KR102018221B1 - 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차 및 생강의 추출물을 적정비로 혼합하여 얻은 생약 추출 혼합물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물 및 보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강, 및 백미의 추출물을 적정비로 혼합하여 얻은 생약 추출 혼합물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing, improving or treating of arthritis comprising boswellia extract, grape seed extract, tumericextract, green tea extract, ginger extract and atratum cynanchum extract as effective component}

본 발명은 관절염 예방 및 치료에 효과를 가지는 기능성 소재에 대한 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 및 백미의 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

삶의 질 향상과 의료기술 등의 발전으로 평균수명연장 결과로 65세 이상의 노인인구가 전체인구의 7%를 넘었으며 노인인구가 14%를 차지하는 고령사회를 곧 앞두고 있다. 세계적으로도 일본, 독일, 이탈리아 등 노인인구가 20% 이상을 차지하는 초고령사회에 진입한 국가들이 있으며 2030년에는 34개국에 달할 것이라는 전망도 있다. 인구 고령화는 사회, 경제적 문제들을 초래할 우려로 우리나라 뿐만 아니라 전세계적으로도 심각성을 인지하여 대응책을 마련하고 있는 문제로 인식되고 있다.

노인인구 증가는 노인성 질환, 즉 치매, 동맥경화, 관절염 등의 퇴행성 질환 환자들의 증가로 이어지고 있고 이와 관련된 의약품 및 기능성 식품 시장이 증가하는 추세이나, 퇴행성 질환에 대한 근원적인 치료 또는 예방의약의 개발은 아직 부족하다. 따라서 임상적인 측면에서 안전성이 확보된 천연 소재를 이용한 노인질환 예방식품의 개발이 필요하고 이에 대한 관심도 증대되고 있다.

현재 65세 이상의 약 80%가 골관절염이라고도 부르는 퇴행성 관절염을 앓고 있을 만큼 관절의 염증성 질환 중 가장 발병 빈도가 높으며 2013년 건강보험심사평가원의 통계에 따르면 퇴행성 관절염 환자는 116만 3천여명으로 매년 4%정도씩 꾸준히 증가하였으며 여성이 66%로 남성보다 2배 가량 많은 것으로 나타났다.

골관절염은 퇴행성 관절 질환의 가장 오래되고 일반적인 유형으로 관절을 보호하는 연골이 나이가 들어감에 따라 손상되면서 염증과 통증을 일으킨다. 또한 비만이 무릎 관절의 골관절염을 야기할 수도 있으며 스포츠, 노동과 관련된 활동 또는 사고로 인해 관절 손상을 입는 경우, 골관절염의 발생 위험은 증가할 수 있다. 또 여성의 경우는 남성에 비해 근육량이 상대적으로 적어 관절을 지지하는 힘이 부족해 통증을 더 쉽게 느끼고 골관절염 발병 빈도가 높다고 알려져 있다.

골관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여 연골세포에서 관절의 기질 물질들인 유형 II 콜라겐(type-II collagen) 및 프로테오글리칸(proteoglycan) 등의 합성이 저해됨과 동시에 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 등의 염증성 사이토카인(cytokine)이 생성됨에 따라 관절 기질을 분해하는 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 합성 및 활성이 관절 세포에서 증가됨으로 인해 관절 조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다. 또한 관절염은 염증성 사이토카인에 의해 발현되는 유도성 질소산화물 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)가 장시간 동안 다량의 질소산화물(NO)을 생성시키고 생성된 질소산화물에 의한 자가 증폭적인 사이토카인의 생성으로 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되게 되어 관절 기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 생성을 증가시켜 관절에서 염증반응을 유발시킨다.

사이클로옥시게나제 2(cyclooxygenase 2; COX-2)는 통증 유발 물질인 프로스타글란딘을 합성하는 효소이며, 이는 NO를 비롯한 기타 자극에 의해 합성이 촉진되기 때문에 COX-2의 발현을 억제하거나 활성을 억제하는 것은 또한 골관절염 치료에 중요한 마커가 된다. 또한, NF-ｋB 단백질은 상기 언급한 바와 같은 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현을 개시하는 전사조절 신호물질로서 평상시에는 IｋBα라는 단백질과 결합하여 세포질에 존재하다가 감염 등의 외부 자극이 들어오면 IｋBα가 인산화되면서 분해되어 제거된 후 NF-ｋB가 핵 안으로 들어가 iNOS의 합성을 개시하도록 유도하게 된다. 따라서, 세포질에 있는 IｋBα의 인산화 과정 또는 분해 억제는 골관절염 치료를 판단하는 중요한 마커가 된다. 즉, NF-ｋB 단백질은 평상시 세포질에 존재하다가 감염이나 기타 외부 신호가 들어오면 핵 안으로 들어가 iNOS 및 COX-2와 같은 단백질의 유전자 발현을 개시하게 하는 역할을 수행한다. 따라서, NF-ｋB가 핵 안으로 들어가 해당 유전자의 전사 조절 부위에 결합하는 것을 억제하는 것은 골관절염 환자에서 골관절염 개선을 판단하는 중요한 마커가 된다.

관절염의 치료는 수술적 치료와 약물 치료, 비 약물 치료 등으로 여러 가지 방법이 사용되고 있다. 그 중 치료제로는 스테로이드, 비스테로이드, 천연물제제, 바이오제제 (DMARDs) 등이 있고 최근 대체치료제로서 재조합 단백질이나 유전자치료 또는 세포치료 등이 시도되고 있다.

관절염의 일반적인 치료방법으로 약물 치료가 있으며 많이 사용하고 있는 약물은 진통 및 소염 효과를 가진 비스테로이드성 소염진통제(NSAIDs)이다. 이것은 주로 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase)를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘 (prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타낸다. 그러나 NSAIDs의 가장 큰 문제는 위장관 부작용이며 이를 감소시키기 위해 식후 바로 복용하거나 또는 위장보호제를 함께 투여하기도 하며 장용성 NSAIDs 개발도 진행 중이다. 하지만 장기 복용 시 위장이나 소장에 속쓰림이나 궤양을 유발하고 이는 결국 천공을 유발시키기도 하며, 야기된 궤양은 위의 출구를 막아 구토와 체중 감소 등을 야기할 뿐만 아니라, 위장과 십이지장 등의 출혈등의 부작용을 야기시킬 수도 있다.

또한 류마티스 관절염치료에 사용되는 면역 시스템을 표적으로 하여 손상된 관절에 대한 면역 공격을 늦추게 하는 DMARDs (Disease-Modifying Anti-Rheumatic Drugs) 계열에 속하는 제제들과 항체 신약 등이 사용되고 있다. 그러나 DMARDs 제제는 비스테로이드 제제들과 비교할 때 가격 면에서 경쟁력을 가지지 못하며 항체 신약의 경우에는 경구 투여제로의 개발에 제한이 있고 상대적으로 고가인 단점이 있다.

그밖에 연골 주사제, 줄기세포 치료제, 수술적 치료 등의 방법은 비용 및 환자 편의성의 한계와 관절염 진행 단계의 거의 마지막 단계에서 사용하는 방법이라는 단점이 있다.

반면 천연물 제제는 예방적 차원에서의 사용도 가능하며 예로부터 오랜시간 사용된 성분들이 많아 장기간 복용시 다른 약물에 비해 부작용 적으며 항체신약이나 바이오제제인 DMARDs 등에 비해 가격 상대적 저렴하다는 장점이 있어 연구가 많이 이루어지고 있다.

한편, 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata) 식물의 고무 수지(gum resin)는 인도의 의학 시스템에서 야유르베다(Ayurvedic) 의약의 의사들에 의해 류마티스 관절염 및 통품의 치료를 위해 오랫동안 사용되어 왔다. 고무 수지의 다양한 추출물은 실험동물에서 강력한 항-염증 및 항-동맥경화 활성을 나타내었다(Cuaz-Perolin et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol Feb 2008). 분리된 보스웰리아 화합물인 인센솔 아세테이트(incensole acetate)는 NF-ｋB 억제제이고 또한 항염증 화합물로서 유용한 것으로 입증되었다(Moussaieff et al., Mol Pharmacol 72, 1657-1664, 2007). 보스웰리아 세라타의 고무 수지의 에탄올 추출물은 랫트 복막 호중구에서 염증반응의 중요한 매개체 중 하나인 류코트리엔(Leukotriene) B4의 형성을 억제하는 것으로 관찰되었다. 류코트리엔 B4는 염증 반응의 중요한 매개체 중 하나이다. (Ammon, H. P. T. et al., Planta Medica, 57, 203 (1991)). 보스웰리아의 추출물은 강력한 항-관절염제(Kimmatkar et al; Phytomedicine. 2003 Jan;10(1):3-7.) 및 면역조절제(Pungle et al; Indian J Exp Biol. 2003 Dec;41(12):1460-1462)인 것으로 밝혀졌다. 보스웰리아 세라타의 콜레스테롤 저하 작용이 또한 입증되었다(Zutshi U et al., Indian J Pharmac. 18, 182-183, 1996.). 실제로, 무릎의 골관절염 환자들군에 대한 보스웰리아 추출물을 사용한 무작위적이고, 이중 맹검의, 위약 조절된(placebo controlled), 교차 임상시험은 통증 감소, 부종 감소, 및 무릎 굽힘(knee flexion)의 증가에 있어서 통계적으로 유의성있는 개선을 나타내었다(Kimmatkar et al., hytomedicine. 2003l 10:3-7). 개방성 비-무작위적 동등성 시험에서, 만성 대장염 환자 30명에게 보스웰리아 고무(gum)(하루에 3회 300 mg) 또는 설파살라진(하루에 3회 1 g)을 투여한 결과 보스웰리아에 의해 나타난 치료 효과는 설파살라진에 의해 나타난 것과 비교할만 했다(Gupta I. et al., Planta Med. 2001; 67: 391-395). 다른 동등성 시험에서, 보스웰리아 표준 추출물은 활성 크론병 환자들에 대한 무작위적인 이중 맹검 시험에서 메살라진과 비교할만하거나 혹은 더욱 우수한 치료학적인 개선을 나타내었다(Gerhardt H, et al., Z Gastroenterol 2001; 39: 11-17). 보스웰리아 고무 수지는 또한 6주간의 이중 맹검, 위약 조절된 시험에서 기관지 천식 환자들에서 통계적으로 유의성있는 개선을 나타내었다(Gupta I. et al., EurJ Med Res 1998; 3: 511-51). 보스웰리아는 인도전통 아유르베다 의학서에 만성염증 및 관절염, 소염, 타박성, 호흡기 질환 및 설사 등에 사용하였다고 기록되어 있으며, 높은 소염 진통 효과로 진통 및 염증 치료에 지속적으로 사용되어 온 것으로 알려져 있다. 보스웰리아의 주요 성분은 보스웰릭산(Boswellic acid)과 테르페노이드 형태의 항산화물질들로, 이중 보스웰릭사은 보스웰리아의 소염 및 진통 효과를 나타내는 기능 물질이다. 보스웰릭산은 5-lipoxygenase(5-LO)의 활성을 저해시킴으로 신체 내 염증 반응 물질 및 염증 유발물질인 TNF-α, IL-6 등의 cytokine 생성을 억제하고, 연골 조직을 구성하는 단백질의 생성 촉진과 연골세포의 cell death를 저해시키는 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

또한 유럽종 포도를 포함한 모든 포도류는 항산화물질을 포함하고 있는데 특히 포도씨 추출물은 바이오플라보노이드의 일종인 프로안토시아니딘을 다량 함유하고 있으며 결합조직의 기능을 향상시키고 심혈관계 질환, 관절염, 암을 유발하는 발생기 산소를 소거시킴으로써 조직손상을 막는다. 또한 포도씨와 껍질에 있는 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)은 항바이러스, 항박테리아, 항염증, 항알러지 기능을 가지고 있다. 포도씨 추출물은 인체내에서 약 3일간 효과를 발휘할 수 있으며, 그 효과는 비타민 C의 20배, 비타민 E의 50배에 달한다. 그밖에 류마티스 관절염 및 골관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과에 대한 문헌도 보고되어 있다(대한민국 등록특허 제 10-1044433호, 대한민국 등록특허 제 10-1099021호).

강황(Curcuma longa L.)은 생강과(Zingiberaceae)의 강황속(Curcuma)으로 분류되는 다년생 식물로 인도가 원산지이며 열대 아시아, 중국, 일본 등지에서 재배된다. 강황의 용도로는 뿌리줄기 (rhizome)를 식용, 한약재, 향신료 등으로 사용한 예가 알려진 바 있으며, 특히 카레의 원료로서 카레의 노란 색상을 띠는 성분으로 알려져 있다. 강황의 주성분은 커큐민(curcumin), 디메톡시커큐민 (demethoxy curcumin),비스디메톡시커큐민 (bis demethoxy curcumin)과 같은 커큐미노이드(curcuminoid) 색소 성분과 ar- turmerone,curlone,α-turmerone, β-turmerone, bisacumol, zingiberene과 같은 휘발성 정유 성분 및 전분이다. 이 중 강황의 노란색의 주성분인 커큐민은 생리활성물질로서 그것과 유사체에 의한 항염작용에 대한 연구가 많이 수행되었다(Anand P et. al., Biochem Pharmacol, 2008, 76:1590-1611). 또한 아유르베다(Ayurvedic) 의약에 있어서 전통적으로 강황은 염증, 피부 상처 및 종양을 치료하기 위하여 사용되어 왔다(Ammon and Wahl, 1991, Planta Med., 57:1-7). 그밖에 항암효과, 알츠하이머 치매 치료효과, 항산화성, 항염증, 간 장애 억제 등의 효과를 갖는 것이 계속적으로 밝혀지고 있다.

녹차는 약 2300년 전부터 이용되기 시작한 기호 음료로, 최근 건강식품으로 알려지면서 전 세계적으로 관심과 소비가 크게 증가하고 있다. 녹차는 카테킨류, 플라보노이드, 비타민 C 및 E 및 아연, 셀레늄, 및 망간 등의 무기질 소량으로 구성되어 있다. 떫은 맛의 주성분인 카테킨(Catechin)은 폴리페놀(Polyphenol)의 일종으로 에피갈로카테킨갈레이트 (EGCG: epigallocatechingallate), 에피갈로카테킨 (EGC: epigallocatechin), 에피카테킨갈레이트 (ECG: epicatechingallate), 에피카테킨 (EC:epicatechin)이 있다. 녹차 내에 70∼80%로 함유된 카테킨 성분은 항산화작용(Matsuzaki, T et al., Nippon Nogeikagaku Kaishi, 59, pp129, 1985), 혈압강하작용(Hara. Y et al., Nippon Nogeikagaku Kaishi, 61, pp803, 1987), 항균, 피부보호, 발암물질 형성방지, 활성 라디칼 제거, 탈취, 항암, 콜레스테롤과 중성지방 분해, 알츠하이머 치매 예방, 비만예방 등의 효능이 있다. 현재까지 연구 조사된 녹차의 약리적인 효과로는 암발생 억제 효과, 콜레스테롤 제거 효과, 류머티즘성 관절염 예방, 동맥경화 억제작용, 혈소판 응집 억제 작용, 식중독 예방 효과, 콜레라 예방 효과, 충치 예방 효과, 항산화 작용, 노화 억제 효과, 중금속 제거 효과, 항당뇨 효과, 지방간의 예방, 다이어트 효과, 항알레르기 효과, 에이즈 바이러스 역전사 효소에 대한 억제 효과, 담배의 해독효과, 구취 및 냄새 제거 효과, 차 향기 성분의 기능성, 알칼리성 체질 개선 효과, 염증 치료 효과, 기억력 및 판단력 증진, 피부 미용 효과, 면역력 증강, 스트레스 해소, 변비 개선 효과, 카페인의 생리 작용, 데아닌의 생리 작용 및 방사능 해독 작용 등이 여러 가지가 있다.

생강은 생강과에 속하는 아열대 및 열대성 다년생 식물로서, 우리나라뿐만 아니라 세계적으로 널리 이용되고 있는 향신료의 하나이며, 식품의 관능성을 향상시키기 위해 첨가하는 조미성분의 하나로 사용되고 있다. 또한 생강은 인체에 유익한 여러 가지 성분이 함유되어 있어 차(tea)나 약재로 널리 사용되어 왔다. 한방에서는 생강의 뿌리줄기 말린 것을 건강(乾薑)이라는 약재로 사용하고 있는데, 소화불량, 구토설사 등에 효과가 있고, 혈액 순환을 촉진하며, 항염증과 진통 효과를 지니고 있다. 생강의 75% 정도는 수분이고, 전체 고형분의 40∼60％는 전분이 차지하고 있다. 정유성분으로는 진지베롤 (zingiberol), 진지베렌(zingiberene) 등이 함유되어 있으며, 특이 성분으로 6-진저롤 (6-gingerol, 0.1∼0.3%), 진저론 (zingerone), 6-쇼가올 (6-shogaol, 0.04%), 감마-아미노부티르산(gamma-aminobutyric acid) 등이 함유되어 있다.

활성에 관한 연구로서는 항산화 작용(Masuda et al., Chem. Lett., 1, pp189-192, 1993; Jitoe et al., Tetrahedron Lett., 35, pp981-984, 1994), 항염증 작용(Ozaki et al., Chem. Pharm. Bull.,39, pp2353-2356, 1991; Jeenapongsa et al., J. Ethnopharmacol., 87, pp143-148, 2003), 살충작용(Nugroho et al., Phytochemistry, 41, pp129-132, 1996) 및 자궁 이완 작용(Kanjanapothi et al., Planta Med., 53, pp329-332, 1987)이 보고되었고, 생강의 뿌리의 성분에 관한 연구에서는 페닐부테노이드(phenylbutenoid) 및 커큐미노이드(curcuminoid)가 보고되었으며(Masuda and Jitoe, Phytochemistry, 39, pp459-461, 1995; Tuntiwachwuttikulet al., Phytochemistry, 20, 1164-1165, 1981; Masuda et al., Chem. Lett., 1, pp189-192, 1993; Jitoe et al., Tetrahedron Lett., 35, pp981-984, 1994), 생강의 용도에 관한 문헌이 다수 개시되어 있다(한국공개특허 제 10-2011-0099949호, 한국등록특허 제 10-0835899호 및 한국공개특허 제 10-2011-0028931호 등 참고).

백미는 백미꽃속(Cynanchum) 식물로 전 세계에 약 200종이 있으며, 아프리카 동부, 지중해 지역 및 유라시아 대륙의 열대, 아열대 및 온대 지역에 분포한다. 중국에 53종이 있는데 12종은 변종이다. 중국의 이 속 중에서 약재로 사용되는 것은 25종으로 중국의 동북, 화북, 화동 및 서남 등지에 분포하며 한반도와 일본에도 분포하는 것이 있다.

백미는 《중국약전(中國藥典)》(2015년 판)에 수록되어 있으며 주요산지는 중국의 안휘, 하북, 요녕, 길림 및 흑룡강 등지이다. 《대한민국약전외한약(생약)규격집》(제4개정판)에는 백미를 “박주가리과에 속하는 백미꽃(Cynanchum atratum Bunge)또는 만생백미(蔓生白薇, Cynanchum versicolor Bge.)의 뿌리 및 뿌리줄기”로 등재하고 있다.

백미의 주요성분은 C21-스테로이드 배당체이며 C21-스테로이드 사포닌, 유기산 등이 함유되어 있다.

한의학에서 백미는 청열양혈(淸熱凉血), 이뇨통림(利尿通淋), 해독료창(解毒療瘡) 등의 효능이 있다. 약리작용으로 해열, 항염, 심장자극, 항종양, 기억력개선, 거담작용 등이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구진에 의한 백미의 용도에 관한 문헌도 있다 (한국등록특허 제 10-1179966호 및 한국등록특허 제 10-1285234호 등 참고).

본 발명자들은 예로부터 식품 등으로 사용해왔던 천연소재를 이용하여 기존의 관절염 치료제에 대한 부작용을 줄이고 통증의 완화, 관절 연골의 기능 유지 및 회복은 물론 동물실험을 통해 연골 조직 재생과 부종 억제 등의 효과를 보는 동시에 위장을 보호할 수 있는 소재를 추가하여 보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 및 백미의 추출물을 유효성분으로 하는 조성물에 대한 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 골관절염 관련 질환의 예방 또는 치료할 수 있는 인체에 안전한 물질, 특히 식물 유래 천연 소재를 개발하고자 보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 및 백미의 추출물을 포함하는 생약추출물 혼합물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 생약추출 조성물이 항염증 작용, 소염진통 작용, 관절조직 분해효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용 및 발부종을 억제하여 골관절염의 예방 또는 치료에 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물 및 생강 추출물을 포함하는 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 상기 생약추출 혼합물은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물 및 생강 추출물을 2:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 포함하는 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시 형태를 따르면, 상기 생약추출 혼합물은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 4:1:1:1:1:2의 중량비로 혼합한 것을 특징으로 한다. 또한 상기 약제학적 조성물은 상기 천연 복합 추출 혼합물 이외의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 약제학적 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 및 패치제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은 건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 및 백미의 2~20배 중량의 물 또는 알코올 또는 혼합용매를 가하여 실온에서 1일 내지 2일 동안 추출하여 각 추출물을 얻는 단계; 상기 각 추출물을 감압농축한 후 40 내지 60 ℃에서 건조하여 각 건조된 추출물을 얻는 단계; 및 상기 각 건조된 추출물을 혼합하는 단계를 통해 얻어지는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 생약추출 혼합물은 관절염 동물모델에서 통증감소와 체중부하 개선 효과를 보였으며, 관절 연골조직의 손상도를 감소시키는 효과를 나타내고 염증성 사이토카인과 산화스트레스 관련 인자(iNOS, Nitrotyrosine)의 감소 효과를 나타냄으로써, 관절염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 행동력에 미치는 영향 중 통증 역치를 Dynamic Planear Aesthesiometer를 이용하여 평가한 결과로서, 도 1a 및 도 1b는 각각 paw withdrawal latency (PWL, 초) 및 paw withdrawal threshold (PWT, g)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 행동력이 미치는 영향을 평가하기 위해, Incapacitance tester를 이용하여 양쪽 발에 실리는 무게를 비교하여 측정하여 체중부하를 평가한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, H&E 염색법을 이용하여 조직학적으로 생약추출 혼합물의 세포 침윤 정도를 평가하여 연골 및 뼈의 파괴정도를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, 사프라닌 O(safranin O) 염색법을 이용하여 조직학적으로 생약추출 혼합물의 연골보호 효력을 평가하여 연골 및 뼈의 파괴정도를 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, 조직병리학적 분석 결과로부터 Histology grade를 계산하여 OARSI, Mankin, structure, cartilage destruction, surfaceirregularities, fibrillation, expose of subchondralbone, increase osteoclast 등을 점수화하여 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, 관절 조직 내 염증성 사이토카인 중 하나인 IL-1β 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, 관절 조직 내 골 이화작용에 영향을 미치는 MMP13 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, 관절 조직 내 산화스트레스 관련 인자인 iNOS 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, 관절 조직 내 산화스트레스 관련 인자인 Nitrotyrosine 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 10은 본 발명의 생약추출 혼합물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위해, IL-1β, MMP13, iNOS, Nitrotyrosine에 대한 각 지표별 침윤 정도를 평가한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물 및 생강 추출물을 포함하는 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 생약추출 혼합물은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물 및 생강 추출물을 1.6~2.4:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2의 중량비, 바람직하게는 2:1:1:1:1의 중량비로 혼합된 생약추출 혼합물일 수 있다.

상기 생약추출 혼합물은 1) 건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차 및 생강의 2~20배 중량의 물 또는 알코올 또는 혼합용매를 가하여 실온에서 1일 내지 2일 동안 추출하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 획득한 각 추출물의 여액을 감압농축한 후 40 내지 60 ℃에서 건조하여 건조된 각 추출물을 얻는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 수득한 건조된 각 추출물을 혼합하는 단계를 거쳐 얻어지는 것이 바람직하다. 추출 시간이 1일보다 짧은 경우 건조물로부터 충분한 추출이 일어나기 어려우며, 추출시간이 2일보다 길어지는 경우 효율성이 떨어지는 문제가 있다. 또한 건조 온도가 40℃보다 낮은 경우 건조 시간이 지나치게 길어지는 문제가 있으며, 60℃보다 높은 경우 추출물의 변성이 일어날 수 있다.

본 발명의 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 산화질소(NO, Nitric oxide), 프로스타글란딘 E2(PGE2, Prostaglandin E2) 또는 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)의 생성을 저해하는 것이 특징이다. 상기 염증성 사이토카인은 TNF-α(Tumor necrosis factor α) 또는 IL-4(Interleukin 4)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 생약추출 혼합물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.

본 발명의 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 건강기능식품 조성물은 관절염을 예방하거나 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 오랫동안 식품으로 사용되어 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등),디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 포함하는 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 생약추출 혼합물은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 3.2~4.8:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:1.6~2.4의 중량비, 바람직하게는 4:1:1:1:1:2의 중량비로 혼합하여 제조된 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 생약추출 혼합물은 1) 건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 및 백미의 2~20배 중량의 물 또는 알코올 또는 혼합용매를 가하여 실온에서 1일 내지 2일 동안 추출하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 획득한 각 추출물의 여액을 감압농축한 후 40 내지 60℃에서 건조하여 건조된 각 추출물을 얻는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 수득한 건조된 각 추출물을 혼합하는 단계를 거쳐 얻어지는 것이 바람직하다. 추출 시간이 1일보다 짧은 경우 건조물로부터 충분한 추출이 일어나기 어려우며, 추출시간이 2일보다 길어지는 경우 효율성이 떨어질 수 있다. 또한 건조 온도가 40℃보다 낮은 경우 건조 시간이 지나치게 길어지는 문제가 있으며, 60℃보다 높은 경우 추출물의 변성이 일어날 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 총 중량에 대하여 상기 생약추출 혼합물을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 약제학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약제학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 생약추출 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 생약추출 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 크림, 로션제, 연고제, 경고제, 액제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭, 패취제, 주사제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 생약추출 혼합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 의한 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 약제와 동등하게 또는 다른 약제를 보조하기 위해 함께 투여될 수 있다. 또한, 각 제형의 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분인 조성물 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 발명의 생약추출 혼합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 바람직하게 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예 및 실험예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 생약추출 혼합물 (CML-16002)의 제조

건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차 및 생강 각 1 kg에 각 EtOH 2 L를 가하고 실온에서 24시간 추출한 후 여액을 감압 농축하고 농축액을 50 ℃에서 건조하여 각 분말 추출물을 얻었다.

보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차 및 생강의 각 분말 추출물을 2:1:1:1:1의 중량비로 혼합하고 뼈건강에 효과가 있는 기능성 원료인 vitamin D, vitamin K 및 망간을 0.00006:0.006:0.02 중량비로 추가로 혼합하여 생약추출 혼합물을 제조하였다.

실시예 2. 생약추출 혼합물 (CML-16002X)의 제조

건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차 및 생강 각 1 kg에 각 EtOH 2 L를 가하고 실온에서 24시간 추출한 후 여액을 감압 농축하고 농축액을 50 ℃에서 건조하여 각 분말 추출물을 얻었다.

보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물 및 생강 추출물을 4:1:1:1:1의 중량비로 혼합하고 뼈건강에 효과가 있는 기능성 원료인 vitamin D, vitamin K 및 망간을 0.00006:0.006:0.02 중량비로 추가로 혼합하여 생약추출 혼합물을 제조하였다.

실시예 3. 생약추출 혼합물 (CML-17001)의 제조

건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 및 백미 뿌리 각 1 kg에 각 EtOH 2 L를 가하고 실온에서 24시간 추출한 후 여액을 감압 농축하고 농축액을 50℃에서 건조하여 각 분말 추출물을 얻었다.

보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 4:1:1:1:1:2의 중량비로 혼합하고 뼈건강에 효과가 있는 기능성 원료인 vitamin D, vitamin K 및 망간을 0.00006:0.006:0.02 중량비로 추가로 혼합하여 생약추출 혼합물을 제조하였다.

실험준비. 관절염 유도된 랫의 in vivo 실험을 위한 시약제조

본 발명의 상기 실시예 1 내지 3의 각 생약추출 혼합물을 관절염 유도된 랫의 in vivo 실험군으로 이용하고자 6개의 실험군으로 나누어 5주간에 걸쳐서 진행하였다. 상기 6개의 실험군은 실시예 1 CML-16002, 실시예 2 CML-16002x를 200 mg/kg의 농도로 saline에 용해시킨 것과, 실시예 3 CML-17001을 200 mg/kg 및 400 mg/kg으로 saline에 용해시킨 것과, positive control인 Rayla를 200 mg/kg으로 saline에 용해시킨 것 및 negative control인 vehicle로 saline을 이용한 것으로 구분하였다. 각 실험군의 조성은 다음 표1과 같다.

	실험군	조성	비고
negative control	Vehicle	saline
실시예1	CML-16002 200 mg/kg	보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 2:1:1:1:1 (vitamin D, vitamin K, 망간 0.00006:0.006:0.02)	CML-16002을 saline에 200 mg/kg의 농도로 용해
실시예2	CML-16002X 200 mg/kg	보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 4:1:1:1:1 (vitamin D, vitamin K, 망간 0.00006:0.006:0.02)	CML-16002X를 saline에 200 mg/kg의 농도로 용해
실시예3	CML-17001 200 mg/kg	보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강, 백미 4:1:1:1:1:2 (vitamin D, vitamin K, 망간 0.00006:0.006:0.02)	실시예 3 CML-17001의 saline에 용해시킨 농도의 차이
	CML-17001 400 mg/kg	보스웰리아, 포도씨, 강황, 녹차, 생강, 백미 4:1:1:1:1:2 (vitamin D, vitamin K, 망간 0.00006:0.006:0.02)
비교예	Rayla 200 mg/kg	당귀, 목과, 방풍, 속단, 오가피, 우슬, 위령선, 육계, 진교, 천궁, 천마, 홍화	한국피엠지제약이 제조 판매하는 관절염 치료제 레일라정 (LAYLA TAB.)을 saline에 200 mg/kg의 농도로 용해

실험예 1. 행동력에 미치는 영향 평가

행동력에 미치는 영향을 평가하기 위해 Monosodium Iodoacetate(MIA)를 이용하여 랫의 관절염을 유도하였고 이후 4일차부터 주 5회 각 실험군에 해당하는 약물을 랫에 경구 투여하였다. 7일 간격으로 랫의 체중을 측정하였고 3일과 4일 간격으로 번갈아 PWT, PWL, Weight Bearing을 측정하였다. 측정 결과 중 WT (wild type)는 관절염이 유도되지 않은 랫에 대한 평가 결과이다. 상세한 평가방법은 다음과 같다.

행동력 측정은 Dynamic Plantar Aesthesiometer를 이용하여 랫의 뒷발에 자극을 주고 그에 대한 반응을 관찰하였다. 즉, Dynamic Plantar Aesthesiometer 에 장착되어 있는 0.5 mm의 직경의 침(필라멘트)을 20초 동안 50g의 힘으로 랫의 발바닥에 직각방향으로 자극을 주어 랫이 해당되는 무게의 힘을 느끼고 발을 치울때의 초와 무게값을 얻어 paw withdrawal latency 와 threshold를 측정하였다. 또한, 랫의 왼발과 오른발에 실리는 힘을 비교, 측정하기 위하여 Incapacitance tester를 이용하였다. 랫을 플라스틱 챔버에 넣고 Incapacitance tester의 분리된 판 위에 랫의 왼발과 오른발을 각 판위에 올려 놓고 3초 동안 각 발에 실리는 힘의 평균값을 얻었다. 이렇게 얻은 Weight bearing (%)은 오른발 (MIA를 주입한 발) / 왼발 (MIA를 주입하지 않은발) X 100%의 식에 대입하여 결과를 얻었다.

MIA를 주입한 뒤 4일 정도가 지났을 때 골관절염이 유도되었으며, Dynamic Planear Aesthesiometer를 이용하여 랫의 뒷발에 자극을 주고 그에 대한 반응을 살펴본 결과, CML약물의 경우 Vehicle 대비 모든 군에서 paw withdrawal latency 및 threshold가 유의성 있게 높게 나타나 유의적 통증감소가 일어났으며 CML 17001 400 mg/kg군에서 가장 좋은 통증 억제효과를 확인하였다. (**P<0.01, ***P<0.005) (도 1). 또한 각 군의 랫의 weight bearing을 측정한 결과, CML약물의 경우 Vehicle 대비 모든 군에서 weight bearing이 비투여 군에 비해 유의성 있게 높게 나타나 유의적 부하 개선이 있었으며 CML 17001 400 mg/kg군에서 가장 좋은 부하 개선을 확인하였다. (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005) (도 2).

실험예 2. 조직병리학적 분석을 통해 랫의 연골에 미치는 영향 평가

조직병리학적 분석을 통해 랫의 연골에 미치는 영향을 평가하기 위하여 MIA 유도 후 31일째 랫의 관절을 채취하여 분리한 뒤, india ink로 염색하여 해부현미경으로 관찰하였다. 관절의 세부적인 형태를 관찰하기 위해 H&E 염색을 하였고, 연골의 파괴정도를 알 수 있는 염색법인 사프라닌 O (Safranin O)를 통해 프로테오글리칸(proteoglycan)의 함량을 degradation에 따라 연골의 형태를 관찰하였다.

또한 OARSI, Mankin, structure, cartilage destruction, surfaceirregulation, fibrillation, exposure of subchondralbone, increase osteoclast 등을 점수화하여 진행하였다. 각각의 평가 기준은 다음과 같이 정의하였다.

A. OARSI 평가 기준 (총점 6)

0= 정상수준의 연골 표면

1= 연골 표면은 정상이나 세포의 사멸이 확인되는 경우

2= 연골 표면의 단절과 표면층의 섬유화

3= 연골의 세로축으로 갈라진 현상

4= 연골 중간 부위까지 손상 및 침윤

5= 기질골 부위가 드러남

6= 연골의 완벽한 손상 및 골극의 형성

B. Mankin score (총점 15)

구조

0= 손상이 없는 일반적 구조

1= 연골표면의 불규칙

2= 판누스 형성 및 연골표면의 불규칙

3= 연골표면이 갈라지는 과도기적 상태

4= 연골표면의 방사상 갈라짐

5= 연골표면의 완벽한 갈라짐

6= 연골이 손상되어 사라짐

세포

0= 일반적 세포

1= 분산적인 세포의 과 증식

2= 세포의 비정상적 군집이 관찰

3= 세포의 비정상적 과증식과 군집형성

safranin-O 염색

0= 일반적 형태

1= 약간의 연골손상

2= 중간정도의 연골손상

3= 심각한 연골손상

4= 연골염색의 부재

혈관

1= 정상적 혈관분포

2= 연골하층까지 혈관의 침식

C. 식품의약안전처 가이드라인

상기 실시예 1에서 수득한 각 추출물이 관절염에 미치는 효과를 측정하기 위하여 식품의약품안전청 바이오생약국 바이오생약심사부에서 2009. 5. 발간한 ‘생약(한약)제제의 효력시험 가이드라인 -골관절염-’제6면 내지 제7면에 개시된 표1 및 표2의 측정대상을 참고하였으며 상기 표1 및 표2는 다음과 같다.

조직병리학적 분석 결과, 부형제대조군 (Vehicle)은 연골의 섬유화 및 손상을 확인하였으며, 골 파괴 증상까지 나타나는 것으로 확인하였다. 양성대조물질군인 Rayla 200 mg/kg는 부형제대조군 (Vehicle) 만큼의 연골 손상은 아니었지만, 섬유화 증상이 확인되었다. 반면 시험약물군 CML 16002 200 mg/kg, CML 16002X 200 mg/kg, CML 17001 200 mg/kg, CML 17001 400 mg/kg군은 부형제대조군 (Vehicle) 대비 연골보호 효과를 보였으며, 연골의 섬유화 현상도 호전된 것을 확인하였다. (도 3, 도 4)

OARSI 종합스코어는 부형제대조군 대비 CML 17001 400 mg/kg군에서 유의적인 감소가 확인되었으며, (*P<0.05) Mankin 스코어와 structure 스코어는 부형제 대조군 대비 거의 모든 약물군에서 유의적 감소가 확인되었으며 CML 17001 400 mg/kg 군에서 가장 큰 감소를 보였다. (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005) (도 5)

표면 손상 스코어(surface irregulation), 섬유화 스코어(fibrillation), 연골하골 노출 스코어(exposure of subchondralbone)의 경우 부형제대조군 대비 대부분의 시험약물군에서 감소하는 경향을 보였으며 CML 17001 400 mg/kg군은 세가지 스코어 모두에서 유의적인 감소가 확인되었다. (*P<0.05, **P<0.01) 또한 연골파괴 스코어(cartilage destruction)와 파골세포 스코어(increase osteoclast)의 경우 부형제 대조군 대비 모든 약물군에서 감소되었으나 통계적 유의성은 없었다. (도 5)

실험예 3. 면역화학염색으로 연골에 미치는 영향 평가

MIA 유도 후 31일 후 랫을 sacrifice 한 뒤 IL-1β, MMP13, iNOS, Nitrotyrosine 항체를 사용하여, 연골 또는 synovium에서 타겟이 침윤된 세포를 카운트하여 분석하여 염증성 cytokine 등의 발현 정도를 확인하고, 관절의 연골조직 손상도, 섬유화 등을 확인하였다. 상세한 평가방법은 다음과 같다.

먼저 4% 파라포름알데하이드에 고정된 각 활막 조직을 통상의 방법대로 파라핀에 포매한 후 절편기를 이용하여 7㎛ 절편을 만들어 슬라이드에 붙인 후 헤마톡실린과 에오진 (hematoxylin-eosin)으로 관절 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였고, IL-1β, MMP13, Nitrothyrosine, iNOS 등의 발현 조사를 위해 면역조직 화학 염색법으로 ABC (vector laborites, California, USA)를 사용하여 염색하여, 슬라이드에 부착된 절편을 자일렌과 에타올로 탈파라핀과 함수를 시킨 후 3% H₂O₂로 내 인성 과산화효소를 차단시키고 PBS로 수세하였다. 비 특이적인 반응을 차단 후 primary Ab를 4℃에서 16~18 시간 반응시키고 PBS 수세 후 바이오틴이 결합된 이차 항체와 과산화 효소가 결합된 streptavidin반응을 시킨 후 DAB으로 발색시켰다. Mayer’s 헤마톡실린으로 대조염색한 후 수세하고 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

골관절염 모델의 경우 염증성 사이토카인 중 IL-1β의 영향을 가장 많이 받는 것으로 알려져 있으며, 그로인한 중증도 증가가 일어남과 동시에 골 이화작용에 영향을 미치는 MMP13이 동반적으로 증가되는 것으로 보고되어 있어 골관절염 질병 지표로서 확인하였고, 염증반응과 동반 되어 조직내 산화 스트레스를 발현하는 세포들이 증가하기 때문에 iNOS 및 Nitrotyrosine을 확인하였다. (도 6, 도 7, 도 8, 도 9)

면역화학염색 분석 결과 IL-1β, MMP13, iNOS의 경우 부형제대조군 대비 CML 17001 200 mg/kg, CML 17001 400 mg/kg 군에서 감소되었지만 유의성은 없었고, Nitrotyrosine의 경우 부형제대조군 대비 CML 17001 200 mg/kg, CML 17001 400 mg/kg, Rayla 200 mg/kg군에서 유의적으로 감소되었다. (*P<0.05, **P<0.01) (도 10)

하기에 본 발명의 추출물 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다. 생약추출물 혼합물의 종류와 조성비는 수요 계층이나 수요국가, 사용용도 등에 따라서 그 배합비를 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 1 : 정제의 제조

실시예 1에 따라 제조된 생약추출물 혼합물(CML 16002) 약 300.4 mg에 결정셀룰로오스 4 mg, 이산화규소 6 mg, 해조분말 30 mg, 말토덱스트린 60 mg, 유당혼합분말 21.1 mg 및 에탄올 적량을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 8.5 mg을 가하여 혼합한 후, 1 정이 500 mg이 되도록 타정하였다.

제제예 2 : 캅셀제의 제조

실시예 1에 따라 제조된 생약추출물 혼합물(CML 16002) 약 300.4 mg에 결정셀룰로오스 4 mg, 스테아린산 마그네슘 8.5 mg, 이산화규소 6 mg, 해조분말 30 mg, 말토덱스트린 60 mg, 유당혼합분말 21.1 mg을 균질하게 혼합하여 1 캅셀에 500 mg이 함유되도록 충전하였다.

Claims (11)

1. 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물 및 생강 추출물을 포함하는 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하고,
   상기 생약추출 혼합물은 건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차 및 생강의 2~20배 중량의 물 또는 알코올 또는 혼합용매를 가하여 실온에서 1일 내지 2일 동안 추출하여 각 추출물을 얻는 단계;
   상기 각 추출물을 감압농축한 후 40 내지 60℃에서 건조하여 각 건조된 추출물을 얻는 단계; 및
   상기 각 건조된 추출물을 혼합하는 단계;를 통해 얻어지는 것이며,
   상기 생약추출 혼합물은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물 및 생강 추출물이 1.6~2.4:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2 의 중량비로 혼합된 생약추출 혼합물인 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
6. 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물을 포함하는 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하고,
   상기 생약추출 혼합물은 건조된 보스웰리아 수지, 포도씨, 강황, 녹차, 생강 및 백미의 2~20배 중량의 물 또는 알코올 또는 혼합용매를 가하여 실온에서 1일 내지 2일 동안 추출하여 각 추출물을 얻는 단계;
   상기 각 추출물을 감압농축한 후 40 내지 60℃에서 건조하여 각 건조된 추출물을 얻는 단계; 및
   상기 각 건조된 추출물을 혼합하는 단계;를 통해 얻어지는 것이며,
   상기 생약추출 혼합물은 보스웰리아 추출물, 포도씨 추출물, 강황 추출물, 녹차 추출물, 생강 추출물 및 백미 추출물이 3.2~4.8:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:1.6~2.4 의 중량비로 혼합된 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물..
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 6항에 있어서, 상기 생약추출 혼합물 이외의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
10. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 및 패치제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
11. 제 6항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

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