KR20150002781A

KR20150002781A - 경색 치료용 의약 조성물

Info

Publication number: KR20150002781A
Application number: KR20147031372A
Authority: KR
Inventors: 신야 미나토구치; 유키히로 아카오
Original assignee: 고꾸리츠 다이가꾸호오징 기후다이가꾸; 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2015-01-07
Also published as: IN2014DN09092A; JPWO2013154192A1; US20150064237A1; EP2837389A1; CA2870248A1; CN104470543A; WO2013154192A1

Abstract

종래의 혈전 용해제에 의한 치료 방법이나 풍선 요법과는 다른 방법으로, 심근 경색이나 뇌경색 등의 경색을 치료하기 위한 의약 조성물을 제공한다. hsa-miR-145 등의 오토파지 인핸서를 경색 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용한다. 특히 hsa-miR-145 등의 오토파지 인핸서를 리포좀화한 상태로 경색 치료용 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용한다.

Description

경색 치료용 의약 조성물{MEDICINAL COMPOSITION FOR TREATING INFARCTION}

본 발명은, 경색 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 오토파지를 항진하는 작용을 갖는 「오토파지 인핸서(autophagy enhancer)」의 경색 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

심근 경색은, 허혈성 심질환의 하나이고, 심장의 관동맥 혈유량이 감소하여, 심근이 허혈 상태가 되어 괴사해 버린 상태를 말한다. 관동맥의 혈유량 감소는, 주로 동맥 경화 등의 어떠한 요인에 의해 협착을 일으키는 것에 의한다.

심근 경색의 치료 방법으로서는, 막힌 혈전을 혈전 용해제(예를 들어, tPA 등)로 용해시키는 방법, 및 혈관 내에 카테터(catheter)를 넣어서 풍선으로 부풀리는 풍선 요법 등이 있다. 혈전 용해제의 정맥 주사에 의한 치료 방법은 간편하지만, 재폐색하기 쉬운 것이 알려져 있다. 또한, 위궤양 등의 출혈성 질환을 갖는 환자에게는 주의가 필요하다. 한편, 풍선 요법은 재개통의 성공률이 높고, 또한 풍선 요법 후에 스텐트를 유치함으로써 재협착을 예방하는 것이 가능한 방법이지만, 그래도 다시 재협착하는 경우가 있다. 또한 풍선 요법은, 심장 카테터실을 갖는 한정된 의료 시설에서밖에 실시할 수 없다는 제약이 있다.

그런데, miRNA란, 유전자 발현을 억제하는 작용을 갖는 21 내지 25 염기 정도의 1본쇄 RNA이다. 게놈 위에 코딩되어 있는 비코딩 영역에서 유래되는 small RNA이다. 일반적으로, miRNA는, 단일 또는 클러스터화된 miRNA 전구체로부터 전사되는 유전자에서 생성된다. 즉, 유전자로부터의 1차 전사물인 pri-miRNA가 전사되고, 계속해서 pri-miRNA로부터 성숙형 miRNA로의 단계적 프로세싱에서, pri-mRNA로부터 특징적인 머리핀 구조를 갖는 약 70 내지 80 염기의 pre-miRNA가 생성되고, 이어서 Dicer의 개재에 의해 pre-miRNA로부터 성숙형 miRNA가 생성된다. miRNA는 분화, 세포 증식, 아폽토시스 등의 생물에게 있어 없어서는 안되는 생명 현상에 깊이 관여하고 있는 것으로 생각된다.

그 중에서도 hsa-miR-145는, 23 염기를 포함하는 miRNA이며, 항암 작용, 평활근의 증식 및 분화의 제어에 관여하고 있는 것으로 추측된다(특허문헌 1, 비특허문헌 1, 2).

WO2009/105759

S. Noguchi, et. al., J. Vet. Med. Sci., 74(1), 1-8, 2012 Eric M. Small, et. al., Nature, 469, 336-342, 2011

본 발명은, 종래의 혈전 용해제에 의한 치료 방법이나 풍선 요법과는 다른 방법으로, 심근 경색이나 뇌경색 등의 경색을 치료하기 위한 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 심근 경색이나 뇌경색을 일으키는 국소 부위에 선택적이고 비침습적으로 도달해서 치료하는 것이 가능한 경색 조직 치료용의 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하여 본 발명의 목적을 달성하기 위해 예의 연구하고 있던 중, 경색을 일으키고 있는 조직 부위에 miRNA인 hsa-miR-145를 투여함으로써 경색 부위의 크기(경색 사이즈)가 축소하는 것, 또한 당해 miRNA에 오토파지를 항진하는 작용이 있는 것, 즉 「오토파지 인핸서」로서 기능하는 것을 발견하였다. 이 지식으로부터, 본 발명자들은, 오토파지 인핸서, 특히 hsa-miR-145가 경색 조직의 수복 개선에 유효하게 작용하고, 경색 조직을 치료하는 유전자 요법의 유효 성분으로서 유용하다고 확신하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 다음의 실시 형태를 갖는 것이다.

(I) 경색 치료용 의약 조성물

(I-1). 오토파지 인핸서를 유효 성분으로 하는 경색 치료용 의약 조성물.

(I-2). 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145, 라파마이신(Rapamycin), 카르바마제핀(Carbamazepine), 소듐 발프로에이트(Sodium Valproate), 베라파밀(Verapamil), 로페라마이드(Loperamide), 아미오다론(Amiodarone), 니모디핀(Nimodipin), 니트렌디핀(Nitrendipine), 니굴디핀(Niguldipine), 프리모자이드(Primozide), 칼파스타틴(Calpastatin), 칼펩틴(Calpeptin), 클로니딘(Clonidine), 필메니딘(Pilmenidine), 2',5'-디데옥시아데노신(2',5'-dideoxyadenosine), 미녹시딜(Minoxidil), 페니트렘 A(Penitrem A), 플루스피릴린(Fluspiriline), 트리플루오페라진(Trifluoperazine), 및 트레할로스(Trehalose)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, (I-1)에 기재하는 경색 치료용 의약 조성물.

(I-3). 상기 오토파지 인핸서를 리포좀화시킨 상태로 포함하는, (I-1) 또는 (I-2)에 기재하는 경색 치료용 의약 조성물.

(I-4). 정맥 투여 형태를 갖는 (I-1) 내지 (I-3) 중 어느 하나에 기재하는 경색 치료용 의약 조성물.

(I-5). 상기 경색이 심근 경색, 뇌경색 또는 척수 경색인 (I-1) 내지 (I-4) 중 어느 하나에 기재하는 경색 치료용 의약 조성물.

(I-6). 상기 심근 경색이, 중증 대형 심근 경색인 (I-5)에 기재하는 경색 치료용 의약 조성물.

( II ) 경색 치료 방법

(II-1). 경색 환자에 오토파지 인핸서를 투여하는 공정을 갖는, 경색 환자의 경색 치료 방법.

(II-2). 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145, 라파마이신, 카르바마제핀, 소듐 발프로에이트, 베라파밀, 로페라마이드, 아미오다론, 니모디핀, 니트렌디핀, 니굴디핀, 프리모자이드, 칼파스타틴, 칼펩틴, 클로니딘, 필메니딘, 2',5'-디데옥시아데노신, 미녹시딜, 페니트렘 A, 플루스피릴린, 트리플루오페라진, 및 트레할로스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, (II-1)에 기재하는 경색 치료 방법.

(II-3). 오토파지 인핸서를 리포좀화한 상태로 투여하는, (II-1) 또는 (II-2)에 기재하는 경색 치료 방법.

(II-4). 오토파지 인핸서를 정맥 투여하는 공정인, (II-1) 내지 (II-3) 중 어느 하나에 기재하는 경색 치료 방법.

(II-5). 상기 경색 환자가 심근 경색, 뇌경색 또는 척수 경색의 환자인 (II-1) 내지 (II-4) 중 어느 하나에 기재하는 경색 치료 방법.

(II-6). 상기 심근 경색 환자가 중증 대형 심근 경색 환자인 (II-5)에 기재하는 경색 치료 방법.

또한, 이들 (II-1) 내지 (II-6)의 경색 치료 방법에 관한 발명에 있어서, 「오토파지 인핸서」라고 하는 용어는, 전술하는 (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 하나로 규정되는 「경색 치료용 의약 조성물」로 치환할 수 있다.

( III ) 오토파지 인핸서의 신규 용도

[ III -1] 경색 치료용 오토파지 인핸서:

(III-1-1) 경색을 치료하기 위해 사용되는, 오토파지 인핸서.

(III-1-2). 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145, 라파마이신, 카르바마제핀, 소듐 발프로에이트, 베라파밀, 로페라마이드, 아미오다론, 니모디핀, 니트렌디핀, 니굴디핀, 프리모자이드, 칼파스타틴, 칼펩틴, 클로니딘, 필메니딘, 2',5'-디데옥시아데노신, 미녹시딜, 페니트렘 A, 플루스피릴린, 트리플루오페라진, 및 트레할로스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, (III-1-1)에 기재하는 오토파지 인핸서.

(III-1-3). 상기 오토파지 인핸서가 리포좀화된 상태의 것인, (III-1-1) 또는 (III-1-2)에 기재하는 오토파지 인핸서.

(III-1-4). 경색의 치료가 오토파지 인핸서를 정맥 투여하는 방법에 의한 것인, (III-1-1) 내지 (III-1-3) 중 어느 하나에 기재하는 경색 치료 방법.

(III-1-5). 상기 경색이 심근 경색, 뇌경색 또는 척수 경색인 (III-1-1) 내지 (III-1-4) 중 어느 하나에 기재하는 오토파지 인핸서.

(III-1-6). 상기 심근 경색이 중증 대형 심근 경색인 (III-1-5)에 기재하는 오토파지 인핸서.

[ III -2] 오토파지 인핸서의 용도:

(III-2-1) 경색 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 오토파지 인핸서의 용도.

(III-2-2). 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145, 라파마이신, 카르바마제핀, 소듐 발프로에이트, 베라파밀, 로페라마이드, 아미오다론, 니모디핀, 니트렌디핀, 니굴디핀, 프리모자이드, 칼파스타틴, 칼펩틴, 클로니딘, 필메니딘, 2',5'-디데옥시아데노신, 미녹시딜, 페니트렘 A, 플루스피릴린, 트리플루오페라진, 및 트레할로스로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, (III-2-1)에 기재하는 용도.

(III-2-3). 상기 오토파지 인핸서가 리포좀화된 상태의 것인, (III-2-1) 또는 (III-2-2)에 기재하는 용도.

(III-2-4). 경색 치료용 의약 조성물이 정맥 투여 형태를 갖는 것인, (III-2-1) 내지 (III-2-3) 중 어느 하나에 기재하는 용도.

(III-2-5). 경색이 심근 경색, 뇌경색 또는 척수 경색인 (III-2-1) 내지 (III-2-4) 중 어느 하나에 기재하는 용도.

(III-2-6). 상기 심근 경색이, 중증 대형 심근 경색인 (III-2-5)에 기재하는 용도.

본 발명의 경색 치료용 의약 조성물은, 유효 성분으로서 오토파지 인핸서, 특히 hsa-miR-145를 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 경색 치료용 의약 조성물에 의하면, 경색 부위에, 유효 성분인 오토파지 인핸서, 특히 hsa-miR-145를 투여함으로써, 경색 사이즈를 축소시킬 수 있고, 경색 치료에 유효하게 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 의약 조성물은, 후술하는 실시예 2에서 나타내는 바와 같이, 심근 경색, 특히 중증 대형 심근 경색에 대하여, 그의 경색 사이즈를 축소시키는 효과가 우수하다.

당해 중증 대형 심근 경색은, 좌실 리모델링이 진행하여 심부전에 빠지기 때문에, 생명 예후가 나쁜 질환이다. 본 발명의 경색 치료용 의약 조성물에 의하면, 당해 중증 대형 심근 경색의 치료 후의 생명 예후를 양호하게 개선하는 것이 가능하다.

도 1은, 중증 대형 심근 경색 모델 동물(토끼)의 심장 조직을 에반스 블루(Evans Blue) 염색 및 TTC 염색을 행한 염색 화상을 나타낸다(실시예 2). (A)는 hsa-miR-145 함유 리포좀 대신에, 생리 식염수를 정맥 투여한 중증 대형 심근 경색 모델 동물(컨트롤 군)의 심장 조직의 염색 화상, (B)는 hsa-miR-145 함유 리포좀을 정맥 투여한 중증 대형 심근 경색 모델 동물(hsa-miR-145 투여군)의 심장 조직의 염색 화상을 나타낸다.
도 2는, 상기 hsa-miR-145 투여군(n=5) 및 컨트롤군(n=5)의 심장의 경색 사이즈를 심장 전체의 위험 영역에 대한 심장의 경색 영역이 차지하는 비율(％)로서 나타낸 도면이다.
도 3은, 실시예 3에서 행한 웨스턴 블롯팅의 전기 영동상을 나타낸다. hsa-miR-145로 처리한 H9c2 세포 내에서의 각 단백질(FRS2, KLF5, 마이오카딘(Myocardin), LC3B, p-Akt, Akt, p-ERK1/2, ERK1/2, β-액틴(actin))의 발현 상황을 나타낸다.
도 4는, hsa-miR-145로 처리한 H9c2 세포를 전자 현미경 하에서 촬영한 화상을 나타낸다. (A) 세포 내에서 오토파고좀(autophagosome)이 형성되어 있는 것, (B) 세포 내에서 오토리소좀(autolysosome)이 형성되어 있는 것을 알 수 있다(실시예 3).

본 발명의 경색 치료용 의약 조성물은, 오토파지 인핸서를 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

여기서 오토파지란, 세포가 갖는 자정 작용이며, 낡아져서 불필요하게 된 세포의 구성 요소를 일부의 세포질과 함께 소포 모양 구조(오토파고좀)에 의해 감싸, 리소좀의 효소를 받아 분해하는 기구이다. 오토파지에는, 세포내 대사와 항상성의 유지 등에 필요한 기초적인 오토파지와, 스트레스에 반응해서 유도되는 오토파지가 있다. 이러한 오토파지의 작용에 의해, 세포 내에서의 이상한 단백질의 축적이 방지된다. 또한, 과잉으로 단백질이 합성되거나, 세포 내에서의 영양 환경이 악화되었을 때, 또한 세포질 내에 병원 미생물 등이 침입했을 때 등에, 오토파지가 작용하고, 그들을 제거 내지 정화한다. 이렇게 오토파지는, 생체 내의 항상성 유지에 관여하고 있다. 또한 오토파지는, 세포가 기아에 빠졌을 때나, 허혈이나 염증 등의 병적 상태에 빠졌을 때에도 유도된다.

본 발명에 있어서 「오토파지 인핸서」란, 상기 세포의 자정 작용인 「오토파지」를 항진시키는 작용을 갖는 것을 말한다. 구체적으로는, 후술하는 실시예에서 세포의 오토파지를 항진하는 것이 나타난 miRNA의 1종인 hsa-miR-145, 및 종래부터 오토파지를 항진시키는 작용을 갖는 것이 알려져 있는 라파마이신, 카르바마제핀, 소듐 발프로에이트, 베라파밀, 로페라마이드, 아미오다론, 니모디핀, 니트렌디핀, 니굴디핀, 프리모자이드, 칼파스타틴, 칼펩틴, 클로니딘, 필메니딘, 2',5'-디데옥시아데노신, 미녹시딜, 페니트렘 A, 플루스피릴린, 트리플루오페라진, 및 트레할로스(S. Sarkar et al., Cell Death and Diffentiation 16, 46-56, 2009)를 들 수 있다. 또한, 이 오토파지 인핸서는, 본 발명의 경색 치료용 조성물의 유효 성분으로서, 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 또한 세포의 오토파지를 항진한다는 효과를 손상시키지 않는 한, 2종 이상을 임의로 조합하여 사용할 수도 있다. 바람직하게는 hsa-miR-145, 또는 hsa-miR-145와 다른 1 또는 2 이상의 오토파지 인핸서와의 조합이다.

여기서 hsa-miR-145는, 인간 유래의 마이크로 RNA로서 공지된 올리고뉴클레오티드이며, the microRNA database (miRBase)(http://www.mirbase.org/)에 액세션 번호 MI0000461로서 등록되어 있다(EntrezGene: 406937, HGNC: 31532).

hsa-miR-145의 염기 서열을 서열 번호 1로 나타내었다. 또한, 이것이 프로세싱 생성되기 전의 분자인 헤어핀 루프 구조를 갖는 primary miRNA(pri-miRNA)의 염기 서열을 서열 번호 2로 나타내었다.

또한, hsa-miR-145는, 당해 염기 서열(서열 번호 1)에 기초하여, 공지된 핵산 합성법에 의해 합성하는 것이 가능하고, 또한 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 등으로부터 상업적으로 입수하는 것도 가능하다. 단, 경색 치료용 의약 조성물에는, hsa-miR-145의 제조 방법별로 한정되지 않고, 인공적으로 화학 합성되거나, 생화학적으로 합성된 것, 생물체 내에서 합성된 것, 또는 80 염기 이상의 2본쇄 RNA(pri-miRNA)가 체내 또는 체외에서 분해되어 생성된 것일 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 유효 성분으로서 상기 오토파지 인핸서를, 그의 투여 경로에 따라, 의약품에 통상 사용되는, 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제와 함께 배합함으로써 제조할 수 있다. 오토파지 인핸서로서, 특히 hsa-miR-145 등의 핵산을 사용하는 경우에는, 통상 유전자 치료제의 제조에 사용되는 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제와 함께 배합함으로써 제조할 수 있다.

투여 경로로서는, 오토파지 인핸서를 환부(경색을 발생하고 있는 조직)에 도달시킬 수 있는 투여 경로일 수 있으며, 경구 투여 및 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내 투여, 환부에의 직접 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 점막 투여, 직장 내 투여, 경폐 투여 등)의 구별을 묻지 않는다. 바람직하게는, 주사나 점적에 의한 정맥 내 투여 또는 환부에의 직접 투여이다.

주사제나 점적제의 경우, 오토파지 인핸서와 함께 배합하는 담체 또는 첨가제로서는, 통상 주사제나 점적제에 사용되는 것을 널리 사용할 수 있고, 예를 들어 담체로서는, 증류수; 염화나트륨 또는 염화나트륨과 무기염과의 혼합물을 포함하는 수용액; 만니톨, 락토오스, 덱스트란 또는 글루코오스 등의 당류를 포함하는 수용액; 글리신이나 아르기닌 등의 아미노산류를 포함하는 수용액; 유기산과 글루코오스 등의 당류를 포함하는 수용액: 염과 글루코오스 등의 당류를 포함하는 수용액을 들 수 있다. 또한, 이들에 필요에 따라, 침투압 조정제, pH 조정제, 식물성 기름 또는 계면 활성제 등의 보조제를 사용하여, 용액상, 현탁상 또는 유탁상으로 제조할 수도 있다. 또한, 첨가제로서, 약학적으로 허용되는 항산화제나 보존제를 배합할 수도 있다. 또한, 주사제나 점적제는, 분말화(스프레이 드라이) 또는 동결 건조 등의 조작에 의해, 용시용해용의 고형 제제로서 제조할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 오토파지 인핸서를 그대로 주사용 증류수 등의 담체에 용해시켜서 포함하는 것일 수도 있고, 또한 오토파지 인핸서를 리포좀화한 상태로 포함하는 것일 수도 있다. 여기서 리포좀화란, 오토파지 인핸서가 리포좀 중에 봉입된 상태(리포좀에 내포된 상태), 및 오토파지 인핸서가 리포좀의 표면에 부착된 상태의 어느 것도 포함하는 취지로 사용된다.

리포좀으로서는, 본 발명의 오토파지 인핸서를 내부에 봉입(내포)할 수 있거나, 또는 표면에 부착될 수 있는 것일 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 오토파지 인핸서로서, 예를 들어 hsa-miR-145를 사용하는 경우, 당해 hsa-miR-145는 음이온성인 점에서, 예를 들어 리포펙타민, 리포펙틴, 셀펙틴, 및 그 외의 양전하를 갖는 리포좀, 인산칼슘, 덱스트란 및 폴리에틸렌글리콜 등을 성분으로 하는 리포좀을 예시할 수 있다. 또한, 이 리포좀도 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들어 리포펙타민은 인비트로겐 등으로부터, FuGENE 6 Transfection Reagent는 로슈로부터 구입할 수 있다.

리포좀의 내부에 약제 등을 봉입하는 방법은 주지이고, 본 발명의 오토파지 인핸서도 이것을 따라서 리포좀 내부에 봉입할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 상업적으로 입수 가능한 리포좀을 사용하는 경우에는, 그의 판매자로부터 제공되는 매뉴얼을 따라서 제조할 수 있다. 또한 그렇지 않은 경우에는, 예를 들어 오토파지 인핸서를 포함하는 용액과, 포스파티딜콜린류, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딘산류 또는 장쇄 알킬 인산염류, 강글리오시드류, 당지질류 또는 포스파티딜글리세롤류 및 콜레스테롤류를 포함하는 지질을 사용해서 리포좀을 형성함으로써, 내부에 오토파지 인핸서가 봉입된 리포좀을 얻을 수 있다.

리포좀의 평균 입자 직경은, 모세혈관을 통과시키는 것을 고려하면 150nm 이하인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 140nm 이하이고, 더욱 바람직하게는 120nm 이하이고, 한층 바람직하게는 100nm 이하이다. 또한, 평균 입자 직경은 30nm 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50nm 이상이고, 더욱 바람직하게는 70nm 이상이다. 또한, 여기에서 평균 입자 직경은, 레이저 회절·산란법에 의해 구해지는 입도 분포에서의 적산값 50％에서의 입경을 의미한다.

주사제나 점적제 이외에, 본 발명의 의약 조성물은, 경구 투여의 형태를 가질 수도 있고, 이러한 것으로서는 정제, 캡슐제, 과립제 또는 산제 등의 고형 제제의 형태를 들 수 있다. 이 제조에는 통상적인 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체나 첨가제를 배합할 수 있고, 예를 들어 부형제, 결합제, 붕괴제, 용해 보조제, 활택제, 항산화제, 방부제, pH 조정제, 착색료, 풍미료 등을 제한 없이 들 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 오토파지 인핸서의 함유량은, 의약 조성물의 투여 경로나 오토파지 인핸서의 종류에 따라 상이하지만, 오토파지 인핸서로서 hsa-miR-145를 예를 들면, 통상 1회 투여의 의약 조성물 중에, hsa-miR-145가 10 내지 1000μg, 바람직하게는 50 내지 160μg, 더욱 바람직하게는 70 내지 80μg의 비율로 포함되도록 배합할 수 있다. 그 밖의 오토파지 인핸서를 사용하는 경우도, 이것을 기준으로 적절히 설정할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 심근 경색, 뇌경색, 척수 경색 등의 경색 환자에 대하여 당해 경색의 치료제로서 사용할 수 있다. 바람직하게는 심근 경색의 치료이고, 보다 바람직하게는 중증 대형 심근 경색의 치료이다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은 심근 경색, 뇌경색 또는 척수 경색 등의 경색의 종류나 중증도, 또한 환자의 연령이나 체중 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 바람직하게는, 경색 조직의 적어도 일부를 재생 수복하는데도 적절한 양이며, 이것을 본 발명에서는 「의약적으로 유효량」이라고도 한다. 이러한 유효량의 목표로서, 1회 투여당의 오토파지 인핸서의 투여량으로서, hsa-miR-145를 예로 하면, 10 내지 1000μg, 바람직하게는 50 내지 160μg, 더욱 바람직하게는 70 내지 80μg이 되는 것과 같은 비율을 들 수 있다. 다른 오토파지 인핸서도 이것을 기준으로서 적절히 설정할 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물의 투여 횟수는, 1일 1회이거나 수회일 수도 있고, 경색 환자의 증상에 따라서 적절히 선택된다.

실시예

이하, 실시예 등에 의해, 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. hsa - miR -145 함유 리포좀의 제조

hsa-miR-145(5 nM; 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수)를 RNase를 포함하지 않는 증류수 100μl에 용해하고, 이것에 400μl의 혈청 저감 배지 Opti-MEM(GIBCO)을 넣어서 보르텍스(vortex)를 사용하여 30초간, 진탕 혼합하였다. 그 후, 얻어진 혼합물에 Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen) 10μl를 넣고, 다시 보르텍스를 사용하여 30초간, 진탕 혼합하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 10분간, 실온에서 인큐베이트하고, 이것에 300μl의 Opti-MEM을 넣어서 800μl로 하였다. 이렇게 해서 제조한 hsa-miR-145 함유 리포좀을 다음의 실시예 2에서 사용하였다.

실시예 2. 심근 경색에의 적용과 그의 치료 효과

상기 실시예 1에서 제조한 hsa-miR-145 함유 리포좀을 중증 대형 심근 경색의 모델 동물의 경색 부위에 투여하여, 경색에 대한 hsa-miR-145의 치료 효과를 평가하였다.

1. 실험 방법

중증 대형 심근 경색의 병태 모델 동물은, 일본 백색종 토끼(수컷, 체중 약 2kg)를 사용하여, 그의 관동맥을 30분간 허혈함으로써 제작하였다.

당해 병태 모델 동물(n=5)에, 실시예 1에서 제조한 hsa-miR-145 함유 리포좀을 체중 1kg당 0.035mg의 비율로 정맥 내 투여하고, 투여 후 14일째에, 마취하에서 죽여 심장을 적출하였다(hsa-miR-145 투여군). 또한, 컨트롤군으로서, 중증 대형 심근 경색의 병태 모델 동물(n=5)에, 상기 hsa-miR-145 함유 리포좀 대신에 생리 식염수를 체중 1kg 0.5ml의 비율로 정맥 내 투여하고, 투여 후 14일째에, 마취하에서 죽여 심장을 적출하였다.

이렇게 해서 적출한 각 군(hsa-miR-145 투여군, 컨트롤군)의 심장을, 각각 에반스 블루 다이를 사용해서 염색하고, 허혈 영역과 비허혈 영역을 결정하였다. 또한, 동 심장을 TTC 염색함으로써 경색 영역을 결정하였다.

또한, 이들 염색을 지표로 하여, 경색 영역의 사이즈를, 심장 전체 중 위험 영역(허혈이 발생하는 영역) 100％에 대한 비율(％)로서 구하였다.

2. 실험 결과

도 1에, 각 군(hsa-miR-145 투여군, 컨트롤군)의 심장 협착 부위(심장 폐색 부위)에서의 염색 조직을 나타내었다. 도 1 중, (A)는 컨트롤군의 심장 조직의 염색 화상, (B)는 hsa-miR-145 투여군의 심장 조직의 염색 화상이다. 에반스 블루 염색에 의해 청색으로 염색된 영역이 비허혈 영역이며, 청색으로 염색되지 않은 영역이 허혈 영역이고, TTC 염색에 의해 회색으로 염색된 영역이 경색 영역이다.

도 2에, hsa-miR-145 투여군(n=5)과 컨트롤군(n=5)의 각 심장에 대해서 경색 사이즈를 대비한 결과를 나타내었다. 도 2에 나타내는 바와 같이, hsa-miR-145 투여군의 심장 경색 사이즈는, hsa-miR-145를 투여하지 않은 컨트롤군의 심장 경색 사이즈보다도 유의하게 작았다. 이 결과로부터, hsa-miR-145에는 경색 부위의 크기를 축소시키는 작용이 있는 것이 확인되었다.

또한, hsa-miR-145의 발현량의 측정은, 공지된 방법에서 실시하는 것이 가능하다. 구체적으로는 적출한 심장의 경색부, 경계부 및 정상부로부터 각각 조직을 채취한다. 채취 조직을 호모게나이즈 후, 트리졸 시약(어플라이드 바이오시스템즈; AB)으로 용해하고, RNA를 추출한다. TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit(AB)를 사용해서 RT를 행하고, Real-time PCR로 hsa-miR-145의 발현을 TaqMan miRNA primer(AB)를 사용해서 조사한다.

여기서 RT-PCR에 사용하는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 프로브에 대해서는 공지된 방법에 기초하여 적절히 선택하는 것이 가능하다.

실시예 3. hsa - miR -145의 작용 기서의 검증

전술하는 실시예 2에서, hsa-miR-145가 심근 경색 둥지의 축소, 및 심기능의 보존에 유효한 것이 확인되었다. 따라서, 당해 hsa-miR-145의 작용 기서의 검증을 행하였다.

(1) 실험 방법

(1-1) 시료의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 hsa-miR-145 함유 리포좀을 래트의 심장 유래 세포인 H9c2 세포에 트랜스펙션 하였다. 구체적으로는, hsa-miR-145의 최종 농도가 20nM 또는 40nM이 되도록 제조하고, 당해 hsa-miR-145 함유 리포좀의 존재 하에서 H9c2 세포를 37℃에서 72시간 배양하였다.

배양 후, 얻어진 H9c2 세포로부터 단백질을 모두 추출하였다. 구체적으로는, 셀 스크레이퍼(스미토모 베이크라이트, 일본)를 사용하여, 배양한 H9c2 세포를 배양 샬레로부터 긁어내어, Phosphate Buffered Saline(PBS(-), TAKARA, 일본)에 부유시켜, 이것을 15ml 용량의 원심관에 회수하고, 회전수 2000rpm으로 3분간 원심 하였다. 원심 후, 상청을 제외하고, 침전물에 Lysis Buffer(1％ NP-40, 0.1％ deoxycholic acid, 0.1％ SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA)와, 1％ Proteinase Inhibitor Cocktail(SIGMA)을 첨가하여 보르텍스로 교반하고, 세포를 완전히 용해하였다. 이것을 빙상에서 20분간 정치한 후, 4℃ 조건 하, 12000rpm으로 20분간, 원심을 거쳐, 그의 상청을 회수하여, 이것을 단백 추출액으로 하였다. 단백 추출액 중의 단백질 농도는 DC Protein Assey Kit(BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 사용하여, 동일 키트의 프로토콜에 따라, 분광 광도계(Biophotometer Plus, eppendorf, Hamburg, Germany)로 측정하였다.

마이크로 튜브에, 상기에서 제조한 단백 추출액(전체 단백질량 100μg)과 5×SDS 용액(0.25M Tris-HCl(pH 6.8), 10％ SDS, 0.5％ Bromophenol Blue, 0.5％ M DTT, 50％ Glycerol) 20μl를 첨가 혼합하고, 이것을 멸균 증류수에서 전량을 100μl로 하였다. 계속해서, 이것을 블록 인큐베이터(ASTEC, 후쿠오카, 일본)로 98℃에서 5분간 가열하고, 빙상에서 5분간 급냉하였다.

(1-2) 웨스턴 블롯팅

상기에서 SDS 처리한 단백질을, XV PANTERA SYSTEM(DRC 가부시끼가이샤, 도쿄, 일본) 또는 이지 세퍼레이터(등록 상표)(와코)로 전기 영동하였다. 영동 후, Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell(BIO-RAD)을 사용하고, PVDF 멤브레인(PerkinElmer Life Science, Boston, MA, USA)에 블롯팅하였다. 또한, PVDF 멤브레인은 미리 메탄올로 친수화하고, Blotting Buffer(48mM Tris, 40mM Glycine)에 침지, 침탕시켜서 사용하였다. 블롯팅은 15V, 370 mA, 40분의 조건에서 실시하였다.

블롯팅 종료 후, 5％ 스킴 밀크(Cell Signaling, Danvers, MA, USA)를 첨가한 Tris Buffered Saline-Tween 20(TBS-T)(20 mM tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 0.1％ Tween20)에 침지하고, 실온에서 1시간 침탕하여 블로킹을 행하였다. TBS-T로 세정 후, 1차 항체 희석액(2％ 소 혈청 알부민, 0.01％ 아지드화나트륨 첨가 TBS-T)으로 희석한 1차 항체액에 4℃에서 밤새 침지하였다. 1차 항체에는 도 3에 나타내는 각 단백질(FRS2, KLF5, 마이오카딘, LC3B, p-Akt, Akt, p-ERK1/2, ERK1/2 및 β-액틴)에 대한 항체를 사용하였다. 다음날, TBS-T로 세정 후, 5％ 스킴 밀크로 희석한 2차 항체액에 침지하고, 1시간 침탕한 후, TBS-T로 세정하였다. 2차 항체에는, 항 마우스 또는 래빗 모노클로날 서양 고추냉이 표지 항체(#7076 또는 #7074, Cell Signaling)(1:4000)를 사용하였다.

계속해서, Western Lightning(등록 상표) ECL Pro(PerkinElmer)를 사용하여 발색시키고, ImageQuant Las 4000 mini(GE Healthcare Japan, 도쿄, 일본)를 사용하여, Chemiluminescence로 검출하였다.

로딩의 컨트롤로서, 동일한 멤브레인을 사용하여, 1차 항체를 항-인간 β-액틴 마우스 모노클로날 항체(AC-15, SIGMA)(1:4000)로서 사용하여, 실온에서 1시간 감작시킨 후, 상기의 프로토콜에 따라 검출하였다.

(1-3) 비교 실험

hsa-miR-145 대신에, 5'-GUAGGAGUAGUGAAAGGCC-3'(다마콘사 제조)(서열 번호3)의 염기 서열을 갖는 miRNA를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 3 (1-1) 및 (1-2)와 동일한 방법으로 실험을 행하였다.

(2) 실험 결과

상기의 실험에서 얻어진 웨스턴 블롯팅의 전기 영동상을 도 3에 나타내었다. 도면 중, 전기 영동상 중의 컨트롤은 상기의 비교 실험의 결과를 나타낸다.

이것으로부터 알 수 있는 바와 같이, hsa-miR-145를 도입한 세포에서, LC3-B I로부터 II로의 현저한 컨버트, 및 PI3K/Akt(p-Akt)의 시그널의 항진이 인정되었다. 한편, KLF5 및 FRS2(Fibroblast growth factor receptor substrate 2; 섬유모세포 성장 인자 수용체 기질 2)는 모두 발현의 저하가 보였다.

도 4에, 최종 농도 40nM의 hsa-miR-145로 처리한 H9c2 세포를 전자 현미경으로 관찰한 결과를 나타내었다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 세포 내의 오토파고좀도 4의 (A)) 및 오토리소좀(도 4의 (B))의 형성이 인정되었다.

서열표 프리텍스트

서열 번호 1은 hsa-miR-145의 염기 서열을 나타낸다. 서열 번호 2는 hsa-miR-145의 전구 물질인 헤어핀 루프 구조를 갖는 primary miRNA의 염기 서열을 나타낸다. 서열 번호 3은 실시예 3에서 비교 실험용으로 사용한 miRNA의 염기 서열을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> GIFU UNIVERSITY <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Pharmaceutical composition for treating infarction <130> P13-053 <150>?JP 2012-090873 <151>?2012-04-12 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 guccaguuuu cccaggaauc ccu?????????????????????23 <210> 2 <211> 88 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 caccuugucc ucacggucca guuuucccag gaaucccuua gaugcuaaga uggggauucc??60 uggaaauacu guucuugagg ucaugguu??????????????????? 88 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Unknown <223> a base sequence of miRNA used in Example 3 <400> 3 guaggaguag ugaaaggcc?????????????????????19

Claims

오토파지 인핸서(autophagy enhancer)를 유효 성분으로 하는 경색 치료용 의약 조성물.
제1항에 있어서, 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145인, 경색 치료용 의약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 오토파지 인핸서를 리포좀화한 상태로 포함하는, 경색 치료용 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥 투여 형태를 갖는, 경색 치료용 의약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경색이 심근 경색, 뇌경색 또는 척수 경색인, 경색 치료용 의약 조성물.
오토파지 인핸서를 경색을 갖는 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 경색의 치료 방법.
제6항에 있어서, 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145인, 경색 치료 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 오토파지 인핸서를 리포좀화한 상태로 투여하는, 경색 치료 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 오토파지 인핸서를 정맥 투여하는, 경색 치료 방법.
경색을 치료하기 위해 사용되는, 오토파지 인핸서.
제10항에 있어서, 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145인, 오토파지 인핸서.
경색 치료용 의약 조성물을 제조하기 위한, 오토파지 인핸서의 용도.
제12항에 있어서, 오토파지 인핸서가 hsa-miR-145인, 용도.