KR20140147463A - 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물 - Google Patents

황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20140147463A
KR20140147463A KR20130070782A KR20130070782A KR20140147463A KR 20140147463 A KR20140147463 A KR 20140147463A KR 20130070782 A KR20130070782 A KR 20130070782A KR 20130070782 A KR20130070782 A KR 20130070782A KR 20140147463 A KR20140147463 A KR 20140147463A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
extract
pancreatic cancer
miacapa
ros
Prior art date
Application number
KR20130070782A
Other languages
English (en)
Inventor
최선복
박성주
배기상
Original Assignee
최선복
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 최선복 filed Critical 최선복
Priority to KR20130070782A priority Critical patent/KR20140147463A/ko
Publication of KR20140147463A publication Critical patent/KR20140147463A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
    • A61K36/718—Coptis (goldthread)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 농도의존적으로 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능, PARP의 분절을 촉진하는 효능, ROS를 촉진하는 효능을 보유하고 있다.

Description

황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물{A COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OF COPTIDIS RHIZOMA FOR THE TREATMENT OF PANCREATIC CANCER}
본 발명은 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능, PARP의 분절을 촉진하는 효능, Miacapa-2 세포를 사멸시키는 ROS를 촉진하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 황련 추출물의 농도범위를 Miapaca-2 세포 2×105 cells/well 기준으로 0.5~20 μg/ml로 구체화한 기술적 특징을 보유하고 있다.
췌장암(膵臟癌)은 위장 뒤쪽에 위치한 췌장에 발생한 종괴(종양덩어리)를 일컫는다. 췌장암의 발병 원인은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않았으며 추정되는 원인들은 45세 이상의 연령, 흡연 경력, 두경부나 폐 및 방광암의 과거력, 비만, 대사증후군, 만성 당뇨병, 지방이 많은 음식 섭취 등이라고 알려져 있다.
췌장의 주된 역할은 췌액이라 불리는 소화액을 만들고 호르몬을 만드는 것이며, 췌장암의 대부분이 췌액을 운반하는 췌관의 세포에서 발생한다. 일반적으로 췌장암은 췌관 선암종(膵腺癌)(adenocarcinoma)을 일컬으며, 실제로 95% 이상이 췌관 선암종이다.
췌장암은 초기에 증상이 거의 없고, 다른 장기들에 둘러싸여 있어 진단이 어려우므로 암이 진행된 뒤에 발견되는 경우가 많다. 외과적인 절제 수술을 시행하여 육안으로 보기에는 완전히 절제되었다 해도 주변 장기나 림프절로 미세 전이를 일으키므로 완치 또한 어렵다. 그 때문에 췌장암은 5년 생존율이 5% 이하로 예후가 매우 나쁜 암이다.
또한 췌장암의 가장 효과적인 치료는 앞서 언급한 외과적인 절제 수술이나, 이는 췌장암 환자의 20~25% 정도에서만 가능하며, 실제로는 대개 황달이 초기 증상으로 나타난 췌장 두부에 종양이 있는 환자에 국한되는 경우가 대부분이다. 항암제 및 방사선 치료 또한 췌장암에 대한 반응성이 낮아 효과가 미약한 실정이다.
2007년 한국중앙암등록사업 연례보고서에 따르면 췌장암은 소화기 암종 중 위암, 간암, 대장암, 담낭 및 기타 담도암 다음인 발생률 5위이고, 전체 암 중에서는 발생 등록분율 2.4%로 9위를 차지하고 있다.
이렇듯 췌장암은 사망률 및 발병률이 높은 암으로, 보건학적 관점에서 관심을 기울여야 할 질환이다. 따라서 췌장암을 부작용 없이 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 천연물 신약의 필요성이 대두되고 있다.
이에 따라 본 출원인은, 황련 추출물을 이용하여 췌장암 세포를 사멸시키고, PARP{poly (adp-ribose) polymerase}의 분절을 촉진하며, ROS (Reactivity oxygen species)의 발현을 촉진하여 효과적으로 췌장암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다고 판단, 본 발명을 안출하였다.
본 발명과 관련된 선행 기술을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 10-2013-0022733호에는 천황련 추출물을 포함하는 췌장암 치료용 조성물 및 화장료 조성물에 관하여 기재되어 있다.
상기 선행 기술을 살펴 보면, 에탄올로 추출한 황련 추출물을 이용하여 인간 췌장암 세포인 Panc-1 세포를 사멸시키는 효능에 관하여 기재되어 있다.
본 발명을 살펴 보면, 물로 추출한 황련 추출물을 이용하여 인간 췌장암 세포인 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능, PARP의 분절을 촉진하는 효능 및 ROS를 촉진하는 효능에 관하여 기재되어 있다.
상기 선행 기술과 본 발명을 비교하여 보면, 상기 선행 기술에서 사용한 Panc-1 세포는 췌장암 연구 전기에 사용되었던 것으로, 최근의 연구에서는 사용 빈도가 낮은 세포주이다. 따라서, 상기 선행 기술은 실효성이 낮다고 할 수 있다.
또한, 상기 선행 기술에는 황련 추출물의 Panc-1 세포의 사멸 촉진 기전에 관하여는 기재되어 있지 않다.
반면, 본 발명에서는 최근의 연구에서 사용 빈도가 상대적으로 높은 Miacapa-2 세포를 사용하였으며, 황련 추출물의 Miacapa-2 세포의 사멸 촉진 기전에 관하여 자세하게 밝혔다.
본 발명의 목적은 황련을 유효성분으로 함유하여 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는데에 있다.
본 발명의 목적은 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능, PARP의 분절을 촉진하는 효능, ROS를 촉진하는 효능을 보유한 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는데에 있다.
본 발명의 목적은 Miapaca-2 세포 2×105 cells/well 기준으로 농도 0.5~20 μg/ml의 황련 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황련 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능, PARP의 분절을 촉진하는 효능, ROS를 촉진하는 효능을 보유한 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 Miapaca-2 세포 2×105 cells/well 기준으로 농도 0.5~20 μg/ml의 황련 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 황련 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물은 천연 유래의 물질을 사용하여 부작용 없이 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 황련 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물은 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능, PARP의 분절을 촉진하는 효능, ROS를 촉진하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 황련 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물은 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 황련 추출물의 농도범위를Miapaca-2 세포 2×105 cells/well 기준으로 농도 0.5~20 μg/ml로 구체화한 효과를 보유하고 있다.
도 1은 Miacapa-2 세포에 황련 추출물을 투여했을시 황련 추출물의 Miacapa-2 세포의 사멸 효능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 Miacapa-2 세포에 황련 추출물을 투여했을시 황련 추출물의 PARP의 분절 효능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 Miacapa-2 세포에 황련 추출물을 투여했을시 황련 추출물의 ROS의 발현 촉진 효능을 나타낸 도이다.
도 4는 ROS의 Miacapa-2 세포사멸 촉진 효능을 나타낸 그래프이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1. 황련 추출물의 제조
황련(黃連)(Coptidis rhizoma)은 미나이라재비과에 속하는 다년생 초본인 황련(Coptis chinensis Franch)의 근경이다. 황련의 근경은 가을에 채취하고 건조하여 사용한다.
황련에 관하여 간략히 살펴보면, 갈라져 나온 가지가 많고 여러 개가 한 묶음으로 되어 있으며 조금 구부러지고 닭의 발톱과 비슷하다. 또한 약간 냄새가 있으며 맛은 매우 쓰다.
황련의 뿌리줄기에는 베르베린(berberine), 콥티신(coptisine), 에피베르베린(epiberberine), 베르베르루빈(berberrubine), 팔마틴(palmatine), 코럼바민(columbamine) 등의 약용성분이 함유되어 있으며, 강장, 동맥경화, 안구건조증 및 안구염증, 중풍, 신경불안, 소화불량증, 위염, 류마티즘 등에 효능을 발휘한다.
설계조건에 따라, 황련 추출물의 제조법은 다양하게 설계될 수 있다.
추출법에는 여러 가지 종류가 있다. 추출법으로는, 열수 또는 유기용매를 이용하여 추출하거나, 발효추출, 초임계유체 추출, 여과침출, 수증기증류, 마이크로웨이브 추출, 온침 등의 방법이 있다. 이들 중 1가지 이상의 방법을 사용하여 황련을 추출할 수 있다.
또한 추출 후 건조할 수 있으며, 건조 후 분말화할 수 있다.
건조법에도 여러 가지 종류가 있다. 건조법으로는, 가압건조, 열풍건조, 분무건조, 포말건조, 피막건조, 초단파건조, 원적외선건조, 동결건조, 피막건조, 분무 및 교반 건조, 진공동결건조, 자연환기건조 등이 있다. 이들 중 1가지 이상의 방법을 사용하여 황련의 추출물을 건조할 수 있다.
설계 조건에 따라, 추출 전후에 여과, 농축, 환류 추출 등의 과정이 추가될 수도 있다. 또한 여과시 생리식염수, 에탄올, 물 등의 액체에 용해하여 여과할 수 있다.
농축 방법에는 증발 농축, 건조 농축 등의 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 건조 방법에는 양건조법, 음건조법, 동결건조법, 열풍건조법 등의 다양한 건조 방법이 사용될 수 있다.
최종적인 일 예로, 다음과 같은 제조예를 들 수 있다.
황련 90~110g을 물 900~1100ml에 약탕기로 1~3시간 동안 가열 추출하여 여과한 후, -90~-70 ℃에서 동결건조하여 건조 분말을 수득하고, 생리식염수에 용해하여 여과한다.
여기에서, 황련 추출물의 농도는 바람직하게 0.5~20 μg/ml으로 설정한다.
본 발명에 따른 조성물은, 췌장암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로 제공될 수 있으며, 각각의 조성물은 식품학적으로 허용되는 첨가제를 이용하여 건강기능식품으로 제조하여 제공한다.
본 발명에 따른 조성물을 이용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 건강보조식품, 차, 과자류 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.
본 발명이 약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질환의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 첨가제가 추가될 수 있음은 물론이다.
실험예 1. Miapaca -2 세포에서의 황련 추출물의 세포독성
(1) 실험 재료 및 시약 준비
1) 약재
황련(중국 사천성)을 옴니 허브(Omni herb, 대구, 대한민국)에서 구입하여, 실시예 1에 기재된 과정으로 제조한 후, 제조한 황련 추출물을 사용하였다.
2) 시약
FBS(Fetal bovine serum), DMEM 배지(medium), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 구입하였다.
실험에 사용된 시약 중 클로로포름(chloroform), 트리스(Tris)-HCl, SDS(sodium dodesyl sulfate), 아크릴아마이드(acrylamide), 비사크리라마이드(bisacrylamide), DCF-DA, NAC(n-acetyl cystein) 등은 시그마(SIGMA)(St. Louis, USA)사에서 구입하였으며, 트리졸(Trizol)은 인비트로젠(Invitrogen)(Carlsbad, CA, USA)사에서, ECL 디텍션(detection) 용액은 어머샴(Amersham)(Buckinghamshire, UK)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.
3) 세포배양
Human-derived pancreatic adenocarcinoma cell line, 즉 췌장암 세포주인 Miapaca-2 세포는 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 5% CO2, 37 ℃ 인큐베이터(incubator) 조건하에서 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 함유된 DMEM 배지에 배양하였으며, 2일마다 10 cm dish에 분주하였다.
이하 모든 실험예에서, 실험 재료 및 시약 준비는 실험예 1에 기재된 사항과 동일한 과정으로 실행되었음을 밝혀둔다.
(2) 실험 과정
1) MTT Assay
Miapaca-2 세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 포르마잔(formazan) 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정하였다.
세포들을 DMEM 배지에서 2×105 cells/well의 밀도로 현탁하여, 미처리, 0.5, 1, 5, 10, 20 μg/ml의 농도별로 황련 추출물을 처리하였다.
배양 후, 5 mg/ml의 농도로 MTT 용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다. MTT-포르마잔 생성물은 DMSO 200 ㎕를 첨가함으로써 용해하였다.
포르마잔의 양은 해액(解液)을 96-웰 플레이트(well plate)에 로딩(loading)하여, 스펙트로포토미터(spectrophotometer)(MD, USA)를 이용하여 540 nm에 흡수되는 양을 측정함으로서 결정하였다.
세포의 생존율은 어떠한 처치도 가하지 않은 컨트롤 세포(control cells)와의 비율로 나타내었다. 그 수식은 다음과 같다.
Figure pat00001
2) 통계처리
모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean±S.D.로 나타내었다. 실험결과에 대한 통계처리는 Oneway ANOVA에 준하였고, p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이하 모든 실험예에서 통계처리가 실행되었으며, 통계처리는 실험예 1에 기재된 사항과 동일한 과정으로 실행되었음을 밝혀둔다.
(3) 실험 결과
도 1은 Miacapa-2 세포에 황련 추출물을 투여했을시 황련 추출물의 Miacapa-2 세포의 사멸 효능을 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 황련 추출물의 농도를 높일 수록 Miacapa-2 세포의 사멸률 또한 증가하는 것을 알 수 있었다.
황련 추출물을 미처리했을시에는 Miacapa-2 세포의 사멸률이 약 100%였으며, 0.5 μg/ml 처리시에는 약 92%, 1 μg/ml 처리시에는 약 86%, 5 μg/ml 처리시에는 약 82%, 10 μg/ml 처리시에는 약 65%, 20 μg/ml 처리시에는 약 30%이었다.
이로써, 황련 추출물이 농도의존적으로 Miacapa-2 세포를 사멸시켰다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예 2. Miapaca -2 세포에서의 황련 추출물의 PARP 분절 유도 효능
(1) 실험 과정
캐스페이즈(caspase)의 활성(activation)은 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. 활성화된 초기 캐스페이즈 즉, 캐스페이즈-8, 9는 효과기 캐스페이즈인 캐스페이즈-3에 작용하여 캐스페이즈-3의 활성화를 촉진한다.
최종적으로 활성화된 캐스페이즈-3은 PARP{poly (adp-ribose) polymerase}의 분절을 촉진한다. PARP는 손상된 DNA의 복구를 돕는 효소로, PARP의 분절은 DNA의분절을 유도하며, 핵의 응축을 유도한다. 따라서 PARP의 분절은 세포사멸을 촉진한 다.
1) 웨스턴 블롯(Western blot analysis)
Miapaca-2 세포를 60 mm 배양 접시(culture dish)에 5×106 cells/dish로 세포를 현탁하고 DMEM(serum free media)로 12시간 스타베이션(starvation) 시킨 후 황련 추출물을 1 , 5, 10, 15, 20 μg/ml의 농도로 24시간 동안 전처리하였다.
차가운 PBS로 3 회 세척한 후, 농도별로 세포를 수확한 뒤 원심분리(5,000 rpm, 5분)하여 그 상층액을 버리고 셀 펠렛(cell pellet)을 수거하였다.
RIPA 라이시스 버퍼(lysis buffer)(RIPA buffer 1 ml + phosphotase inhibitor 10 ㎕ + protease inhibitor 10 ㎕)를 넣어 단백질을 라이시스(lysis)시키고 원심분리(15,000 rpm, 20분)하여 찌꺼기를 가라앉힌 뒤 단백질을 정량하였다.
동일한 양의 단백질을 샘플링 버퍼(4×)에 넣어 섞은 후 그 샘플을 10% SDS-PAGE에 전기영동하여 5% 스킴 밀크로 2시간 블로킹(blocking) 하였다.
1차 항체와 9시간 동안 반응시키고, PBS로 4회 세척하였다.
그 후 2차 항체로 1시간 반응시킨 후, Caspase-3,8,9의 변화를 관찰하였다.
(2)실험 결과
도 2는 Miacapa-2 세포에 황련 추출물을 투여했을시 황련 추출물의 PARP의 분절 효능을 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 각 농도별 황련 추출물 처리군 중 20 μg/ml의 황련 추출물 처리군에서 PARP의 분절이 촉진된 것을 알 수 있었다. 20 μg/ml 이하의 황련 추출물 처리군에서는 PARP의 분절이 일어나지 않았다.
이로써, 황련 추출물은 20 μg/ml 이상에서 PARP의 분절을 촉진한다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예 3. Miapaca -2 세포에서의 황련 추출물의 ROS 발현 촉진 효능
(1) 실험 과정
황련 추출물이 유발한 세포사멸의 원인을 알아보기 위해 ROS(Reactivity oxygen species, 반응성 산소 종)를 측정하였다. 기존의 연구에서 ROS는 과산화 상태를 유발하여, 세포사멸을 유도하는 물질로 알려져 있다.
1) DCF-DA(dichlorofluorescein diacetate) 염색
PA에 의한 ROS의 생성을 측정하기 위하여 형광 DCF-DA(probe 2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하였다. 본디 비형광물질인 DCF-DA는 ROS의 일종인 H2O2(hydrogen peroxide)와 관련된 페록시데스(peroxides)가 세포내에 존재할시, 형광의 DCF로 변환되어 녹색의 형광을 발한다.
황련 추출물을 미처리, 0.5, 1, 5, 10, 20 μg/ml의 농도별로 24시간 동안 Miapaca-2 세포에 배양한 뒤, 세포를 순수하게 분리하였다.
Miapaca-2 세포에 PA를 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하기 전에 10 μM DCF-DA를 처리하여 37 ℃에서 20분 동안 배양하였다.
배양한 세포는 PBS로 세척하여 1 % 트립신(trypsin)-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확하고, 다시 PBS로 세척하여 플로우 시미트리(flow cytometry)(FACS Calibur, BD Biosciences)로 형광을 측정하였다. 정보의 분석은 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software)(Becton Dickinson)를 이용하였다.
DCF-DA 염색 후, ROS의 변화를 플로우 시미트리로 분석하였다.
(2) 실험 결과
도 3은 Miacapa-2 세포에 황련 추출물을 투여했을시 황련 추출물의 ROS의 발현 촉진 효능을 나타낸 도이다.
실험 결과, 황련 추출물의 농도를 높일 수록 DCF-DA에 반응하는 Miacapa-2 세포의 비율 또한 증가하는 것을 알 수 있었다.
황련 추출물을 미처리했을시에는 DCF-DA에 반응하는 Miacapa-2 세포의 비율이 약 3%였으며, 0.5 μg/ml 처리시에는 약 2%, 1 μg/ml 처리시에는 약 6%, 5 μg/ml 처리시에는 약 7 μg/ml, 10 μg/ml 처리시에는 약 25%, 20 μg/ml 처리시에는 약 41%이었다.
이로써, 황련 추출물이 Miacapa-2 세포에서 농도의존적으로 ROS의 발현을 증가시켰다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예 4. 황련 추출물이 발현 촉진한 ROS 의 Miapaca -2 세포 사멸 효능
(1)실험 과정
실험예 3에서 Miapaca-2 세포에 황련 추출물을 처리했을시 ROS 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이렇게 분비된 ROS가 Miacapa-2 세포의 사멸에 있어 주요 원인인지 알아보기 위해 ROS의 저해제(scavenger)인 NAC을 처리하여, ROS를 억제하였을시의 Miacapa-2 세포의 사멸률을 측정하였다.
1) MTT Assay
Miapaca-2 세포의 생존율은 밀집 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 포르마잔(formazan) 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정하였다.
세포들을 DMEM 배지에서 2×105 cells/well의 밀도로 현탁하여, 미처리, 0.5, 1, 5, 10, 20 μg/ml의 농도별로 황련을 처리하였다.
배양 후, 5 mg/ml의 농도로 MTT 용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다. MTT-포르마잔 생성물은 DMSO 200 ㎕를 첨가함으로써 용해하였다.
포르마잔의 양은 해액(解液)을 96-웰 플레이트(well plate)에 로딩(loading)하여, 스펙트로포토미터(spectrophotometer)(MD, USA)를 이용하여 540 nm에 흡수되는 양을 측정함으로서 결정하였다.
세포의 생존율은 어떠한 처치도 가하지 않은 컨트롤 세포(control cells)와의 비율로 나타내었다. 그 수식은 다음과 같다.
(2)실험 결과
도 4는 ROS의 Miacapa-2 세포사멸 촉진 효능을 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 황련 추출물을 단독처리한 군 및 황련 추출물과 NAC를 병용처리한 군은 Miacapa-2의 세포사멸 양상에서 차이를 보였다.
황련 추출물을 미처리했을시에는 Miacapa-2의 세포생존률이 약 100%였으며, 0.5 μg/ml 처리시에는 약 95%, 1 μg/ml 처리시에는 약 90%, 5 μg/ml 처리시에는 약 80 %, 10 μg/ml 처리시에는 약 65%, 20 μg/ml 처리시에는 약 35%의 세포생존률을 보였다.
황련 추출물과 NAC를 병용 처리했을시에는 Miacapa-2의 세포생존률이 약 100%였으며, 0.5 μg/ml 처리시에는 약 99%, 1 μg/ml 처리시에는 약 94%, 5 μg/ml 처리시에는 약 93%, 10 μg/ml 처리시에는 약 90%, 20 μg/ml 처리시에는 약 79%의 세포생존률을 보였다.
황련 추출물을 단독처리했을시에는 농도의존적으로 Miacapa-2의 세포사멸이 일어났으나, 황련 추출물과 NAC를 병용처리했을시에는 Miacapa-2의 세포사멸이 상대적으로 적게 일어났음을 알 수 있었다.
이로써, 황련 추출물이 발현을 촉진한 ROS가 췌장암 세포의 사멸에 주요한 작용을 한다는 결론을 도출할 수 있다.

Claims (3)

  1. 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 황련 추출물은 Miapaca-2 세포 2×105 cells/well 기준으로 0.5~20 μg/ml에서 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하며,
    PARP{poly (adp-ribose) polymerase}의 분절을 촉진하고, ROS(Reactivity oxygen species)의 발현을 촉진하여 Miacapa-2 세포를 사멸시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는, 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물.
  3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 함유하는, 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 첨가한 건강기능식품.
KR20130070782A 2013-06-20 2013-06-20 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물 KR20140147463A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130070782A KR20140147463A (ko) 2013-06-20 2013-06-20 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130070782A KR20140147463A (ko) 2013-06-20 2013-06-20 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140147463A true KR20140147463A (ko) 2014-12-30

Family

ID=52676245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20130070782A KR20140147463A (ko) 2013-06-20 2013-06-20 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20140147463A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gouthamchandra et al. Chlorogenic acid complex (CGA7), standardized extract from green coffee beans exerts anticancer effects against cultured human colon cancer HCT-116 cells
Lin et al. Antioxidant, antioedema and analgesic activities of Andrographis paniculata extracts and their active constituent andrographolide
Deb et al. Pharmacognostic and phytochemical evaluation of the rhizomes of Curcuma longa Linn
JP2009515977A (ja) 癌の治療のためのＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｂａｒｂａｔａ抽出物
KR101797813B1 (ko) 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 조성물
KR101872950B1 (ko) 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 뇌종양 줄기세포 성장 억제 또는 사멸용 조성물
TWI300352B (en) Water soluble extract from plant of solanum genus and the preparation process thereof, and pharmaceutical composition containing the water soluble extract
WO2006099804A1 (en) Herbal compositions useful in cancer treatment
KR101702046B1 (ko) 장수풍뎅이 유충 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 항암용 조성물
WO2002080951A1 (en) Herbal extracts for the treatment of cancer
Durak et al. The study of interactions between active compounds of coffee and willow (Salix sp.) bark water extract
TW202327636A (zh) 包含混合的草藥萃取物的用於預防或治療癌症的藥物組合物和保健機能性食品
Hosseinzadeh et al. Protective effects of ethanolic extract of Lemon Beebrush (Aloysia citrodora) leaf against hypoxia-induced lethality in mice
JP2011503237A (ja) Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｂａｒｂａｔａｄ．ｄｏｎの精製抽出物を作製するためのプロセス
TWI679985B (zh) 含有橄欖果實萃取物的Ｔｉｅ２活化劑
Usha et al. Pomegranate peel and its anticancer activity: A mechanism-based review
KR102018221B1 (ko) 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
Shahnazi et al. Protective effects of methanolic extract of Vicia cracca against hypoxia-induced lethality in mice
Swanson Flavonoids, inflammation and cancer
KR101702053B1 (ko) 장수풍뎅이 유충 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 항암용 조성물
CN106535939A (zh) 用于治疗对化疗有抗性的肿瘤的包含褪黑激素和类黄酮的组合物
Ahmed et al. Cactus and lupin extracts as prospective anticancer agents compared with utoral drug
Wang et al. Modified rougan decoction alleviates lipopolysaccharide-enrofloxacin-induced hepatotoxicity via activating the Nrf2/ARE pathway in chicken
Clementi et al. Potential health benefits of rhubarb
KR20140147463A (ko) 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 췌장암을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application