KR20150000795A

KR20150000795A - 단백질 복합체, 이를 포함하는 c-Met과 EGFR에 대한 이중특이 항체, 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20150000795A
Application number: KR1020130073360A
Authority: KR
Inventors: 이현; 이정욱; 이재일; 김민경
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2015-01-05

Abstract

c-Met에 대한 항원 결합 부위 및 EGFR에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 단백질 복합체, 상기 단백질 복합체로부터 얻어지는 c-Met과 EGFR에 대한 이중특이 항체, 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 단백질 복합체를 이용하면, c-Met과 EGFR를 동시에 표적으로 하는 시스템을 효과적으로 구축할 수 있다.

Description

단백질 복합체, 이를 포함하는 c-Met과 EGFR에 대한 이중특이 항체, 및 그 제조 방법{Protein complex, Bispecific Anti-C-Met/EGFR antibody comprising the protein complex, and method of preparation thereof}

c-Met에 대한 항원 결합 부위와 EGFR에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 단백질 복합체, 상기 단백질 복합체로부터 얻어지는 c-Met과 EGFR에 대한 이중특이 항체, 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

단일클론항체가 신약 시장의 강자로 자리매김하면서 다양한 표적에 대한 치료제로 개발되고 있으나, 많은 경우 만족할 만한 약효를 보이지 못하거나, 항체 생산에 고비용이 드는 등 신약 개발에 있어 한계를 지니고 있다. 이러한 문제점 해결을 위한 하나의 방법으로 1980년 중반 이후 이중특이 항체에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있으나, 많은 노력에도 불구하고 아직 주도적인 기술은 나타나지 않고 있다.

기존의 이중특이 항체 제조법은 동질의 이중특이 항체를 대량 생산하는데 어려움이 있거나, 낮은 효능과 부작용으로 인해 실용화에 어려움이 있었다. 최근 들어 항체 공학 기술의 발달에 힘입어 경쟁력이 있는 새로운 항체 플랫폼들이 나타나고 있으나, 아직 검증 단계에 머무르고 있는 실정이다.

한편, c-Met은 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로, 그 자체가 암유발 유전자이며, 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 치료의 타겟으로 주목받는 단백질이다.

c-Met과 EGFR은 폐암을 포함한 각종 고형암에서 과발현 되어 cell cycle progression 및 암의 침윤과 전이에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. EGFR 변이가 있는 폐암 환자에게 EGFR 저해제인 Gefitinib을 사용하면 치료에 효과적이지만, 곧 약제 저항성이 생기는데, 이에 c-Met의 과발현이 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이처럼 한가지 치료제에 대한 내성을 보일 수 있는 암세포를 효과적으로 치료 가능한 항암제, 및 치료방법의 개발이 요구된다.

일 예는 c-Met에 대한 항원 결합 부위 및 EGFR에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 단백질 복합체를 제공한다.

또 다른 예는 상기 단백질 복합체의 제조 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

또 다른 예는 상기 단백질 복합체로부터 얻어지는 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 제공한다.

또 다른 예는 상기 단백질 복합체를 이용한 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 예는 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 유효성분으로 포함하는 c-Met 및 EGFR의 활성화 및/또는 과생성에 의한 질병의 진단, 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

일반적인 항체 형성과정에는 Fc 부위를 통한 이량체(dimer) 형성이 일어나는데, 이 경우에는 동형이량체(homodimer)와 이형이량체(heterodimer)의 형성률이 유사하기 때문에, 이형이량체 형성률, 즉 이중특이 항체 형성률이 낮아지는 단점이 있다. 이에, 본 발명자들은 단일가닥 폴리펩타이드 프로세싱(single polypeptide processing)과 이를 통한 이중특이 항체 제조법에 항체의 Fc부분의 CH3 도메인에 "knob into hole"의 개념을 조합함으로써 이중특이 항체 형성률을 향상시키고 보다 안정한 구조의 이중특이 항체를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 이형이량체 형성률이 개선된 scFv-Fc 이중특이 항체, 특히 c-Met과 EGFR을 동시에 타겟팅하는 것을 특징으로 하는 이중특이 항체에 관한 것이다.

일 예는 단백질 복합체를 제공하며, 상기 단백질 복합체는 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 연결하는 제1 링커를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1 항원 결합 부위는 제1 경쇄 항원 결합 부위 또는 제1 중쇄 항원 결합 부위를 포함하는 단일가닥 폴리펩타이드, 또는 제1 경쇄 항원 결합 부위 및 제1 중쇄 항원 결합 부위를 포함하고 상기 제1 경쇄 항원 결합 부위와 제1 중쇄 항원 결합 부위가 연결된 단일가닥 폴리펩타이드이고, 상기 제1 폴리펩타이드의 N-말단에 위치할 수 있다.

상기 제2 항원 결합 부위는 제2 경쇄 항원 결합 부위 또는 제2 중쇄 항원 결합 부위를 포함하는 단일가닥 폴리펩타이드, 또는 제2 경쇄 항원 결합 부위 및 제2 중쇄 항원 결합 부위를 포함하고 상기 제2 경쇄 항원 결합 부위와 제2 중쇄 항원 결합 부위가 연결된 단일가닥 폴리펩타이드이고, 상기 제2 폴리펩타이드의 N-말단에 위치할 수 있다.

상기 제1 링커는 상세하게는 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단 및 상기 제2 폴리펩타이드의 N-말단을 연결하는 것으로서, 그의 내부, 또는 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단 및 상기 제2 폴리펩타이드의 N-말단 중 어느 하나의 말단 쪽 또는 양 말단 쪽에 절단 가능한 아미노산 서열을 갖는 태그가 연결된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 단백질 복합체는 제1 폴리펩타이드, 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단 쪽에 연결된 제2 폴리펩타이드, 및 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 N-말단을 연결하는 제1 링커를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, "... 말단 쪽에 연결"되었다 함은 상기 말단에 직접 연결되거나 링커 등을 통하여 간접적으로 연결된 것을 모두 포함하는 의미이다.

상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 연결하는 제1 링커는 예컨대 펩타이드 링커일 수 있고, 상기 절단 가능한 아미노산 서열을 갖는 태그는 예컨대 프로테아제와 같은 효소에 의하여 절단될 수 있는 부위를 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.

상기 제1 폴리펩타이드의 제1 항원 결합 부위와 제2 폴리펩타이드의 제2 항원 결합 부위 중 하나는 c-Met를 항원으로 인식하여 c-Met에 특이적으로 결합하는 항 c-Met 항체의 항원 결합 부위이고, 나머지 하나는 EGFR를 항원으로 인식하여 EGFR에 특이적으로 결합하는 항 EGFR 항체의 항원 결합 부위일 수 있다. 예컨대, 일 구체예에서 상기 제1 폴리펩타이드의 제1 항원 결합 부위는 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고, 제2 폴리펩타이드의 제2 항원 결합 부위는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위일 수 있고, 다른 구체예에서 상기 제1 폴리펩타이드의 제1 항원 결합 부위는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고, 제2 폴리펩타이드의 제2 항원 결합 부위는 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위일 수 있다.

일 예에서, 상기 제1 폴리펩타이드의 제1 항원 결합 부위는 제1 경쇄 항원 결합 부위와 제1 중쇄 항원 결합 부위가 폴리펩타이드 링커(이하, 제2 링커라 함)를 통해 연결된 단일 가닥 형태의 폴리펩타이드(단일쇄 가변영역 단편(scFv; single-chain variable-region fragment)일 수 있다. 예컨대, 상기 제1 경쇄 항원 결합 부위와 제1 중쇄 항원 결합 부위가 제2 폴리펩타이드 링커를 통해 연결된 단일 가닥 형태의 폴리펩타이드는 제1 경쇄 항원 결합 부위의 C-말단과 제1 중쇄 항원 결합 부위의 N-말단이 상기 제2 링커를 통하여 연결된 형태이거나, 또는 그 역의 형태, 즉 제1 중쇄 항원 결합 부위의 C-말단과 제1 경쇄 항원 결합 부위의 N-말단이 상기 제2 링커를 통하여 연결된 형태일 수 있다.

또한 제2 폴리펩타이드의 제2 항원 결합 부위는 제2 경쇄 항원 결합 부위와 제2 중쇄 항원 결합 부위가 폴리펩타이드 링커(이하, 제3 링커라 함)를 통해 연결된 단일 가닥 형태의 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 제2 경쇄 항원 결합 부위와 제2 중쇄 항원 결합 부위가 제3 폴리펩타이드 링커를 통해 연결된 단일 가닥 형태의 폴리펩타이드는 제2 경쇄 항원 결합 부위의 C-말단과 제2 중쇄 항원 결합 부위의 N-말단이 상기 제3 링커를 통하여 연결된 형태이거나, 또는 그 역의 형태, 즉 제2 중쇄 항원 결합 부위의 C-말단과 제2 경쇄 항원 결합 부위의 N-말단이 상기 제3 링커를 통하여 연결된 형태일 수 있다.

상기 제1 경쇄 항원 결합 부위, 제1 중쇄 항원 결합 부위, 또는 이들의 조합과, 상기 제2 경쇄 항원 결합 부위, 제2 중쇄 항원 결합 부위, 또는 이들의 조합 중 어느 하나는 c-Met를 항원으로 인식하거나 및/또는 c-Met에 특이적으로 결합하는 항 c-Met 항체의 경쇄 항원 결합 부위 및/또는 중쇄 항원 결합 부위이고, 나머지 하나는 EGFR를 항원으로 인식하거나 및/또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항 EGFR 항체의 경쇄 항원 결합 부위 및/또는 중쇄 항원 결합 부위이다.

상기 태그는 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 절단 가능한 아미노산 서열 (절단부위; 예컨대 효소의 절단 부위)을 갖는 것으로, 제1 폴리펩타이드의 C-말단 (또는 제1 링커의 N-말단) 또는 제2 폴리펩타이드의 N-말단 (또는 제1 링커의 C-말단) 중 어느 한 부분 또는 이들 모두 부착될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 태그는 제1 폴리펩타이드의 C-말단에 부착된 것이고, 상기 제1 링커는 상기 태그의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 N-말단 (예컨대, 제2 경쇄 항원 결합 부위의 N-말단 또는 제2 중쇄 항원 결합 부위의 N-말단)을 연결하는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 태그는 상기 제2 폴리펩타이드의 제2 경쇄 항원 결합 부위의 N-말단 또는 제2 중쇄 항원 결합 부위의 N-말단에 부착된 것이고, 상기 제1 링커는 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 상기 태그의 N-말단을 연결하는 것일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 태그는 제1 폴리펩타이드의 C-말단 및 제2 폴리펩타이드의 N-말단(예컨대, 제2 경쇄 항원 결합 부위의 N-말단 또는 제2 중쇄 항원 결합 부위의 N-말단)에 모두 부착된 것이고, 상기 제1 링커는 상기 제1 폴리펩타이드에 부착된 태그의 C-말단과 상기 제2 폴리펩타이드에 부착된 태그의 N-말단을 연결하는 것일 수 있다 (도 2 참조).

또한, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드에서 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지는, 면역글로불린, 구체적으로 인간 면역 글로불린의 Fc 부위의 전부 또는 일부, 및/또는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 각각 상기 Fc 부위의 전부 또는 일부와 연결하는 경첩부위(hinge region)로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 경첩부위는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위, 바람직하게는 각 폴리펩타이드의 중쇄 불변 부위 중 C-말단 쪽에 위치한 CH3 도메인상의 아미노산 잔기가 일부 변형된 것일 수 있다.

상기 변형은 바람직하게는 Knob-into-hole 원리의 도입을 통해 이루어질 수 있다.

즉, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에, 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 하나 이상의 홀(hole)을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 상기 노브는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 어느 하나의 폴리펩타이드의 CH3 도메인에 형성되고, 상기 홀은 다른 하나의 폴리펩타이드의 CH3 도메인에 형성되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 노브와 상기 홀은 각각의 폴리펩티드의 CH3 도메인상에서 상호 대응되는 위치에 형성되는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "노브 (knob)" 및 "홀 (hole)" 은 상기 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드의 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위, 바람직하게는 각 폴리펩타이드의 CH3 도메인상의 아미노산 잔기 변형에 의해 형성되는 것으로서, 단백질 복합체의 3차 구조 상에서 상대적으로 돌출되거나 또는 함몰된 형태로 나타나는 구조를 의미한다.

다시 말해, 상기 Knob-into-hole 원리란 각 중쇄의 CH3 도메인간 접점에 존재하는 잔기를 일부 변형시켜 목적하는 이형이량체 형태의 항체 형성률을 높이는 기술로서, 상기 변형은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 각각의 CH3 도메인에 대해 각각 상이하게 적용되는 것일 수 있다. 상세하게는 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 어느 하나의 CH3 도메인은 주변 아미노산 잔기보다 상대적으로 큰(돌출된) 측쇄를 갖는 잔기가 포함되도록 하고, 다른 하나의 CH3 도메인은 주변 아미노산 잔기보다 상대적으로 작은(함몰된) 측쇄를 갖는 잔기가 포함되도록 변형된 것일 수 있다.

상기 노브(knob)는 주변 아미노산 서열에 포함된 아미노산 잔기보다 상대적으로 돌출된(큰) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 형성되는 것으로, 바람직하게는 상기 돌출된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 Arg, Phe, Tyr, 및 Trp 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 상기 홀(hole)은 주변 아미노산 서열에 포함된 아미노산 잔기보다 상대적으로 함몰된(작은) 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 형성되는 것으로, 바람직하게는 상기 함몰된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 Ala, Ser, Thr, Gly 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 각각의 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위, 바람직하게는 상기 두 폴리펩타이드 각각의 중쇄의 CH3 도메인에 포함된 노브-홀 쌍은 하나 이상 존재할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 각각 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 및/또는 하나 이상의 홀(hole)을 포함하며(즉, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 중 하나는 노브, 다른 하나는 홀을 포함), 상기 제1 링커의 한 쪽 말단은 제1 태그와, 다른 쪽 말단은 제2 폴리펩타이드의 N-말단과 연결되며, 상기 제1 태그는 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단에 연결되며, 태그 내부, 링커의 어느 하나의 말단, 또는 양 말단에 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다 (도 2 참조). 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 각각의 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 포함된 노브-홀 쌍은 하나 이상 존재할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "항원 결합 부위(antigen binding site)"는 면역글로불린 분자 내에서 항원(antigen) 또는 에피토프(epitope)가 결합하는 부위를 총칭하는 개념으로 해석되며, 상기 항원 결합 부위는 CDR(complementarity determining region)을 포함할 수 있다. CDR은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.

본 명세서에서, "항원 결합 부위"는 "중쇄 항원 결합 부위"와 "경쇄 항원 결합 부위"를 포함하며, 상기 "중쇄 항원 결합 부위"는 3개의 중쇄 CDR(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 "경쇄 항원 결합 부위"는 3개의 경쇄 CDR (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항원 결합 부위는, 하나 이상의 CDR를 포함하는 형태, 예컨대, 하나 이상의 CDR을 포함하는 Fab, scFab(single chain Fab) 또는 scFv 등의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

일 구체예에 따르면, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 각각 Fab, scFab(single chain Fab) 또는 scFv 형태의 항원 결합부위 및 Fc(fragment crystalline) 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 각각 경쇄 항원 결합 부위 및 중쇄 항원 결합 부위가 연결된 단일 가닥 항원 결합 부위 및 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 가닥 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 CDR을 제외한 나머지 부분은 모든 종류의 면역글로불린, 예컨대, IgG 타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등), IgA 타입, IgD 타입, IgE 타입 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 상기 단백질 복합체는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 서로 연결하는 제1 링커를 포함한다. 상기 제1 링커는 제1 폴리펩타이드의 C-말단과, 제2 폴리펩타이드의 제2 경쇄 항원 결합 부위의 N-말단 또는 제2 중쇄 항원 결합 부위의 N-말단을 연결하는 것일 수 있다. 또한, 상기 단백질 복합체는 제1 폴리펩타이드 내의 제1 경쇄 항원 결합 부위와 제1 중쇄 항원 결합 부위를 연결하는 제2 링커, 및 제2 폴리펩타이드 내의 제2 경쇄 항원 결합 부위와 제2 중쇄 결합 부위를 연결하는 제3 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커(제1, 제2, 제3)는 펩타이드 링커일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 복수의 아미노산으로 이루어진 링커일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 링커는 예를 들어, 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 펩타이드 링커(제1 링커)는 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이를 충분한 거리로 이격시킴으로써, 각각의 폴리펩타이드가 적절한 기능을 하기 위한 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩되기에 유리한 거리를 제공함과 동시에, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 일정 거리 이상 떨어지지 않도록 하여 이들간 결합 가능성을 높이고 원하지 않는 동형이량체 형성 가능성은 낮춤으로써, 원하는 구조의 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 결합된 이형이량체 형태의 단백질 복합체를 높은 효율로 얻을 수 있도록 하는 역할을 할 수 있다.

상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 융합 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위, 예컨대 Fc 부위에 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 이량체, 특히 바람직하게는 이형이량체를 형성하기 위해, 어느 하나의 폴리펩타이드의 Fc 영역에는 하나 이상의 노브(knob)를 형성하고, 다른 하나의 폴리펩타이드의 Fc 영역에는 하나 이상의 홀(hole)을 형성하여 상호 결합시켜 비대칭 구조의 이중특이 항체를 제조할 수 있다.

세포 내에서 일반적으로 항체가 형성되는 과정에서는 2개 중쇄의 Fc 영역이 상호 상보적인 형태로 결합되면서 이량체(dimer)를 형성하게 된다. 특히, 이중특이 항체를 제조하는 과정에 있어서는 상기와 같이 일반적인 항체 생성 방법에 의하면 동형이량체(homodimer)와 이형이량체(heterodimer)가 형성되는 확률이 유사하기 때문에 이중특이 항체의 형성률이 낮아질 수 있다.

따라서 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드에 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위, 바람직하게는 Fc 영역 중 CH3 도메인상의 아미노산 잔기에 앞서 언급한 바와 같은 Knob-into-hole 원리에 따른 변형을 가하여 이형이량체의 형성률을 높여서 이중특이 항체의 생성 효율을 향상시킬 수 있다.

따라서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 서로 인접한 위치에 존재할 때, 노브와 홀의 상호 결합을 통해 이량체를 형성하도록 할 수 있다. 상기 노브 및 홀은 제1 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드의 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 내의 염기 서열을 치환시킴으로써 도입할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본래의 CH3 도메인에 포함된 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열을 상술한 바와 같이 노브를 형성할 수 있는 돌출된 잔기를 갖는 아미노산인 Arg, Tyr, Phe, 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 코팅하는 염기서열, 또는 상기 홀을 형성할 수 있는 함몰된 잔기를 갖는 아미노산인 Ser, Ala, Thr, Val, 및 Gly으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 코딩하는 염기서열로 각각 치환하여 노브 및 홀을 형성한 후 상호 결합시킬 수 있다. 상기 노브 및 홀 결합은 상호 결합할 수 있는 아미노산 서열의 쌍이면 어떠한 아미노산의 조합도 가능하며, 이러한 아미노산에는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열의 쌍은 예를 들어, Arg/Ala, Phe/Ser, Tyr/Thr 또는 Trp/Val일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 상기 노브 및 홀이 위치하는 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위는 항체의 Fc 부분의 CH3 도메인일 수 있으며, 상기 CH3 도메인 내 상기와 같이 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브 및 홀을 포함함으로써, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 사이의 결합력을 높여, 이량체(dimer)의 형성률을 높이도록 한다.

일 구체예에 따르면, 상기 링커는 내부 및/또는 양 말단 중 적어도 하나의 말단에 태그를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 태그는 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단, 제2 폴리펩타이드의 N-말단 또는 이들 모두에 연결된 것일 수 있으며, 적어도 하나의 말단 또는 내부에 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 제2 폴리펩타이드의 N-말단에 결합하는 태그의 경우, 경쇄 항원 결합 부위의 N-말단 또는 중쇄 항원 결합 부위의 N-말단에 결합된 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "태그(tag)"는 상기 링커의 말단에 결합되어 있으며, 서로 다른 상기 폴리펩타이드 사이를 연결하기 위한 매개가 되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로, 일 구체예에 따르면, 상기 태그는 상기 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 태그는 생체 외적으로(in vitro) 또는 생체 내적으로(in vivo) 절단 가능한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 생체 외 또는 생체 내에서의 절단은 프로테아제에 의한 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질, TEV 절단 펩타이드(TEV cleavage peptide), 퓨린(furin) 절단 펩타이드 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

유비퀴틴(ubiquitin, Ub; Gene Accession No.: 751864)은 자연계에서 발견되는 가장 보존적인 단백질로 76개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 곤충, 송어 및 인간처럼 진화적으로 다양한 종들간의 완벽한 상동성을 보이는 수용성 단백질이다. 또한, 유비퀴틴은 pH의 변화에 대해 안정하고, 고온에서도 쉽게 변성되지 않으며, 프로테아제에 대해서도 안정성이 있는 단백질로 알려져 있다. 또한, 생체 체내에서 어떠한 독성이나 부작용을 나타내지 않는 매우 안전한 단백질이다. 따라서, 유비퀴틴은 상기 단백질 복합체의 불용성을 개선할 수 있으며, 생체외 또는 생체내에서 안전하고 용이하게 절단될 수 있다.

상기 유비퀴틴-유사 단백질은 유비퀴틴과 그 특성이 유사한 단백질로, 예를 들어, Nedd8(NP_006147.1, NM_006156.1), SUMO-1(NP_001005781.1, NM_001005781), SUMO-2(NP_008868.3, NM_006937.3), NUB1(NP_001230280.1, NM_001243351.1), PIC1(AAB40388), UBL3(NP_009037.1, NM_007106.3), UBL5(NP_001041706.1, NM_001048241.2), ISG15(NP_005092.1, NM_005101.3) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질(ubiquitin-like protein)은 야생형 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴-유사 단백질, 돌연변이 유비퀴틴 및 돌연변이 유비퀴틴-유사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 돌연변이 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 바꾼 것을 의미하며, 예를 들면, 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴 C-말단 RGG를 RGA로 변경시킨 유비퀴틴 등이 포함될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 돌연변이형 유비퀴틴에서, 상기 치환은 야생형 유비퀴틴의 6, 11, 27, 29, 33, 48 및 63번째에 존재하는 Lys 위치 중 어느 하나에 대해 독립적으로, 또는 조합을 통해 상기 7개 위치 중 둘 이상의 Lys에 대해 이루어질 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 생체외 또는 생체내에서의 절단을 위해 C-말단에 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 당 업계에 공지된 검색 데이터베이스를 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/peptidecutter_enzymes.html에서 검색되는 프로테아제 및 그의 절단 가능한 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 상기 절단 가능한 아미노산 서열이 포함되는 경우, 상기 단백질 복합체는 인 비트로 또는 인 비보에서 상기 단백질 복합체에 포함된 상기 태그가 절단됨으로써, 2 이상의 융합 단백질이 이중 또는 다중 특이적 항원 결합 부위를 갖는 단백질 복합체로써 그 기능을 할 수 있다.

본 발명에서 c-Met 단백질을 특이적으로 인식하거나 및/또는 여기에 특이적으로 결합하는 c-Met 단백질에 대한 항원 결합 부위는 항 c-Met 항체로부터 유래한 것일 수 있다.

"c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

상기 c-Met을 항원으로 인식하여 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 제공하는 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그 항원 결합 단편일 수 있다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

에피토프(epitope)는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 인접하는 (예컨대, 1차구조, 2차구조 또는 3차구조 상에서 인접하는) 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 인접하는(예컨대, 1차구조, 2차구조 또는 3차구조 상에서 인접하는) 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체의 항원 결합 부위(c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위)는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 항원 결합 부위;

서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노선 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 항원 결합 부위; 또는

상기 중쇄 항원 결합 부위 및 상기 경쇄 항원 결합 부위의 조합

을 포함하고,

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체의 항원 결합 부위는,

서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄 항원 결합 부위;

서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄 항원 결합 부위; 또는

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체의 항원 결합 부위는 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(중쇄 항원 결합 부위), 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(경쇄 항원 결합 부위), 또는 상기 중쇄 항원 결합 부위 및 상기 경쇄 항원 결합 부위의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체의 항원 결합 부위(scFv)는 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

한편, "상피세포성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor; EGFR)"는 EGFR (HER1), HER2, HER3 및 HER4으로 구성되어 있는 HER 패밀리의 수용체 티로신 키나아제(RTKs)의 일원이다. EGFR의 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합은 다른 ErbB 수용체와의 리셉터 호모- 또는 헤테로이량체화를 유도하며, 이는 특이적인 티로신 잔기의 세포내 자가인산화를 유발한다. EGFR 자가인산화는 세포 증식, 혈관신생 및 전이에 영향을 미치는 MAPK 및 PI3K/Akt 활성화를 포함한 다운스트림 신호전달 네트워크를 이끈다. EGFR 과발현, 유전자 증폭, 돌연변이, 또는 재배열은 여러 종류의 인간 악성 종양에서 빈번히 관찰되며, 암 치료의 불량한 예후 및 나쁜 임상적 결과와 관련 있다. 이러한 이유로, EGFR는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다. 상기 EGFR는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 단백질은 GenBank Accession Nos. JQ739160, JQ739161, JQ739162, JQ739163, JQ739164, JQ739165, JQ739166, JQ739167, NM_005228.3, NM_201284.1, NM_201282.1, NM_207655.2, NM_031507 또는 NM_201283.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 EGFR 항체의 항원 결합 부위는,

서열번호 109의 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 110의 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 111의 폴리펩타이드(CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄 항원 결합 부위;

서열번호 112의 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 113의 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 114의 폴리펩타이드(CDR-L1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄 항원 결합 부위; 또는

상기 중쇄 항원 결합 부위 및 경쇄 항원 결합 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

또한 일 구체예에 따르면, 상기 항 EGFR 항체의 항원 결합부위는 서열번호 115의 중쇄 가변 영역(중쇄 항원 결합 부위) 및 서열번호 116의 경쇄 가변 영역 (경쇄 항원 결합 부위) 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면 상기 폴리펩타이드는, 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 연결하는 제1 링커, 및 상기 제1 링커의 N-말단, C-말단 또는 양 말단에 위치하는 태그를 포함하는 것으로,

상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 중 하나는 상기한 항 c-Met 항체의 중쇄 가변 영역(중쇄 항원 결합 부위), 경쇄 가변 영역(경쇄 항원 결합 부위), 필요에 따라서 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 연결하는 링커(제2 링커 또는 제3 링커), 인간 항체의 힌지, 및 인간 항체의 Fc 영역를 포함하고,

다른 하나는 상기한 항 EGFR 항체의 중쇄 가변 영역(중쇄 항원 결합 부위), 경쇄 가변 영역(경쇄 항원 결합 부위), 필요에 따라서 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 연결하는 링커(제2 링커 또는 제3 링커), 인간 항체의 힌지, 및 인간 항체의 Fc 영역를 포함하며,

상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 N-말단을 연결하고 태그(상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 N-말단 중 어느 하나에 부착된 하나의 태그, 또는 양 말단에 부착된 2개의 태그(제1 태그 및 제2 태그))와 연결된 제1 링커를 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 단백질 복합체는 서열번호 133의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 19번째까지는 신호서열임) 또는 서열번호 133의 아미노산 서열 중 20번째부터 1058번째까지의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기한 조건을 충족하는 모든 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다 (도 8 참조.)

다른 예는 앞서 설명한 단백질 복합체를 포함하는 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 제공한다. 상기 이중특이 항체는 상기 단백질 복합체 자체 또는 상기 단백질 복합체의 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 이량체화되고, 및/또는 포함된 태그의 절단 부위가 절단되어 완전한 형태를 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 이중특이 항체는 상기 단백질 복합체가 하나의 태그를 포함하는 경우, 상기 태그의 절단 부위가 절단된 것일 수 있고, 상기 단백질 복합체가 제1 링커의 양 말단에 총 두 개의 태그 (제1 태그 및 제2 태그)를 포함하는 경우, 두 개의 태그의 절단부위가 절단되어 제1 링커 또는 제1 링커 말단에 제1 태그, 제2 태그 또는 제1 태그와 제2 태그가 연결된 형태가 제거된 것일 수 있다.

상기 이중특이 항체는 각 단량체에 서로 상이한 항원 결합 부위(c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위 또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위)를 가지므로, c-Met와 EGFR를 동시에 표적으로 인지할 수 있다. 따라서 c-Met의 과발현으로 인해 야기되는 EGFR 치료제에 대한 약제 저항성 문제를 효과적으로 해결할 수 있다.

또한 이처럼 이중 항체 형태로 제조함으로써 c-Met 단일 특이적인 항체에서 발생할 수 있는 agonism(p-AKT) 문제를 경감시킬 수 있는 효과가 있다(실시예 6 참고). AKT에 의해 조절되고 있는 세포작용들은 세포증식, 세포생존, 세포크기 조절, 가용 영양분에 대한 반응성, 중간 대사과정, 혈관신생(angiogenesis), 조직침해(tissue invasion) 등을 포함한다. 이 모든 과정들은 암의 특징을 대표하는 것으로 수많은 종양발생단백질(oncoprotein)과 종양발생 억제물질(tumor suppressor)은 AKT 경로 상에서 상호 교차적으로 영향을 미치며, 신호전달과 고전적인 대사조절의 연결점에서 세포의 작용을 미세하게 조절하는 기능을 수행한다. 따라서 이 AKT의 활성형인 인산화된 AKT의 정도가 높을 수록 암세포가 더욱 활성형인 것을 의미하며, 따라서 항체가 AKT의 인산화를 얼마나 저해할 수 있는지가 매우 중요하다.

일 구체예에 따르면, 상기 이중특이 항체는 마우스 유래 항체, 인간 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.

상기 이중특이 항체는 F(ab')2, (scFv)2, 디아바디(Diabody), Di-scFv, 나노바디(nanobody), 또는 IgG 타입 등일 수 있다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 알려진 기술을 당업자가 적절히 선택하여 용이하게 적용할 수 있다.

다른 예는 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 유효성분으로 포함하는 c-Met 및/또는 EGFR의 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 예에서, 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체의 치료적 유효량을 c-Met 및/또는 EGFR의 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, c-Met 및 EGFR의 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 c-Met 및/또는 EGFR의 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 포함하는 약학 조성물은 항체를 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.

한편, 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체는 c-Met 및 EGFR에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 c-Met 및 EGFR의 활성화 및/또는 과생성 여부를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 포함하는 c-Met 및 EGFR 활성화 및/또는 과생성 및/또는 c-Met 및 EGFR 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 처리하는 단계; 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계; 및 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 환자를 c-Met 및 EGFR 활성화 및/또는 과생성 증상이 존재하거나, c-Met 및 EGFR 활성화 및/또는 과생성 관련 질병을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 진단 방법을 제공한다. 상기 생물 시료는 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다

상기 약학 조성물의 투여 또는 진단 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.

상기 c-Met 및/또는 EGFR의 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병은 암, 암전이, 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염, 만성 염증, 등이 있다. 상기 암은 c-Met 및 EGFR을 과발현하는 것일 수 있고, 고형암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암, 두경부암, 뇌암, 인두암, 담도 암종, 담관암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다

다른 예는 앞서 설명한 단백질 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

용어 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.

또한, 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, 서열번호 134의 염기서열 (이 중에서 1번째부터 63번째까지는 kozac sequence 및 신호 서열 코딩 부위이고 3181부터 3183까지는 종료코돈임), 또는 서열번호 134의 64번째부터 3180번째까지의 염기서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 상기한 단백질 복합체를 코딩하는 모든 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또 다른 예는 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된(operatively linked) 발현 조절 인자 (예컨대, 프로모터 등)를 포함하는 재조합 벡터 (발현 벡터)를 제공한다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pL^λ프로모터, CMV promoter, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO, CHO-s, HEK293, HEK293f, DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

또 다른 예는 단백질 복합체를 생산하는 단계를 포함하는 이중특이 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 단백질 복합체를 생산하는 단계는, 예컨대, 상기 재조합 벡터를 발현시키거나 통상적인 방법으로 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 제1 링커를 통하여 화학적으로 연결시킴으로써 수행될 수 있다.

상기 이중특이 항체를 제조하는 방법은 생체내 또는 생체외에서 이루어질 수 있다.

상기 이중특이 항체가 생체내에서 제작되는 경우, 상기 재조합 벡터를 세포 내에서 발현시켜 단백질 복합체를 생산하게 되면, 상기 단백질 복합체는 세포 내에서 완전한 이중특이 항체의 형태로 세포 외부로 방출될 수 있다. 즉, 상기 단백질 복합체는 소포체(endoplasmic reticulum)에서 번역(translation)이 일어난 후, 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 링커를 통하여 서로 인접하여 위치하여 자발적으로 이량체를 형성하여 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 이후 상기 단백질 복합체는 세포 내에 존재하는 프로테아제에 의해 상기 태그에 존재하는 절단 가능한 아미노산 서열이 절단됨으로써, 완전한 형태의 이중특이 항체가 생성될 수 있다. 이때, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드에 존재하는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 하나 이상의 서로 상호 결합하는 아미노산 서열(노브 및 홀)로 인하여, 이중특이 항체의 형성률은 더욱 증가될 수 있다. 이후, 상기 생성된 이중특이 항체는 당업계에 잘 알려진 정제 방법에 따라 정제하여 사용할 수 있다.

상기 이중특이 항체가 생체외적으로 제작되는 경우, 상기 재조합 벡터를 세포 내에서 발현시키거나, 통상적인 방법으로 상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 상기 제1 링커를 통하여 화학적으로 연결시켜 상기 단백질 복합체를 생산하는 단계 이후, 상기 태그를 절단시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

생체외에서 상기 단백질 복합체는 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 링커로 연결된 상태로 존재하며, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 서로 인접하여 자발적으로 이량체를 형성할 수 있다. 이때, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드에 존재하는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 하나 이상의 서로 상호 결합하는 아미노산 서열(노브 및 홀)로 인하여, 이량체의 형성률은 더욱 증가될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 태그를 절단시키는 단계는 단백질 복합체의 태그에 포함된 절단 가능한 아미노산 서열을 인식하는 프로테아제를 첨가하여 절단시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질, TEV 절단 펩타이드 및 퓨린 절단 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 예를 들어, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질, TEV 절단 펩타이드 또는 퓨린 절단 펩타이드를 절단할 수 있는 프로테아제를 상기 단백질 복합체에 첨가함으로써, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질, TEV 절단 펩타이드 또는 퓨린 절단 펩타이드는 프로테아제에 의해 절단되어 분리되므로, 상기 단백질 복합체로부터 이중특이 항체를 생성할 수 있게 된다.

이와 같은 태그를 절단시키는 단계는 이량체 형성 전 또는 후에 수행할 수 있다.

일 구체예에 따른 단백질 복합체를 이용하면, 2개의 항원 또는 2 개의 에피토프를 동시에 표적으로 하는 이중특이 항체 시스템을 효과적으로 구축할 수 있으므로, 이중 항체 작용에 의한 상승 효과로 인하여 항체 치료게 개발에 보다 유리하게 적용될 수 있으며, 한가지 치료제에 대한 내성을 보일 수 있는 암세포에 대해 효과적인 치료 방법이 될 수 있다. 특히 AKT 인산화를 효과적으로 억제할 수 있어, 암세포의 성장 및 혈관 형성의 억제 효과가 우수하고 높은 안정성 또한 달성할 수 있어 매우 유용하게 적용될 수 있다.

도 1 내지 도 3은 일 예에 따른 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 복합체 및 이중특이 항체가 제조되는 방법을 모식적으로 보여주는 개략도로서,
도 1은 단일가닥 폴리펩타이드 프로세싱을 통한 항 c-Met/항 EGFR 이중특이 항체의 제조를 예시한 것이고,
도 2는 단일가닥 폴리펩타이드, 제1 태그, 제2 태그 및 노브(knob)-홀(hole)을 이용한 이중특이 항체의 제조를 예시한 것이고,
도 3은 단일가닥 폴리펩타이드, 태그, 및 노브(knob)-홀(hole)을 이용한 이중특이 항체의 제조를 예시한 것이다.
도 4는 일 예에 따른 단일가닥의 항체 전구단백질의 절단(cleavage)에 의하여 만들어진 이중특이 항체의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 일 예에 따른 단일가닥 항체 전구 단백질의 절단에 의하여 만들어진 이중특이 항체의 전기영동 사진 및 SEC profile을 나타낸 것이다.
도 6a는 일 예에 따른 이중특이 항체의 이중특이적 항원-항체 반응의 결합 친화도를 Surface Plasmon Resonance (SPR) 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 일 예에 따른 이중특이 항체(MxE)의 EGFR 및 c-Met에 대한 결합 친화도를 Monovalent 항체(MxM 또는 ExE)와 비교한 결과를 나타낸 것이다(M: c-Met, E: EGFR).
도 7a는 일 예에 따른 이중특이 항체의 c-Met degradation level을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 일 예에 따른 이중특이 항체의 Akt phosphorylation(agonism)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 일 예에 따른 단일가닥 항체 전구 단백질의 전체 서열을 보여준다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

도 1 내지 도 3은 일 구체예에 따른 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩타이드로 이루어진 단백질 복합체의 개략도이다.

도 1은 제1 항원 결합 부위 (붉은색: 제1 경쇄 항원 결합 부위와 제1 중쇄 항원 결합 부위를 포함; 예컨대 c-Met 결합 부위)를 포함하는 제1 폴리펩타이드와 제2 항원 결합 부위 (파란색: 제2 경쇄 항원 결합 부위와 제2 중쇄 항원 결합 부위를 포함; 예컨대 EGFR 결합 부위)를 포함하는 제2 폴리펩타이드, 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단에 결합된 태그(노란색), 및 상기 태그의 C-말단과 상기 제2 폴리펩타이드의 N-말단을 연결하는 링커를 포함하는 단백질 복합체 (왼쪽 및 오른쪽), 및 태그의 절단 가능한 부위가 절단된 완전한 형태의 이중특이 항체 (오른쪽)를 예시적으로 보여준다.

도 2에 예시된 바와 같이, 제1 항원 결합 부위(101 및 102)를 포함하는 제1 폴리펩타이드(100) 및 제2 항원 결합 부위(201 및 202)를 포함하는 제2 폴리펩타이드 (200)는 각각 그 말단에 제1 태그(302) 및 제2 태그(303)가 연결되어 있으며, 폴리펩타이드로 이루어진 링커(300)의 말단에 상기 제1 태그(302) 및 제2 태그(303)가 연결되어 있다. 상기 제1 태그(302) 및 제2 태그(303)는 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질과 같은 단백질로 이루어져 있으므로, 인 비트로 또는 인 비보로 절단이 가능하다. 인 비트로 또는 인 비보 상에서 상기 제1 항원 결합 부위(101 및 102)를 포함하는 제1 폴리펩타이드(100) 및 제2 항원 결합 부위(201 및 202)를 포함하는 제2 폴리펩타이드(200)는 서로 인접하여 완전한 자발적 결합을 통해서 결합되며, 이때, 제1 폴리펩타이드(100)에서 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 서열이 형성하는 노브(knob)(400) 및 제2 폴리펩타이드(200)에서 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 서열이 형성하는 홀(hole)(500)은 상호 결합하므로, 서로 다른 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 단백질 복합체를 형성률을 더욱 높일 수 있다.

도 3은 도 2에 개시된 일 구체예에 따른 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩타이드로 이루어진 단백질 복합체에서 제2 태그(303)가 없는 형태의 예를 나타낸다. 상기 설명한 바와 같이, 단백질 복합체의 인 비트로 또는 인 비보로 절단을 통해, 서로 다른 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 단백질 복합체를 형성하게 되며, 다만, 도 3에서 개시된 단백질 복합체는 제2 태그(303)이 없기 때문에, 제2 항원 결합 부위(201 및 202)를 포함하는 제2 폴리펩타이드(200)의 제2 경쇄 항원 결합 부위(201) 또는 제2 중쇄 항원 결합 부위(202)의 N-말단에 링커(300)가 결합된 형태로 존재하지만, 상기 링커(300)는 2 내지 50개의 짧은 아미노산 서열을 포함하므로, 상기 제2 항원 결합 부위(201 및 202)를 포함하는 제2 폴리펩타이드(200)의 기능에 영향을 미치지 않게 된다.

실시예 1: 2 종류의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 단백질 복합체의 발현 벡터의 제조

c-Met 및 EGFR에 대해 각각 특이적인 결합 부위를 포함하는 이중특이항체의 전구 단백질 복합체를 제조하기 위해, 상기 단백질 복합체의 발현 벡터를 Genotech에 의뢰하여 제조하였으며, 단백질 과발현을 위한 동물세포 발현벡터는 pCEP4 (Invitrogen)를 사용하였다.

구체적으로, 도 4에 개시된 바와 같이,

분비 신호 서열(signal sequence, ss)(서열번호 117; 코딩 염기 서열: 118), 간세포성장인자 수용체(c-Met) 결합 부위인 anti-c-Met 부위(서열번호 119: 코딩 염기 서열: 120) 및 힌지(hinge)를 포함하며, 노브(knob)를 형성하는 아미노산 서열이 포함된 Fc 도메인(서열번호 121 (knob: 151번째 아미노산 (Y)); 코딩 염기서열: 122 (knob 코딩 서열: 451번째부터 453번째까지의 염기서열)으로 구성된 단일 사슬 폴리펩타이드; 및

적어도 하나의 유비퀴틴 태그(서열번호 123; 코딩 염기서열: 124); 링커('GS' 아미노산 서열 포함: 서열번호 125; 코딩 염기서열: 126); 및 상피 성장인자 수용체(EGFR/ErbB) 결합부위인 anti-EGFR 부위(서열번호 127: 코딩 염기 서열: 128)를 포함하며, 홀(hole)을 형성하는 아미노산 서열이 포함된 Fc 도메인(서열번호 129 (hole: 192번째 아미노산 (T)); 코딩 염기서열: 130 (hole 코딩 서열: 574번째부터 576번째까지의 염기서열)으로 구성된 단일 사슬 폴리펩타이드

로 구성된 단백질 복합체의 아미노산 서열(서열번호 133)을 암호화하는 단일 서열 DNA (서열번호 134)를 합성하였다.

상기 단일서열 DNA 절편의 5' 말단에 HindIII로 절단될 수 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 131)을, 3' 말단에 XhoI으로 절단될 수 있는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 132)을 삽입하여, pCEP4 벡터의 HindIII-Xho1 절단 서열에 삽입될 수 있도록 하였다.

또한, 상기 단백질 복합체를 통해 유도되는 이중특이항체와 각각의 단일 사슬 폴리펩타이드에 의해 생성되는 이중특이항체의 비교 실험을 위해 하기와 같이 DNA 2종을 합성하였다.

분비 신호 서열, 간세포 성장인자 수용체(c-Met) 결합 부위인 anti-c-Met 및 힌지(hinge)를 포함하는 Fc 도메인으로 구성된 단일 사슬 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 해당하는 DNA 서열(서열 번호 135)을 합성하여 HindIII-XhoI의 절단 서열을 통해 pCEP4 벡터에 삽입하였다.

또한, 분비 신호 서열, 상피 성장인자 수용체(EGFR) 결합 부위인 E2를 포함하며 Fc 도메인로 구성된 단일 사슬 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 해당하는 DNA 서열(서열 번호 136)을 합성하여 HindIII-XhoI의 절단 서열을 통해 pCEP4 벡터에 삽입하였다.

실시예 2: 단백질 복합체의 발현 및 이중특이 항체의 정제

상기 실시예 1에서 제조한 벡터를 이용하여 단백질 복합체를 과발현시키기 위해, 상기 벡터로 형질 전환된 Human embryonic kidney cell (HEK293-F, Invitrogen)를 이용하였다. HEK293-F 세포는 130 rpm의 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 내 37 ℃, 8 % CO₂ 조건에서 유지하였다.

형질 전환을 위해 먼저 원심 분리를 통해 세포를 배지와 분리시키고 1 x 10⁶/mL 농도의 세포를 다시 Freestyle 293 Expression media (Invitrogen)에 부유시킨 뒤, FreeStyle^TM MAX reagent (Invitrogen)를 이용, 상기 벡터 100 ㎍을 사용하여 위 HEK293-F 세포를 형질 전환하였다. 형질 전환 후 7~8일 뒤에 원심 분리 (4000 x g, 10 min, 4 ℃)를 통해 단백질 복합체가 포함되어 있는 세포 배양액을 수집하고, 배양액 속의 세포 잔해를 제거하기 위해 포어 사이즈 0.22 micron의 필터를 이용해 여과하였다. 이렇게 얻어진 상등액(여과액)을 이중특이 항체의 정제에 사용하였다.

이중특이 항체는 Protein A affinity column (GE Healthcare)을 이용하여 분리하였다. 먼저, Protein A affinity column을 1X PBS (Invitrogen) 용액으로 평형화 시키고, 상기 상등액을 상기 용액으로 평형화된 Protein A affinity column에 적용시킨 다음, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액(1X PBS)으로 세척하고, 10 % 글리세롤을 포함하는 용출 완충액(IgG elution buffer, Thermo Scientific)으로 상기 이중특이 항체를 용출하였다. 용출된 용액은 1 M Tris-HCl (pH 9.0) 용액으로 즉시 중화시켰다. 상기 용출된 용액을 1x PBS로 평형화되어 있는 HiLoad 16/60 Superdex 200 column(GE Healthcare)에 loading하여 size exclusion chromatography를 수행하였다.

정제된 단백질 농도는 Herceptin 항체를 표준 물질로 사용하여 측정하였다. 이후, 상기 농축한 이중특이 항체를 SDS-PAGE를 통해 최종 확인하였다. 젤에 로딩하기 전에, 상기 이중특이 항체를 둘로 나누어, 한쪽은 1 mM의 β-머캅토에탄올을 처리(환원 조건: R)하였고, 다른 한쪽은 β-머캅토에탄올을 처리하지 않은 상태(비환원 조건: NR)로 로딩하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, R/NR 조건에서의 비교를 통해 항체 고유의 성격인 이황화 결합의 생성을 확인하였으며, 호모이량체(homodimeric)의 항체가 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 단백질 복합체로부터 제작된 이중특이 항체의 이중특이적 항원-항체 반응 확인

실시예 2에서 제조한 이중특이 항체의 이중특이적 항원-항체 반응의 결합 친화도 (binding affinity)를 측정하기 위해, BiacoreT100 instrument (GE healthcare)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon resonance; SPR) 실험을 통해 c-Met 및 EGFR 에 대한 항체의 결합력을 검증하였다. 런닝(running) 완충액 및 희석 완충액으로는 1X HBS-EP (GE healthcare)를 사용하였다.

인간 c-Met(Sino Biologicals)를 표준 아민-커플링(standard amine-coupling) 반응을 이용하여 CM5 칩 (GE healthcare)의 표면에 약 2000 RU (response unit)로 고정하였다. 실시예 2에서 제조된 이중특이 항체를 10 μL/min의 속도로 1분간 흘려주어 결합을 확인한 후, 인간 EGFR 세포외 도메인(human EGFR extracellular domain, Prospec)을 10 μL/min의 유속으로 1분 동안 흘려주었다. 각각의 결합 싸이클이 끝난 후, 재생 용액인 Glycine-HCl pH 2.0 (GE healthcare)를 1분 동안 10 μL/min의 속도로 흘려주어 결합된 항원 및 항체를 칩으로부터 제거하고 표면을 재생시켰다. 상기 분석 결과, 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체는 인간 c-Met과 인간 EGFR에 대한 결합력을 동시에 갖는 것으로 확인되었다(도 6a).

또한 이로부터 생성된 센소그램(sensorgram)은 1:1 Langmuir binding model을 사용하여 BIA evaluation software에서 fitting을 수행하고 그 결과를 도 6b에 나타내었다. 도 6b에 나타난 바와 같이 Monovalent 항체 (MxM 또는 ExE)와 비교하여 볼 때, Kd value가 유지되는 것으로 나타나 Bivalent 항체인 MxE의 각각 EGFR과 c-Met에 대한 결합력에 큰 차이가 없음을 확인하였다.

실시예 4: 단백질 복합체로부터 제작된 이중특이 항체의 c- Met degradation ELISA ( MKN45 ): efficacy 확인

상대적인 총 c-Met량은 항체가 c-Met에 결합하여 내재화를 일으켜 c-Met의 분해(degradation)가 일어나는 것을 이용하여 총 c-Met양의 증감을 파악하여 항체의 효능을 검사하는 것이다. C-Met과 HGF의 결합이 암세포의 성장을 촉진시키는 것은 이미 알려져 있으며 따라서 총 c-Met양이 감소하면 암세포의 성장도 저하되는 데서 착안한 것이다. R&D systems사의 human total HGF R/c-Met ELISA kit을 사용하였으며 MKN45 위암 세포주(ATCC)에서 실험하였다. DMEM 배지(GIBCO)에서 2x10⁵cells/mL의 세포를 5 mg/mL의 항 c-Met 항체와 섞어 37℃, 5% CO₂ incubator에서 culture한 후 24hr이후에 ELISA실험을 진행하였다.

최종적으로 Super Aquablue (eBiosciences)를 사용하여 반응시켰으며 colorimetric signals은 450nm 파장에서의 OD값으로 측정하였다. 항 c-Met 항체를 처리하지 않은 비교군(media 처리군)의 값을 100%로 환산하여 항 c-Met 항체를 처리한 후의 값을 계산하여 그 결과를 그래프로 나타냈다(도 7a). 도 7a에 나타난 바와 같이 정량적 ELISA 방법으로 측정한 결과, 실시예 2의 이중특이항체(MxE)는 단일 항체(MxM)과 c-Met degradation 정도가 비슷한 것을 알 수 있다.

실시예 6: 단백질 복합체로부터 제작된 이중특이 항체의 Akt phosphorylation ( Caki ): agonism 확인

치료용 항체에 있어 안전성과 효능을 메커니즘 기반 실험으로 검증하였다. 즉, 이중특이 항체가 c-Met과 결합함으로써 발생할 수 있는 agonism을 정량적 ELISA 방법에 의해 AKT라는 키나아제의 인산화 정도 측정을 통해 알아보았다. AKT의 인산화 되는 자리는 Ser 473이며 Cell signaling사의 PathScan phospho-AKT1 (Ser473) chemiluminescent Sandwich ELISA kit을 사용하였다.

하루 전날 2x10⁵　cells/ml로 culture한 Caki-1 신장암 세포주(ATCC

HTB-46)에 Serum이 없는 DMEM media (Gibco) 에 5ug/ml의 항체를 섞어 30분간 처리한 후 ELISA kit을 사용하여 실험하였다. 결과는 Perkins Elmer사 기계(2104 Envision

Multilabel Reader)로 측정하여 얻었다. AKT의 인산화 정도를 계산할 때는 5D5에 의한 인산화를 100%로 잡았으며 그 값과 비교하여 다른 항 c-Met항체의 인산화 유도 정도를 표시하였다.

AKT에 의해 조절되고 있는 세포작용들은 세포증식, 세포생존, 세포크기 조절, 가용 영양분에 대한 반응성, 중간 대사과정, 혈관신생(angiogenesis), 조직침해(tissue invasion) 등을 포함한다. 이 모든 과정들은 암의 특징을 대표하는 것으로 수많은 종양발생단백질(oncoprotein)과 종양발생 억제물질(tumor suppressor)은 AKT 경로 상에서 상호 교차적으로 영향을 미치며, 신호전달과 고전적인 대사조절의 연결점에서 세포의 작용을 미세하게 조절하는 기능을 수행한다. 따라서 이 AKT의 활성형인 인산화된 AKT의 정도가 높을 수록 암세포가 더욱 활성형인 것으로 우리는 항체가 AKT의 인산화를 얼마나 저해할 수 있는지를 살펴보았다. 그 결과 도 7b에 나타난 바와 같이 실시예 2의 이중특이항체(MxE)는　단일 항체(MxM)보다 AKT 인산화를 높게 저해하는 것을 확인할 수　있었다.

100: 제1 폴리펩타이드
101: 제1 경쇄 항원 결합 부위
102: 제1 중쇄 항원 결합 부위
200: 제2 폴리펩타이드
201: 제2 경쇄 항원 결합 부위
202: 제2 중쇄 항원 결합 부위
300: 제1 링커
301: 태그
302: 제1 태그
303: 제2 태그
400: 노브(knob)
500: 홀(hole)

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Protein complex, Bispecific Anti-C-Met/EGFR antibody comprising the protein complex, and method of preparation thereof <130> DPP20126075KR <160> 136 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is 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<222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 39 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 40 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H1-heavy <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 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ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 48 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-heavy <400> 48 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcact gactactaca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gttgggcttt attagaaaca aagctaacgg ttacaccaca 180 gaatacagtg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagataattc aaagaactca 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggtcaagga accctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 49 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-heavy <400> 49 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gattactaca tgagctgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcgtttc actataagca gagataattc caaaaacaca 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 50 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H1-light <400> 50 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggcaccagc agaaaccagg acagcctcct aagatgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc 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cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 52 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-light <400> 52 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag 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Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-2 clone <400> 59 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgggcagtc ctacagccgt ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 60 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-3 clone <400> 60 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 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gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser 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acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 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of light chain of antibody L3-11Y <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 109 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-1H, anti-EGFR <400> 109 Asp Tyr Lys Ile His 1 5 <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-2H, anti-EGFR <400> 110 Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-3H, anti-EGFR <400> 111 Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-1L, anti-EGFR <400> 112 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-2L, anti-EGFR <400> 113 Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-3L, anti-EGFR <400> 114 Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 1 5 <210> 115 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain variable domain, anti-EGFR <400> 115 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 116 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain variable domain, anti-EGFR <400> 116 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 117 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of signal peptide <400> 117 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 118 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide coding sequence, wherein "gccacc" from 1st to 6th positions is kozac sequenc <400> 118 gccaccatgg gatggtcatg tatcatcctt tttctagtag caactgcaac tggagtacat 60 tca 63 <210> 119 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-c-MET region (antigen-binding region) <400> 119 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met 130 135 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 145 150 155 160 Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn 165 170 175 Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Met 180 185 190 Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 210 215 220 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Arg 225 230 235 240 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 245 250 <210> 120 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-cMET region coding sequence <400> 120 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gattactaca tgagctgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcgtttc actataagca gagataattc caaaaacaca 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc gggcctgggc 360 ggcctgggcg gaggaggctc tggaggcggc ggaagcggcg gcagcagcgg cgtgggcagc 420 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 480 atcacctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 540 tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg aaaatgctga ttatttgggc atccactagg 600 gtatctggag tcccttctcg cttctctggg tccgggtctg ggacggattt cactctgacc 660 atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca acttattact gtcagcagtc ctacagccgc 720 ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gt 762 <210> 121 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of Fc region with knob, wherein 151th amino acid "Y" is knob <400> 121 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 122 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding Fc region linked to anti-c-Met region, wherein codon(TAC) from 451th to 453th positions encodes the knob, 'Y'. <400> 122 gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg 60 ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 120 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg cgaggagcag 240 tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 360 atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 420 gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg tactgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540 cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 600 cgctggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660 tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggcaag 696 <210> 123 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of ubiquitin <400> 123 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 65 70 75 <210> 124 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubiquitin coding sequence <400> 124 atgcagatct tcgtgaagac cctgaccggc aagaccatca ccctggaggt ggagcccagc 60 gacaccatcg agaacgtgaa ggccaagatc caggacaagg agggcatccc ccccgaccag 120 cagcgcctga tcttcgccgg caagcagctg gaggacggcc gcaccctgag cgactacaac 180 atccagaagg agagcaccct gcacctggtg ctgcgcctgc gcggcggc 228 <210> 125 <211> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <400> 125 gs 2 <210> 126 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker coding sequence <400> 126 ggatcc 6 <210> 127 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EGFR region (antigen-binding region) <400> 127 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Gln His Asn Ser Phe Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys Arg Thr <210> 128 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EGFR region coding sequence <400> 128 caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggctt caccttcacc gactacaaga tccactgggt gcgccaggcc 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggctac ttcaacccca acagcggcta cagcacctac 180 gcccagaagt tccagggccg cgtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcctgagc 300 cccggcggct actacgtgat ggacgcctgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgagcagc 360 ggaggcggag gcagcagcgg cggaggcagc ggaggcggcg gaagcgacat ccagatgacc 420 cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg ggcgaccgcg tgaccatcac ctgccgcgcc 480 agccagggca tcaacaacta cctgaactgg taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag 540 cgcctgatct acaacaccaa caacctgcag accggcgtgc ccagccgctt cagcggcagc 600 ggcagcggca ccgagttcac cctgaccatc agcagcctgc agcccgagga cttcgccacc 660 tactactgcc tgcagcacaa cagcttcccc accttcggcc agggcaccaa gctggagatc 720 aagcgcacc 729 <210> 129 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Fc region with hole, wherein the 192th amino acid, "T", is hole <400> 129 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 130 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding Fc region linked to anti-EGFR region, wherein codon(ACC) from 574th to 576th positions encodes the hole, 'T'. <400> 130 gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg 60 ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 120 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg cgaggagcag 240 tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 360 atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 420 gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540 cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgaccagca agctgaccgt ggacaagagc 600 cgctggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660 tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggcaag 696 <210> 131 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind III site <400> 131 aagctt 6 <210> 132 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XhoI site <400> 132 ctcgag 6 <210> 133 <211> 1058 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a protein complex (bispecific antibody) including anti-c-Met polypeptide and anti-EGFR polypeptide, wherein the sequence from 1st to 19th positions is a signal peptide <400> 133 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 165 170 175 Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly 180 185 190 Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 195 200 205 Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val Pro 210 215 220 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 225 230 235 240 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 245 250 255 Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 265 270 Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 275 280 285 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 290 295 300 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 305 310 315 320 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 325 330 335 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 340 345 350 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 355 360 365 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 370 375 380 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 385 390 395 400 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 405 410 415 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 420 425 430 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 435 440 445 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 450 455 460 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 465 470 475 480 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 485 490 495 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Met Gln Ile Phe Val Lys Thr 500 505 510 Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile 515 520 525 Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp 530 535 540 Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr 545 550 555 560 Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu 565 570 575 Arg Leu Arg Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 580 585 590 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 595 600 605 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 610 615 620 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr 625 630 635 640 Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 645 650 655 Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 660 665 670 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr 675 680 685 Val Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly 690 695 700 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 705 710 715 720 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 725 730 735 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 740 745 750 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asn 755 760 765 Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 770 775 780 Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 785 790 795 800 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr Phe Gly 805 810 815 Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp 820 825 830 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 835 840 845 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 850 855 860 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 865 870 875 880 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 885 890 895 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 900 905 910 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 915 920 925 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 930 935 940 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 945 950 955 960 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 965 970 975 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 980 985 990 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 995 1000 1005 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp 1010 1015 1020 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 1025 1030 1035 1040 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 1045 1050 1055 Gly Lys <210> 134 <211> 3183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protein complex(bispecific antibody) coding sequence, wherein the sequence from 1st to 63th includes a kozac sequence (gccacc) and a signal peptide coding sequence <400> 134 gccaccatgg gatggtcatg tatcatcctt tttctagtag caactgcaac tggagtacat 60 tcagaggttc agctggtgga gtctggcggt ggcctggtgc agccaggggg ctcactccgt 120 ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccttc actgattact acatgagctg ggtgcgtcag 180 gccccgggta agggcctgga atggttgggt tttattagaa acaaagctaa tggttacaca 240 acagagtaca gtgcatctgt gaagggtcgt ttcactataa gcagagataa ttccaaaaac 300 acactgtacc tgcagatgaa cagcctgcgt gctgaggaca ctgccgtcta ttattgtgct 360 agagataact ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc ctcgggcctg 420 ggcggcctgg gcggaggagg ctctggaggc ggcggaagcg gcggcagcag cggcgtgggc 480 agcgatatcc agatgaccca gtccccgagc tccctgtccg cctctgtggg cgatagggtc 540 accatcacct gcaagtccag tcagagtctt ttagctagtg gcaaccaaaa taactacttg 600 gcctggcacc aacagaaacc aggaaaagct ccgaaaatgc tgattatttg ggcatccact 660 agggtatctg gagtcccttc tcgcttctct gggtccgggt ctgggacgga tttcactctg 720 accatcagca gtctgcagcc ggaagacttc gcaacttatt actgtcagca gtcctacagc 780 cgcccgtaca cgttcggaca gggtaccaag gtggagatca aacgtgagcc caagagctgc 840 gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 900 ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccgcacccc cgaggtgacc 960 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 1020 ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg agcagtacaa cagcacctac 1080 cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 1140 tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 1200 ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gccgcgagga gatgaccaag 1260 aaccaggtga gcctgtactg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1320 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 1380 gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagccgctg gcagcagggc 1440 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 1500 ctgagcctga gccccggcaa gatgcagatc ttcgtgaaga ccctgaccgg caagaccatc 1560 accctggagg tggagcccag cgacaccatc gagaacgtga aggccaagat ccaggacaag 1620 gagggcatcc cccccgacca gcagcgcctg atcttcgccg gcaagcagct ggaggacggc 1680 cgcaccctga gcgactacaa catccagaag gagagcaccc tgcacctggt gctgcgcctg 1740 cgcggcggcg gatcccaggt gcagctggtg cagagcggcg ccgaggtgaa gaagcccggc 1800 agcagcgtga aggtgagctg caaggccagc ggcttcacct tcaccgacta caagatccac 1860 tgggtgcgcc aggcccccgg ccagggcctg gagtggatgg gctacttcaa ccccaacagc 1920 ggctacagca cctacgccca gaagttccag ggccgcgtga ccatcaccgc cgacaagagc 1980 accagcaccg cctacatgga gctgagcagc ctgcgcagcg aggacaccgc cgtgtactac 2040 tgcgcccgcc tgagccccgg cggctactac gtgatggacg cctggggcca gggcaccacc 2100 gtgaccgtga gcagcggagg cggaggcagc agcggcggag gcagcggagg cggcggaagc 2160 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 2220 atcacctgcc gcgccagcca gggcatcaac aactacctga actggtacca gcagaagccc 2280 ggcaaggccc ccaagcgcct gatctacaac accaacaacc tgcagaccgg cgtgcccagc 2340 cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 2400 gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag cacaacagct tccccacctt cggccagggc 2460 accaagctgg agatcaagcg caccgagccc aagagctgcg acaagaccca cacctgcccc 2520 ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc 2580 aaggacaccc tgatgatcag ccgcaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc 2640 cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 2700 aagaccaagc cccgcgagga gcagtacaac agcacctacc gcgtggtgag cgtgctgacc 2760 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc 2820 ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc aaggccaagg gccagccccg cgagccccag 2880 gtgtacaccc tgccccccag ccgcgaggag atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc 2940 ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc 3000 gagaacaact acaagaccac cccccccgtg ctggacagcg acggcagctt cttcctgacc 3060 agcaagctga ccgtggacaa gagccgctgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg 3120 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 3180 tga 3183 <210> 135 <211> 1536 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding anti-c-Met control antibody <400> 135 aagcttgcca ccatgggatg gtcatgtatc atcctttttc tagtagcaac tgcaactgga 60 gtacattcag aggttcagct ggtggagtct ggcggtggcc tggtgcagcc agggggctca 120 ctccgtttgt cctgtgcagc ttctggcttc accttcactg attactacat gagctgggtg 180 cgtcaggccc cgggtaaggg cctggaatgg ttgggtttta ttagaaacaa agctaatggt 240 tacacaacag agtacagtgc atctgtgaag ggtcgtttca ctataagcag agataattcc 300 aaaaacacac tgtacctgca gatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc cgtctattat 360 tgtgctagag ataactggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac cgtctcctcg 420 ggcctgggcg gcctgggcgg aggaggctct ggaggcggcg gaagcggcgg cagcagcggc 480 gtgggcagcg atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 540 agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag ctagtggcaa ccaaaataac 600 tacttggcct ggcaccaaca gaaaccagga aaagctccga aaatgctgat tatttgggca 660 tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctgggt ccgggtctgg gacggatttc 720 actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa cttattactg tcagcagtcc 780 tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg agatcaaacg tgagcccaag 840 agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 900 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg cacccccgag 960 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 1020 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gcgaggagca gtacaacagc 1080 acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1140 tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1200 gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccccagccg cgaggagatg 1260 accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1320 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1380 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag ccgctggcag 1440 cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1500 aagagcctga gcctgagccc cggcaagtga ctcgag 1536 <210> 136 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding anti-EGFR control antibody <400> 136 aagcttgcca ccatgggatg gtcatgtatc atcctttttc tagtagcaac tgcaactgga 60 gtacattcac aggtgcagct ggtgcagagc ggcgccgagg tgaagaagcc cggcagcagc 120 gtgaaggtga gctgcaaggc cagcggcttc accttcaccg actacaagat ccactgggtg 180 cgccaggccc ccggccaggg cctggagtgg atgggctact tcaaccccaa cagcggctac 240 agcacctacg cccagaagtt ccagggccgc gtgaccatca ccgccgacaa gagcaccagc 300 accgcctaca tggagctgag cagcctgcgc agcgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 360 cgcctgagcc ccggcggcta ctacgtgatg gacgcctggg gccagggcac caccgtgacc 420 gtgagcagcg gaggcggagg cagcagcggc ggaggcagcg gaggcggcgg aagcgacatc 480 cagatgaccc agagccccag cagcctgagc gccagcgtgg gcgaccgcgt gaccatcacc 540 tgccgcgcca gccagggcat caacaactac ctgaactggt accagcagaa gcccggcaag 600 gcccccaagc gcctgatcta caacaccaac aacctgcaga ccggcgtgcc cagccgcttc 660 agcggcagcg gcagcggcac cgagttcacc ctgaccatca gcagcctgca gcccgaggac 720 ttcgccacct actactgcct gcagcacaac agcttcccca ccttcggcca gggcaccaag 780 ctggagatca agcgcaccga gcccaagagc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc 840 cccgcccccg agctgctggg cggccccagc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 900 accctgatga tcagccgcac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag 960 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 1020 aagccccgcg aggagcagta caacagcacc taccgcgtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 1080 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccc 1140 gcccccatcg agaagaccat cagcaaggcc aagggccagc cccgcgagcc ccaggtgtac 1200 accctgcccc ccagccgcga ggagatgacc aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg 1260 aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac 1320 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag 1380 ctgaccgtgg acaagagccg ctggcagcag ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1440 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgagcc tgagccccgg caagtgactc 1500 gag 1503

Claims

제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
상기 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 연결하는 제1 링커
를 포함하고,
상기 제1 항원 결합 부위는 제1 경쇄 항원 결합 부위와 제1 중쇄 항원 결합 부위가 연결된 단일가닥 폴리펩타이드이며,
상기 제2 항원 결합 부위는 제2 경쇄 항원 결합 부위와 제2 중쇄 항원 결합 부위가 연결된 단일가닥 폴리펩타이드이고,
상기 제1 항원 결합 부위와 제2 항원 결합 부위 중 하나는 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고, 나머지 하나는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이며,
상기 제1 링커는 상기 제1 폴리펩타이드의 C-말단 및 상기 제2 폴리펩타이드의 N-말단을 연결하는 것으로서, 절단 가능한 아미노산 서열을 갖는 태그가 하나의 말단 쪽 또는 양 말단 쪽에 연결된 것인,
단백질 복합체.
제1항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에, 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 하나 이상의 홀(hole)을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 단백질 복합체.
제2항에 있어서, 상기 노브는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 어느 하나의 폴리펩타이드의 CH3 도메인에 형성되고, 상기 홀은 다른 하나의 폴리펩타이드의 CH3 도메인에 형성되는 것인, 단백질 복합체.
제2항에 있어서,
상기 노브는 주변 아미노산 서열에 포함된 아미노산 잔기보다 돌출된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 형성되는 것으로, 상기 돌출된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 Arg, Phe, Tyr, 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이며,
상기 홀은 주변 아미노산 서열에 포함된 아미노산 잔기보다 함몰된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 형성되는 것으로, 상기 함몰된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 Ala, Ser, Thr, Gry, 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인,
단백질 복합체.
제1항에 있어서, 상기 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 인접하는 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항 c-Met 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인,
단백질 복합체.
제5항에 있어서,
상기 항 c-Met 항체는 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체인,
단백질 복합체.
제5항에 있어서, 상기 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 항원 결합 부위; 및
서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 항원 결합 부위
를 포함하는 것인, 단백질 복합체.
제7항에 있어서,
상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이며,
상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이며,
상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이고,
상기 CDR-L3는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인,
단백질 복합체.
제5항에 있어서, 상기 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는,
서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 항원 결합 부위; 및
서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 항원 결합 부위를 포함하는 것인,
단백질 복합체.
제1항에 있어서, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는,
서열번호 109의 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 110의 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 111의 폴리펩타이드(CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 중쇄 항원 결합 부위; 및
서열번호 112의 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 113의 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 114의 폴리펩타이드(CDR-L1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 경쇄 항원 결합 부위
를 포함하는 것인,
단백질 복합체.
제10항에 있어서, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 115의 중쇄 항원 결합 부위 및 서열번호 116의 경쇄 항원 결합 부위를 포함하는 것인,
단백질 복합체.
제1항에 있어서, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질, TEV 절단 펩타이드(TEV cleavage peptide), 및 퓨린(furin) 절단 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 단백질 복합체.
제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 1 내지 100개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드인 것인 단백질 복합체.
제1항에 있어서, 상기 단백질 복합체는 서열번호 133의 아미노산 서열 또는 서열번호 133의 아미노산 서열 중 20번째부터 1058번째까지의 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질 복합체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질 복합체를 포함하는 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체.
제15항에 있어서, 상기 단백질 복합체는 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부분에서 이량체화되고, 절단 가능한 아미노산 서열이 절단된 형태인, 이중특이 항체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제17항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 134의 염기서열 또는 서열번호 134의 64번째부터 3183번째까지의 염기서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오타이드.
제17항의 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된(operatively linked) 발현 조절 인자를 포함하는 재조합 벡터.
제19항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단백질 복합체를 생산하는 단계를 포함하는, c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체의 제조 방법.
제21항에 있어서, 상기 생산하는 단계 이후, 태그를 절단시키는 단계를 더 포함하는 것인, 이중특이 항체의 제조 방법.
제22항에 있어서, 상기 태그를 절단시키는 단계는 상기 단백질 복합체의 태그에 포함된 절단 가능한 아미노산 서열을 인식하는 프로테아제를 첨가하여 수행하는 것인, 이중특이 항체의 제조 방법.
제15항의 c-Met 및 EGFR에 대한 이중특이 항체를 유효성분으로 포함하는, 암, 암전이, 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염, 및 만성 염증으로 이루어진 군에서 선택된 질병의 예방 또는 치료용 조성물.