadly reactive)"은 인플루엔자 바이러스 (예를 들면 특정 아류형(subtype) 내에 대부분 또는 모든 인플루엔자 바이러스)의 넓은 범위의 감염을 억제, 중화 또는 방지하기에 충분한 개체에서 면역반응을 이끌어내는 단백질 서열을 의미한다. 일부 경우에서, 최적화된 인플루엔자 HA 단백질은 대부분 또는 모든 H5N1 인플루엔자 바이러스 분리체이거나, 대부분 또는 모든 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리체에 대하여, 방어 면역반응(protective immune response)과 같은 면역반응을 유도할 수 있다.
아웃브레이크( Outbreak ): 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 "아웃브레이크"는 주어진 해에 단일 국가내에서 바이러스 분리체의 수집물을 언급한다.
약학적으로 허용가능한 비히클 ( Pharmaceutically acceptable vehicles ): 본 개시에서 유용한 약학적으로 허용가능한 담체(비히클)은 관습적(conventional)이다. E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)에 의한, Remington's Pharmaceutical Sciences은 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 백신과 같은, 하나 또는 그 이상의 치료 조성물 및 추가 약학제제의 약학적 운반에 적합한 조성물 및 제제를 설명한다.
일반적으로, 상기 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 모드에 따른다. 예를 들면, 비경구 제제(parenteral formulations)는 물, 생리식염수(physiological saline), 평형염액(balanced salt solutions), 수용성 덱스트로오스(aqueous dextrose), 글리세롤 또는 비히클 같은 것과 같은 약학적 및 생리학적으로 허용가능한 액체(fluids)를 포함하는 주사가능한 액체를 항상 포함한다. 고체 조성물(예를 들면, 분말, 알약, 정제, 또는 캡슐 형태)에 대해서, 관습적 비독성 고체 담체는 예를 들면, 약학적 등급의 만니톨(mannitol), 락토오스, 전분(starch), 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적-중성 담체에 추가하여, 투여되는 약학적 조성물은 습윤제(wetting) 또는 유화제(emulsifying agent), 보존제(preservatives), 및 pH 완충제(buffering agents) 등, 예를 들면, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate)과 같은 소량의 비독성 보조 물질을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 ( Polypeptide ): 아미드 결합을 통하여 함께 결합된 아미노산 잔기로 된 모노머들(monomes)인 폴리머(polymer). 아미노산이 알파-아미노산일 때, L-광학적 이성질체(optical isomer) 또는 D-광학적 이성질체가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 임의 아미노산 서열을 포함하고자 하고 글리코단백질과 같은 변형된 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩타이드"는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 것뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 단백질을 커버하도록 특정적으로 의도된다. 용어 "잔기(residue)" 또는 "아미노산 잔기(amino acid residue)"는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 혼합된 아미노산에 대한 참조를 포함한다,
질환 예방( Preventing ), 치료( treating ) 또는 개선( ameliorating ): 질환 "예방(preventing)"은 질환의 전체 발달을 억제하는 것을 언급한다. "치료(treating)"은 발달하기 시작한 후에 질환의 사인 또는 증상 또는 병적 증상을 개선하는 치료 간섭을 언급한다. "개선(ameliorating)"은 질환의 사인 또는 증상의 수 또는 심각도에서 감소를 언급한다.
프로모터( promoter ): 프로모터는 핵산의 직접적 전사핵산 조절 서열의 어레이이다. 프로모터는 전사의 시작 위치 근처의 필수적인 핵산 서열을 포함한다. 또한 프로모터는 먼거리(distal) 증강인자(enhancer) 또는 억제인자(repressor) 요소를 선택적으로 포함한다. "구성적 프로모터(constitutive prmoter)"는 계속적으로 활성이고 외부 신호 또는 분자에 의해 조절하는 개체가 아니다. 반대로, "유도하는 프로모터(inducible promoter)"의 활성은 외부 신호 또는 분자(예를 들면, 전사 요인)에 의해 조절된다. 본 명세서의 일부 실시형태에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다.
정제된( Purified ): 용어 "정제된(purified)"은 절대적 순수를 요구하지 않는다; 다소, 이것은 상대적 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들면, 정제된 펩타이드, 단백질, 바이러스, VLP 또는 다른 활성 화합물은 자연적으로 연관된 단백질 및 다른 오염물질로부터 전체 또는 부분에서 분리된 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "상당히 정제된(substantially purified)"은 세포, 세포 배양 배지, 또는 다른 거친 제조로부터 분리되고 단백질, 세포 내 파편, 및 다른 구성요소와 같은 초기 제조의 다양한 구성요소를 제거하기 위해 분류(fractionation)에 대상이 된 펩타이드, 단백질, 바이러스, VLP 또는 다른 활성 화합물을 언급한다.
재조합( Recombinant ): 재조합 핵산, 단백질, 바이러스 또는 VLP은 자연적으로 발생하지 않는 서열이거나 또는 두 개의 다른 떨어진 서열 부분(segments)의 인공적 조합에 의해 만들어진 서열을 가진 것이다. 상기 인공적 조합은 화학적 합성 또는 핵산의 분리된 부분의 인공적 조작(artificial manipulation), 예를 들면, 유전적 엔지닝어링 기술에 의해 종종 완성된다.
개체( Subject ): 살아있는 다세포 척추생물, 비인간 영장류와 같은 인간 및 비인간 포유류 모두를 포함하는 카테고리.
치료적 유효량( Therapeutically effective amount ): 상기 제제로 치료되는 개체에서 원하는 효과를 얻기 위한 충분한 특정 제제의 양. 예를 들면, 상기는 개체에서 면역반응을 유도하고/하거나 인플루엔자 바이러스에 의해 기인된 감염 또는 질환을 예방하기 위해 유용한 인플루엔자 바이러스 백신의 수량이 될 수 있다. 이상적으로, 본 개시의 문맥에서, 인플루엔자 백신의 치료적으로 유효한 양은 개체에서 상당한 독성효과 원인 없이 개체에서 인플루엔자 바이러스에 기인된 감염을 저항 증가, 예방, 개선 및/또는 치료하는데 충분한 양이다. 개체에서 감염을 저항 증가, 예방, 개선 및/또는 치료에 유용한 인플루엔자 백신의 유효한 양은 예를 들면, 치료되는 개체, 치료 조성물 및 다른 요인의 투여 방식에 따라 의존될 것이다.
형질전환( Transformed ): 형질전환된 세포는 분자 생물학 기술에 의해 핵산 분자로 도입된 세포이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 형질전환(transformation)은 바이러스 벡터를 갖는 형질주입(transfection), 플라스미드 벡터를 갖는 형질전환(transformation), 및 전기천공(electroporation), 리포펙션(lipofection), 및 입자 총 가속화(particle gun acceleration)에 의해 네이크드(naked)DNA의 도입을 포함하여, 상기 세포로 도입될 수 있는 핵산 분자에 의한 모든 기술을 포함한다.
백신(Vaccine): 감염성 질환과 같은 질환의 예방, 예방, 또는 치료를 위해 투여되는, 면역반응을 자극할 수 있는 면역원 물질 제조. 면역원 물질은 예를 들면, 약독화 또는 사멸된 미생물(약독화(attenuated) 바이러스와 같은), 또는 이들로부터 유래된 항원 단백질(VLPs를 포함하여), 펩타이드 또는 DNA를 포함할 수 있다. 백신은 예방(preventative) 및 치료 반응 모두를 이끌어 낼 수 있다. 백신에 따라 투여 방법은 다양하나, 접종(inoculation), 섭취(ingestion), 흡입(inhalation) 또는 다른 투여형태를 포함할 수 있다. 접종은 정맥내 투여(intravenous), 피하(subcutaneous) 또는 근육 내(intramuscular)와 같은 비경구를 포함하여 임의 다수의 경로(routes)에 의해 운반될 수 있다. 백신은 면역반응을 고양시키기 위해 보조제로 투여될 수 있다.
벡터( Vector ): 벡터는 숙주세포에서 복제 및/또는 통합하기 위해 벡터의 능력을 방해 없이 외부 핵산의 삽입을 허가하는 핵산 분자이다. 벡터는 복제기원(origin of replication)과 같이, 숙주세포에 복제하도록 허가하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 삽입벡터(insertional vector)는 숙주세포로 자체를 삽입할 수 있다. 또한 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별마커 유전자 및 다른 유전자를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 삽입된 유전자 또는 유전자들의 전사 및 번역을 허가하는 필수 조절 서열을 포함하는 벡터이다. 본 개시의 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 인플루엔자 HA, NA 또는 M1 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 pTR600 발현 벡터(미국 특허공개번호. 2002/0106798; Ross et al ., Nat Immunol . 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001)이다.
바이러스-같은 입자 ( VLP ): 바이러스 입자는 많은 바이러스 구조 단백질의 하나로 구성되나, 바이러스 유전체(viral genome)가 부족하다. VLPs는 바이러스 유전체가 부족하기 때문에, 이들은 비감염적이다. 추가적으로, VLPs는 이종 발현(heterologous expression)에 의해 종종 생성될 수 있고 용이하게 정제될 수 있다. 대부분의 VLPs는 숙주세포로부터 버딩(budding)을 운전하고 및 입자 방출하는 적어도 바이러스 핵심 단백질(viral core protein)을 포함한다. 상기 핵심 단백질의 하나의 실시예는 인플루엔자 M1이다. 본 명세서의 일부 실시형태에서, 인플루엔자 VLP는 HA, NA 및/또는 M1 단백질을 포함한다. 인플루엔자 VLPs는 HA 및 NA 단백질, 및 선택적으로 M1 단백질을 암호화하는 플라스미드를 갖는 숙주세포의 형질주입에 의해 생성될 수 있다. 단백질 발현(예를 들면 대략 72 시간)을 위해 허가하는 적절한 시간을 위한 형질주입된 세포 배양 후에, VLPs는 세포 배양 상층액으로부터 분리될 수 있다. 실시예 4는 세포 상층액으로부터 인플루엔자 VLPs를 정제하기 위한 전형적 프로토콜을 제공한다. 상기 실시예에서, VLPs는 20% 글리세롤을 통하여 저속원심분리(세포파편을 제거하기 위하여), 진공 여과(vacuum filtration) 및 초고속원심분리(ultracentrfugation)에 의해 분리된다. 인플루엔자 VLPs를 생성하는 다른 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들면, 미국 특허공개 출원번호. 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769; 및 2010/0239610).
달리 설명되지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시에 속하는 당업계의 보통 기술에 의해 일반적으로 이해되는 것으로서 동일한 의미를 가진다. 단수형 용어 "a," "an," 및 "the"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시물(referents)를 포함한다. "A 또는 B의 비교"는 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대한, 모든 베이스(base) 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량값은 대략적이고 설명을 위해 제공된다는 것이 추가적으로 이해될 것이다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 물질은 본 개시의 연습 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질을 하기에 설명하였다. 본 명세서에서 언급된 모든 출간물, 특허출원, 특허, 및 다른 참조는 자체의 완전한 상태에서 참조로서 혼합된다. 분쟁의 경우에서, 용어 설명을 포함하여, 본 열거는 조정될 것이다. 추가적으로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명하는 것이고 제한하는 것은 아니다.
III . 몇 가지 실시형태의 개요
본 명세서는 인플루엔자 바이러스에 넓게 반응하는 면역반응을 유도하는 계산적으로-최적화된 H5N1 및 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 생성을 개시한다. 최적화된 HA 폴리펩타이드는 일련의 HA 단백질 정렬, 및 선별된 H5N1 및 H1N1 인플엔자 바이러스 분리체에 기반한 컨센서스 서열의 후속적 생성을 통하여 발달된다. 최적화된 HA 컨센서스 서열을 생성하기 위해 사용된 방법은 실시예 1 및 2에 설명되었고, 도 1 및 2에 나타냈다. 2 개의 특정 HA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호: 1(H5N1) 및 서열번호: 2(H1N1)로서 본 명세서에서 설명되었다. H5N1 은 서열은 분기군(clades) 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 및 7로부터 426 인간 H5N1 분리체를 사용하여 생성되고, "PATH H5N1 COBRA" HA로서 언급되었다. H1N1 서열은 205개의 인간 및 돼지 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리체를 사용하여 생성되었고, "PATH H5N1 COBRA" HA로서 언급되었다.
본 개시는 H5N1 또는 H1N1인플루엔자에 대하여 넓게 반응하는 면역반응을 유도하는 최적화된 아미노산 서열을 갖는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 제공한다. 일부실시형태에서, 상기 HA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 구성한다.
다른 실시형태에서, 상기 HA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호: 1의 잔기 2-568, 또는 서열번호: 2의 잔기 2-566의 아미노산 서열을 포함하거나 구성한다.
추가적으로 본 명세서에서 개시된 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 일부실시형태에서, 상기 핵산 분자는 포유동물 세포에서 발현을 위한 코돈-최적화이다. 핵산 분자는 RNA 안정성을 위해 선택적으로 추가적으로 최적화되어 있다.
재조합 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 본 개시에 의해 또한 제공된다. 벡터는 포유동물 발현 벡터와 같이, HA 폴리펩타이드의 발현을 위한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 벡터는 pTR600 발현 벡터 (미국 특허공개출원 번호. 2002/0106798, 참조에 의해 본 명세서에 포함됨; Ross et al ., Nat Immunol . 1(2):102-103, 2000; Green et al ., 백신 20:242-248, 2001).
일부 실시예에서, 상기 벡터는 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 실시가능하게 연결된(Operably linked) 프로모터를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다.
또한, 개시된 벡터를 포함하는 분리된 세포를 제공한다. 일부 경우에서, 상기 세포는 포유동물 세포와 같은, VLPs의 생성 및 발현을 위한 임의의 적합한 세포 유형이다.
추가적으로, 본 명세서에 개시된 최적화된 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 VLPs를 제공한다. 상기 인플루엔자 VLPs는 추가적으로 바이러스 입자를 형성하는데 필요한 임의의 추가 인플루엔자 단백질을 포함할 수 있다. 일부실시형태에서, 인플루엔자 VLPs는 인플루엔자 뉴라미니다제(neuraminidase) (NA) 단백질, 인플루엔자 매트릭스(matrix) (M1) 단백질, 또는 모두를 추가적으로 포함한다..
또한 HA, M1 및 NA 단백질의 발현을 허가하기에 충분한 조건하에서 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터, 인플루엔자 NA 단백질을 암호화하는 벡터 및 인플루엔자 M1 단백질을 암호화하는 벡터를 숙주 세포에 형질주입하여 생성하는, 본 명세서에 개시된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 VLPs를 제공한다.
최적화된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 추가적으로 본 개시에 의해 제공한다.
또한 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 최적화된 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 조성물 또는 최적화된 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 VLP을 제공한다.
일부실시형태에서, 상기 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 포함한다. 예를 들면, 보조제는 백반(alum), 프륜드(Freund's) 완전 보조제, 생물학적 보조제 또는 공동자극 올리고뉴클레오티드(CpG 올리고뉴클레오티드와 같은)일 수 있다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이 최적화된 인플루엔자 HA 단백질, 최적화된 인플루엔자 HAffm 포함하는 융합 단백질, 최적화된 인플루엔자 HA를 포함하는 VLPs,, 또는 이의 조성물을 투여하여 개체에 인플루엔자 바이러스에게 면역반응을 유도하는 방법을 추가적으로 제공한다. 일부실시형태에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 H5N1 또는 H1N1인플루엔자 바이러스이다. 일부실시형태에서, HA 단백질, HA 융합 단백질 또는 VLP는 예를 들면, 근육내(intramuscular), 비강내(intranasal), 또는 경구와 같은 투여의 임의의 적합한 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 일부실시형태에서, HA 단백질, 융합 단백질 또는 VLP는 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 추가적으로 포함하는 조성물로서 투여된다. 예를 들면, 상기 보조제는 백반(alum), 프륜드(Freund's) 완전 보조제, 생물학적 보조제 또는 면역자극 올리고뉴클레오티드(CpG 올리고뉴클레오티드와 같은)일 수 있다.
또한 본 명세서에서 개시된 최적화된 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 VLPs를 개체에게 투여하여 인플루엔자 바이러스에 대하여 개체를 면역하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 일부실시형태에서, 상기 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 추가적으로 포함한다. 예를 들면, 상기 보조제는 백반, 프륜드(Freund's) 완전 보조제, 생물학적 보조제 또는 면역자극 올리고뉴클레오티드(CpG 올리고뉴클레오티드와 같은)일 수 있다. 일부실시형태에서, VLPs (또는 이의 조성물)는 근육 내로 투여된다.
면역반응을 유도하거나 개체를 면역하는 방법의 일부실시형태에서, 상기 개체는 최적화된 HA 단백질을 포함하는 약 1 내지 약 25 mg의 VLP가 투여된다. 특정 실시예에서, 상기 개체는 약 5 내지 약 20 mg의 VLP, 또는 10 내지 약 15 mg의 VLPs가 투여된다. 하나의 특정 비-제한적 실시예에서, 상기 개체는 약 15 mg의 VLPs가 투여된다. 그러나, 당업자는 개체에게 투여하기 위해 치료적으로 유효한 양 VLPs(예를 들면 H5N1 또는 H1N1 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보호를 제공하는 양)을 결정할 수 있다.
IV . 인플루엔자
인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스(Orthomyxoviridae)페밀리에 속하는 역-가닥(negative-strand) RNA 바이러스 부분으로 나뉜다. 인플루엔자 바이러스, A, B 및 C의 세 가지 유형이 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 말, 해양 포유류, 돼지, 족제비(ferrets), 및 닭을 포함하여 넓은 다양한 조류 및 포유류를 감염시킨다. 동물에서, 대부분의 대부분의 인플루엔자 A 바이러스는 호흡기 및 장관의 약한 국부의 감염을 일으킨다. 그러나, H5N1과 같은, 고병원성의 인플루엔자 A 균주는 치사율이 100%에 도달할 수 있는 가금에 있는 시스테믹 감염을 일으킨다. 인플루엔자 A로 감염된 동물은 인플루엔자 바이러스에 대하여 종종 병원소로서 행하고 특정 아류형은 인간에 장벽인 종을 교차하는 것으로 나타내어 왔다.
인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 부착 및 세포 내 방출에 대해 요구되는 표면 글리코단백질, 이름하여 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(neuraminidase (NA))를 암호화하는 2 개의 유전자의 항원 영역에서 대립형질(allelic) 변화(variations)에 기반된 아류형으로 분류될 수 있다. 현재, HA (H1-H16)의 16개의 아류형 및 9개 NA (N1-N9) 항원변형체(variants)는 인플루엔자 A 바이러스로 알려져 있다. 기존에, 단지 3 개의 아류형이 인간에서 순환하는 것으로 알려져 있다(H1N1, H1N2, 및 H3N2). 그러나, 최근에 조류 인플루엔자 A의 병원성 H5N1 아류형은 종의 장벽을 교차하고 몇몇 환자를 사망에 이르게 한 1997 및 2003년에 홍콩에서 기록된 것처럼 인간을 감염시킨 것으로 기록되어왔다.
2009년에, H1N1 인플루엔자는 인간 인플루엔자의 대부분 일반적인 원인이었다. 돼지-기원 H1N1의 새로운 균주는 2009년에 발생되었고 세계건강기구(World Health Organization)에 의해 범유행으로 선언되었다. 상기 균주는 돼지-기원 H1N1의 새로운 균주는 2009년에 부상하고 세계보건기구에 의해 유행이 선언되었다. 상기 균주는 "돼지-감기(swine flu.)"로서 언급되었다. H1N1 인플루엔자 A 바이러스는 1918년 스페인 감기 유행, 1976년에 포트 딕스 아웃브레이크(Fort Dix outbreak), 및 1977-1978년에 러시아 감기 유행병에 대해 책임이 있다.
인플루엔자 바이러스 부분으로 된 게놈은 RNA-직접적 RNA 폴리머라제 단백질 (PB2, PB1 및 PA), 핵산단백질(NP), 뉴라미니다제(neuraminidase) (NA), 적혈구응집소(hemagglutinin) (아류형 HA1 및 HA2), 매트릭스(matrix) 단백질 (M1 및 M2) 및 비구조적 단백질 (NS1 및 NS2)을 포함하여, 적어도 10 개의 폴리펩타이드를 암호화하는 8 개의 역-센스 RNA (nsRNA) 유전자 부분 (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA 및 NA)를 포함한다(Krug et al ., In "The Influenza Viruses," R. M. Krug, ed., Plenum Press, N.Y., 1989, pp. 89 152).
널리 퍼지는 질병 원인이 되는 인플루엔자 바이러스 능력은 항원 변화 과정에 의해 면역 시스템을 침범하는 자체의 능력에 기인하고, 이는 숙주가 동물 인플루엔자 바이러스 및 인간 인플루엔자 바이러스 모두에게 동시에 감염될 때 발생된다고 여겨진다. 숙주에서 돌연변이 및 재분류 동안에, 상기 바이러스는 다른 바이러스로부터 자체의 게놈으로 HA 및/또는 NA 표면 단백질 유전자를 혼합할 수 있으므로, 새로운 인플루엔자 아류형을 생성하고 면역 시스템을 회피한다.
HA는 대략 560 아미노산을 일반적으로 포함하는 바이러스 표면 글리코단백질이고 총 바이러스 단백질의 25%를 대표한다. 감염의 초기단계의 숙주 세포로, 바이러스 입자의 접착(adhesion), 및 자체의 침투에 대한 책임이 있다. HA1 및 HA2 하위-단편으로 바이러스 HA0 전구체의 절단은 바이러스를 세포에 감염시키기 위하여 필요한 단계이다. 따라서, 절단(cleavage)은 숙주세포에 있는 새로운 바이러스 입자를 새로운 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스입자(virions)로 전환시키기 위해 요구된다. 절단은 감염된 세포의 세포질그물(endoplasmic reticulum)로부터 플라스마 멤브린으로 내장된 HA0 멤브린 단백질의 수송과정에서 발생한다. 수송과정 중에, 헤마글루티닌은 아미노-말단 HA1단편 및 카르복시 말단 HA2로 전구체 HA의 단백질 절단을 포함하는 일련의 공동- 및 번역 후 변형을 진행한다. 기본적 조직 배양 또는 수립된 세포주에서 자라는 인플루엔자 균주의 기본적 어려움의 하나는 숙주세포에서 인플루엔자 헤마글루티닌의 활성요구로부터 발생한다.
비록 비절단 HA는 세포 표면 상의 뉴라민산(neuraminic acid)을 포함하는 수용체에 바이러스 부착을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 융합인 감염성 사이클에서 다음 단계를 수행할 수 없다. 표적세포로 삽입될 수 있도록 절단에 의한 HA2의 소수성(hydrophobic) 아미노 말단의 노출이 요구되므로, 바이러스와 표적세포 멤브린 사이의 브리지(bridge)를 형성하는 것으로 보고되어 있다. 상기 진행은 두 개의 멤브린 융합과 표적 세포로 바이러스의 진입 다음에 따른다.
HA의 단백질 가수분해 활성은 칼슘 의존적이고 중성 pH 최적을 가지는 종종 세포내 효소인, 트립신-같은 엔도프로테아제(endoprotease)에 의해 아르기닌 잔기(arginine residue)에서 절단을 관련시킨다. 활성화하는 프로테아제(protease)는 세포 내 효소이기 때문에, 감염된 세포유형은 HA가 절단되었는지 아닌지를 결정한다. 포유동물 인플루엔자 바이러스 및 비병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA는 제한된 수의 세포 유형에서 단지 단백질 절단에 걸리기 쉽다. 다른 한편으로는, H5및 H7 아류형 사이에서 병원성의 조류 바이러스의 HA는 넓은 범위의 상이한 숙주세포에서 존재하는 프로테아제에 의해 절단된다. 따라서, 바이러스의 병원성의 성질과 연관된 헤마글루티닌 절단성의 차이로부터 얻어진 숙주범위에서 차이가 있다.
뉴라미니다제(NA)는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 멤브린 글리코단백질이다. 바이러스 NA의 존재는 감염 바이러스에 대하여 다수-직면한 반응하는 면역반응을 생성하기에 중요한 것으로 나타내어져 왔다. 대부분의 인플루엔자 A 바이러스에 대하여, NA는 길이에서 413 아미노산이고, 1413 뉴클레오티드의 유전자에 의해 암호화된다. 아홉개의 상이한 NA 아류형은 인플루엔자 바이러스(N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9), 상기의 모두는 야생 조류사이에서 발견되었다. NA는 감염된 세포의 표면 상에 카보하이드레이트 부분으로부터 말단 뉴라민산(neuraminic acid)(또한 시알산으로 불림) 잔기를 절단하여 바이러스 HA에 대한 세포 내 수용체의 파괴에 관여된다. NA는 바이러스 단백질로부터 시알산 잔기를 절단하여, 바이러스 응집을 방지한다. 상기 기전을 이용하여, NA가 (mucosal)상에 존재하는 점액(mucus)을 통하여 바이러스의 수송을 촉진하는 것뿐만 아니라, 세포 멤브린을 따라 축적으로부터 새롭게 형성된 바이러스 입자를 방지하여 바이러스 자손후대(progeny) 방출을 용이하게 한다는 것을 예측하였다. NA는 항원 변화에 당하게 되는 중요한 항원 결정기이다.
표면 단백질 HA 및 NA에 추가적으로, 인플루엔자 바이러스는 폴리머라제 유전자 PB1, PB2 및 PA, 매트릭스(matrix) 단백질 M1 및 M2, 뉴클레오단백질(NP), 및 비-구조 단백질 NS1 및 NS2(Horimoto et al., Clin Microbiol Rev. 14(1):129-149, 2001)를 포함하여, 8개의 상이한 단백질이 생기게 하는, 6개의 추가 내부(internal) 유전자를 포함한다.
후대(progeny) 바이러스입자(viron)로 포장되기 위해서, 바이러스 RNA는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 (M1) 단백질 및 핵 유출 단백질과 연관하여, 세 개의 인플루엔자 바이러스 폴리머라제(polymerase) 단백질, 뉴클레오단백질(NP), 및 바이러스 RNA로 구성된 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 핵으로부터 수송된다(Marsh et al., J Virol, 82:2295-2304, 2008). 외피 내에 있는 M1 단백질은 집합(assembly) 및 버딩(budding)에서 기능을 할 것으로 생각된다. 제한된 수의 M2 단백질의 바이러스입자로 통합된다(Zebedee, J. Virol. 62:2762-2772, 1988). 이들은 H+ 이온 채널(channel) 활성을 갖고, 엔도좀에서 낮은 PH에 의해 활성화될 때, 바이러스입자 내부를 산성화시키고, 자체의 비코팅(uncoating)을 용이하게 하는 테트라머(tetramers)를 형성한다(Pinto et al., 세포 69:517-528, 1992). 아마타딘(Amantadine)은 M2 이온 채널( channel)활성으로 간섭하여, 비코팅 바이러스를 억제하여 바이러스 감염을 방지하는 항-인플루엔자 약물이다.
NS1, 비구조 단백질은 번역(translation) 자극뿐만 아니라 세포 내 mRNA의 스플라이싱(splicing) 및 핵 유출(export)의 조절을 포함하여, 다수 기능을 가진다. 비록 NS1 유전자 결핍 바이러스가 인터페론-무결점 세포의 부모 바이러스보다 덜 효과적으로 자라지만 살아있기 때문에, NS1의 주요 기능은 숙주의 인터페론 활성에 반대인 것처럼 보인다(Garcia-Sastre, Virology 252:324-330, 1998).
NS2는 바이러스 입자에서 검출되었다(Richardson et al., Arch. Virol. 116:69-80, 1991; Yasuda et al., Virology 196:249-255, 1993). 바이러스 입자에서 NS2 단백질의 평균 수는 130-200 분자로 추정되었다. 시험관 내 결합분석은 M1 및 NS2 사이의 직접 단백질-단백질 접촉을 나타낸다. NS2-M1복합체는 바이러스-감염된 세포 용출물에서 면역침전물에 의해 검출되었다. NS2 단백질은 M1 단백질과 결합을 통하여 핵으로부터 RNP의 유출(export)에서 역할을 하는 것으로 여겨진다(Ward et al., Arch. Virol. 140:2067-2073, 1995).
V. 인플루엔자 VLPs 및 이의 투여
최적화된 HA(서열번호: 1 또는 서열번호 2의 임의 하나로써 구성된 아미노산 서열을 갖는 HA와 같은)를 포함하는 인플루엔자를 본 명세서에서 제공한다. 인플루엔자 VLPs 생성은 일반적으로 HA, NA 및 M1 단백질로 구성된다. 인플루엔자 VLPs의 생성물은 당업계에 설명되어 있고 당업계의 보통 기술의 능력 내에 있다. 예를 들면, 인플루엔자 VLPs는 HA, NA 및 M1 단백질을 암호화하는 플라스미드로 숙주세포의 형질주입(transfection)에 의해 생성될 수 있다. 단백질 발현(예를 들면, 대략 72 시간 동안)을 허가하기 위한 적당한 시간 동안 형질주입된 세포 배양 후, VLPs는 세포 배양 상층액으로부터 분리될 수 있다. 하기의 실시예 4는 세포 상층액으로부터 인플루엔자 VLPs를 정제하는 전형적 프로토콜을 제공한다. 상기 실시예에서, VLPs는 20% 글리세롤을 통해서 저속도 원심분리(세포 파편을 제거하기 위해), 진공여과 및 초고속원심분리하여 분리한다.
본 명세서에서 개시된 인플루엔자 VLPs는 인플루엔자 B 바이러스뿐만 아니라 H5N1 및 H1N1 인플루엔자 바이러스에 대한 방어적 면역반응(protective immune response)을 이끌어내도록 인플루엔자 백신으로서 사용될 수 있다.
인플루엔자 VLPs, 또는 이의 조성물은 개체로 재조합 바이러스를 도입함으로써 주로 사용되는 임의 경로에 의해 개체로 투여될 수 있다. 투여 방법은 진피내(intradermal), 근육 내, 복강내(intraperitoneal), 비경구, 정맥내 투여, 피하, 질내(vaginal), 직장(rectal), 비강내, 흡입(inhalation) 또는 경구(oral)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 피하, 정맥 내 투여 또는 근육 내 투여와 같은 비경구 투여는, 일반적으로 주사에 의해 얻어진다. 주사가능 물질(injectable)은 액체 수용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체에서 용액 또는 현탁액을 위한 적절 고체 형태, 또는 에멀젼으로서, 관습적 형태로 제조될 수 있다. 주사용액 및 현탁액은 기존에 설명된 종류의 멸균 분말, 그래뉼(granules), 및 정제로부터 제조될 수 있다. 투여는 시스테믹(systemic) 또는 국소(local)일 수 있다.
인플루엔자 VLPs, 또는 이의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 같은 임의 적절한 방식으로 투여된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의한 것뿐만 아니라, 투여되는 특정 조성물에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 개시의 약학적 조성물의 넓은 다양한 적절한 제제이다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수용성 또는 비-수용성 수용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비-수용성 용매의 실시예는 프로필렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물기름, 및 에틸올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사가능한 유기 에스테르(organic esters)이다. 수용성 담체는 식염수 및 버퍼배지를 포함하여, 물, 알코올/수용성 수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 소듐클로라이드 용액, 링거(Ringer's) 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 소듐클로라이드, 락테이트를 가한 링거, 또는 고정유(fixed oils)를 포함한다. 정맥내 투여 비히클은 유동체(fluid) 및 영양보충물(nutrient replenishers), 전해질 보충물(electrolyte replenishers) (링거 덱스트로오스에 기반한 것과 같은), 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제는 예를 들면, 항균제, 항-산화제, 킬레이트 시약, 및 불활성 기체 등과 같이 존재될 수 있다.
조성물의 일부는 약학적으로 허용가능한 산- 또는 염기-첨가 염으로서 잠재적으로 투여되고, 염산(hydrochloric acid), 브롬화수소산(hydrobromic acid), 과염소산(perchloric acid), 질산(nitric acid), 티오시안산(thiocyanic acid), 황산(sulfuric acid), 및 인산(phosphoric acid)과 같은 무기산(inorganic acid), 및 포름산(formic acid), 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid), 글리콜산(glycolic acid), 락트산(lactic acid), 피부르산(pyruvic acid), 옥살산(oxalic acid), 말론산(malonic acid), 숙신산(succinic acid), 말레산(maleic acid), 및 푸마르산(fumaric acid)와 같은 유기산(organic acid)으로 반응하여, 또는 소듐하이드록사이드(sodium hydroxide), 암모늄하이드록사이드(ammonium hydroxide), 포타슘하이드록사이드(potassium hydroxide)와 같은 무기염(inorganic base), 및 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴아민(aryl amines)와 같은 유기염기(organic bases) 및 치환된 에탄올아민(substituted ethanolamines)로 반응하여 형성될 수 있다.
투여는 단일 또는 다수 용량에 의해 성취될 수 있다. 본 개시의 문맥에서 개체에게 투여되는 용량은 오랜시간 동안 개체에게 유익한 치료 반응을 유도하기 위해서, 또는 H5N1 또는 H1N1 인플루엔자 바이러스 감염을 억제 또는 예방하기 위해서 충분해야만 한다. 요구되는 용량은 개체의 종, 연령, 체중 및 일반 조건, 치료된 감염 정도, 사용된 특정 조성물 및 투여의 자체 모드에 따라 개체에서 개체로 다양할 것이다. 적당한 용량은 단지 일상적 실험을 사용하여 실험을 사용하여 당업계의 평범한 기술의 하나에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 VLPs 단독 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 조합하여 치료적으로 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 버퍼된 식염수, 덱스트로오스(dextrose), 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 조합을 포함하나, 제한하지 않는다. 담체 및 조성물은 멸균될 수 있고 제제(formulation)는 투여 모드에 적합하다. 상기 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 지연된 방출 제제(sustained release formulation), 또는 분말일 수 있다. 상기 조성물은 트리글리세리드(triglycerides)와 같은 전통적 바인더(binders) 및 담체로, 좌약으로서 제제될 수 있다. 경구제제는 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 녹말, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 소듐사카린(sodium saccharine), 셀룰로오스, 및 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate)와 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 멸균 식염수 또는 참기름과 같은 임의 공통 약학적 담체가 사용될 수 있다. 배지는 예를 들면, 삼투압, 버퍼, 보존제 등을 맞추기 위하여 약학적으로 허용가능한 염과 같은 관습적 약학적 부속물질을 또한 포함할 수 있다. 본 개시에서 제공된 조성물 및 방법으로 사용될 수 있는 다른 배지는 보통 식염수 및 참기름이다.
본 명세서에서 설명된 인플루엔자 VLPs는 항원성을 증가시키기 위해 단독 또는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 인플루엔자 VLPs는 프륜드 불완전(Freund incomplete) 보조제 또는 프륜드 완전 보조제와 같은, 보조제로서 투여될 수 있다.
선택적으로, IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α 또는 IFN-γ, GM-CSF 또는 G-CSF와 같은 하나 또는 그 이상의 성장인자; OX-40L 또는 41 BBL와 같은 하나 또는 그 이상의 분자, 또는 상기 분자의 조합은 생물학적 보조제로서 사용될 수 있다(예를 들면, Salgaller et al ., 1998, J. Surg . Oncol . 68(2):122-38; Lotze et al ., 2000, Cancer J. Sci . Am . 6(Suppl 1):S61-6; Cao et al ., 1998, Stem cells 16(Suppl 1):251-60; Kuiper et al ., 2000, Adv . Exp . Med . Biol . 를 참조). 상가 분자는 숙주에 시스템적으로(또는 국소적으로) 투여될 수 있다.
세포 내 반응, 시험관 내 및 생체 내 모두를 유도하기 위한 많은 수단이 알려져 있다. 지질(lipids)은 다양한 항원에 대한 생체 내 기본적인 CTL에서 보조할 수 있는 제제로서 식별될 수 있다. 예를 들면, 미국특허번호 5,662,907에서 설명된 바와 같이, 팔미트산(palmitic acid) 잔기는 리신(lysine) 잔기의 알파 및 엡실론(epsilon) 아미노기(amino groups)에 부착된 후 면역원(immunogenic) 펩타이드에 (예를 들면, 글라이신(glycine), 글라이신-글라이신, 세린(serine), 세린-세린, 또는 등과 같은, 잔기와 결합한 하나 또는 그 이상을 경유하여) 결합될 수 있다. 지질화된(lipidated) 펩타이드는 리포좀에서 혼합된, 또는 보조제에서 유화된, 미셀(micellar) 형태로 직접적으로 주사될 수 있다. 다른 실시예와 같이, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인릴세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)과 같은 E. coli 리포단백질(lipoprotein)은 적절한 펩타이드에 공유결합으로 부착될 때 기본 종양 특정 CTL에 사용될 수 있다(Deres et al., Nature 342:561, 1989 참조하시오). 추가적으로, 중성화 항체의 유도가 적절한 항원결정기(epitope)를 전시하는 펩타이드에 결합된 동일한 분자로 또한 주요하게 될 수 있기 때문에, 두 개의 조성물은 바람직하게 간주되는 체액(humoral) 및 세포-매개된 반응 모두를 이끌어내도록 혼합될 수 있다.
비록 최적화된 HA 단백질을 포함하는 VLPs의 투여가 본 명세서에서 실시예가 되었지만, 당업계의 기술의 하나는 최적화된 인플루엔자 HA 단백질 자체(바이러스 입자 부재에서) 또는 개체에서 면역반응을 이끌어내는 융합 단백질로서 투여하는것이 또한 가능하다는 것을 이해할 수 있다. 일부 실시형태에서, HA 단백질의 단편은 HA1 또는 HA2 하위-단편(sub-fragment)과 같이 투여될 수 있다.
하기의 실시예는 확실한 특정한 특징 및/또는 실시형태를 설명하는 것을 제공한다. 상기 실시예는 본 개시를 특정 특징 또는 설명된 실시형태에 제한하는 것으로 해석하여서는 안된다.
실시예
실시예 1: H5N1 인플루엔자 COBRA 서열의 생성
상기 실시예는 분기군(clade) 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 및 7로부터 426 인간 H5N1 인플루엔자 HA 서열을 사용하여 H5N1 인플루엔자 HA COBRA 컨센서스 서열 생성을 설명한다. 얻어진 COBRA 서열은 "PATH H5N1 COBRA"라고 언급되었다.
최종 H5N1 인플루엔자 HA COBRA 서열을 생성하기 위하여, 컨센서스 서열의 세 개의 층이 생성되었다(도 1). 첫째 층에서, 6개 각각의 컨센서스 서열은 (1) 5 분기군 0 분리체; (2) 86 분기군 1 분리체; (3) 106 분기군 2.1 분리체; (4) 97 분기군 2.2 분리체; (5) 34 분기군 2.3 분리체; 및 (6) 1 분기군 7 분리체를 사용하여 생성된다. 2번째 층에서, 분기군(clade) 2 컨센서스 서열은 첫번째 층(분기군 2.1, 분기군 2.2 및 분기군 2.3 컨센서스 서열)에서 생성되었다.
최종 컨센서스 서열은 첫 번째 층에서 생성된 각각의 분기군 0, 분기군 1 및 분기군 7 컨센서스 서열 및 두 번째 층에서 생성된 분기군 2 컨센서스 서열을 사용하여 생성되었다. PATH H5N1 COBRA 서열은 하기에서 나타냈고 서열번호: 1로서 본 명세서에서 기재되어 있다.
PATH H5N1 COBRA HA (서열번호: 1)
Figure pct00001

실시예 2: H1N1 인플루엔자 COBRA 서열의 생성
상기 실시예는 205 개의 인간 및 돼지 H1N1 인플루엔자 HA 서열을 사용하여 H1N1 인플루엔자 HA COBRA 컨센서스 서열의 생성을 설명한다. 얻어진 COBRA 서열은 "PATH H1N1 COBRA"라고 언급된다.
최종 H1N1 인플루엔자 HA COBRA 서열을 생성하기 위하여, 컨센서스 서열의 2 개의 층이 생성된다(도 2). 첫 번째 층에서, 5개의 각각의 컨센서스 서열은 (1) 1933-1934로부터 분리된 8개의 인간 균주; (2) 1935-1947로부터 분리된 13개의 인간 균주; (3) 1948-1957로부터 분리된 12개의 인간 균주; (4) 2009-2011로부터 분리된 123개의 인간 균주; 및 (5) 49개의 돼지 균주. 최종 컨센서스 서열은 첫 번째 층에서 생성된 5 개의 각각의 컨센서스 서열을 사용하여 생성되었다. PATH H1N1 COBRA 서열은 하기에 나타냈고 서열번호: 2로서 본 명세서에서 기재되어 있다.
PATH H1N1 COBRA HA (서열번호: 2)
Figure pct00002

실시예 3: 코돈-최적화된 COBRA 유전자 서열
본 명세서에서 개시된 COBRA 아미노산 서열은 코돈 사용 및 RNA 최적화 (GeneArt; Regensburg, Germany)를 포함하여, 포유동물 세포에서 발현을 위하여 역 변화되고 최적화될 수 있다(GeneArt; Regensburg, Germany). 상기 최적화된 핵산 서열은 pTR600 발현 벡터와 같은, 적절한 발현 벡터로 삽입될 수 있다(U.S. Patent Application Publication No. 2002/0106798; Ross et al ., Nat Immunol . 1(2):102-103, 2000; Green et al ., vaccine 20:242-248, 2001). 코돈-최적화된 COBRA 유전자 서열을 암호화하는 발현 벡터는, 예를 들면, COBRA HA를 포함하는 VLPs를 생성하기 위하여, 사용될 수 있다.
실시예 4: 인플루엔자 VLPs 의 제조 및 면역
하기의 방법은 COBRA HA를 포함하는 인플루엔자 VLPs를 생성하고 특징화하는데 사용할 수 있다. 마우스, 흰족제비 및 마카크(macaques)의 면역을 위한 실시예 방법을 또한 하기에 설명한다(Giles 및 Ross, 백신 29(16):3043-3054, 2011를 참조하시오).
백신 제조
293T 세포는 M1, NA 및 최적화된 HA를 포함하는 플라스미드를 갖는 일시적으로 형질감염되엇고, 37oC에서 72 시간 동안 배양하였다. 서열을 코딩하는 M1, NA 및 HA는 포유동물 세포에서 발현을 위하여 코돈-최적화될 수 있다. 상층액을 수득하고 세포파편은 저속도 원심분리하여 제거되고 0.22 mm 멸균 필터를 통하여 진공 여과하였다. VLPs는 4 시간 동안 4oC에서 초고속원심분리를 경유하여 정제되었다(20% 글리세롤을 통하여 100,000 x g , 부피당 체중). 펠렛은 PBS pH 7.2에서 나중에 현탁되었고 사용될 때까지 -80oC에서 단일사용 엘리쿼트(aliquots)로 저정되었다. 총 단백질 농도는 마이크로 BCATM 단백질 분석시약키트로 결정하였다(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA).
용량 결정( Dose determination )
HA 특정 함량을 웨스턴 블랏 및 농도계측(densitometry)으로 결정될 수 있다. 정제된 재조합 COBRA HA 및 정제된 VLPs를 표준 총 단백질 양으로 제조하고 10% SDS-PAGE 젤 상에서 전기이동시키고 PVDF 멤브린으로 트랜스퍼하였다. 블랏을 인플루엔자가 감염된 마우스로부터의 마우스 다클론 항혈청(polyclonal antisera)으로 프로브(probed)하고 HA-항체 복합체를 호스래디쉬퍼옥시다제(horseradish peroxidase) (HRP) (Southern Biotech; Birmingham, AL, USA)에 결합된 염소(goat) 항-마우스 IgG를 사용하여 검출하였다. HRP는 화학발광 기질(Pierce Biotechnology; Rockford IL, USA)에 의해 검출되고 X-레이 필름(ThermoFisher; Pittsburgh, PA, USA)에 노출되었다. 밴드의 농도를 이미지J 수프트웨어(ImageJ software (NIH))를 사용하여 결정하였다. 재조합 HA 밴드의 농도는 표준 곡선 계산하는데 사용하였고 정제된 VLPs의 농도는 재조합 HA로부터의 결과를 사용하여 보충되었다.
마우스 연구
BALB/c 마우스(Mus musculis, 암컷, 6-8 주령)은 할란 스프라그 다우리(Harlan Sprague Dawley)(Indianapolis, IN, USA)로부터 구입할 수 있다. 마우스는 마이크로고립체 유닛(microisolator units)에서 수용하고 음식 및 물에 자유롭게 접근하게 하고 실험 동물을 위한 USDA 설명지침(guidelines)하에서 보호되었다. 마우스는 0주에서 근육 내 주사를 경유하여, 농도계측분석(densitometry assay)으로부터 HA 함량에 기반하여, 정제된 COBRA HA VLPs(1.5 ㎍, 0.3 ㎍ 또는 0.06 ㎍)의 3개 용량 중의 하나(one of three)로 백신접종을 하였고(vaccinated) 3 주에 동일한 용량으로 부양되었다(boosted). 각각의 용량에서 백신은 알룸 보조제(Imject Alum, Pierce Biotechnology; Rockford, IL, USA), CpG 올리고뉴클레오티드, 또는 비히클 단독으로 제제화되었다. 각각의 백신접종 후 14일 내지 21일에, 혈액은 레트로-오비탈-플렉석스(retro--orbital plexus)를 경유하여 마취시킨 마우스로부터 수득되었고 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)로 트랜스퍼 하였다. 튜브를 원심분리하고 혈청(sera)을 제거하고 -80 ± 5℃에서 냉동시켰다. 각각의 백신 군을 위한 헤마글루티네이션 억제(HAI) 혈청 항체 타이터(titer)는 대표 재조합체(reassortant) 바이러스 또는 COBRA HA VLPs를 사용하여 5 주에 결정되었다.
최종 백신 후 3 주째에, 마우스는 50 ㎕ 부피의 병원성 H5N1 또는 H1N1 인플루엔자 바이러스를 갖는 비강내로 투여되었다. 감염 후에 14일 동안에, 마우스는 체중 감량, 질환 징후, 및 사망에 대해 매일 모니터되었다. 각각의 체중, 질병 점수(scores)(Toapanta 및 Ross, Respiratory Research 10(1):112, 2009) 및 사망을 접종 후에 매일 각 군에 대해 기록되었다.
족제비 연구( Ferret studies )
피치 족제비(Fitch ferrets) (Mustela putorius furo, 암컷, 6-12-달령(months of age)), 인플루엔자 네이브(naive) 및 향기를 없애는 것(de-scented)은 마쉘 농장(Marshall Farms (Sayre, PA, USA)으로부터 구입될 수 있다. 족제비는 사니-칩-실험 동물베딩(Sani-chips Laboratory Animal Bedding (P.J. Murphy Forest Products, Montville, NJ, USA)를 포함하는 스테인리스 스틸 케이지(Shor-line, Kansas City, KS, USA)에서 쌍(pairs)으로 수용되었다. 족제비는 테크랄드 글로벌 족제비 식이(Teklad Global Ferret Diet) (Harlan Teklad, Madison, WI, USA) 및 신선한 물 ad libitum로 제공되었다. 최종 농도를 얻기 위해서 COBRA HA VLPs를 PBS, pH 7.2에서 희석하였다. 족제비는 0주에서 0.25 ㎖ 부피로 대퇴사두근(quadriceps muscle)에서 근육 내 주사를 경유하여, 농도계측분석에 의해 결정된 바와 같이 HA 함량에 기반하여, 정제된 COBRA VLPs(15 ㎍, 3 ㎍의 두 개의 용량 중 하나로 백신접종 되었고 3주에 동일한 용량으로 부양되었다(boosted). 백신을 사용하기 전에 -80℃에 저장하였고 사용하기 전에 즉시 알룸(alum)보조제(Imject Alum; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)로 제제화하였다. 동물은 예방접종 요법 동안에 매주마다 체중 감량, 온도, 활동에서 감소, 비루(nasal discharge), 재채기(sneezing) 및 설사(diarrhea)를 포함하는 부작용(adverse events)에 대해서 모니터하였다. 백신 전에, 동물은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스를 순환하기 위하여 혈청반응음성(seronegative)이 되도록 HAI 분석으로 확인되었다. 각각 백신 후에 14일 내지 21일째에, 혈액을 하대정맥혈전(anterior vena cava)을 경유하여 마취된 족제비로부터 수득하였고 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)로 트랜스퍼하였다. 튜브를 원심분리하엿고 혈청을 -80 ± 5℃에서 냉동시켰다. 각각 백신 군에 대한 HAI 혈청 항체 타이터(titer)를 대표 재조합체(reassortant) 바이러스 또는 COBRA HA VLPs를 사용하여 5 주째에 결정하였다.
최종 백신 후 3 주째에, 족제비는 1 ㎖ 부피의 병원성 H5N1 또는 H1N1인플루엔자 바이러스로 비강내로 도전되었다. 감염 후에 14일 동안에, 마우스는 체중 감량, 질환 징후, 및 사망에 대해 매일 모니터되었다. 접종 후에 각각의 체중, 질병 점수(scores) 및 사망을 매일 각 군에 대해 기록되었다. 콧물 세척은 접종 후 7일 동안 매일 마취된 족제비의 콧구멍(nares)으로 3 ㎖의 PBS를 불어넣어 수행되었다. 세척물은 수득되고 사용하기 전까지 -80℃에 저장하였다.
기본 면역법( Primate immunizations )
게잡이 원숭이(Cynomolgus macaques) (Macaca fascicularis , 수컷, 3-5 연령)는 할란 스프라그 다우리(Harlan Sprague Dawley) (Indianapolis, IN, USA)으로부터 구입될 수 있다. 원숭이(Macaques)는 0주에서 근육 내 주사를 경유하여, 농도계측분석으로부터 HA 함량에 기반하여, 정제된 COBRA HA VLPs(15 ㎍)으로 백신접종 되었고 3 및 6주째에 동일한 용량으로 부양되었다(boosted). 백신은 사용하기 전에 즉시 알룸 보조제 (Imject Alum, Pierce Biotechnology; Rockford, IL, USA)로 제제화되었다. 각각 백신 후 21일째에, 혈액을 대퇴정맥(femoral vein)을 경유하여 마취된 원숭이로부터 수득하였고 혈청 분리 튜브(serum separator tube)로 트랜스퍼하였다. 튜브는 응고를 활성화하게 하고 원심분리하고 혈청은 제거되고 -80 ± 5℃에서 냉동되었다. 말단 IgG 타이터 및 각각의 백신 군에 대한 HAI 혈청 항체 타이터(titers)는 대표적 재조합 바이러스 또는 COBRA HA VLPs를 사용하여 5 주째에 결정되었다.
최종 백신 후 3주째에, 원숭이는 1 ㎖ 부피로 병원성 H5N1 또는 H1N1 인플루엔자 바이러스로 비강내(intranasal), 기관내마취(intratracheal), 및 안와 접종(orbital inoculation)에 의해 도전되었다. 감염 후 5일 동안, 원숭이는 체중 감량, 질환 징후 및 사망에 대해 매일 모니터되었다. 각각의 체중, 질병 점수(scores) 및 사망을 당일에 각 군에 대해 기록하였다.
실시예 5: PATH H5N1 COBRA HA -포함하는 VLPs 의 면역원성( immunogenecity ) 및 방어 효능
PATH H5N1 COBRA VLPs의 면역원성(immunogenecity) 및 방어 효능을 테스트하기 위하여 마우스에서 4 가지 연구를 설명한다.
COBRA 연구 1
본 연구는 분기군 1 및 분기군 2 투여에 대한 PATH H5N1 COBRA VLPs의 면역원성 및 방어 효능을 테스트하기 위하여 수행되었다. 인간 분기군 2 COBRA HA (인간 COBRA-2 VLPs)을 포함하는 VLPs는 비교를 하기 위하여 사용되었다.
마우스는 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1), 인간 COBRA-2 HA 서열을 포함하는 VLPs, 또는 큰 고니(Whooper Swan) (A/큰 고니(Whooper Swan)/몽골리아(Mongolia)/244/2005)인플루엔자 바이러스 HA를 포함하는 VLPs를 근육내에서 백신하였다. 백신접종은 보조제(ImjectTM)와 같이 0 주째 및 3 주째에 수행되었다. 마우스는 5 주 동안 5000 PFU의 인도네시아 분기군 2.1 바이러스 (A/인도네시아/5/2005) 또는 5000 PFU의 베트남 분기군 1 바이러스 (A/베트남/1203/2004)로 투여되었다. 혈액 시료는 0 주, 3 주 및 5 주에서 수득되었다. 폐는 바이러스 적정농도에 따라 투여 후에 3일(D3)에 수득되었다.
백신화된 마우스에서 PATH H5N1 COBRA VLPs (positive control), 베트남 분기군 1 바이러스, 인도네시아 분기군 2.1 바이러스, 큰 고니 분기군 2.2 바이러스, 이집트/3300/08 분기군 2.2.1, 이집트/321/07 분기군 2.2.1, 안후이(Anhui)분기군 2.3 바이러스 및 닭(Chicken)/베트남 분기군 7 바이러스에 대한 HAI 적정농도를 도 3에 나타냈다. 상기 결과는 PATH H5N1 COBRA HA-포함하는 VLPs를 갖는 백신접종이 분기군 1 및 분기군 2 인플루엔자 바이러스 모두를 식별할 수 있는 항체 반응을 유발한다는 것을 나타낸다.
인도네시아 분기군 2.1 및 베트남 분기군 1을 갖는 투여 후 14일(D14)까지 백신화되고 네이브(naive) 마우스의 체중을 각각 도 4 및 도 5에 나타냈다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 모든 백신화된 마우스의 체중은 시간에 따라 거의 변하지 않은 반면, 네이브 마우스는 분기군 2.1 바이러스와 같이 투여 후 5일(D5) 후에 예리하게 감소하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, PATH H5N1 VLPs로 백신화된 마우스의 체중은 분기군 1 바이러스로 투여 후에 현저히 변하지 않았다. 반대로, 네이브(naive) 마우스는 도전 후 D3에 시작하여 빠른 체중 감소를 나타냈다.
COBRA 연구 2A
본 연구는 PATH H5N1 COBRA VLPs를 포함하는 VLPs를 갖는 마우스의 단일 백신접종 다음에 분기군 1 투여에 대한 방어 효능 테스트를 수행하였다.
마우스는 PATH H5N1 COBRA HA 서열 (서열번호: 1)를 포함하는 3 ㎍ of VLPs, 인간 COBRA-2 HA 서열을 포함하는 VLPs, 또는 큰 고니(Whooper Swan) (A/큰 고니(Whooper Swan)/몽골리아(Mongolia)/244/2005) 인플루엔자 바이러스 HA를 포함하는 VLPs를 근육 내로 백신하였다. 백신접종은 보조제 (ImjectTM)와 같이 0 주에 수행되었다. 4 주 동안에 5000 PFU의 인도네시아 분기군 2.1 바이러스 (A/인도네시아/5/2005) 또는 5000 PFU의 베트남 분기군 1 바이러스 (A/베트남/1203/2004)으로 투여되었다. 혈액시료는 0 주 및 3 주에 수득되었다. 폐는 바이러스 적정농도에 대하여 도전 후에 D2 및 D3에 수득되었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 백신된 마우스의 체중은 베트남 분기군 1 바이러스으로 투여에 따라 변하지 않은 반면, 네이브(naive) 마우스는 D3 후에 체중에서 현저한 손실을 나타냈다.
COBRA 연구 4A
본 연구는 보조제의 부재하에서 단일 백신접종 다음에 분기군 1 바이러스에 대한 방어 효능을 테스트하기 위해 수행되었다. 마우스는 보조제 없이 3 ㎍의 PATH H5N1 COBRA VLPs, 인간 COBRA-2 VLPs, 또는 큰 고니(Whooper Swan) VLPs로 근육 내로 백신화되었다. 마우스는 4 주 동안 5000 PFU의 베트남 분기군 1 바이러스로 투여되었다. 혈액 시료는 0 주 및 3 주에서 수득되었다. 폐는 바이러스 적정농도(titers)를 위한 도전 후에 D2 및 D3에서 수득되었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 네이브(naive) 마우스는 7일까지 감염으로 쓰러졌으나, 백신화된 마우스의 40-60%는 14일에 투여되어 생존되었다. 특정적으로, 인간 COBRA-2 VLPs으로 백신화된 마우스의 60%는 감염에 생존된 반면 PATH H5N1 COBRA VLPs 또는 큰 고니(Whooper Swan) VLPs로 백신화된 마우스의 40%는 감염에 생존되었다.
COBRA 연구 5A
본 연구는 저 복용량의 VLP (0.6 ㎍)에서 보조제 (ImjectTM)로 단일 백신접종 다음으로 분기군 1 바이러스에 대한 방어 효능을 테스트하기 위하여 수행되었다. 보조제의 존재에서 마우스는 PATH H5N1 COBRA VLPs, 인간 COBRA-2 VLPs, 또는 큰 고니(Whooper Swan) VLPs의 0.6 ㎍으로 근육 내로 백신화되었다. 마우스는 4 주 동안 베트남 분기군 1 바이러스의 5000 PFU으로 감염되었다. 혈액시료는 0 주 및 3 주에서 수득되었다. 폐는 바이러스 적정농도에 대하여 감염 후에 D2 및 D3에서 수득되었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 백신화된 마우스의 체중은 약하게 떨어졌고 다음에 바이러스 감염 후에 D10까지 정상 수준으로 회복되었다. 반대로, 네이브 마우스의 체중은 현저하게 떨어졌고 마우스는 회복되지 않았다.
개시된 발명의 원칙이 적용될 수 있는 많은 가능한 실시형태의 관점에서, 설명된 실시형태는 단지 본 발명의 바람직한 실시예이고 본 발명의 제한적 범위로서 간주되어서는 안된다. 다소, 본 발명의 범위는 하기 청구항에 의해 정의된다. 그러므로 우리는 본 청구항의 범위 및 정신 내에 있는 우리의 모든 발명으로서 청구한다.
<110> UNIVERSITY OF PITTSBURGH - OF THE COMMONWEALTH SYSTEM OF HIGHER EDUCATION Ross, Ted M. Crevar, Corey J. Carter, Donald M. <120> COMPUTATIONALLY OPTIMIZED BROADLY REACTIVE ANTIGENS FOR H5N1 AND H1N1 INFLUENZA VIRUSES <130> 8123-88529-02 <150> US 61/617,815 <151> 2012-03-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 568 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 2 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Met Lys Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Leu Ser Ala Arg Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asn 130 135 140 Thr Thr Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Ala Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Ser Thr Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser Asn Tyr Asn 210 215 220 Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Glu Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln 225 230 235 240 Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser 275 280 285 Met His Glu Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Arg Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565

Claims (20)

  1. 서열번호: 1의 잔기 2-568 또는 서열번호: 2의 잔기 2-566의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 인플루엔자 적혈구응집소(hemagglutinin) (HA) 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호: 1의 잔기 2-568 또는 서열번호: 2의 잔기 2-566의 아미노산 서열을 구성하는, 인플루엔자 HA 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는, 인플루엔자 HA 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 구성하는, 인플루엔자 HA 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 포유동물 세포에서 발현을 위한 코돈-최적화된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  7. 제5항 또는 제6항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 작용가능하게 연결된 프로모터를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제7항 또는 제8항의 벡터를 포함하는 분리된 세포.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 바이러스-같은 입자 (VLP).
  11. 제10항에 있어서, 인플루엔자 뉴라미니다제(neuraminidase) (NA) 단백질, an 인플루엔자 매트릭스(matrix) (M1) 단백질, 모두를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 VLP.
  12. HA, M1 및 NA 단백질의 발현을 허가하는 충분한 조건하에서 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터, 인플루엔자 NA 단백질을 암호화하는 벡터 및 인플루엔자 M1 단백질을 암호화하는 벡터를 숙주 세포에 형질감염시켜 생성되는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 VLP.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 VLP 또는 제13항의 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 VLP, 제13항의 융합 단백질 또는 제14항의 조성물 투여를 포함하는, 개체의 인플루엔자 바이러스에 면역반응을 유도하는 방법.
  16. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 VLP 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대한 개체를 면역하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물은 보조제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 조성물은 근육 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 1 내지 약 25 ㎍의 VLP를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 약 15 ㎍의 VLP를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020147027594A 2012-03-30 2013-03-12 H5n1 및 h1n1 인플루엔자 바이러스를 위한 계산적으로 최적화된 넓게 반응하는 항원 KR20150004800A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261617815P 2012-03-30 2012-03-30
US61/617,815 2012-03-30
PCT/US2013/030530 WO2013148164A1 (en) 2012-03-30 2013-03-12 Computationally optimized broadly reactive antigens for h5n1 and h1n1 influenza viruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150004800A true KR20150004800A (ko) 2015-01-13

Family

ID=49261015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147027594A KR20150004800A (ko) 2012-03-30 2013-03-12 H5n1 및 h1n1 인플루엔자 바이러스를 위한 계산적으로 최적화된 넓게 반응하는 항원

Country Status (15)

Country Link
US (2) US9212207B2 (ko)
EP (1) EP2831094B1 (ko)
JP (1) JP2015513902A (ko)
KR (1) KR20150004800A (ko)
CN (1) CN104395336B (ko)
AU (1) AU2013240365B2 (ko)
BR (1) BR112014023900A2 (ko)
CA (1) CA2868330A1 (ko)
HK (1) HK1203522A1 (ko)
IN (1) IN2014DN07399A (ko)
MX (1) MX345150B (ko)
MY (1) MY166953A (ko)
RU (2) RU2639551C2 (ko)
SG (1) SG11201406153XA (ko)
WO (1) WO2013148164A1 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011302360B2 (en) * 2010-09-14 2015-01-29 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for influenza
JP6113155B2 (ja) 2011-06-20 2017-04-12 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 計算で最適化した広い反応性を示すｈ１ｎ１インフルエンザの抗原
SG11201503989PA (en) * 2012-11-27 2015-06-29 Univ Pittsburgh Computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza
US20140286981A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine
CN107847579A (zh) * 2014-12-19 2018-03-27 俄勒冈健康与科学大学 人和禽h5n1流感的计算优化的广泛反应性抗原的协同共同给药
EP3233116A4 (en) * 2014-12-19 2018-05-30 Oregon Health & Science University Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza
WO2016196846A2 (en) * 2015-06-02 2016-12-08 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
WO2016201127A1 (en) * 2015-06-09 2016-12-15 Sanofi Pasteur, Inc. Methods of optimizing nucleotide sequences encoding engineered influenza proteins
WO2017053413A1 (en) * 2015-09-21 2017-03-30 Oregon Health & Science University Vaccines intelligently produced by epitope recombination (viper) for influenza
WO2017210599A1 (en) * 2016-06-02 2017-12-07 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
AU2017275663B2 (en) 2016-06-03 2021-12-09 Sanofi Pasteur Inc. Modification of engineered influenza hemagglutinin polypeptides
US11576964B2 (en) 2018-03-28 2023-02-14 Sanofi Pasteur Inc. Methods of generating broadly protective vaccine compositions comprising hemagglutinin
JP7329530B2 (ja) * 2018-03-28 2023-08-18 サノフィ パスツール インコーポレイテッド ノイラミニダーゼを含む広範に防御的なワクチン組成物を生成する方法
JP2021519596A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 サノフイＳａｎｏｆｉ フェリチンタンパク質
EP3773703A1 (en) 2018-04-03 2021-02-17 Sanofi Antigenic influenza-ferritin polypeptides
EP3876983A4 (en) * 2018-11-06 2022-08-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH IMMUNOGENIC COMPOSITION AGAINST THE H5 SUBTYPE OF THE AVIAN INFLUENZA VIRUS

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL153290A0 (en) 2000-06-23 2003-07-06 American Cyanamid Co Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps)
US20050181459A1 (en) 2002-06-11 2005-08-18 Matthew Baker Method for mapping and eliminating T cell epitopes
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
WO2006104615A2 (en) 2005-02-24 2006-10-05 University Of Massachusetts Influenza nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
KR20080028941A (ko) 2005-07-19 2008-04-02 다우 글로벌 테크놀로지스 인크. 재조합 인플루엔자 백신
WO2007072214A2 (en) 2005-12-19 2007-06-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Methods of clustering gene and protein sequences
US20080045472A1 (en) 2006-03-31 2008-02-21 Council Of Scientific And Industrial Research Bharat Biotech Targets for human micro rnas in avian influenza virus (h5n1) genome
EA017203B1 (ru) 2006-09-07 2012-10-30 Круселл Холланд Б.В. Связывающие молекулы человека, способные нейтрализовать вирус гриппа h5n1, и их применение
US8030029B2 (en) * 2007-01-23 2011-10-04 Academia Sinica Flu vaccines and methods of use thereof
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
JP5705545B2 (ja) 2007-11-12 2015-04-22 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア インフルエンザウイルスの複数のサブタイプに対する新規ワクチン
KR101956910B1 (ko) 2008-01-21 2019-03-12 메디카고 인코포레이티드 헤마글루티닌을 발현하는 트랜스제닉 식물에서 생산된 재조합 인플루엔자 바이러스-유사 입자(ＶＬＰｓ)
US7981428B2 (en) * 2008-01-23 2011-07-19 Academia Sinica Flu vaccines and methods of use thereof
WO2010036970A2 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza vaccines, antigens, compositions, and methods
WO2010036948A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Dna prime/inactivated vaccine boost immunization to influenza virus
DK2998315T4 (da) 2009-04-03 2022-02-07 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Newcastle sygdomsvirus-bårne fuglevacciner
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
AU2011302360B2 (en) * 2010-09-14 2015-01-29 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for influenza
JP6113155B2 (ja) 2011-06-20 2017-04-12 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 計算で最適化した広い反応性を示すｈ１ｎ１インフルエンザの抗原
JP6336915B2 (ja) 2012-02-07 2018-06-06 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 計算で最適化した広い反応性を示すｈ３ｎ２、ｈ２ｎ２、およびｂ型インフルエンザウイルスの抗原
JP6175452B2 (ja) 2012-02-13 2017-08-02 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション ヒトおよびトリｈ５ｎ１インフルエンザのための、計算で最適化した反応性の広い抗原
SG11201503989PA (en) 2012-11-27 2015-06-29 Univ Pittsburgh Computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017141447A (ru) 2019-02-13
EP2831094A1 (en) 2015-02-04
MX345150B (es) 2017-01-18
RU2014142785A (ru) 2016-05-20
US20160279226A1 (en) 2016-09-29
EP2831094B1 (en) 2018-06-13
RU2639551C2 (ru) 2017-12-21
MX2014011387A (es) 2014-10-14
CN104395336A (zh) 2015-03-04
AU2013240365A1 (en) 2014-10-23
HK1203522A1 (en) 2015-10-30
US9212207B2 (en) 2015-12-15
JP2015513902A (ja) 2015-05-18
US20150017196A1 (en) 2015-01-15
MY166953A (en) 2018-07-25
CA2868330A1 (en) 2013-10-03
BR112014023900A2 (pt) 2020-11-24
US9555095B2 (en) 2017-01-31
AU2013240365B2 (en) 2017-03-30
EP2831094A4 (en) 2015-10-14
IN2014DN07399A (ko) 2015-04-24
CN104395336B (zh) 2018-01-23
SG11201406153XA (en) 2014-10-30
WO2013148164A1 (en) 2013-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10562940B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
US10865228B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for human and avian H5N1 influenza
US9555095B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for H5N1 and H1N1 influenza viruses
US9234008B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for H3N2, H2N2, and B influenza viruses

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
WITB Written withdrawal of application