KR20140144262A - 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물 및 단백질의 나이트록실화를 위한 이의 사용 방법 - Google Patents

숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물 및 단백질의 나이트록실화를 위한 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140144262A
KR20140144262A KR1020147030716A KR20147030716A KR20140144262A KR 20140144262 A KR20140144262 A KR 20140144262A KR 1020147030716 A KR1020147030716 A KR 1020147030716A KR 20147030716 A KR20147030716 A KR 20147030716A KR 20140144262 A KR20140144262 A KR 20140144262A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
hemoglobin
lysine
nitroxylated
peg
Prior art date
Application number
KR1020147030716A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102076874B1 (ko
Inventor
킴 디. 반데그리프
아쇼크 말라발리
그넬 므크리찬
Original Assignee
생가트, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 생가트, 인코포레이티드 filed Critical 생가트, 인코포레이티드
Publication of KR20140144262A publication Critical patent/KR20140144262A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102076874B1 publication Critical patent/KR102076874B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/416—2,5-Pyrrolidine-diones with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to other ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)

Abstract

본 발명은 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물 및 이러한 화합물의 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 나이트록실화된 단백질, 예를 들면 나이트록실화된 헴 단백질(예를 들면, 나이트록실화된 헤모글로빈 및 나이트록실화된 미오글로빈)을 제조하기 위한, 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물의 용도에 관한 것이다. 나이트록실화된 단백질은 임의로 또한 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)에 접합된다. 폴리나이트록실화된 헴 단백질은 산소 치료제(OTA)로서 유용하다. 본 발명은 추가로 나이트록실화된 단백질의 약제학적 조성물 및 다양한 병증의 치료에서의 나이트록실화된 단백질의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물 및 단백질의 나이트록실화를 위한 이의 사용 방법{SUCCINIMIDE-ACTIVATED NITROXYL COMPOUNDS AND METHODS FOR THE USE THEREOF FOR NITROXYLATION OF PROTEINS}
본 발명은 일반적으로 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물 및 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물의 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 나이트록실화된 단백질, 예를 들면 나이트록실화된 헴(heme) 단백질(예를 들면, 나이트록실화된 헤모글로빈 및 나이트록실화된 미오글로빈)을 제조하기 위한 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물의 용도에 관한 것이다. 나이트록실화된 단백질은 임의로 또한 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)에 접합된다. 폴리나이트록실화된 헴 단백질은 산소 치료제(oxygen therapeutic agent: OTA)로서 유용하고 분자 산소, 일산화탄소, 일산화질소 및 이들의 혼합물을 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명은 나이트록실화된 단백질의 약제학적 조성물 및 다양한 병증의 치료에서의 나이트록실화된 단백질의 사용 방법을 추가로 포함한다.
헤모글로빈 기반 산소 캐리어(hemoglobin-based oxygen carrier: "HBOC")는 헴에 의한 일산화질소(NO) 소거에 기여하는 혈관수축과 오랫동안 관련되어 왔다. 산소 치료제(때때로 "산소 운반 혈장 증량제"라 칭함), 예컨대 안정화 헤모글로빈(Hb)으로서 유용한 산소 캐리어는 일산화질소를 소거하여 혈관수축 및 고혈압을 야기하므로 제한된 효과를 갖는 것으로 나타났다. 혈관수축을 야기하는 이 산소 운반 용액의 성향은 동물 및 사람에서 고혈압으로 나타날 수 있다. HBOC의 혈관수축 효과에 기초한 기전이 잘 알려져 있지 않지만, 헴철이 강력한 혈관확장제인 내생 NO와 신속히 비가역적으로 조합되어 혈관수축을 야기할 수 있다는 것이 제시되었다.
부분적으로 이 혈관수축 효과 때문에, 현재까지 산소 캐리어는 산소 치료제(OTA)로서 전적으로 성공적이지 않지만, 변형 세포 비함유 Hb를 포함하는 제품이 가장 유망하다. 미국 국방부가 모델 대용 적혈구로서 비스-다이브로모살리실-퓨마레이트를 갖는 α-사슬 간에 가교결합된 인간 Hb(ααHb)를 개발하였지만, 심각한 폐 및 전신 혈관 저항 증가를 나타낸 후 이를 포기하였다(Hess, J. et al., 1991, Blood 78:356A). 이 제품의 상업적 버전은 실망스러운 III상 임상 실험 후 또한 포기되었다(Winslow, R. M., 2000, Vox Sang 79:1-20).
Hb의 NO 결합 활성을 극복하도록 시도하는 데 있어서 2가지 분자 접근법이 제기되었다. 제1 접근법은 NO 결합 친화도가 감소한 재조합 헤모글로빈을 생성하고자 하는 시도로 원위 헴 포켓의 자리 지정 돌연변이유발을 이용하였다(Eich, R.F. et al., 1996, Biochem. 35:6976-83). 제2 접근법은 화학 변형 접근법을 이용하였고, 여기서 혈관 공간으로부터 간질 공간으로의 Hb의 유출을 감소시키거나 가능하게는 완전히 억제하고자 하는 시도로 올리고머화를 통해 Hb의 크기가 증대되었다(Hess, J.R. et al., 1978, J. Appl. Physiol. 74:1769-78; Muldoon, S.M. et al., 1996, J. Lab. Clin. Med. 128:579-83; Macdonald, V.W. et al., 1994, Biotechnology 22:565-75; Furchgott, R., 1984, Ann. Rev. Pharmacol. 24:175-97; 및 Kilbourne, R. et al., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:155-62).
사실, 탑-로드(top-load) 래트 실험에서 덜 혈압 상승시키는 NO에 대한 회합 결합 속도가 감소한 재조합 Hb가 제조되었다(Doherty, D.H. et al. 1998, Nature Biotechnology 16:672-676 및 Lemon, D.D. et al . 1996, Biotech 24:378). 그러나, 연구는 NO 결합이 Hb의 혈관활성에 대한 유일한 설명이지 않을 수 있다고 제시한다. 특정한 큰 Hb 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)에 의해 변형된 것은 이의 NO 회합 속도가 심각하게 혈압 상승시키는 ααHb와 동일하더라도 실질적으로 혈관수축이 없다는 것이 발견되었다(Rohlfs, R.J. et al. 1998, J Biol. Chem. 273:12128-12134). 더욱이, PEG-Hb가 출혈 전에 교환 수혈로서 제공될 때 출혈의 결과를 방지하는 데 이례적으로 효과적인 것으로 발견되었다(Winslow, R.M. et al. 1998, J. Appl. Physiol. 85:993-1003).
Hb에 대한 PEG의 접합은 이의 항원성을 감소시키고 이의 순환 반감기를 연장한다. 그러나, PEG 접합 반응은 αβ-이합체 아단위로의 Hb 사합체의 해리를 발생시켜 40,000달톤("Da") 미만의 Hb 단량체 단위의 PEG-접합체를 투여받은 교환 수혈된 래트에서 그로스 헤모글로빈뇨증을 발생시키는 것으로 보고되었다(Iwashita and Ajisaka Organ-Directed Toxicity: Chem. Indicies Mech., Proc. Symp., Brown et al. 1981, Eds. Pergamon, Oxford, England pgs 97-101). 엔존, 인크.(Enzon, Inc.(미국 특허 제5,650,388호)는 α- 및 ε-아미노기에서 Hb에 연결된 약 10개의 카피의 PEG-5,000 사슬을 보유하는 분자량이 84,000달톤 초과인 폴리알킬렌 옥사이드("PAO") 접합 Hb를 제조하였다. 이 치환도는 포유동물에서 헤모글로빈뇨증과 관련된 임상적으로 유의적인 신독성을 회피하는 것으로 기재되어 있다. 그러나, 접합 반응은 이질성 접합체 집단을 발생시키고 칼럼 크로마토그래피에 의해 제거되어야 하는 다른 원치 않는 반응물을 포함한다.
생물분자의 표면에서 활성화 PEG 모이어티와 작용기의 반응을 통해 PEG 접합을 통상적으로 수행한다. 가장 흔한 작용기는 라이신의 아미노기, 히스티딘 잔기의 이미다졸기 및 단백질의 N-말단; 시스테인 잔기의 티올기; 및 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기의 하이드록실기 및 단백질의 C-말단이다. 하이드록실 말단을 온화한 수성 환경에서 이 작용기와 반응할 수 있는 반응성 모이어티로 전환함으로써 PEG는 보통 활성화된다. 치료학적 생물의약품의 접합에 사용되는 가장 흔한 1작용성 PEG 중 하나는 오직 1개의 작용기(즉, 하이드록실)를 가져, 2작용성 PEG와 관련된 가교결합 및 응집 문제를 최소화하는 메톡시-PEG("mPEG-OH")이다. 그러나, mPEG-OH는 대개 고분자량 2작용성 PEG(즉, "PEG 다이올")로 오염되고, 이는 이의 제조 공정으로 인해 10% 내지 15% 범위만큼 높을 수 있다(Dust J.M. et al. 1990, Macromolecule 23:3742-3746). 이 2작용성 PEG 다이올은 바람직한 1작용성 PEG의 크기의 거의 2배이다. 오염 문제점은 PEG의 분자량이 증가하면서 더 악화된다. mPEG-OH의 순도는 PEG화 생물치료제의 제조에 특히 중요한데, 왜냐하면 FDA가 높은 수준의 제조 공정의 재현성 및 최종 약물 제품의 품질을 요구하기 때문이다.
산소화 상태 및 탈산소화 상태 둘 다에서 PAO에 대한 Hb의 접합을 수행한다. 미국 특허 제6,844,317호는 생성된 PEG-Hb 접합체의 산소 친화도를 증대시키기 위해 접합 전에 Hb를 대기와 평형화시킴으로써 산소화 또는 "R" 상태에서의 Hb를 접합하는 것을 기술한다. 다른 특허는 산소 친화도를 감소시키고 구조 안정성을 증가시켜 Hb가 화학 변형의 물리적 응력, 정용여과 및/또는 무균 여과 및 저온살균을 견디도록 하게 하는 접합 전의 탈산소화 단계를 기술한다(미국 특허 제5,234,903호). Hb의 분자내 가교결합을 위해, 변형 전에 Hb를 탈산소화하는 것은 α-사슬의 99번 라이신을 가교결합 시약에 노출시키는 것을 요할 수 있는 것으로 제시되었다(미국 특허 제5,234,903호).
아카르야(Acharya) 등(미국 특허 제7,501,499호)은 PEG와의 접합 전의 2-이미노티올란에 의한 Hb 티올화의 동력학을 조사하였다. 10배(사합체당 평균 5개의 외재성 티올을 도입함)로부터 30배로 이미노티올란의 농도를 증가시키는 것은 Hb에서 외재성 티올의 수를 거의 2배로 만드는 것으로 관찰되었다. 그러나, 티올 수의 2배에도 불구하고 PEG 접합이 오직 미미한 후 크기 증대가 관찰되었다. 이는 20배 몰 초과의 말레이미딜 PEG-5000의 존재 하의 접합 반응이 덜 반응성인 티올을 갖는 Hb의 표면을 덮어, 더 반응성인 티올을 갖는 Hb의 추가의 변형을 견디는 입체 장애를 발생시킨다는 것을 제시한다. 결과적으로, 변형된 Hb의 원하는 접합도(즉, Hb 분자당 6±1개의 PEG)를 성취하기 위해, 아카르야 등은 Hb를 8 내지 15 몰 초과의 이미노티올란으로 티올화하고 이후 티올화된 Hb를 16-30배 몰 초과의 말레이미딜 PEG-5000과 반응시켰다. 그러나, 대규모 제조에서의 이 높은 몰 초과 반응물 농도는 HBOC를 제조하는 비용을 유의적으로 증가시키고 최종 생성물의 이질성을 증가시킨다. 더욱이, 이러한 높은 몰 초과의 말레이미딜 PEG-5000은 또한 더 많은 수의 원치않는 부산물의 생성과 함께 더 이질성인 생성물을 생성시킨다.
선행 연구에서, 표면 개질된 헤모글로빈의 분자 크기가 신장에 의해 청소되는 것을 피하고 원하는 순환 반감기를 성취하도록 충분히 커야 한다는 것이 관찰되었다. 블루멘스테인, 제이.(Blumenstein, J.) 등은 84,000달톤("Da") 이상의 분자량에서 이것이 성취된다고 결론지었다("Blood Substitutes and Plasma Expanders," Alan R. Liss, editors, New York, N.Y., pages 205-212 (1978)). 이 연구에서, 저자는 다양한 분자량의 덱스트란을 Hb에 접합하였다. 저자는 Hb(64,000Da의 분자량을 가짐) 및 덱스트란(20,000Da의 분자량을 가짐)의 접합체가 "순환으로부터 무시할만하게 신장을 통해 천천히 청소된다"고 보고하였다. 추가로, 84,000Da 초과의 분자량 증가가 이 청소율 곡선을 유의적으로 변경시키지 않는 것으로 관찰되었다. 분자내 가교결합은 사합체 헤모글로빈 단위의 아단위와 함께 화학적으로 결합하여 신장에 의해 조기 배설되는 이합체의 형성을 방지한다. (예를 들면, 미국 특허 제5,296,465호 참조).
나이트록사이드는 염증성 질환의 동물 모델에서 산화 손상을 약화시키고 생체 이용 가능한 NO 가스를 보존하는 저독성의 널리 공지된 항산화제 화합물이다. 이들은 원칙적으로 SOD 모방체 또는 라디칼 소거제로서 작용함으로써 보호 효과를 발휘하는 것으로 생각된다. 따라서, 폴리나이트록실화된 화합물은 항산화제 및 소염 특성을 갖는다. 이는 혈관 이완을 증대시키는 것으로 보고된 일산화질소(NO) 도너 분자와 HBOC를 조합하는 것과 혼동되지 않아야 한다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2010/0311657호를 참조한다. 그러나, SOD 모방 나이트록사이드는 이의 작은 크기로 인해 짧은 혈장 반감기를 갖고 따라서 생체내 이 분자의 항산화 효과를 유지시키기 어렵다.
상기를 고려하면, 혈관수축 및 고혈압을 야기하지 않고 항산화제 및 소염 특성을 갖는 산소 치료제에 대한 당해 분야의 수요가 존재한다.
더욱이, 나이트록실화제로서 사용하기 위한 나이트록사이드를 활성화하는 현재의 방법은 다단계이고 비싼 공정이다. 따라서, 나이트록실화제로서 사용하기 위한 활성화 나이트록사이드 화합물을 만드는 단순하고 저렴한 방법에 대한 당해 분야의 수요가 존재한다.
본 발명의 일 양태는 하기 화학식 (I)의 나이트록실화제에 관한 것이다:
Figure pct00001
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며; Y는 CH2이고; n은 0 또는 1이며; m은 0 또는 1이다.
본 발명의 다른 양태는 하기 화학식 (III)을 갖는 화합물을 유기 염기의 존재 하에 N,N'-다이숙신이미딜 카보네이트(DSC)와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (II)의 나이트록실화제의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00002
Figure pct00003
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며; Y는 CH2이고; m은 0 또는 1이다.
본 발명의 또 다른 양태는 또한 하기 화학식 (V)를 갖는 화합물을 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC)의 존재 하에 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (IV)의 나이트록실화제의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00005
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; Y는 CH2이며; m은 0 또는 1이다.
추가의 양태는 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함하는 나이트록실화된 단백질이고, 나이트록실화된 단백질은 하기 구조 (VI)을 가질 수 있다:
Figure pct00006
식 중, Z는 단백질이고; R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이며; X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이고; Y는 CH2이며; m은 0 또는 1이고; n은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이며, -NH-기는 단백질의 아민기이고, N은 단백질 중의 질소이다.
본 발명의 또 다른 양태는 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있는 나이트록실화된 단백질이고, 나이트록실화된 단백질은 하기 구조 (VII)을 갖는다:
Figure pct00007
식 중, Z는 단백질이고; R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이며; Y는 CH2이고; m은 0 또는 1이며; n은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이고; -NH-기는 단백질의 아민기이며, N은 단백질 중의 질소이다.
다른 양태는 말레이미드-PEG인 접합 PEG를 갖는 나이트록실화된 단백질이고, 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티에 접합되거나 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG는 하기 구조 (VIII)을 갖는다:
Figure pct00008
식 중, Z는 단백질이고; S는 단백질 중의 티올기이며, R3은 알킬렌 또는 페닐렌기이고, X는 말단기이며, m은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이고, n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수를 나타낸다.
추가의 양태는 말레이미드-PEG인 접합 PEG를 갖는 나이트록실화된 단백질이고, 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티에 접합되거나 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG는 하기 구조 (VIII)을 갖는다:
Figure pct00009
식 중, Z는 단백질이고; S는 단백질 중의 티올기이며, R3은 알킬렌 또는 페닐렌기이고, X는 말단기이며, m은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이고, n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 단백질을 하기 화학식 (IV)의 나이트록실화제와 반응시키는 단계를 포함하는, 나이트록실화된 단백질의 제조 방법이다:
Figure pct00010
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; Y는 CH2이며; m은 0 또는 1이다.
제G2항의 방법으로서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 -CH3이다.
추가의 양태는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용하여 나이트록실화된 단백질을 제조하는 방법이고, 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG는 하기 구조 (VIII)을 갖는다:
Figure pct00011
식 중, Z는 단백질이고, R3은 알킬렌 또는 페닐렌기이며, S는 단백질 중의 티올기이고, m은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이며, n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수를 나타낸다.
도 1은 4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실(TEMPOL)의 ESI-TOF 고정확성 질량 분광법의 결과를 나타낸 도면;
도 2는 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)의 분자 구조를 확인시켜주는 ESI-TOF 고정확성 질량 분광법의 결과를 나타낸 도면;
도 3은 TEMPOL, N'-다이숙신이미딜 카보네이트(DSC), N-하이드록시-숙신이미드(NHS), 6시간 시점에서 TEMPOL과 DSC의 반응으로부터 얻은 반응 생성물 및 최종 4-STC 반응 생성물에서 수행된 박층 크로마토그래피(TLC)를 나타낸 도면;
도 4는 폴리나이트록실화(PN-MP4) 전 및 후 둘 다에서 TEMPOL 및 PEG화 헤모글로빈(MP4)에 대한 전자 상자성 공명(EPR) 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 5는 PEG화 헤모글로빈(PEG-Hb) 및 폴리나이트록실화된 PEG화 헤모글로빈(PEG-Hb-PN)의 크기 배제 분석 프로필을 나타낸 도면;
도 6은 폴리나이트록실화된 PEG화 헤모글로빈(PEG-Hb-PN)에 대한 특징적인 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 7은 래트에 대한 PEG-Hb-PN의 투여 후 혈장 헤모글로빈에 대한 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 8은 PEG화 헤모글로빈에 비해 1:5 내지 1:100의 몰 초과에서 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)를 사용하여 PEG화 헤모글로빈이 나이트록실화된 실험의 대표적인 결과를 나타낸 도면;
도 9 및 도 13은 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA)에 대한 MALDI-TOF 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 10 내지 도 12 및 도 14 내지 도 16은 HSA에 비해 1:5 내지 1:100의 몰 초과에서 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트를 사용하여 폴리나이트록실화된 HSA에 대한 MALDI-TOF 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 17은 HSA에 비해 1:5 내지 1:100의 몰 초과에서 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)를 사용하여 HSA가 나이트록실화된 실험의 대표적인 결과를 나타낸 도면.
정의
용어 "일," "한" 또는 "하나"가 본 개시내용에 사용될 때, 달리 기재되지 않은 한, 이들은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "활성화 폴리알킬렌 옥사이드" 또는 "활성화 PAO"는 적어도 하나의 작용기를 갖는 PAO 분자를 의미한다. 작용기는 PAO와 접합하고자 하는 분자 상의 유리 아민, 설프하이드릴 또는 카복실기와 상호작용하는 반응성 모이어티이다. 예를 들면, 유리 설프하이드릴과 반응하는 이러한 하나의 작용기는 말레이미드기이다. 유리 아민과 반응하는 작용기는 숙신이미드기이다.
"데옥시헤모글로빈" 또는 "비리간드화 헤모글로빈"은 외인성 리간드가 헴에 결합되지 않은 임의의 헤모글로빈을 의미한다.
"헤모글로빈" 또는 "Hb"는 일반적으로 산소를 수송하는 헴 단백질을 의미한다. 인간에서, Hb의 각각의 분자는 4개의 아단위, 2개의 α-사슬 아단위 및 2개의 β-사슬 아단위를 갖고, 이들은 사합체 구조로 배열된다. 각각의 아단위는 제2철(Fe2+)에서 리간드 O2, NO 또는 CO를 결합시키는 철 함유 중심인 1개의 헴기를 또한 포함한다. 따라서, 각각의 Hb 분자는 4개 이하의 리간드 분자를 결합시켜, 각각 HbO2, HbNO 또는 HbCO 리간드화 화합물을 만들 수 있다. 추가로, 헤모글로빈은 O2, NO 및 CO의 혼합물과 리간드화될 수 있다.
"헤모글로빈 기반 산소 캐리어"(HBOC)는 산소를 운반하지만, 다른 분자 가스, 예컨대 일산화탄소 및 일산화질소를 운반하는 데 또한 유용한 헤모글로빈을 의미한다.
"높은 산소 친화도"는 간질 유리 헤모글로빈(stroma free-hemoglobin: SFH)보다 큰 산소 친화도를 나타내도록 변형된 헤모글로빈을 의미한다. 따라서, "높은 산소 친화도" Hb는 37℃ 및 pH 7.4에서 측정된 때에 P50이 15mmHg인, SFH보다 낮은 P50을 갖는다.
"리간드화 헤모글로빈"은 외인성 리간드가 헴에 결합된 헤모글로빈을 의미한다. 보통의 바람직한 리간드는 산소, 일산화탄소 및 일산화질소를 포함한다.
"MalPEG"는 말레이미딜 폴리에틸렌 글라이콜을 의미하고, 링커를 통해 폴리에틸렌 글라이콜에 부착된 말레이미딜 모이어티를 포함한다.
"MalPEG-Hb"는 말레이미딜-활성화 PEG가 접합된 Hb를 의미한다. MalPEG를 Hb 상의 티올기(및 적은 정도로, 아미노기)와 반응시켜 MalPEG-Hb를 형성함으로써 접합을 수행한다. 티올기는 βCys 93에서의 2개의 내재성 티올과 같이 Hb의 아미노산 서열에 존재하는 시스테인 잔기에서 발견되고, 티올기를 포함하도록 표면 아미노기를 변형시킴으로써 또한 도입될 수 있다. MP4(Sangart, Inc.)로서 공지된 예시적인 MalPEG-Hb는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00012
식 중, Hb는 헤모글로빈이고; S는 헤모글로빈 상의 티올기이며; n은 5,000달톤 폴리알킬렌 옥사이드 중합체의 옥시에틸렌 단위의 수이고; m은 헤모글로빈에 접합된 말레이미딜-활성화 폴리알킬렌 옥사이드 중합체의 평균 수이며, 7 내지 8이다.
"메트헤모글로빈" 또는 "metHb"는 제2철 상태의 철을 포함하는 Hb의 산화 형태를 의미한다. MetHb는 산소 또는 CO 캐리어로서 기능하지 않는다. 본 명세서에 사용되는 용어 "메트헤모글로빈(%)"은 전체 Hb에 대한 산화된 Hb의 백분율을 의미한다.
"메톡시-PEG" 또는 "mPEG-OH"는 히드록실 말단의 수소가 메틸(-CH3)기로 대체된 PEG를 의미한다.
"변형된 헤모글로빈" 또는 "변형된 Hb"는 화학 반응, 예컨대 분자내 및 분자간 가교결합, 중합, 접합 및/또는 재조합 기법에 의해 변경되어 Hb가 더 이상 그의 "네이티브" 상태에 있지 않은 Hb를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "헤모글로빈" 또는 "Hb"는, 달리 기재되지 않은 한, 네이티브 비변형된 Hb 및 변형된 Hb 둘 다를 의미한다.
"아질산염 환원효소 활성" 또는 "NRA"는 아질산염을 일산화질소로 환원시키는 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 기반 단백질의 능력이다. "최대 아질산염 환원효소 활성"은 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 기반 단백질이 아질산염을 일산화질소로 환원시킬 수 있는 최대 속도이다. "초기 아질산염 환원효소 활성"은 아질산염이 완전 탈산소화된 단백질에 첨가될 때 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 기반 단백질이 아질산염을 일산화질소로 환원시키는 초기 속도이다.
용어 "비산소화"는 헴 단백질 또는 헤모글로빈이 비리간드화, 탈산소화 상태로 존재하거나 O2 이외의 가스, 예컨대 NO 또는 CO로 리간드화된 것을 의미한다.
"산소 친화도"는 산소 캐리어, 예컨대 Hb가 분자 산소에 결합하는 결합도를 의미한다. 이 특징은 산소 평형 곡선에 의해 정의되고, 이는 산소에 의한 Hb 분자의 포화도(Y 축)를 산소의 분압(X 축)과 상관시킨다. 이 곡선의 위치는 "P50" 값에 의해 표시되고, 이 값은 산소 캐리어가 산소로 반포화된 산소의 분압이고 산소 친화도와 역비례한다. 그러므로, P50이 더 낮을수록, 산소 친화도가 더 높다. 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 전혈(및 전혈의 성분, 예컨대 적혈구 및 Hb)의 산소 친화도를 측정할 수 있다(예를 들면, 문헌[Winslow, R.M. et al., J. Biol. Chem. 1977, 252:2331-37] 참조). 상업적으로 구입 가능한 헤목스(HEMOX)(상표명) 분석기(TCS Scientific Corporation, 미국 펜실베니아주 뉴 호프)를 사용하여 산소 친화도를 또한 결정할 수 있다(예를 들면, 문헌[Vandegriff and Shrager in "Methods in Enzymology" (Everse et al., eds.) 232:460 (1994)); 및 Vandegriff, et al., Anal. Biochem. 256(1): 107-116 (1998)] 참조).
본 명세서에 사용되는 용어 "산소 치료제"는 분자 산소에 결합하고 이를 필요로 하는 세포/조직/장기에 이를 운반할 수 있는 헴 단백질을 의미한다. CO 또는 NO 리간드화 헴 단백질의 형태로 투여될 때, CO 또는 NO가 헴 모이어티로부터 방출되면, 헴기는 분자 산소에 결합하고 이를 운반할 수 있다.
"폴리에틸렌 글라이콜" 또는 "PEG"는 일반식 H(OCH2CH2)n OH의 중합체를 의미하고, "n"은 4 이상, 바람직하게는 약 45 내지 약 500, 더 바람직하게는 약 70 내지 약 250, 가장 바람직하게는 약 90 내지 약 140 또는 약 115이다. 중합체는 치환되거나 비치환될 수 있고, 말단 히드록시기는 상이한 종래의 말단기, 예컨대 메톡시 또는 카복시로 대체될 수 있다. PEG는 많은 공급원(예를 들면, 카보왁스(Carbowax)(상표명)(다우 케미컬(Dow Chemical), 미국 미시간주 미드랜드), 폴리-지(Poly-G)(등록상표)(아르치 케미컬즈(Arch Chemicals), 미국 코네티컷주 노워크) 및 솔베이스(Solbase))로부터 상업적으로 구입 가능하다.
"폴리에틸렌 글라이콜 접합 헤모글로빈", "PEG-Hb 접합체" 또는 "PEG-Hb"는 적어도 하나의 PEG가 공유 결합된 Hb를 의미한다.
"용액"은 액체 혼합물을 의미하고, 용어 "수용액"은 약간의 물을 포함하고 다성분 용액을 형성하기 위해 물과 함께 하나 이상의 다른 액체 물질을 또한 포함할 수 있는 용액을 의미한다.
"간질 비함유 헤모글로빈" 또는 "SFH"는 적혈구 막이 제거된 Hb를 의미한다.
"표면 개질된 헤모글로빈"은 화학 그룹, 보통 중합체가 부착된 헤모글로빈, 예컨대 덱스트란 또는 폴리알킬렌 옥사이드를 의미한다. 용어 "표면 개질 산소화된 헤모글로빈"은 이것이 표면 개질될 때 "R" 상태에 있는 Hb를 의미한다.
"말단 활성"은 헴 단백질 또는 헤모글로빈의 반응성 기와 반응할 수 있는 모이어티로 작용기화된 PAO의 백분율의 표시이다. "100% 말단 활성"은 모든 PAO가 헴 단백질 또는 헤모글로빈의 반응성 기와 반응할 수 있는 모이어티를 갖는다는 것에 기초하여 접합 반응에 사용된 PAO의 몰 초과가 표시된다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 이용 가능한 Mal-PEG가 80% 말단 활성을 가져 PEG의 80%가 Mal로 작용기화되고 Mal-PEG가 헤모글로빈에 비해 20배 몰 초과로 사용되는 경우, 이 몰 비는 100% 말단 활성에 기초하여 헤모글로빈에 비해 16배 몰 초과의 Mal-PEG로 표시될 수 있다.
"티올화"는 분자 상의 설프하이드릴기의 수를 증가시키는 과정을 의미한다. 예를 들면, 단백질을 2-이미노티올란("2-IT")과 반응시키는 것은 단백질의 표면 상의 유리 아민을 설프하이드릴기로 전환시킨다. 이후, 티올 반응성 모이어티, 예컨대 말레이미드와의 반응에 이 설프하이드릴기가 이용 가능하다.
"비리간드화 헤모글로빈"은 분자 가스, 예컨대 산소, 일산화탄소 또는 일산화질소에 리간드화되지 않은 적어도 하나의 헴 모이어티를 포함하는 임의의 헤모글로빈을 의미한다. 그러므로, 헤모글로빈은 오직 하나의 헴 모이어티가 분자 가스에 리간드화되지 않은 경우 "비리간드화"된 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "헴 단백질"은 가스, 예컨대 산소, 일산화질소 또는 일산화탄소에 결합하는 헴 모이어티를 보유하는 임의의 단일의 또는 다수의 사슬 단백질을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "나이트록사이드"는 안정한 나이트록사이드 유리 라디칼, 이의 전구체 및 이의 유도체를 의미한다. 상기 용어는 일산화질소 도너 분자와 혼동되지 않는다.
발명의 설명
본 발명은 일반적으로 단백질을 나이트록실화하는 데 사용될 수 있는 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물에 관한 것이다. 예를 들면, 이러한 나이트록실 화합물은 헴 단백질, 예컨대 헤모글로빈을 나이트록실화하는 데 사용될 수 있다. 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물에 의한 헴 단백질의 나이트록실화는 산화 물질, 예컨대 슈퍼옥사이드 및 과산화수소에 의한 NO 및 다른 생물분자의 산화에 대항한다. 본 발명의 폴리나이트록실화된 헴 단백질은 분자 산소, 일산화탄소, 일산화질소 및 이들의 혼합물을 전달할 수 있는 (OTA)로서 유용하다.
숙신이미딜 나이트록사이드 시약
본 발명은 단백질의 아미노기를 나이트록실화하도록 사용될 수 있는 숙신이미딜 나이트록사이드 시약에 관한 것이다. 숙신이미딜 나이트록사이드 시약은 일반적으로 나이트록사이드기, 예를 들면 TEMPO(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-옥실) 또는 PROXYL(2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-N-옥실) 나이트록사이드기에 연결된 숙신이미드를 포함한다. 숙신이미드와 나이트록사이드 사이의 연결은 예를 들면 카복시 연결 또는 카보네이트 연결일 수 있다. 이러한 시약, 예를 들면 나이트록실 숙신이미딜 카보네이트는 고반응성이어서, 단백질의 아민과 숙신이미드 사이의 커플링이 매우 효과적이게 만든다.
예를 들면, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 나이트록실화제에 관한 것이다:
Figure pct00013
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며; Y는 CH2이고; n은 0 또는 1이며; m은 0 또는 1이다.
화학식 (I)의 나이트록실화제는 X, Y, n 및 m이 상기 정의된 바와 같고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 구조를 가질 수 있다.
또한, 화학식 (I)의 나이트록실화제는 R1, R2, R3, R4, Y, n 및 m이 상기 정의된 바와 같고, X가 산소 또는 황인 구조를 가질 수 있다.
추가로, 화학식 (I)의 나이트록실화제는 R1, R2, R3, R4, Y, n 및 m이 상기 정의된 바와 같고, X가 산소인 구조를 가질 수 있다.
화학식 (I)의 나이트록실화제는 또한 Y, n 및 m이 상기 정의된 바와 같고, X가 산소이고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 구조를 가질 수 있다.
추가로, 화학식 (I)의 나이트록실화제는 R1, R2, R3, R4, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, n이 0인 구조를 가질 수 있다.
화학식 (I)의 나이트록실화제는 또한 R1, R2, R3, R4, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, n이 1인 구조를 가질 수 있다.
추가로, 화학식 (I)의 나이트록실화제는 R1, R2, R3, R4, Y 및 n이 상기 정의된 바와 같고, m이 0인 구조를 가질 수 있다.
화학식 (I)의 나이트록실화제는 또한 R1, R2, R3, R4, Y 및 n이 상기 정의된 바와 같고, m이 1인 구조를 가질 수 있다.
예를 들면, 화학식 (I)의 나이트록실화제는 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC), 3-숙신이미딜-PROXYL-카보네이트(3-SPC), 4-숙신이미딜-카복시-TEMPO(4-SCT) 및 3-숙신이미딜-카복시-PROXYL(3-SCP)로부터 선택될 수 있다. 이 화합물의 각각의 구조는 하기 기재되어 있다:
Figure pct00014
4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC; 1-(((2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시)-4-옥시카보닐)옥시)-2,5-피롤리딘다이온)
Figure pct00015
3-숙신이미딜-PROXYL-카보네이트(3-SPC;1-(((2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시)-3-옥시카보닐)옥시)-2,5-피롤리딘다이온)
Figure pct00016
4-숙신이미딜-카복시-TEMPO(4-SCT; 1-(((2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시)-4-카보닐)옥시)-2,5-피롤리딘다이온)
Figure pct00017
3-숙신이미딜-카복시-PROXYL(3-SCP; 1-(((2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시)-3-카보닐)옥시-2,5-피롤리딘다이온).
예를 들면, 화학식 (I)의 나이트록실화제는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00018
숙신이미딜 나이트록사이드 시약의 합성을 위한 방법
용이하게 구입 가능한 시약을 사용하여 단순한 1단계 활성화 화학을 이용하여 숙신이미딜 나이트록사이드 시약을 합성할 수 있다. 더욱이, 활성화 반응을 온화한 조건 하에 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 하기 화학식 (III)을 갖는 화합물을 유기 염기의 존재 하에 N,N'-다이숙신이미딜 카보네이트(DSC)와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (II)의 나이트록실화제의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00019
Figure pct00020
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며; Y는 CH2이고; m은 0 또는 1이다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 X, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, X가 산소 또는 황인 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, X가 산소인 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, X가 산소이고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4, X 및 Y가 상기 정의된 바와 같고, m이 0인 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4, X 및 Y가 상기 정의된 바와 같고, m이 1인 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4, X, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, 유기 염기가 트라이에틸아민(TEA), N,N-다이아이소프로필에틸아민, 4-다이메틸아미노피리딘, 피리딘, N-메틸피페리딘 또는 이들의 조합을 포함하는 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4, X, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, 유기 염기가 트라이에틸아민을 포함하는 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4, X, Y 및 m이 상기 정의된 바와 같고, 유기 염기가 트라이에틸아민을 포함하고, 화학식 (III)의 화합물, N,N'-다이숙신이미딜 카보네이트 및 트라이에틸아민이 약 1:2:3의 비율로 존재하는 화학식 (II) 및 (III)의 구조를 가질 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 임의의 상기 방법에서, 반응을 약 2℃ 내지 약 30℃; 약 15℃ 내지 약 25℃; 약 4℃; 또는 약 20℃의 온도에서 수행할 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 임의의 상기 방법에서, 반응은 약 3시간 내지 약 6시간 동안 진행될 수 있다.
화학식 (II)의 나이트록실화제를 제조하는 임의의 상기 방법에서, 반응을 극성 비양자성 용매 중에 수행할 수 있다. 극성 비양자성 용매는 아세토나이트릴(ACN), 테트라히드로퓨란(THF), 에틸 아세테이트(EtOAc), 아세톤, 다이메틸폼아마이드(DMF), 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 극성 비양자성 용매는 아세토나이트릴을 포함할 수 있다.
4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트의 제조에 대한 반응식이 하기 기재되어 있다.
Figure pct00021
상기 기재된 바대로, 1단계 활성화 화학을 이용하여 4-숙신미딜-TEMPO-카보네이트를 제조하기 위해 4-하이드록시-TEMPO(4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 1-옥실)를 사용한다. 트라이에틸아민의 존재 하의 TEMPOL과 N,N'-다이숙신이미딜-카보네이트의 반응에 의해 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트로의 TEMPOL의 활성화를 성취한다. 하이드록실 나이트록사이드의 -OH기를 탈양성자화하는 촉매(상기 반응식에서의 TEMPOL)로서 유기 염기(상기 반응식에서의 TEA)를 사용하여, 이것을 더 반응성으로 만들어 이것이 친핵체로서 작용하고 N,N'-다이숙신이미딜-카보네이트(DSC)의 친전자 카보닐을 공격할 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 화학식 (V)를 갖는 화합물을 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC)의 존재 하에 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (IV)의 나이트록실화제의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00022
Figure pct00023
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; Y는 CH2이며; m은 0 또는 1이다.
화학식 (IV)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 화학식 (IV) 및 (V)의 구조(여기서, Y 및 m은 화학식 (IV) 및 (V)와 관련하여 상기 정의된 바와 같고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 -CH3임)를 사용할 수 있다.
화학식 (IV)의 나이트록실화제를 제조하는 방법에서, 화학식 (IV)의 화합물, N-하이드록시숙신이미드 및 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드는 약 1:1.1:1.1의 몰 비로 반응 혼합물 내에 존재할 수 있다.
화학식 (IV)의 나이트록실화제를 제조하는 방법은 화학식 (IV) 및 (V)의 구조(여기서, Y 및 R1, R2, R3 및 R4는 화학식 (IV) 및 (V)와 관련하여 상기 정의된 바와 같고, m은 0임)를 사용할 수 있다. 상기 방법은 또한 m이 1인 구조를 사용할 수 있다.
화학식 (IV)의 나이트록실화제를 제조하는 임의의 상기 방법에서, 반응을 약 2℃ 내지 약 30℃; 약 15℃ 내지 약 25℃; 약 4℃; 또는 약 20℃의 온도에서 수행할 수 있다.
화학식 (IV)의 나이트록실화제를 제조하는 임의의 상기 방법에서, 반응은 약 6시간 내지 약 24시간 동안 진행될 수 있다.
화학식 (IV)의 나이트록실화제를 제조하는 임의의 상기 방법에서, 반응을 약 7.2 내지 약 7.6의 pH; 또는 약 7.4의 pH에서 수행할 수 있다.
나이트록실화된 단백질 및 나이트록실화된 PAO -변형된 단백질
본 발명은 또한 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 갖는 나이트록실화된 단백질에 관한 것이다. 나이트록실화된 단백질은 또한 하나 이상의 폴리알킬렌 옥사이드(PAO) 분자, 예를 들면 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 분자에 임의로 접합된다.
단백질의 접합에 사용되는 폴리에틸렌 옥사이드는 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 및 폴리에틸렌/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. PAO는 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤, 바람직하게는 약 3,000 내지 약 10,000달톤, 더 바람직하게는 4,000 내지 약 6,000달톤, 가장 바람직하게는 약 5,000달톤이다. 단백질의 표면을 개질하기 위해 현재 사용되는 가장 흔한 PAO는 이의 약제학적 허용성 및 상업적 이용성으로 인해 PEG이다. PEG는 단백질에 접합된 PEG 분자의 수 및 크기에 기초하여 원하는 분자량을 성취하기 위해 분자 내에 에틸렌 옥사이드(즉, -CH2CH2O-)의 반복 아단위의 수에 기초하여 다양한 분자량으로 이용 가능하다.
PAO 중합체의 말단 기 중 하나 또는 둘 다를 반응성 작용기로 전환시킨다("활성화"). 예를 들면, PEG-OH는 PEG-할라이드, 메실레이트 또는 토실레이트를 제조하기 위해 사용되고, 이들은 이후 수성 암모니아(Zalipsky, S. et al ., 1983, Eur. Polym. J. 19:1177-1183), 나트륨 아지드 또는 칼륨 프탈이미드에 의한 친핵 치환 반응을 수행함으로써 PEG-아민("PEG-NH2")으로 전환된다. 이후, 활성화 PEG를 PEG 아민기(-"NH2")와 단백질의 카복실기("-COOH")와의 상호작용을 통해 단백질에 접합할 수 있다.
PEG를 아민기로 작용기화하고 이를 말레이미드기로 전환하는 것 이외에, 이에 의해 활성화된 PEG는 당해 분야에서 사용되는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, PEG를 몇몇 열거하자면 p-나이트로페닐 카보네이트, 알데히드, 아미노프로필, 아미노에틸, 티올, 아미녹시, 히드라지드 및 요오도아세트아마이드로 활성화할 수 있다. 이러한 작용성 PEG를 공지된 방법을 이용하여 단백질의 표면 아미노산 측쇄에 접합할 수 있다.
PEG-NH2를 카복실 이외의 기에 접합시키도록 추가로 작용기화할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,828,401호는 mPEG-말레이미드를 형성시키기 위한 PEG-NH2와 말레이미드의 반응을 개시한다. 이 반응에서, mPEG-OH를 유기 용매(다이클로로메탄)의 존재 하에 토실화 시약(p-톨루엔설포닐 클로라이드) 및 염기 촉매(트라이에틸렌아민)와 반응시켜 mPEG-토실레이트를 제조한다. 이후, mPEG-토실레이트를 N,N-다이메틸아세트아마이드("DMAc")와 N-사이클로헥실피롤리디논("CHP")의 유기 용매 혼합물 중에 28% 암모니아 물 및 말레산 무수물과 반응시켜 말레암산 화합물을 제조한다. 이후, 이 화합물을 다이클로로메탄의 존재 하에 펜타플루오로페닐트라이플루오로아세테이트와 반응시켜 mPEG-말레이미드를 제조한다.
대안적으로, 유기 용매(다이클로로메탄)의 존재 하에 mPEG-OH를 토실화 시약(p-톨루엔설포닐 클로라이드) 및 염기 촉매(트라이에틸렌아민)와 반응시켜 mPEG-토실레이트를 제조함으로써 mPEG-말레이미드를 만들 수 있다. 이후, mPEG-토실레이트를 28% 암모니아와 반응시켜 mPEG-NH2를 제조한다. 이후, mPEG-NH2를 포화 중탄산나트륨(NaHCO3)의 존재 하에 N-메톡시 카보닐 말레이미드(MCM)와 반응시켜 mPEG-말레이미드를 제조한다.
PAO에 대한 접합을 위해 아민 반응성 화학을 이용하여 변형될 수 있는 인간 Hb의 아미노산 잔기 측쇄의 비제한적인 예가 하기 표 1에 제시되어 있다:
Figure pct00024
Hb에서 이용 가능한 접합 자리의 수를 증가시키는 하나의 방법은 설프하이드릴기를 도입하는 것(티올화로도 공지됨)이고, 이 기는 유리 아민보다 MalPEG와 더 반응성인 경향이 있다. 단백질 티올화에 대한 다양한 방법이 공지되어 있다. 일 방법에서, 단백질 유리 아민을 숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트와 반응시킨 후 다이티오트레이톨("DTT") 또는 트라이스(2-카복시에틸)포스핀("TCEP")으로 환원시킨다. 이 반응은 티올화도를 결정하기 위해 사용될 수 있는 2-피리딘티온 발색단을 방출한다. 아민은 거의 중성 pH에서 숙신이미딜아세틸티오아세테이트, 이어서 50mM 히드록실아민 또는 히드라진과의 반응에 의해 간접적으로 또한 티올화될 수 있다.
미국 특허 제5,585,484호에 기재된 다른 방법은 접합 후 Hb의 아미노(α- 또는 ε-)기의 양전하를 유지시킨다. 이 방법은 단백질에 설프하이드릴기를 도입하기 위해 2-IT에 의한 Hb의 ε-아미노기의 아미딘화를 포함한다. 이 접근법은 이전에 사용된 숙신이미딜 화학물질에 비해 적어도 2가지 추가의 이점을 갖는다: 1) 말레이미드기와 설프하이드릴기의 높은 반응성 및 선택도는 제한된 초과의 시약으로 티올의 거의 정량적 변형을 수월하게 하고, 2) 2-IT의 티올기는 잠재적이고 시약과 단백질 아미노기의 반응의 결과로서 오직 인 시츄 생성된다. 이 이점은 하나의 추가의 이익을 제공하고; 이들은 표면 장식을 위해 Hb와 티올화 및 PEG화 시약 둘 다의 동시 항온처리를 허용한다.
예를 들면, MalPEG는 Hb의 표면 상에 티올기를 도입하도록 Hb의 아민을 티올화함으로써 Hb에 접합될 수 있다. 반응에 이용 가능한 Hb의 2개의 내재성 티올기는 βCys93에 있고, Hb의 표면 상에 첨가된 티올기는 말레이미딜 PAO의 말레이미드와 반응하여 페길화 Hb 접합체를 형성할 수 있다.
말레이미드-PEG는 PEG에 말레이미드를 부착시키는 링커를 포함한다. 링커는 알킬렌, 예컨대 에틸렌, 프로필렌 또는 아이소프로필렌, 페닐렌, 아마이드(-NH-C(O)-) 또는 페닐 카바메이트(예를 들면, -Ph-NH-C(O)-)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
티올 반응성 화학을 이용하여 변형될 수 있는 아미노산 잔기 측쇄의 비제한적인 예는 하기 표 2에 제시되어 있다:
Figure pct00025
접합 반응에 의해 PAO-Hb의 분자량을 조절할 수 있다. 종래의 관념은 반응물의 몰 비의 증가가 Hb에 결합된 PEG 분자의 수를 증가시킨다고 제시하였다. 이는 Hb의 티올화 과정(즉, 티올화제 대 Hb의 몰 비 증가) 및 접합 과정(즉, 티올 활성화 PEG 대 티올화 Hb의 몰 비 증가) 둘 다를 포함한다. 그러나, 이 초과의 몰 비는 Hb당 오직 6±1개의 PEG 분자의 결합을 발생시킨다(미국 특허 제7,501,499호 참조).
최근에, 더 낮은 몰 비의 반응물을 사용하여 더 많은 수의 PAO 분자가 Hb에 결합한다고 결정되었다. 다이티오피리딘 비색 검정을 이용하여 티올화 전에 및 후에 및 접합 후에 Hb 상의 이용 가능한 티올기의 수를 결정하였다(Ampulski, R.S. et al., 1969, Biochem. Biophys. Acta 32:163-169). 인간 Hb는 β93시스테인 잔기에서 2개의 내재성, 반응성 티올기를 포함하고, 이는 다이티오피리딘 반응에 의해 확인되었다. 2-IT에 의한 SFH의 티올화 후, 반응성 티올기의 수는 2개로부터 7개 초과로 증가하였다. 이 예에서, 평균 8개의 PEG 분자가 Hb에 결합하였다. 티올화 반응에서 SFH에 비해 7.5배 몰 초과의 2-IT를 사용하고 접합 반응에서 티올화 Hb에 비해 12배 몰 초과의 MalPEG를 사용하여 이를 성취하였다.
헤모글로빈은 산소화 상태에 있을 때 폴리알킬렌 옥사이드와 접합되어 Hb-PAO 접합체의 산소 친화도를 증가시킨다.
나이트록실화된 단백질
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 갖는다. 나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함하고, 나이트록실화된 단백질은 하기 구조 (VI)을 가질 수 있다:
Figure pct00026
식 중, Z는 단백질이고; R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이며; X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이고; Y는 CH2이며; m은 0 또는 1이고; n은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이며; -NH-기는 단백질의 아민기이고, N은 단백질 중의 질소이다.
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있고, 나이트록실화된 단백질은 R1, R2, R3, R4, Y, m, n 및 Z가 화학식 (VI)과 관련하여 상기 정의된 바와 같고, X가 산소 또는 황인 구조 (VI)을 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있고, 나이트록실화된 단백질은 R1, R2, R3, R4, Y, m, n 및 Z가 화학식 (VI)과 관련하여 상기 정의된 바와 같고, X가 산소인 구조 (VI)을 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있고, 나이트록실화된 단백질은 Y, m, n 및 Z가 화학식 (VI)과 관련하여 상기 정의된 바와 같고, X가 산소이고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 구조 (VI)을 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있고, 나이트록실화된 단백질은 하기 구조 (VII)을 갖는다:
Figure pct00027
식 중, Z는 단백질이고; R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이며; Y는 CH2이고; m은 0 또는 1이며; n은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이고; -NH-기는 단백질의 아민기이며, N은 단백질 중의 질소이다.
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있고, 나이트록실화된 단백질은 X, Y, m, n 및 Z가 화학식 (VI) 또는 (VII)과 관련하여 상기 정의된 바와 같고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 구조 (VI) 또는 (VII)을 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있고, 나이트록실화된 단백질은 R1, R2, R3, R4, X, Y, M, n 및 Z가 화학식 (VI) 또는 (VII)과 관련하여 상기 정의된 바와 같고, m이 0인 구조 (VI) 또는 (VII)을 갖는다.
나이트록실화된 단백질은 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있고, 나이트록실화된 단백질은 R1, R2, R3, R4, X, Y, M, n 및 Z가 화학식 (VI) 또는 (VII)과 관련하여 상기 정의된 바와 같고, m이 1인 구조 (VI) 또는 (VII)을 갖는다.
임의의 상기 나이트록실화된 단백질에서, 적어도 하나의 나이트록실화된 아미노기는 단백질의 N-말단 아미노기 또는 라이신 잔기의 엡실론(ε)-아미노기일 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 적절하게 폴리나이트록실화된 단백질일 수 있다. 예를 들면, 화학식 (VI) 또는 (VII)의 구조를 갖는 나이트록실화된 단백질의 경우, n은 약 1 내지 약 25이거나; n은 적어도 약 2이거나; n은 적어도 약 5이거나; n은 적어도 약 10이거나; n은 약 15 내지 약 20이다.
폴리나이트록실화된 단백질은 폴리나이트록실화된 헴 단백질일 수 있다.
헴 단백질은 본 발명의 실행 시 유용하다. 사합체 헤모글로빈(Hb) 이외에, 이는 단일 사슬(단량체) 천연 또는 재조합 헴 단백질, 예컨대 BMC Structural Biology, 11:13(http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1472-6807-11-13.pdf로 이용 가능)에 기재된 것을 포함한다. 헴 단백질의 다른 예는 문헌[The Journal of Experimental Biology, 201: 1085-1098 (1998)]에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 다양한 Hb를 사용할 수 있다. Hb를 동물 공급원, 예컨대 인간, 소, 돼지 또는 말 헤모글로빈으로부터 얻을 수 있다. 인간 Hb가 바람직하다. Hb를 천연 공급원으로부터 얻거나 공지된 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 헤모글로빈 접합체는 간질 비함유 헤모글로빈보다 큰 높은 산소 친화도를 갖는다. 이는 헤모글로빈이 37℃ 및 pH 7.4에서 측정될 때 15mmHg 미만, 바람직하게는 약 2 내지 약 10mmHg, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 8mmHg 또는 약 2 내지 약 5mmHg의 P50을 갖는다는 것을 의미한다.
예를 들면, 나이트록실화된 단백질은 헤모글로빈 α-아단위, 헤모글로빈 β-아단위, 헤모글로빈 사합체 또는 미오글로빈을 포함할 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 헤모글로빈 α-아단위, 헤모글로빈 β-아단위, 헤모글로빈 사합체, 미오글로빈 또는 알부민을 포함할 수 있다.
나이트록실화된 단백질이 알부민인 경우, 나이트록실화된 단백질은 혈청 알부민을 포함할 수 있다. 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함할 수 있다. HSA는 585개의 아미노산을 갖는 단일 폴리펩타이드이다. BSA는 60개의 라이신, 17쌍의 이황화 브릿지 및 1개의 유리 시스테인을 포함하고, 분자량은 대략 약 67kD이다.
나이트록실화된 단백질은 헤모글로빈 α-아단위 또는 헤모글로빈 β-아단위 또는 헤모글로빈 사합체를 포함할 수 있다. 나이트록실화된 단백질은 동물 헤모글로빈 α-아단위, 동물 헤모글로빈 β-아단위 또는 동물 헤모글로빈 α-아단위 및 β-아단위를 포함하는 헤모글로빈 사합체를 포함할 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 인간 헤모글로빈 α-아단위, 인간 헤모글로빈 β-아단위, 또는 인간 헤모글로빈 α-아단위들과 β-아단위들을 포함하는 헤모글로빈 사합체를 포함할 수 있다.
나이트록실화된 단백질이 헤모글로빈 사합체인 경우, 헤모글로빈은 분자내 가교결합될 수 있다. 분자내 가교결합된 헤모글로빈은 이합체로의 해리를 방지하고 신장에 의해 청소되는 것을 피하고, 순환 반감기를 연장시킨다. Hb를 분자내 가교결합하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 화학 가교결합 시약은 글루타르알데히드(미국 특허 제7,005,414호), 폴리알데히드(미국 특허 제4,857,636호), 다이아스피린(미국 특허 제4,529,719호), 피리독실-5'-포스페이트(미국 특허 제4,529,719호) 트라이메소일트라이스(메틸 포스페이트)(미국 특허 제5,250,665호), 다이알킨(아지드 링커를 갖는 헤모글로빈과의 반응을 위함. 문헌[Foot et al ., Chem. Commun. 2009, 7315-7317; Yang et al ., Chem. Commun. 2010, 46: 7557-7559] 참조)을 포함하고, 헤모글로빈은 재조합 방법론을 통해 가교결합될 수 있다.
예를 들면, 헤모글로빈 사합체는 가교결합된 αα 이합체 또는 가교결합된 ββ 이합체를 포함할 수 있다.
상기 표 1에 기재된 바대로, 인간 헤모글로빈 N-말단 발린 잔기의 α-아단위 및 β-아단위는 N-말단 아미노기 상에 나이트록실화될 수 있다. 또한, 인간 헤모글로빈의 α-아단위 및 β-아단위는 ε-아미노기에서 나이트록실화될 수 있는 다수의 라이신기를 포함한다.
추가로, 나이트록실화된 단백질은 인간 헤모글로빈 α-아단위를 포함할 수 있다. 인간 헤모글로빈 α-아단위는 N-말단 발린 잔기의 α-아미노기에서 나이트록실화될 수 있다. 추가로, 인간 헤모글로빈 α-아단위는 라이신-7, 라이신-11, 라이신-16, 라이신-40, 라이신-56, 라이신-60, 라이신-61, 라이신-90, 라이신-99, 라이신-127, 라이신-139 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 라이신 잔기의 ε-아미노기에서 나이트록실화될 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 또한 인간 헤모글로빈 β-아단위를 포함할 수 있다. 인간 헤모글로빈 β-아단위는 N-말단 발린 잔기의 α-아미노기에서 나이트록실화될 수 있다. 인간 헤모글로빈 β-아단위는 또한 라이신-8, 라이신-17, 라이신-59, 라이신-61, 라이신-65, 라이신-66, 라이신-82, 라이신-95, 라이신-120, 라이신-132, 라이신-144 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 라이신 잔기의 ε-아미노기에서 나이트록실화될 수 있다.
추가로, 나이트록실화된 단백질은 헤모글로빈 사합체를 포함할 수 있고, 헤모글로빈 사합체는 약 17개의 나이트록실화된 아미노기를 포함할 수 있다.
나이트록실화된 및 PAO 접합된 단백질
나이트록실화된 단백질은 또한 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)에 접합될 수 있다. PAO는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)일 수 있다.
PEG는 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤; 약 3,000 내지 약 10,000달톤; 약 4,000 내지 약 6,000달톤; 또는 약 5,000달톤일 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 또한 말레이미드-PEG인 PEG에 접합될 수 있다. 말레이미드는 알킬렌 또는 페닐렌 링커를 통해 PEG에 연결될 수 있다. 알킬렌 링커는 에틸렌 링커일 수 있다.
또한, 나이트록실화된 단백질은 단백질의 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티, 단백질 중의 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 중의 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG인 접합 PEG를 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 말레이미드-PEG인 접합 PEG를 가질 수 있고, 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티에 접합되거나 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG는 하기 구조 (VIII)을 갖는다:
Figure pct00028
식 중, Z는 단백질이고; S는 단백질 중의 티올기이며, R3은 알킬렌 또는 페닐렌기이고, X는 말단기이며, m은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이고, n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수를 나타낸다.
나이트록실화된 단백질은 R3이 에틸렌인 화학식 (VIII)의 구조를 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 m이 약 6 내지 약 10인 화학식 (VIII)의 구조를 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 X가 메톡시(-OCH3) 또는 카복실레이트(-COOH)인 화학식 (VIII)의 구조를 가질 수 있다.
나이트록실화된 단백질은 말레이미드-PEG가 헤모글로빈 β-아단위의 시스테인-93 잔기의 티올 모이어티에 접합된 화학식 (VIII)의 구조를 가질 수 있다.
말레이미드-PEG가 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티에 접합된 화학식 (VIII)의 구조를 갖는 나이트록실화된 단백질. 티올화 라이신 잔기가 라이신-7, 라이신-11, 라이신-16, 라이신-40, 라이신-56, 라이신-60, 라이신-61, 라이신-90, 라이신-99, 라이신-127, 라이신-139 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 α-아단위의 티올화 라이신 잔기인 화학식 (VIII)의 구조를 갖는 나이트록실화된 단백질. 티올화 라이신 잔기가 라이신-8, 라이신-17, 라이신-59, 라이신-61, 라이신-65, 라이신-66, 라이신-82, 라이신-95, 라이신-120, 라이신-132, 라이신-144 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 β-아단위의 티올화 라이신 잔기인 화학식 (VIII)의 나이트록실화된 단백질.
나이트록실화된 헤모글로빈 사합체
본 명세서에 기재된 임의의 하나의 나이트록실화된 헤모글로빈의 적어도 하나의 α-아단위 또는 적어도 하나의 β-아단위를 포함하는 헤모글로빈 사합체.
이 헤모글로빈 사합체는 본 명세서에 기재된 임의의 하나의 나이트록실화된 헤모글로빈의 적어도 하나의 α-아단위 및 적어도 하나의 β-아단위를 가질 수 있다.
헤모글로빈 사합체는 본 명세서에 기재된 임의의 하나의 나이트록실화된 헤모글로빈의 2개의 α-아단위 및 2개의 β-아단위를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 헤모글로빈 사합체로서, 헤모글로빈은 사합체당 평균 5개 내지 10개의 PAO 분자에 접합되고, 헤모글로빈은 사합체당 평균 7.1개 내지 8.9개의 PAO 분자에 접합된 헤모글로빈 사합체.
헤모글로빈 사합체로서, 헤모글로빈이 산소화된 것인 헤모글로빈 사합체.
헤모글로빈 사합체로서, 헤모글로빈이 탈산소화된 것인 헤모글로빈 사합체.
헤모글로빈 사합체로서, 헤모글로빈이 CO, NO, 또는 CO와 NO의 혼합물로 리간드화된 것인 헤모글로빈 사합체.
본 발명의 헤모글로빈 접합체는 산소화 형태 또는 탈산소화 형태에 있거나, CO 또는 NO에 리간드화되거나, 이 4개의 형태 중 2개 이상을 포함하는 혼합물일 수 있다. 비산소화 헤모글로빈을 공기, 순수한 O2 가스 또는 O2/질소 가스 혼합물과 평형화시켜 HbO2를 제조한다.
당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 탈산소화를 수행할 수 있다. 하나의 단순한 방법은 헤모글로빈 용액을 불활성 가스, 예컨대 질소, 아르곤 또는 헬륨에 노출하는 것이다. 탈산소화가 비교적 균일하도록 보장하기 위해, Hb 용액을 이 과정에서 순환시킨다. 코옥시미터 682(Instrument Laboratories)를 사용하여 원하는 수준을 얻기 위한 탈산소화의 모니터링을 수행할 수 있다. 부분 재산소화가 바람직한 경우, 탈산소화된 Hb를 산소 또는 산소를 포함하는 가스 혼합물, 예컨대 공기에 노출할 수 있다.
가스 투과성 막, 예컨대 폴리프로필렌 또는 셀룰로스 아세테이트 막을 통해 분자 산소를 다른 가스로 대체하는 가스 교환을 성취할 수 있다. 예를 들면, 공개 미국 특허 출원 제2006/0234915호를 참조한다. 이 막을 사용하는 상업적으로 구입 가능한 가스 교환 장치는 훽스트-셀라네스(Hoechst-Celanese)(미국 텍사스주 달라스)사제의 셀가드(Celgard)(상표명) 폴리프로필렌 미세다공성 중공 섬유 장치 또는 아메리칸 래버러토리(American Laboratory)(미국 코네티컷주 이스트 라임)사제의 셀팜(Cell-Pharm)(상표명) 중공 섬유 산화기를 포함한다. 훽스트-셀라네스 셀가드(상표명) 장치에서, 10-100㎖/분/ft2에서 폴리프로필렌 미세다공성 중공 필터를 통해 수성 Hb 용액을 통과시킴으로써 산소화된 Hb를 탈산소화하는 반면, 시스템을 5-20psi에서 질소로 퍼징한다. 원하는 백분율의 데옥시Hb를 성취하기 위해 Hb를 약 5 내지 30분 동안 일반적으로 순환시킨다. 탈산소화된 Hb를 제조하는 다른 방법은 Hb 용액을 화학 환원제, 예컨대 나트륨 아스코르베이트, 나트륨 다이티오네이트 및 중아황산나트륨에 노출하는 단계를 포함한다. 환원제 농도, 반응 시간 및 온도를 조정함으로써 Hb는 부분 탈산소화된다. 대안적으로, Hb를 실질적으로 탈산소화하도록 환원제를 사용할 수 있고, 이후 산소를 재도입하여 부분 탈산소화된 생성물을 형성할 수 있다. 예를 들면, 항산화제를 첨가하기 전에 Hb를 약 1시간 동안 중아황산나트륨의 100mM 농도에 노출할 수 있다.
단순히 O2에 대해 CO를 치환함으로써 옥시헤모글로빈을 형성하는 임의의 공지된 방법을 이용하여 Hb를 CO로 리간드화할 수 있다. 이는 헤모글로빈이 O2 대신에 CO와 리간드화되도록 CO의 공급원을 헤모글로빈의 용액에 도입하는 것을 일반적으로 포함한다(K. D. Vandegriff, et al., Biochem. J. 382:183-189(2004)). 헤모글로빈이 산소에 대해서보다 CO에 대해 더 높은 친화도를 가지므로, 처음에 헤모글로빈을 탈산소화하는 것이 필요하지 않을 수 있다. 따라서, CO-Hb 복합체를 형성하는 가장 편리한 방식은 100% 가스 CO를 헤모글로빈의 용액에 도입하는 것이다.
탈산소화된 헤모글로빈을 일산화질소 가스와 반응시킴으로써 또는 NO가 CO에 교환하도록 CO-Hb를 NO 가스에 노출함으로써 HbNO를 제조할 수 있다. 탈산소화된 헤모글로빈을 프롤리 노노에이트(PROLI NONOate)(상표명)(즉, 1-(히드록시-NNO-아족시)-L-프롤린, 이나트륨염; 카이만 케미컬(Cayman Chemical), 미국 미시간주 앤 아버)와 같은 작은 NO-도너 분자와 반응시킴으로써 HbNO를 또한 만들 수 있다.
자유 라디칼인 NO가 글로빈 사슬에서의 아미노산 측기에 결합된 헤모글로빈이 본 명세서에 정의된 NO-Hb 복합체가 아니라는 것에 유의해야 하는데, 왜냐하면 이 화합물이 산소 대신에 헴 포켓에서 리간드로서 이원자성(비이온성) NO를 포함하지 않기 때문이다. 예를 들면, 네이티브 헤모글로빈이 유리 설프하이드릴기에 결합하도록 하는 조건 하에 이를 NO 도너에 노출할 때 나이트로실헤모글로빈이 형성된다(미국 특허 제6,627,738호). 이 나이트로실헤모글로빈은 여전히 산소를 운반하는 반면, 본 발명의 NO-Hb 복합체는 그렇지 않다. 더욱이, 상기 기재된 것과 같은 설프하이드릴 모이어티에 지향된 반응에 의해 변형된 헤모글로빈을 형성할 때, 이 모이어티는 NO 결합에 더 이상 이용 가능하지 않다.
단백질 및 PAO 변형된 단백질의 나이트록실화 방법
본 발명은 또한 PAO 변형된 단백질을 포함하는 단백질의 나이트록실화 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 자리 특이적 나이트록실화를 제공하고 양호한 반응 조건 하에 수행될 수 있다. 이 방법을 이용하여 제조된 나이트록실화-PEG화 헤모글로빈은 증대된 순환 시간 및 단백질 안정성 및 높은 산소 친화도를 갖는다.
단백질을 하기 화학식 (II)의 나이트록실화제와 반응시킴으로써 나이트록실화된 단백질을 제조할 수 있다:
Figure pct00029
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며; Y는 CH2이고; m은 0 또는 1이다.
화학식 (II)의 나이트록실화제가 화학식 (II)와 관련하여 상기 정의된 바와 같은 R1, R2, R3, R4, Y 및 m을 갖고, X가 산소 또는 황인 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
화학식 (II)의 나이트록실화제가 화학식 (II)와 관련하여 상기 정의된 바와 같은 R1, R2, R3, R4, Y 및 m을 갖고, X가 산소인 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
화학식 (II)의 나이트록실화제가 화학식 (II)와 관련하여 상기 정의된 바와 같은 Y 및 m을 갖고, X가 산소이고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
단백질을 하기 화학식 (IV)의 나이트록실화제와 반응시키는 단계를 포함하는, 나이트록실화된 단백질의 제조 방법:
Figure pct00030
식 중, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고; Y는 CH2이며; m은 0 또는 1이다.
제G2항의 방법으로서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 -CH3이다.
화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제가 화학식 (II) 또는 (IV)와 관련하여 상기 정의된 바와 같은 X, Y 및 m을 갖고, R1, R2, R3 및 R4가 각각 -CH3인 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제가 화학식 (II) 또는 (IV)와 관련하여 상기 정의된 바와 같은 R1, R2, R3, R4, X 및 Y를 갖고, m이 0인 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제가 화학식 (II) 또는 (IV)와 관련하여 상기 정의된 바와 같은 R1, R2, R3, R4, X 및 Y를 갖고, m이 1인 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제의 비율이 단백질에 비해 약 5배 내지 약 100배 몰 초과로 존재하는 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
단백질이 헤모글로빈 사합체의 α-아단위 또는 β-아단위를 포함하는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용하는 나이트록실화된 단백질의 제조 방법. 단백질이 헤모글로빈 사합체를 포함하는 방법. 헤모글로빈 사합체가 비산소화된 헤모글로빈 사합체인 방법. 비산소화된 헤모글로빈 사합체가 CO-리간드화 헤모글로빈 사합체인 방법. 헤모글로빈 사합체가 탈산소화된 헤모글로빈 사합체인 방법.
반응이 약 2℃ 내지 약 30℃; 약 15℃ 내지 약 25℃; 약 2℃ 내지 약 8℃; 약 4℃; 또는 약 20℃의 온도에서 수행되는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
반응이 약 3시간 내지 약 20시간; 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 약 16시간 동안 진행되는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
반응이 수성 용매 중에 수행되는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
반응이 약 6.5 내지 약 8.5의 pH; 약 7.5의 pH; 또는 약 7.2의 pH에서 수행되는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
단백질이 헤모글로빈 사합체를 포함하고, 반응이 약 7.2의 pH 및 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 수행되고 약 16시간 동안 진행되며, 방법이 약 17개의 나이트록실화된 아미노기를 갖는 나이트록실화된 헤모글로빈 사합체를 생성시키는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
단백질이 헤모글로빈 사합체를 포함하고, 나이트록실화제가 헤모글로빈 사합체에 비해 약 10배 내지 약 100배 몰 초과로 존재하는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
반응 생성물이 화학식 (VI) 또는 (VII)의 나이트록실화된 단백질 또는 본 명세서에 기재된 헤모글로빈 사합체인 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
단백질을 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)에 접합하는 단계를 더 포함하는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
숙신이미딜 발레레이트 PAO를 수성 희석제 중에 단백질에 첨가하여 PAO-발레레이트 접합 단백질을 형성하는 단계를 더 포함하는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법. 상기 방법은 단백질을 수성 희석제 중에 2-이미노티올란(2-IT)과 혼합하여 티올화 단백질을 형성하는 단계; 및 PAO-말레이미드를 수성 희석제 중에 티올화 단백질에 첨가하여 PAO-말레이미드 접합 단백질을 형성하는 단계를 더 포함한다. PAO가 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)인 방법.
단백질을 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)에 접합하는 단계를 더 포함하고, PAO가 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이고, PEG가 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤; 약 3,000 내지 약 10,000달톤; 약 2,000 내지 약 6,000달톤; 또는 약 5,000달톤인 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
PEG가 말레이미드-PEG인 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법. 말레이미드가 알킬렌 또는 페닐렌 링커를 통해 PEG에 연결된 방법. 알킬렌 링커가 에틸렌 링커인 방법. 말레이미드-PEG가 단백질의 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티, 단백질 중의 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 중의 티올 모이어티에 접합된 방법.
시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG가 하기 구조 (VIII)을 갖는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법:
Figure pct00031
식 중, Z는 단백질이고, R3은 알킬렌 또는 페닐렌기이며, S는 단백질 중의 티올기이고, m은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이며, n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수를 나타낸다.
시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG가 R3이 에틸렌인 구조 (VIII)을 갖는 방법. 단백질이 헤모글로빈 α-아단위, 헤모글로빈 β-아단위, 헤모글로빈 사합체, 미오글로빈 또는 알부민을 포함하는 방법. 단백질이 혈청 알부민을 포함하는 방법. 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함하는 방법. 단백질이 헤모글로빈 사합체를 포함하는 방법.
헤모글로빈 사합체가 가교결합된 αα 이합체 또는 가교결합된 ββ 이합체를 포함하는 방법. 말레이미드-PEG가 헤모글로빈 β-아단위의 시스테인-93 잔기의 티올 모이어티에 접합된 방법. 말레이미드-PEG가 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티에 접합된 방법. 티올화 라이신 잔기가 라이신-7, 라이신-11, 라이신-16, 라이신-40, 라이신-56, 라이신-60, 라이신-61, 라이신-90, 라이신-99, 라이신-127, 라이신-139 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 α-아단위의 티올화 라이신 잔기인 방법. 티올화 라이신 잔기가 라이신-8, 라이신-17, 라이신-59, 라이신-61, 라이신-65, 라이신-66, 라이신-82, 라이신-95, 라이신-120, 라이신-132, 라이신-144 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 β-아단위의 티올화 라이신 잔기인 방법.
2-이미니티올란이 단백질 농도에 비해 약 7배 내지 약 15배 몰 초과; 단백질 농도에 비해 약 7배 내지 약 8배 몰 초과; 또는 단백질 농도에 비해 약 7.5배 몰 초과로 존재하는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
PAO-말레이미드가 단백질 농도에 비해 약 9배 내지 약 20배 몰 초과; 단백질 농도에 비해 약 9배 내지 약 15배 몰 초과; 또는 단백질 농도에 비해 약 12배 몰 초과로 존재하는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
티올화 단계가 약 7 내지 약 9의 pH; 또는 약 8.5의 pH에서 수행되는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
PAO-말레이미드를 티올화 단백질에 첨가하여 PAO-말레이미드 접합 단백질을 형성하는 단계는 약 6.5 내지 약 8.5의 pH; 또는 약 7.5의 pH에서 수행되는 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법.
PEG가 SVA-PEG인 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법. 숙신이미드가 -C(O)-(CH2)4-를 통해 PEG에 연결된 방법. SVA-PEG는 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노 모이어티, 단백질의 말단 발린 잔기의 α-아미노 모이어티 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 단백질의 아미노 모이어티에 접합될 수 있다. SVA-PEG는 또한 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노 모이어티에 접합될 수 있거나, 단백질의 말단 발린 잔기의 α-아미노 모이어티는 하기 구조 (IX)를 갖는다:
Figure pct00032
식 중, Z는 단백질이고, N은 단백질 중의 질소이며, X는 말단기이고, m은 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이며, n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수이다.
X는 PAO의 말단기이고, 하이드록시, 아릴옥시, 예컨대 벤질옥시 또는 C1-C20 알콕시, 더 바람직하게는 C1-C10 알콕시기, 훨씬 더 바람직하게는 C1-C5 알콕시기, 예컨대 메톡시 또는 에톡시일 수 있다.
화학식 IX의 경우 m이 사합체당 평균 약 6개 내지 약 10개의 PAO 분자인 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법. SVA-PEG는 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 라이신 잔기의 ε-아미노 모이어티에 접합된다. SVA-PEG는 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 말단 발린 잔기의 α-아미노 모이어티에 접합된다.
화학식 IX의 경우 라이신 잔기가 라이신-7, 라이신-11, 라이신-16, 라이신-40, 라이신-56, 라이신-60, 라이신-61, 라이신-90, 라이신-99, 라이신-127, 라이신-139 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 α-아단위의 라이신 잔기인 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법. 라이신 잔기는 라이신-8, 라이신-17, 라이신-59, 라이신-61, 라이신-65, 라이신-66, 라이신-82, 라이신-95, 라이신-120, 라이신-132, 라이신-144 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 β-아단위의 라이신 잔기이다.
단백질이 단백질의 나이트록실화 전에 PAO에 접합된 화학식 (II) 또는 (IV)의 나이트록실화제를 사용한 나이트록실화된 단백질의 제조 방법. PAO-말레이미드를 티올화 단백질에 첨가하여 PAO-말레이미드 접합 단백질을 형성하는 단계를 단백질의 나이트록실화와 동시에 수행할 수 있다. 숙신이미딜 발레레이트 PAO를 단백질에 첨가하여 PAO-발레레이트 접합 단백질을 형성하는 단계를 단백질의 나이트록실화와 동시에 수행한다.
임의의 상기 방법에서, 전자 상자성 공명(EPR) 또는 MALDI-TOF 질량 분광법을 이용하여 나이트록실 치환도를 평가하고 정량할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 PAO-Hb 접합체는 비경구 투여를 위한 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 수성 희석제 중에 PAO-Hb 접합체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제제화될 수 있다. 담체 중의 PAO-Hb 접합체의 농도는 분야에 따라 변할 수 있다. 바람직하게는, PAO-Hb 접합체 농도는 약 0.1g/㎗ 내지 약 10g/㎗, 더 바람직하게는 약 2.0g/㎗ 내지 약 8.0g/㎗, 가장 바람직하게는 약 4.0 내지 약 6.0g/㎗ 범위이다. 헤모글로빈의 적절한 농도의 선택은 최종 헤모글로빈 생성물의 콜로이드성 삼투(삼투성) 특성에 따라 달라진다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전혈과 비교하여 정상 삼투성이거나 혈장과 비교하여 과삼투성이다. 각각의 적응증에 대해 원하는 삼투압을 얻기 위해 헤모글로빈 농도를 조정할 수 있다.
상기 조성물을 비경구로서 제제화할 때, 용액은 일반적으로 헤모글로빈의 가역적인 산소, CO 또는 NO 운반 및 전달 특성을 유지시키고 전혈과 등장성인 생리학적으로 상용성인 전해질 담체를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 수성 희석제일 수 있다. 수성 희석제는 콜로이드의 수용액 또는 산소 비운반 성분의 수용액, 예컨대 단백질, 예컨대 알부민의 수용액, 당단백질의 수용액, 다당류의 수용액 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 수성 희석제는 세포 비함유 수용액을 포함할 수 있다.
적합한 수성 희석제는 생리학적 식염수, 식염수-글루코스 혼합물, 링거 용액, 락트산염 링거 용액, 로크(Locke)-링거 용액, 크렙스(Krebs)-링거 용액, 하트만(Hartmann) 균형 식염수, 헤파린화 시트르산나트륨-시트르산-덱스트로스 용액, 아세테이트 용액, 다중 전해질 용액(예를 들면, 박스터 인터내셔널(Baxter International)(미국 일리노이주 디어필드)사제의 플라즈마 라이트(Plasma Lyte)(등록상표) 또는 플라즈마 라이트-A(등록상표)), 락토바이오네이트 용액 및 대용 중합체 혈장, 예컨대 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 에틸렌 옥사이드-프로필렌 글라이콜 축합물 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 충전제, 염 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 재료를 추가로 포함할 수 있고, 이의 선택은 제형, 치료하고자 하는 병증, 당해 분야의 당업자의 결정에 따라 성취하고자 하는 특정 목적 및 이 첨가제의 특성에 따라 달라진다. 예를 들면, 상기 조성물은 생리학적 완충제, 탄수화물(예를 들면, 글루코스, 만니톨 또는 솔비톨), 알코올 또는 폴리 알코올, 약제학적으로 허용되는 염(예를 들면, 나트륨 또는 염화칼륨), 계면활성제(예를 들면, 폴리솔베이트 80), 항산화제, 항박테리아제, 교질 삼투압제(예를 들면, 알부민 또는 폴리에틸렌 글라이콜) 또는 환원제(예를 들면, 아스코르브산, 글루타티온 또는 N-아세틸 시스테인)를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 점도가 적어도 약 2센티포이즈(cP)이다. 더 구체적으로, 점도는 약 2 내지 약 5cP, 특히 약 2.5 내지 약 4.5cP 범위이다.
투여 시 합병증을 피하기 위해, 약제학적 조성물은 높은 순도를 갖고, 즉 간질, 인지질 및 발열원이 없고, LAL(리물루스 변형세포 용해물) 시험에 의해 측정될 때 내독소 수준이 0.25 EU/㎖ 미만이고 메트헤모글로빈이 8% 미만이다.
약제학적 조성물을 예컨대 피하, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 비경구로 또는 대용적 비경구 용액으로서 투여할 수 있다. 상기 조성물을 경구영양법에 의해 또한 투여할 수 있다.
치료제로서의 헤모글로빈 접합체의 통상적인 용량은 환자 체중의 킬로그램당 약 1 내지 약 15,000밀리그램의 헤모글로빈일 수 있다. 예를 들면, 산소 치료제로서 사용할 때, 용량은 100 내지 7500㎎/㎏ 환자 체중, 더 바람직하게는 500 내지 5000㎎/㎏ 체중, 가장 바람직하게는 700 내지 3000㎎/㎏ 체중 범위이다. 따라서, 인간 환자에 대한 통상적인 용량은 1그램 내지 1000그램 초과이다. 필요한 유효량이 다수의 개별 용량의 투여에 의해 도달되므로, 각각의 제형의 개별 용량에 포함된 활성 성분의 단위 함량이 그 자체로 유효량을 구성할 필요가 없는 것으로 이해된다. 용량 선택은 이용하고자 하는 제형, 치료하고자 하는 병증 및 당해 분야의 당업자의 결정에 따라 성취하고자 하는 특정 목적에 따라 달라진다.
치료 방법
산소, CO 및/또는 NO를 대상체에게 전달하기 위해 PAO-Hb 접합체 및 약제학적 조성물을 사용할 수 있다. 산소, 일산화질소, 일산화탄소 또는 이들의 혼합물을 조직에 전달하고 아질산염을 환원시켜 미소혈관계에서 추가로 내생 일산화질소(NO)를 제조하는 방법은 헤모글로빈 접합체 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 투여 후, 헤모글로빈은 비리간드화되어 미소혈관계에서 아질산염을 일산화질소로 전환시킨다.
본 발명의 헤모글로빈 접합체 및 이의 조성물을 급성 간부전, 베타 지중해빈혈, 화상, 만성 중증 하지 허혈, 이산화탄소 또는 사이아나이드 중독, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)(예를 들면, 급성 악화), 울혈성 심부전(예를 들면, 급성 심부전, 만성 심부전), 저산소증(예를 들면, 폐부종, 감압증을 포함하는 높은 고도 사용), 말라리아(예를 들면, 뇌 말라리아(열원충 폐색 사건), 장기 허혈(예를 들면, 급성 장 허혈(비틀림), 급성 장 허혈(색전증), 심인성 쇼크, 급성 혈관 장기 허혈, 뇌졸중(CAT 스캔 전), 뇌졸중(CAT 스캔 후), 심근 경색/중증 심장 허혈), 말초 혈관 질환, 포르피린증, 임신중독증, 패혈증, 겸상 적혈구 질환(예를 들면, 뇌졸중/일과성 허혈성 발작, 비장 격리, 간 격리, 지속발기), 망막 질환/안내 병증(예를 들면, 중추 망막 동맥 폐색증, 중추 정맥 폐색증), 고환염전, 외상/쇼크(예를 들면, 외상성 출혈성 쇼크, 비외상성 출혈성 쇼크, 입원전/필드 사용(군사/응급), 외상성 뇌 손상/모세포), 궤양 또는 혈관경련을 치료하기 위해; 혈관성형술에 대한 보조제로서, 성형 수술(피판)(예를 들면, 급성 치료, 만성 치료)에 대한 보조제로서 또는 심실 보조 장치 이식 시 보조제로서; 대용 혈액(예를 들면, 급성 혈액 손실, 여호와의 증인(Jehovah's Witness), 환자의 교차 어려움, 희귀 혈액형, 겸상 재생불량성 위기, 겸상 적혈구 빈혈 수술 전후 관리, 급성 용혈성 빈혈(자가면역), 급성 용혈성 빈혈(독소) 또는 다른 불응성 빈혈을 위한), 심장보호제, 냉동보존제, 혈액투석 보조제, 종양 물질(예를 들면, 방사선치료 또는 화학요법, 고형 종양에 대한 보조제), 장기 보존제(예를 들면, 생체외, 공여자에서, 수혜자에서), 성능 증대제(예를 들면, 시민/육상, 군사), 수술 보조제(예를 들면, 심폐 우회(프라임), 심폐 우회(조정), 폐 허혈, 수술전 처리, 파열된 대동맥류, 흉대동맥(절개 또는 동맥류)의 대체) 또는 상처 치유제로서; 조영(x선 또는 자기 공명 영상화(MRI))에서; 폐 기능(예를 들면, 급성 폐 손상, 만성 폐 손상, 일과성 바이러스 폐렴, 신생아 호흡 곤란 증후군)을 개선하기 위해; 또는 이들의 조합으로서 사용할 수 있다. 이러한 사용은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 접합체 또는 조성물의 투여를 포함한다.
추가로, 본 발명의 헤모글로빈 및 조성물을 비외상성 출혈성 쇼크, 입원전 환경 외상, 외상성 출혈성 쇼크, 급성 폐 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 고형 종양 암, 장기 기능저하(organ degradation)(생체외), 장기 기능저하(수혜자에서), 중증 패혈증/패혈성 쇼크, 심근 경색/심장 허혈, 심인성 쇼크, 급성 심부전, 폐 색전증, 수술에 의한 다양한 병증(예를 들면, 혈관성형술에 대한 보조제, 흉부 대동맥류 보수에 대한 보조제, 심폐 우회에 대한 보조제, 심폐 우회에 대한 프라이밍 용액) 또는 이들의 조합을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 헤모글로빈 및 조성물이 유용한 다양한 임상 설정은 하기를 포함한다:
외상. 급성 전혈 손실은 피부 및 장을 포함하는 낮은 우선순위 장기로부터 혈액을 문합시키면서 혈액의 손실 용적을 대체하기 위해 간질성 및 세포내 공간으로부터 유체 이동을 발생시킬 수 있다. 장기로부터의 혈액 문합은 이 장기에서 O2 수준을 감소시키고 때때로 제거하고 진행성 조직 사멸을 발생시킨다. 1차 목적은 이환 조직을 산소화시키는 것이다. 이 외상은 입원전 환경에 있거나 외상성 출혈성 쇼크 또는 외상성 뇌 손상을 발생시킬 수 있다.
허혈. 적혈구 또는 많은 다른 산소 치료제가 침투할 수 없는 부위로 산소, CO 및/또는 NO를 전달하기 위해 접합체 및 이의 조성물을 또한 사용할 수 있다. 이 부위는 적혈구 흐름에 대한 폐색의 하류에 위치한 임의의 조직 부위, 예컨대 혈전, 겸상 적혈구 폐색, 동맥 폐색, 혈관성형술 벌룬, 수술 장치의 하류의 부위, 및 산소 기아로 고생하거나 저산소성인 임의의 조직을 포함할 수 있다. 예를 들면, 뇌졸중, 출현 뇌졸중, 일과성 허혈성 쇼크, 심근 기면 및 동면, 급성 또는 불안정 협심증, 출현 협심증, 경색 등을 포함하는 모든 유형의 조직 허혈을 치료할 수 있다. 특히, 허혈을 발생시키는 병증은 급성 심부전, 심인성 쇼크, 심근 경색/심장 허혈, 뇌졸중, 폐 색전증, 비외상성 출혈성 쇼크 또는 뇌혈관 외상을 포함한다.
혈액희석. 이 용도에서, 제거된 자가 혈액의 O2 수준을 대체(또는 치환)하도록 치료제를 투여한다. 이는 수술 동안에 및 후에 필요한 수혈에 대한 제거된 자가 혈액의 사용을 허용한다. 수술전 혈액 제거를 요하는 이러한 하나의 수술은 심폐 우회 시술이다.
패혈증/ 패혈성 쇼크. 패혈증에서, 일부 환자는 엄청난 체액 치료 및 혈관 수축제에 의한 치료에도 불구하고 고혈압이 될 수 있다. 이러한 경우에, 일산화질소(NO)의 과생성은 혈압을 낮춘다. 따라서, 헤모글로빈이 높은 결합도로 NO에 결합하므로 헤모글로빈은 이 환자의 치료를 위한 바람직한 물질이다.
저산소증. 환자가 폐렴 또는 췌장염에 의해 발생한 급성 폐 손상을 앓는 경우, 저산소증이 관찰될 수 있고 본 발명의 헤모글로빈 또는 조성물을 제공하여 이환 조직을 산소화함으로써 경감될 수 있다.
암. 고형 종양 덩어리의 저산소성 내부 코어로의 O2의 전달은 방사선치료 및 화학치료에 대한 이의 감수성을 증가시킨다. 종양의 미소혈관계가 다른 조직과 다르므로, O2 수준 증가를 통한 감수성화는 저산소성 코어 내에 O2가 비로딩(unload)될 것을 요한다. 즉, P50은 O2의 조기 비로딩을 방지하여, O2 수준을 증가시키고, 후속 방사선 및 화학요법 치료에 대한 종양의 최적 감수성화를 보장하도록 매우 낮아야 한다.
수술. 본 발명의 헤모글로빈 및 조성물을 다양한 수술 시술 동안 사용할 수 있다. 예를 들면, 이들을 혈관성형술, 흉부 대동맥류 보수, 심폐 우회 시술 동안에 대한 보조제로서 또는 심폐 프라이밍 용액으로서 사용할 수 있다.
장기 관류. 장기가 생체외 또는 장기 공여 수혜자에서 유지되는 동안, O2 함량을 유지시키는 것은 구조적 및 세포 통합성을 보존하고 경색 형성을 최소화하는 것을 돕는다. 헤모글로빈 및 조성물은 이러한 장기에 대한 산소 요건을 지속시킬 수 있다.
헤모글로빈 및 이의 조성물을 비인간, 예컨대 가정용 동물(예를 들면, 가축 및 반려 동물, 예컨대 개, 고양이, 말, 새, 파충류)에서 또한 사용할 수 있다. 본 발명은 손상으로 인한 혈액 손실, 용혈성 빈혈 등을 겪는 가정용 및 야생 동물의 응급 치료에서 유용성을 발견하는 것으로 고려된다. 수의학적 용도는 손상으로 인한 혈액 손실, 용혈성 빈혈, 말 감염성 빈혈, 고양이 감염성 빈혈, 박테리아 감염, IV 인자 단편화, 비대증 및 비종대, 가금류에서의 출혈 증후군, 저형성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 특발성 면역 용혈성 병증, 철 결핍증, 동종면역 용혈성 빈혈, 미세혈관병 용혈성 빈혈, 기생 또는 수술-마취 유발 뇌 손상의 치료를 포함한다.
실시예
실시예 1. 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC; 1-(((2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시)-4-옥시카보닐)옥시)-2,5-피롤리딘다이온)의 합성
1그램의 4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실(TEMPOL)을 20㎖의 무수 아세토나이트릴 중에 용해시키고 실온에서 5분 동안 혼합하였다. TEMPOL이 용해되면, 2.975g의 N,N'-다이숙신이미딜 카보네이트(DSC)(2당량) 및 2.425㎖의 트라이에틸아민(3.0당량)을 반응에 첨가하였다. 혐기성 조건 하에 6-8시간 동안 실온에서 반응을 수행하였다. 반응 완료 후, 감압 하에 용매를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고 포화 수성 CuSO4 용액으로 세척하였다. 유기 상을 분리하고 TEMPOL 1그램당 0.5g의 Na2SO4를 유기 상에 첨가하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 혼합한 후 여과시켰다. 감압 하에 여과된 용액을 증발시켰다. n-헵탄을 첨가하여 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트인 생성물을 침전시키고 여과하고 진공 하에 실온에서 건조시켰다.
4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트의 제조를 위한 반응식은 하기 도시되어 있다:
Figure pct00033
실시예 2. 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)의 분석
출발 물질 TEMPOL 및 최종 생성물 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)에서 ESI-TOF 고정확성 질량 분광법을 수행하여 4-STC로의 TEMPOL의 전환을 확인하였다(도 1 및 도 2).
또한, 도 3에 도시된 바대로 출발 물질 TEMPOL(1레인) 및 N,N'-다이숙신이미딜 카보네이트(DSC, 3레인) 및 6시간에 반응 생성물(4레인) 및 침전 후 최종 생성물 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(5레인)에서 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 2레인에 반응 동안 DSC로부터 방출된 반응 부산물인 N-하이드록시-숙신이미드(NHS)를 로딩하였다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 최종 생성물은 임의의 출발 물질 또는 부산물을 포함하지 않는다.
실시예 3. 3- 숙신이미딜 - PROXYL -카보네이트(3- SPC ;1-(((2,2,5,5- 테트라메틸 -1-피 롤리디닐옥 시)-3- 옥시카보닐 ) 옥시 )-2,5- 피롤리딘다이온 )의 합성
출발 물질로서 TEMPOL 대신에 3-하이드록시-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-1-옥실을 사용하여 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트에 대해 실시예 1에서 상기 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 3-숙신이미딜-PROXYL-카보네이트를 제조할 수 있다.
실시예 4. 4-숙신이미딜-카복시-TEMPO(4-SCT; 1-(((2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시)-4-카보닐)옥시)-2,5-피롤리딘다이온)의 합성
1그램의 4-카복시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실(4-카복시 TEMPO)을 75㎖의 테트라히드로퓨란 중에 용해시키고 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 4-카복시 TEMPO가 용해되면, 0.632g의 N-하이드록시숙신이미드(NHS)(1.1당량) 및 1.15g의 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(1.1당량)를 반응에 첨가하였다. 혐기성 조건 하에 24시간 동안 실온에서 반응을 수행하였다. 반응 완료 후, 감압 하에 용매를 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고 물로 세척하였다. 유기 상을 분리하고 4-카복시 TEMPO 1그램당 0.5g의 Na2SO4를 유기 상에 첨가하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 혼합한 후 여과시켰다. 감압 하에 여과된 용액을 증발시켰다. n-헵탄을 첨가하여 4-숙신이미딜-카복시-TEMPO인 생성물을 침전시키고 여과하고 진공 하에 실온에서 건조시켰다.
4-숙신이미딜-카복시-TEMPO의 제조를 위한 반응식은 하기 도시되어 있다:
Figure pct00034
실시예 5. 3- 숙신이미딜 - 카복시 -PROXYL(3- SCP ; 1-(((2,2,5,5- 테트라메틸 -1- 피롤리디닐옥시 )-3- 카보닐 ) 옥시 -2,5- 피롤리딘다이온 )의 합성
출발 물질로서 4-카복시 TEMPO 대신에 3-카복시-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-1-옥실(3-카복시 PROXYL)을 사용하여 4-숙신이미딜-카복시-TEMPO에 대해 실시예 3에서 상기 기재된 화학물질과 동일한 화학물질을 사용하여 3-숙신이미딜-카복시 PROXYL을 합성할 수 있다.
실시예 6. 폴리나이트록실화된 PEG화 헤모글로빈(PN-PEG-Hb)의 제조
a) PEG-접합 헤모글로빈의 제조 및 b) PEG-Hb의 폴리나이톡실화의 2단계 공정으로 폴리나이톡실화된 헤모글로빈을 제조하였다.
SFH를 2.5시간 동안 9배 몰 초과의 2-이미노티올란(2-IT)과 반응시키고 2시간 동안 16배 몰 초과의 말레이미드 PEG 5000(MalPEG5000)과 반응시킴으로써 PEG를 간질 비함유 헤모글로빈(SFH)에 접합하였다. 티올화 및 PEG화 반응을 pH 7.4에서 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 수행하였다. 하기 반응식에 도시된 것처럼, 2-이미노티올란은 라이신 잔기를 티올화하고 MalPEG5000은 β-Cys93 잔기 및 티올화 라이신 잔기의 내재성 티올과 반응한다:
Figure pct00035
R1, R2 및 R3은 헤모글로빈 주쇄의 나머지를 나타내고, R4는 에틸렌이며, n은 5,000달톤 PEG 사슬에서 옥시에틸렌 단위의 수를 나타낸다. 상기 반응식이 별개의 단계로서 티올화 및 PEG화를 나타내지만, 반응을 "1용기" 반응으로 수행하고, SFH, 2-IT 및 MalPEG 5000은 단일 반응 혼합물 내에 포함된다.
카복시-PEG-Hb를 사용하여 PEG-Hb의 폴리나이트록실화를 수행하였다. 실온에서 또는 냉동 조건에서 CO의 분위기 하에 헤모글로빈에 비해 30배 몰 초과의 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)를 사용하여 반응을 수행하였다. 헤모글로빈에 대한 4-STC의 몰 초과, 반응이 수행되는 온도 및/또는 반응 시간을 변화시켜 헤모글로빈 분자당의 나이트록실기의 수를 변경할 수 있다. 70kDa 접선 흐름 여과를 이용하여 폴리나이트록실화된 헤모글로빈을 정제하고, CO의 분위기 하에 최종 생성물을 무균 여과하고 저장하였다. PEG-Hb로부터의 PN-PEG-Hb의 제조에 대한 반응식이 하기 도시되어 있다:
Figure pct00036
R1, R2 및 R3은 헤모글로빈 주쇄의 나머지를 나타낸다.
실시예 7. 폴리나이트록실화된 PEG화 헤모글로빈( PN - PEG - Hb )의 규명
도 4는 TEMPOL(상부 패널) 및 폴리나이트록실화 전(MP4)(중간 패널) 및 폴리나이트록실화 후(PN-MP4)(하부 패널) 둘 다에서의 PEG화 헤모글로빈의 비쌍지음 전자에 대한 전자 상자성 공명(EPR) 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 PEG화 헤모글로빈(PEG-Hb; 상부 패널) 및 폴리나이트록실화된 PEG화 헤모글로빈(PEG-Hb-PN; 하부 패널)의 크기 배제 분석 프로필을 제시한다. 슈퍼로스(Superose)-12 칼럼을 사용하여 크기 배제 분석을 수행하고, 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 단백질을 용리시켰다.
도 6은 폴리나이트록실화된 PEG화 헤모글로빈(PEG-Hb-PN)에 대한 특징적인 UV-가시광선 스펙트럼을 나타낸다.
래트에서 10% 탑 로드를 투여함으로써 PEG-Hb-PN의 안정성을 생체내 시험하였다. 도 7은 점적 종료 시 및 점적 1시간 후 혈장 헤모글로빈의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 5배, 10배, 20배, 30배, 50배 또는 100배 몰 초과의 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)를 사용하여 PEG화 헤모글로빈(MP4)이 나이트록실화되는 실험의 결과를 나타낸다. 4-STC의 몰 초과가 5배로부터 30배로 증가하면서 나이트록실화의 정도가 용량 의존 방식으로 증가하였다. 30배, 50배 또는 100배 몰 초과의 4-STC가 사용될 때 나이트록실화의 정도가 대략 동일하였다.
실시예 8. 폴리나이트록실화된 알부민 ( PN - Alb )의 제조
25% 인간 혈청 알부민 용액을 사용하여 알부민의 폴리나이트록실화를 수행하였다. 알부민에 대한 4-STC의 몰 초과를 변화시켜 알부민 분자당의 나이트록실기의 수를 변경하였다. 실온에서 또는 냉동 조건에서 17 내지 24시간 동안 7.4의 pH에서 알부민에 비해 5배, 10배, 20배, 30배, 50배 또는 100배 몰 초과의 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)를 사용하여 반응을 수행하였다. 겔 여과에 의해 폴리나이트록실화된 알부민을 정제하고, MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 분석하여 알부민 분자당의 나이트록실기의 수를 확인하였다. 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)를 사용한 알부민으로부터 PN-알부민의 제조에 대한 반응식이 하기 도시되어 있다:
Figure pct00037
R1 및 R2는 알부민 주쇄의 나머지를 나타낸다.
MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 도 9 및 도 13(비나이트록실화된 HSA) 및 도 10-12 및 도 14-16(각각 5배, 10배, 20배, 30배, 50배 또는 100배 몰 초과의 4-STC를 사용한 HSA 나이트록실화)에 도시되어 있다. 도 17은 이 데이터의 그래프 표시를 제공하고, 4-STC의 몰 초과가 5배로부터 100배로 증가하면서, 나이트록실화의 정도가 용량 의존 방식으로 증가한다는 것을 나타낸다.
실시예 9. 폴리나이트록실화된 PEG 화-알부민( PN - PEG - Alb )의 제조.
a) PEG 접합 알부민의 제조 및 b) PEG-Alb의 폴리나이톡실화의 2단계 공정으로 폴리나이톡실화된 PEG화 알부민을 제조하였다.
알부민을 2.5시간 동안 9배 몰 초과의 2-이미노티올란(2-IT)과 반응시키고 2시간 동안 16배 몰 초과의 말레이미드 PEG 5000(MalPEG5000)과 반응시킴으로써 PEG를 알부민에 접합하였다. 티올화 및 PEG화 반응을 pH 7.4에서 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 수행하였다. PEG화 2시간 후, PEG-알부민 접합체를 70kDa 접선 흐름 여과를 통과시켜 미반응 시약을 제거하고 제제 완충제 중에 제제화하였다. 실온에서 또는 냉동 조건에서 알부민에 비해 100배 몰 초과의 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)를 사용하여 PEG-알부민을 4-숙신이미딜-TEMPO-카보네이트(4-STC)와 반응시킴으로써 폴리나이트록실화를 수행하였다. 알부민에 대한 4-STC의 몰 초과, 반응이 수행되는 온도 및/또는 반응 시간을 변화시켜 알부민 분자당의 나이트록실기의 수를 변경할 수 있다. 70kDa 접선 흐름 여과를 이용하여 폴리나이트록실화된 알부민을 정제하였다. PEG-Alb로부터의 PN-PEG-Alb의 제조에 대한 반응식이 하기 도시되어 있다:
Figure pct00038
R1, R2 및 R3은 알부민 주쇄의 나머지를 나타내고, R4는 에틸렌이며, n은 5,000달톤 PEG 사슬 내의 옥시에틸렌 단위의 수를 나타낸다.

Claims (157)

  1. 의기 화학식 (I)의 나이트록실화제:
    Figure pct00039

    식 중,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며;
    Y는 CH2이고;
    n은 0 또는 1이며;
    m은 0 또는 1이다.
  2. 하기 화학식 (III)을 갖는 화합물을 유기 염기의 존재 하에 N,N'-다이숙신이미딜 카보네이트(DSC)와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (II)의 나이트록실화제의 제조 방법:
    Figure pct00040

    Figure pct00041

    식 중,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며;
    Y는 CH2이고;
    m은 0 또는 1이다.
  3. 하기 화학식 (V)를 갖는 화합물을 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC)의 존재 하에 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (IV)의 나이트록실화제의 제조 방법:
    Figure pct00042

    Figure pct00043

    식 중,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    Y는 CH2이며;
    m은 0 또는 1이다.
  4. 하기 구조 (VI)을 갖는 나이트록실화된 단백질:
    Figure pct00044

    식 중,
    Z는 상기 단백질을 나타내고;
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이며;
    X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이고;
    Y는 CH2이며;
    m은 0 또는 1이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 상기 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이고;
    N는 상기 단백질 중의 질소이다.
  5. 상기 단백질을 하기 화학식 (II)의 나이트록실화제와 반응시키는 단계를 포함하는, 나이트록실화된 단백질의 제조 방법:
    Figure pct00045

    식 중,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    X는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소이며;
    Y는 CH2이고;
    m은 0 또는 1이다.
  6. 상기 단백질을 하기 화학식 (IV)의 나이트록실화제와 반응시키는 단계를 포함하는, 나이트록실화된 단백질의 제조 방법:
    Figure pct00046

    식 중,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-C4 알킬이고;
    Y는 CH2이며;
    m은 0 또는 1이다.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH3인 것인 나이트록실화제, 나이트록실화된 단백질 또는 방법.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서, n은 1인 것인 나이트록실화제.
  9. 제8항에 있어서, X는 산소 또는 황인 것인 나이트록실화제.
  10. 제8항에 있어서, X는 산소인 것인 나이트록실화제.
  11. 제8항에 있어서, X는 산소이고, R1, R2, R3 및 R4는 각각 -CH3인 것인 나이트록실화제.
  12. 제1항 또는 제7항에 있어서, n은 0인 것인 나이트록실화제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, m은 0인 것인 나이트록실화제, 나이트록실화된 단백질 또는 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1인 것인 나이트록실화제, 나이트록실화된 단백질 또는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    Figure pct00047

    Figure pct00048

    Figure pct00049
    및
    Figure pct00050

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 나이트록실화제.
  16. 제1항에 있어서, 상기 나이트록실화제는
    Figure pct00051

    인 것인 나이트록실화제.
  17. 제2항, 제7항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 염기는 트라이에틸아민(TEA), N,N-다이아이소프로필에틸아민, 4-다이메틸아미노피리딘, 피리딘, N-메틸피페리딘 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 유기 염기는 트라이에틸아민을 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 화학식 (III)의 화합물, N,N'-다이숙신이미딜 카보네이트 및 트라이에틸아민은 약 1:2:3의 비율로 존재하는 것인 방법.
  20. 제2항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 2℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 반응은 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  22. 제2항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 4℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 반응은 약 20℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  24. 제2항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 3시간 내지 약 6시간 동안 진행되는 것인 방법.
  25. 제2항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 극성 비양자성 용매 중에 수행되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 극성 비양자성 용매는 아세토나이트릴(ACN), 테트라히드로퓨란(THF), 에틸 아세테이트(EtOAc), 아세톤, 다이메틸폼아마이드(DMF), 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 극성 비양자성 용매는 아세토나이트릴을 포함하는 것인 방법.
  28. 제3항, 제7항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (IV)의 화합물, N-하이드록시숙신이미드 및 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드는 약 1:1.1:1.1의 몰 비로 존재하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, m은 0인 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1인 것인 방법.
  31. 제3항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 2℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 반응은 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 반응은 약 4℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 반응은 약 20℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  35. 제3항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 6시간 내지 약 24시간 동안 진행되는 것인 방법.
  36. 제3항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 7.2 내지 약 7.6의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  37. 제3항, 제7항, 제13항, 제14항 및 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 7.4의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  38. 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 N-말단 아미노기는 나이트록실화된 것인 나이트록실화된 단백질.
  39. 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 잔기의 적어도 하나의 엡실론(ε)-아미노기는 나이트록실화된 것인 나이트록실화된 단백질.
  40. 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항, 제38항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서, p는 약 1 내지 약 25인 것인 나이트록실화된 단백질.
  41. 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항, 제38항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서, p는 적어도 약 2인 것인 나이트록실화된 단백질.
  42. 제41항에 있어서, p는 적어도 약 10인 것인 나이트록실화된 단백질.
  43. 제40항에 있어서, p는 약 15 내지 약 20인 것인 나이트록실화된 단백질.
  44. 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈(Hb) α-아단위, 헤모글로빈 β-아단위, 헤모글로빈 사합체, 미오글로빈 또는 알부민을 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  45. 제44항에 있어서, 상기 단백질은 혈청 알부민을 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  46. 제45항에 있어서, 상기 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA)을 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  47. 제44항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈 α-아단위 또는 헤모글로빈 β-아단위 또는 헤모글로빈 사합체를 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  48. 제44항에 있어서, 상기 단백질은 인간 헤모글로빈 α-아단위, 인간 헤모글로빈 β-아단위, 또는 인간 헤모글로빈 α-아단위들과 β-아단위들을 포함하는 헤모글로빈 사합체를 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  49. 제44항, 제47항 및 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈 사합체는 가교결합된 αα 이합체 또는 가교결합된 ββ 이합체를 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 상기 나이트록실화된 단백질은 인간 헤모글로빈 α-아단위를 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 상기 인간 헤모글로빈 α-아단위는 상기 N-말단 발린 잔기의 α-아미노기에서 나이트록실화된 것인 나이트록실화된 단백질.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 인간 헤모글로빈 α-아단위는 라이신-7, 라이신-11, 라이신-16, 라이신-40, 라이신-56, 라이신-60, 라이신-61, 라이신-90, 라이신-99, 라이신-127, 라이신-139 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 라이신 잔기의 ε-아미노기에서 나이트록실화된 것인 나이트록실화된 단백질.
  53. 제50항에 있어서, 상기 나이트록실화된 단백질은 인간 헤모글로빈 β-아단위를 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  54. 제53항에 있어서, 상기 인간 헤모글로빈 β-아단위는 상기 N-말단 발린 잔기의 α-아미노기에서 나이트록실화된 것인 나이트록실화된 단백질.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 인간 헤모글로빈 β-아단위는 라이신-8, 라이신-17, 라이신-59, 라이신-61, 라이신-65, 라이신-66, 라이신-82, 라이신-95, 라이신-120, 라이신-132, 라이신-144 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 라이신 잔기의 ε-아미노기에서 나이트록실화된 것인 나이트록실화된 단백질.
  56. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈 사합체를 포함하고, 상기 헤모글로빈 사합체는 약 17개의 나이트록실화된 아미노기를 포함하는 것인 나이트록실화된 단백질.
  57. 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제38항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나이트록실화된 단백질은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)에 접합된 것인 나이트록실화된 단백질.
  58. 제57항에 있어서, 상기 PAO는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)인 것인 나이트록실화된 단백질.
  59. 제58항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 것인 나이트록실화된 단백질.
  60. 제58항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량이 약 3,000 내지 약 10,000달톤인 것인 나이트록실화된 단백질.
  61. 제58항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량이 약 4,000 내지 약 6,000달톤인 것인 나이트록실화된 단백질.
  62. 제61항에 있어서, 상기 PEG는 평균 분자량이 약 5,000달톤인 것인 나이트록실화된 단백질.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 말레이미드-PEG인 것인 나이트록실화된 단백질.
  64. 제63항에 있어서, 상기 말레이미드는 알킬렌 또는 페닐렌 링커를 통해 상기 PEG에 연결된 것인 나이트록실화된 단백질.
  65. 제64항에 있어서, 상기 알킬렌 링커는 에틸렌 링커인 것인 나이트록실화된 단백질.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말레이미드-PEG는 상기 단백질의 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티, 상기 단백질 중의 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 중의 티올 모이어티에 접합된 것인 나이트록실화된 단백질.
  67. 제66항에 있어서, 시스테인 잔기의 내재성 티올 모이어티에 접합되거나 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티에 접합된 말레이미드-PEG는 하기 구조 (VIII)을 갖는 것인 나이트록실화된 단백질:
    Figure pct00052

    식 중,
    Z는 상기 단백질을 나타내고,
    S는 상기 단백질 중의 티올이며,
    R3은 알킬렌 또는 페닐렌기이고,
    X는 말단기이며,
    m은 상기 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 평균 수이고,
    n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수를 나타낸다.
  68. 제67항에 있어서, R3은 에틸렌인 것인 나이트록실화된 단백질.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, m은 약 6 내지 약 10인 것인 나이트록실화된 단백질.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, X는 메톡시(-OCH3) 또는 카복실레이트(-COOH)인 것인 나이트록실화된 단백질.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말레이미드-PEG는 헤모글로빈 β-아단위의 시스테인-93 잔기의 티올 모이어티에 접합된 것인 나이트록실화된 단백질.
  72. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말레이미드-PEG는 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 티올화 라이신 잔기의 티올 모이어티에 접합된 것인 나이트록실화된 단백질.
  73. 제72항에 있어서, 상기 티올화 라이신 잔기는 라이신-7, 라이신-11, 라이신-16, 라이신-40, 라이신-56, 라이신-60, 라이신-61, 라이신-90, 라이신-99, 라이신-127, 라이신-139 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 α-아단위의 티올화 라이신 잔기인 것인 나이트록실화된 단백질.
  74. 제72항에 있어서, 상기 티올화 라이신 잔기는 라이신-8, 라이신-17, 라이신-59, 라이신-61, 라이신-65, 라이신-66, 라이신-82, 라이신-95, 라이신-120, 라이신-132, 라이신-144 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 β-아단위의 티올화 라이신 잔기인 것인 나이트록실화된 단백질.
  75. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG는 숙신이미딜 발레레이트 PEG(SVA-PEG)인 것인 나이트록실화된 단백질.
  76. 제75항에 있어서, 상기 SVA-PEG는 상기 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노 모이어티, 상기 단백질의 말단 발린 잔기의 α-아미노 모이어티 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 단백질의 아미노 모이어티에 접합된 것인 나이트록실화된 단백질.
  77. 제76항에 있어서, 상기 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노 모이어티 또는 상기 단백질의 말단 발린 잔기의 α-아미노 모이어티에 접합된 SVA-PEG는 하기 구조 (IX)를 갖는 것인 나이트록실화된 단백질:
    Figure pct00053

    식 중,
    Z는 상기 단백질이고,
    N은 상기 단백질의 아미노기이며,
    X는 말단기이고,
    m은 상기 단백질에 접합된 활성화-PEG 중합체의 수이며,
    n은 평균 분자량이 약 2,000 내지 약 20,000달톤인 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 수이다.
  78. 제77항에 있어서, X는 메톡시(-OCH3) 또는 카복실레이트(-COOH)인 것인 나이트록실화된 단백질.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, m은 사합체당 평균 약 6개 내지 약 10개의 PAO 분자인 것인 나이트록실화된 단백질.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SVA-PEG는 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 라이신 잔기의 ε-아미노 모이어티에 접합된 것인 나이트록실화된 단백질.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SVA-PEG는 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 말단 발린 잔기의 α-아미노 모이어티에 접합된 것인 나이트록실화된 단백질.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 라이신 잔기는 라이신-7, 라이신-11, 라이신-16, 라이신-40, 라이신-56, 라이신-60, 라이신-61, 라이신-90, 라이신-99, 라이신-127, 라이신-139 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 α-아단위의 라이신 잔기인 것인 나이트록실화된 단백질.
  83. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 라이신 잔기는 라이신-8, 라이신-17, 라이신-59, 라이신-61, 라이신-65, 라이신-66, 라이신-82, 라이신-95, 라이신-120, 라이신-132, 라이신-144 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 헤모글로빈 β-아단위의 라이신 잔기인 것인 나이트록실화된 단백질.
  84. 제44항, 제47항, 제48항, 제50항 내지 제52항, 제57항 내지 제70항, 제72항, 제73항 및 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 α-아단위 또는 제44항, 제47항, 제48항, 제53항 내지 제55항, 제57항 내지 제72항, 제74항 내지 제81항 및 제83항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 β-아단위를 포함하는 헤모글로빈 사합체.
  85. 제84항에 있어서, 제44항, 제47항, 제48항, 제50항 내지 제52항, 제57항 내지 제70항, 제72항, 제73항 및 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 α-아단위 및 제44항, 제47항, 제48항, 제53항 내지 제55항, 제57항 내지 제72항, 제74항 내지 제81항 및 제83항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 β-아단위를 포함하는 헤모글로빈 사합체.
  86. 제85항에 있어서, 제44항, 제47항, 제48항, 제50항 내지 제52항, 제57항 내지 제70항, 제72항, 제73항 및 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항의 2개의 α-아단위 및 제44항, 제47항, 제48항, 제53항 내지 제55항, 제57항 내지 제72항, 제74항 내지 제81항 및 제83항 중 어느 한 항의 2개의 β-아단위를 포함하는 헤모글로빈 사합체.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 사합체당 평균 5개 내지 10개의 PAO 분자에 접합된 것인 헤모글로빈 사합체.
  88. 제87항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 사합체당 평균 7.1개 내지 8.9개의 PAO 분자에 접합된 것인 헤모글로빈 사합체.
  89. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 산소화된 것인 헤모글로빈 사합체.
  90. 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 탈산소화된 것인 헤모글로빈 사합체.
  91. 제84항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 CO, NO, 또는 CO와 NO의 혼합물로 리간드화된 것인 헤모글로빈 사합체.
  92. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나이트록실화제의 비율은 상기 단백질에 비해 약 5배 내지 약 100배 몰 초과로 존재하는 것인 방법.
  93. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈 사합체의 α-아단위 또는 β-아단위를 포함하는 것인 방법.
  94. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항, 제92항 및 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈 사합체를 포함하는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 헤모글로빈 사합체는 비산소화된 헤모글로빈 사합체인 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 비산소화된 헤모글로빈 사합체는 CO-리간드화 헤모글로빈 사합체인 것인 방법.
  97. 제95항에 있어서, 상기 헤모글로빈 사합체는 탈산소화된 헤모글로빈 사합체인 것인 방법.
  98. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 2℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 반응은 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  100. 제98항에 있어서, 상기 반응은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  101. 제98항에 있어서, 상기 반응은 약 4℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  102. 제98항에 있어서, 상기 반응은 약 20℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  103. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 3시간 내지 약 20시간 동안 진행되는 것인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 반응은 약 3시간 내지 약 6시간 동안 진행되는 것인 방법.
  105. 제103항에 있어서, 상기 반응은 약 16시간 동안 진행되는 것인 방법.
  106. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 수성 용매 중에 수행되는 것인 방법.
  107. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 약 6.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 반응은 약 7.5의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  109. 제107항에 있어서, 상기 반응은 약 7.2의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  110. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈 사합체를 포함하고, 상기 반응은 약 7.2의 pH 및 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 수행되고 약 16시간 동안 진행되며, 상기 방법은 약 17개의 나이트록실화된 아미노기를 갖는 나이트록실화된 헤모글로빈 사합체를 생성하는 것인 방법.
  111. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈 사합체를 포함하고, 상기 나이트록실화제는 상기 헤모글로빈 사합체에 비해 약 10배 내지 약 100배 몰 초과로 존재하는 것인 방법.
  112. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응의 생성물은 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제38항 내지 제83항 중 어느 한 항의 나이트록실화된 단백질 또는 제84항 내지 제91항 중 어느 한 항의 헤모글로빈 사합체인 것인 방법.
  113. 제5항 내지 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제92항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질을 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)에 접합하는 단계를 더 포함하는 방법.
  114. 제113항에 있어서,
    수성 희석제 중에 상기 단백질에 숙신이미딜 발레레이트 PAO를 첨가하여 PAO-발레레이트 접합 단백질을 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  115. 제113항에 있어서,
    상기 단백질을 수성 희석제 중에 2-이미노티올란(2-IT)과 혼합하여 티올화 단백질을 형성하는 단계; 및
    상기 수성 희석제 중에 상기 티올화 단백질에 PAO-말레이미드를 첨가하여 PAO-말레이미드 접합 단백질을 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  116. 제113항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 헤모글로빈 사합체를 포함하는 것인 방법.
  117. 제113항 또는 제116항에 있어서, 상기 헤모글로빈 사합체는 가교결합된 αα 이합체 또는 가교결합된 ββ 이합체를 포함하는 것인 방법.
  118. 제115항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-이미노티올란은 상기 단백질 농도에 비해 약 7배 내지 약 15배 몰 초과의 농도로 존재하는 것인 방법.
  119. 제115항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-이미노티올란은 상기 단백질 농도에 비해 약 7배 내지 약 8배 몰 초과의 농도로 존재하는 것인 방법.
  120. 제115항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-이미노티올란은 상기 단백질 농도에 비해 약 7.5배 몰 초과의 농도로 존재하는 것인 방법.
  121. 제115항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAO-말레이미드는 상기 단백질 농도에 비해 약 9배 내지 약 20배 몰 초과의 농도로 존재하는 것인 방법.
  122. 제115항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAO-말레이미드는 상기 단백질 농도에 비해 약 9배 내지 약 15배 몰 초과의 농도로 존재하는 것인 방법.
  123. 제115항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAO-말레이미드는 상기 단백질 농도에 비해 약 12배 몰 초과의 농도로 존재하는 것인 방법.
  124. 제115항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올화 단계는 약 7 내지 약 9의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  125. 제115항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올화 단계는 약 8.5의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  126. 제115항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올화 단백질에 PAO-말레이미드를 첨가하여 PAO-말레이미드 접합 단백질을 형성하는 단계는 약 6.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  127. 제115항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올화 단백질에 PAO-말레이미드를 첨가하여 PAO-말레이미드 접합 단백질을 형성하는 단계는 약 7.5의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  128. 제113항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질을 상기 단백질의 나이트록실화 전에 PAO에 접합하는 것인 방법.
  129. 제115항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티올화 단백질에 PAO-말레이미드를 첨가하여 PAO-말레이미드 접합 단백질을 형성하는 단계는 상기 단백질의 나이트록실화와 동시에 수행되는 것인 방법.
  130. 제114항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질에 숙신이미딜 발레레이트 PAO를 첨가하여 PAO-발레레이트 접합 단백질을 형성하는 단계는 상기 단백질의 나이트록실화와 동시에 수행되는 것인 방법.
  131. 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제38항 내지 제83항 중 어느 한 항의 나이트록실화된 단백질 또는 제84항 내지 제91항 중 어느 한 항의 헤모글로빈 사합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  132. 제131항에 있어서, 상기 조성물은 혈액과 정상 삼투성(normooncotic)인 것인 약제학적 조성물.
  133. 제131항 또는 제132항에 있어서, 상기 조성물은 혈액에 비해 과삼투성인 것인 약제학적 조성물.
  134. 제131항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 희석제를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  135. 제134항에 있어서, 상기 수성 희석제는 콜로이드의 수용액 또는 산소 비운반 성분의 수용액을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 상기 수성 희석제는 세포 비함유 수용액을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  137. 제134항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 희석제는 단백질의 수용액, 당단백질의 수용액, 다당류의 수용액 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  138. 제134항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 희석제는 알부민의 세포 비함유 수용액을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  139. 제131항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 생리학적 식염수, 식염수-글루코스 혼합물, 링거 용액, 락트산염 링거 용액, 로크(Locke)-링거 용액, 크렙스(Krebs)-링거 용액, 하트만(Hartmann) 균형 식염수, 헤파린화 시트르산나트륨-시트르산-덱스트로스 용액, 아세테이트 용액, 다중 전해질 용액, 락토바이오네이트 용액, 대용 중합체 혈장 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  140. 제139항에 있어서, 상기 대용 중합체 혈장은 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 에틸렌 옥사이드-프로필렌 글라이콜 축합물 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  141. 제131항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 충전제, 염, 생리학적 완충제, 탄수화물, 알코올, 폴리 알코올, 항산화제, 항박테리아제, 삼투압제, 환원제 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  142. 제141항에 있어서, 상기 환원제는 아스코르브산, 글루타티온, N-아세틸 시스테인 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  143. 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 간부전, 베타 지중해빈혈, 화상, 만성 중증 하지 허혈, 이산화탄소 또는 사이아나이드 중독, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 울혈성 심부전, 저산소증, 말라리아, 장기 허혈, 말초 혈관 질환, 포르피린증, 임신중독증, 패혈증, 겸상 적혈구 질환, 망막 질환, 안내 병증, 고환염전, 외상, 쇼크, 외상성 뇌 손상, 궤양, 혈관경련 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 것인 약제학적 조성물.
  144. 제143항에 있어서, 상기 장기 허혈은 급성 장 허혈(비틀림), 급성 장 허혈(색전증), 심인성 쇼크, 급성 혈관 장기 허혈, 뇌졸중, 심근 경색 또는 중증 심장 허혈을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  145. 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 비외상성 출혈성 쇼크, 입원전 환경 외상, 외상성 출혈성 쇼크, 급성 폐 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 고형 종양 암, 장기 성능저하(organ degradation)(생체외), 장기 성능저하(수혜자에서), 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 심근 경색, 심장 허혈, 심인성 쇼크, 급성 심부전, 폐 색전증 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 것인 약제학적 조성물.
  146. 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관성형술에 대한 보조제(adjunct)로서, 성형 수술에 대한 보조제로서 또는 심실 보조 장치 이식 시 보조제로서; 대용 혈액, 심장보호제, 냉동보존제, 혈액투석 보조제, 종양 물질, 장기 보존제, 성능 증대제, 수술 보조제 또는 상처 치유제로서; 조영에서; 폐 기능을 개선하기 위해; 또는 이들의 조합으로서 사용하기 위한 것인 약제학적 조성물.
  147. 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 손상으로 인한 혈액 손실, 용혈성 빈혈, 감염성 빈혈, 박테리아 감염, IV 인자 단편화, 비대증(hypersplenation) 및 비종대(splenomegaly), 가금류에서의 출혈 증후군, 저형성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 특발성 면역 용혈성 병증, 철 결핍증, 동종면역 용혈성 빈혈, 미세혈관병 용혈성 빈혈, 기생 또는 수술-마취 유발 뇌 손상의 수의학적 치료를 위한 것인 약제학적 조성물.
  148. 제84항 내지 제91항 중 어느 한 항의 헤모글로빈 사합체 또는 제131항 내지 제147항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  149. 제148항에 있어서, 상기 대상체는 동물인 것인 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것인 방법.
  151. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 급성 간부전, 베타 지중해빈혈, 화상, 만성 중증 하지 허혈, 이산화탄소 또는 사이아나이드 중독, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 울혈성 심부전, 저산소증, 말라리아, 장기 허혈, 말초 혈관 질환, 포르피린증, 임신중독증, 패혈증, 겸상 적혈구 질환, 망막 질환, 안내 병증, 고환염전, 외상, 쇼크, 외상성 뇌 손상, 궤양, 혈관경련 또는 이들의 조합의 치료를 위한 방법인 것인 방법.
  152. 제151항에 있어서, 상기 장기 허혈은 급성 장 허혈(비틀림), 급성 장 허혈(색전증), 심인성 쇼크, 급성 혈관 장기 허혈, 뇌졸중, 심근 경색 또는 중증 심장 허혈을 포함하는 것인 방법.
  153. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비외상성 출혈성 쇼크, 입원전 환경 외상, 외상성 출혈성 쇼크, 급성 폐 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 고형 종양 암, 장기 성능저하(생체외), 장기 성능저하(수혜자에서), 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 심근 경색, 심장 허혈, 심인성 쇼크, 급성 심부전, 폐 색전증 또는 이들의 조합의 치료를 위한 방법인 것인 방법.
  154. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈 사합체 또는 약제학적 조성물은 혈관성형술에 대한 보조제로서, 성형 수술에 대한 보조제로서 또는 심실 보조 장치 이식 시 보조제로서; 대용 혈액, 심장보호제, 냉동보존제, 혈액투석 보조제, 종양 물질, 장기 보존제, 성능 증대제, 수술 보조제 또는 상처 치유제로서; 조영에서; 폐 기능을 개선하기 위해; 또는 이들의 조합으로서 투여되는 것인 방법.
  155. 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈 사합체 또는 약제학적 조성물은 혈관성형술에 대한 보조제로서, 흉부 대동맥류 보수에 대한 보조제로서, 심폐 우회에 대한 보조제로서 또는 심폐 우회를 위한 프라임 용액으로서 투여되는 것인 방법.
  156. 제148항 또는 제149항에 있어서, 상기 대상체는 비인간 동물이고, 상기 방법은 손상으로 인한 혈액 손실, 용혈성 빈혈, 감염성 빈혈, 박테리아 감염, IV 인자 단편화, 비대증 및 비종대, 가금류에서의 출혈 증후군, 저형성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 특발성 면역 용혈성 병증, 철 결핍증, 동종면역 용혈성 빈혈, 미세혈관병 용혈성 빈혈, 기생 또는 수술-마취 유발 뇌 손상의 수의학적 치료를 위한 방법인 것인 방법.
  157. 산소, 일산화질소, 일산화탄소 또는 이들의 혼합물을 조직에 전달하고 미소혈관계에서 아질산염을 일산화질소(NO)로 환원시키는 방법으로서, 상기 방법은 제4항, 제7항, 제13항, 제14항, 제29항, 제30항 및 제38항 내지 제83항 중 어느 한 항의 나이트록실화된 단백질 또는 제131항 내지 제147항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 투여 후, 상기 헤모글로빈은 비리간드화되어 상기 미소혈관계에서 아질산염을 일산화질소로 전환시키는 것인 방법.
KR1020147030716A 2012-04-03 2013-03-15 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물 및 단백질의 나이트록실화를 위한 이의 사용 방법 KR102076874B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261619768P 2012-04-03 2012-04-03
US201261619783P 2012-04-03 2012-04-03
US61/619,768 2012-04-03
US61/619,783 2012-04-03
PCT/US2013/032704 WO2013151776A1 (en) 2012-04-03 2013-03-15 Succinimide-activated nitroxyl compounds and methods for the use thereof for nitroxylation of proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140144262A true KR20140144262A (ko) 2014-12-18
KR102076874B1 KR102076874B1 (ko) 2020-02-12

Family

ID=49300942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147030716A KR102076874B1 (ko) 2012-04-03 2013-03-15 숙신이미드-활성화 나이트록실 화합물 및 단백질의 나이트록실화를 위한 이의 사용 방법

Country Status (10)

Country Link
US (3) US20150094267A1 (ko)
EP (1) EP2834329B1 (ko)
JP (2) JP2015514718A (ko)
KR (1) KR102076874B1 (ko)
CN (1) CN104411807B (ko)
AU (2) AU2013243875B2 (ko)
CA (1) CA2908238C (ko)
HK (1) HK1207659A1 (ko)
MX (1) MX358784B (ko)
WO (1) WO2013151776A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013151776A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Sangart, Inc. Succinimide-activated nitroxyl compounds and methods for the use thereof for nitroxylation of proteins
KR102238718B1 (ko) * 2013-03-15 2021-04-12 쉰들러, 윌리엄 폴리알킬렌 산화물 발레르산염 헤모글로빈 접합체
EP2894476A1 (en) * 2014-01-14 2015-07-15 Universität Konstanz Genetically Encoded Spin Label
US20170143844A1 (en) 2015-11-24 2017-05-25 AntiRadical Therapeutics LLC Composition and Methods of Use of Nano Anti-Radical Therapeutics To Inhibit Cancer
CN105777893B (zh) * 2016-03-24 2019-10-25 杭州亚慧生物科技有限公司 一种高强度血清白蛋白骨修复材料及其制备方法
US11504417B2 (en) 2017-07-18 2022-11-22 VirTech Bio, Inc. Blood substitutes comprising hemoglobin and methods of making
CN114279777A (zh) * 2020-09-28 2022-04-05 深圳市瑞图生物技术有限公司 一种含有脒基类化合物的溶血剂及其血液分析试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09501681A (ja) * 1993-08-16 1997-02-18 シャー、ジェン−チャン ニトロキシドを用いる酸素毒性の防止用組成物と防止法
WO2013151776A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Sangart, Inc. Succinimide-activated nitroxyl compounds and methods for the use thereof for nitroxylation of proteins

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4240797A (en) 1977-10-18 1980-12-23 The Governing Council Of The University Of Toronto Assay for reserve bilirubin binding capacity
US4529719A (en) 1983-05-04 1985-07-16 Tye Ross W Modified crosslinked stroma-free tetrameric hemoglobin
US5004809A (en) * 1986-02-04 1991-04-02 University Of Cincinnati Nitroxide labeled nucleotides and nitroxide labeled hybridization probes
CA1312009C (en) 1986-11-10 1992-12-29 Carl W. Rausch Extra pure semi-synthetic blood substitute
GB8710598D0 (en) 1987-05-05 1987-06-10 Star Medical Diagnostics Ltd Hemoglobin based blood substitute
US5312808A (en) * 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5234903A (en) 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
US5650388A (en) 1989-11-22 1997-07-22 Enzon, Inc. Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5250665A (en) 1991-05-31 1993-10-05 The University Of Toronto Innovations Foundation Specifically β-β cross-linked hemoglobins and method of preparation
US5840701A (en) * 1993-08-16 1998-11-24 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US6458758B1 (en) 1993-08-16 2002-10-01 Synzyme Technologies, Inc. Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
SG95590A1 (en) * 1995-03-31 2003-04-23 Synzyme Technologies Inc Compositions and method utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5585484A (en) 1995-04-19 1996-12-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Hemoglobin crosslinkers
US6627738B2 (en) 1995-09-15 2003-09-30 Duke University No-modified hemoglobins and uses therefor
DE10031740A1 (de) 2000-06-29 2002-02-14 Sanguibio Tech Ag Künstliche Sauerstoffträger aus vernetztem modifizierten Human- oder Schweinehämoglobin mit verbesserten Eigenschaften, Verfahren zu ihrer technisch einfachen Herstellung aus gereinigtem Material in hohen Ausbeuten, sowie deren Verwendung
US20030153491A1 (en) 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
KR100608415B1 (ko) 2002-07-24 2006-08-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 폴리알킬렌 글리콜산 첨가제
DE10393955T5 (de) * 2002-12-23 2005-12-29 L'oreal Zusammensetzung zum Färben von Keratinfasern, die mindestens eine freiradikalische Verbindung vom Nitroxyl-Typ und mindestens einen primären oder sekundären Alkohol enthält
DE60336018D1 (de) 2002-12-23 2011-03-24 Einstein Coll Med Nicht-hypertensive pegylierte hämoglobine und deren herstellungsverfahren
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
WO2006014968A2 (en) 2004-07-27 2006-02-09 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Propargyl nitroxydes and indanyl nitroxides and their use for the treatment of neurologic diseases and disorders
TW200616604A (en) * 2004-08-26 2006-06-01 Nicholas Piramal India Ltd Nitric oxide releasing prodrugs containing bio-cleavable linker
WO2006096774A2 (en) 2005-03-07 2006-09-14 Sangart, Inc. Composition and methods for delivering carbon monoxide (co) and nitric ozide (no) co to tissue using heme proteins as carriers
US8741832B2 (en) * 2005-06-10 2014-06-03 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Pegylated albumin and uses thereof
CA2695384A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Burnham Institute For Medical Research Bi-dentate compounds as kinase inhibitors
EP2030624A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-04 Johannes Gutenberg Universität Antioxidant and paramagnetic heparin-nitroxide derivatives
AU2010258752B2 (en) 2009-06-09 2015-07-09 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US8273857B2 (en) 2009-09-22 2012-09-25 Jen-Chang Hsia Compositions and methods of use of neurovascular protective multifunctional polynitroxylated pegylated carboxy hemoglobins for transfusion and critical care medicine
AU2011220885A1 (en) * 2010-02-25 2012-09-06 Sangart, Inc. Methods for preparing PEG-hemoglobin conjugates using reduced reactant ratios
CN102249987B (zh) * 2011-05-06 2013-07-24 兰州大学 一种考布他汀类化合物及其制备方法和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09501681A (ja) * 1993-08-16 1997-02-18 シャー、ジェン−チャン ニトロキシドを用いる酸素毒性の防止用組成物と防止法
WO2013151776A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Sangart, Inc. Succinimide-activated nitroxyl compounds and methods for the use thereof for nitroxylation of proteins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Archives of Biochemistry & Biophysics 320(1):155-161 (1995) *
J. Org. Chem. 58:2573-2577 (1993) *
Journal of Controlled Release 111:73-80 (2006) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2834329A1 (en) 2015-02-11
US11359004B2 (en) 2022-06-14
AU2018201285A1 (en) 2018-03-22
US20230026348A1 (en) 2023-01-26
AU2013243875A1 (en) 2014-11-20
MX2014011944A (es) 2015-06-05
CN104411807B (zh) 2018-10-02
US20190127445A1 (en) 2019-05-02
US20150094267A1 (en) 2015-04-02
EP2834329B1 (en) 2018-10-17
KR102076874B1 (ko) 2020-02-12
AU2018201285B2 (en) 2020-05-14
WO2013151776A1 (en) 2013-10-10
JP2018150335A (ja) 2018-09-27
EP2834329A4 (en) 2015-12-23
HK1207659A1 (en) 2016-02-05
CN104411807A (zh) 2015-03-11
JP2015514718A (ja) 2015-05-21
JP6686067B2 (ja) 2020-04-22
CA2908238A1 (en) 2013-10-10
CA2908238C (en) 2023-01-10
AU2013243875B2 (en) 2017-11-30
MX358784B (es) 2018-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6686067B2 (ja) スクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物およびタンパク質のニトロキシル化のためのその使用のための方法
JP6668515B2 (ja) ジアスピリン架橋ｐｅｇヘモグロビン
CN105188761B (zh) 聚环氧烷戊酸酯血红蛋白缀合物
US20120282236A1 (en) Method of delivering oxygen using peg-hemoglobin conjugates with enhanced nitrite reductase activity

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant