KR20140142715A - 단일 샘플에 대한 면역형광 및 형광-기반 핵산 분석 - Google Patents

단일 샘플에 대한 면역형광 및 형광-기반 핵산 분석 Download PDF

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피오나 진티
케빈 비. 케니
데이비드 라반 헨더슨
마이클 제이. 게르데스
모레노 아드리아나 아이. 라리에라
지아오펭 리우
알렉스 디. 코윈
스티븐 이. 진젤레비치
토마스 하
나탈리 알. 준
아이누라 키쉬투바예브
데니스 에이 홀맨-해글리
잉 리
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Abstract

본 발명은 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하고, 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하고, 표적 단백질 및 표적 핵산 둘 모두의 상대적인 위치를 제공하는 복합 영상을 생성하는 것을 포함하는, 단일 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하는 방법을 제공한다. 또한, 복합 영상을 제공하는 방법에 따라 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하고, 복합 영상으로부터 관심 있는 핵산 서열 및 단백질의 발현을 분석하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플의 분석 방법을 제공한다. 또한, 신규한 방법을 수행하기 위한 수단을 포함하는 시스템 및 키트를 제공한다.

Description

단일 샘플에 대한 면역형광 및 형광-기반 핵산 분석{IMMUNOFLUORESCENCE AND FLUORESCENT-BASED NUCLEIC ACID ANALYSIS ON A SINGLE SAMPLE}
본 발명은 생물학적 샘플에 대한 단백질 발현 및 표적 핵산 서열의 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생물학적 샘플의 동일한 절편에 대한 단백질 발현 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다. 또한, 신규한 방법을 수행하기 위한 키트 및 시스템을 제공한다.
대부분의 질환은 불균일한 표현형을 갖고, 환자 평가를 위해 복잡한 특성화를 필요로 한다. 예를 들어, 유방암은 5개의 특유한 아형으로 이루어지고, 각각의 아형은 상이한 표현형, 생존 시간, 요법 반응성과 연관된다. 예를 들어, 내강형 (luminal type)은 최고의 예후를 갖고, 호르몬 요법에 잘 반응하는 반면, HER2-양성 및 기저 종양 환자는 불량하게 진행된다. 최근의 표적화된 요법의 개발이 HER2-양성 종양의 치료에 유의한 영향을 주었지만, 많은 상기 환자는 반응하지 않거나, 내성이 발생하였다. 많은 상기 환자에서, HER2 유전자의 돌연변이 또는 다른 경로 (예를 들어 PI3K/AKT)의 활성화가 확인되었고, 상기 다른 경로에도 영향을 주는, 정상 및 돌연변이된-HER2를 모두 표적화하는 새로운 요법 또는 조합 요법이 제안되었다. 추가로, 몇몇 연구는 심지어 상이한 유방암 아형에서 동일한 유전자 내의 변화가 질환 경로 및 요법 반응 둘 모두에 상이하게 영향을 줄 수 있다고 나타내었다. 따라서, 환자의 종양에 대한 포괄적인 프로파일링 (profiling)은 의사가 환자에 대한 최상의 치료 결정을 내릴 수 있도록 하는데 가장 중요하다.
유방암 환자의 일부에서, HER2 유전자는 악성 변환 및 종양 진행 과정의 일부로서 증폭된다. HER2 유전자 증폭은 일반적으로 유방암 세포의 표면 상의 HER2 단백질의 과다발현을 야기한다. HER2 유전자의 증폭 및/또는 그의 단백질의 과다발현은 25-30%의 유방암에서 입증되었다. 몇몇 연구는 HER2 상태가 특정 화학요법에 대한 감수성 또는 내성과 상관성이 있음을 보여주었다. 높은 HER2 단백질 과다발현 또는 HER2 유전자 증폭의 입증은 HER2 단백질에 대한 모노클로날 항체인 허셉틴(Herceptin)™을 사용한 요법의 개시를 위해 필수적이다. 임상 연구는 종양이 높은 HER2 단백질 과다발현 및/또는 HER2 유전자의 증폭을 갖는 환자가 허셉틴™으로부터 가장 큰 효과를 얻음을 보여주었다. HER2 단백질 수준 및 HER2 유전자 증폭 둘 모두를 측정하여야 한다고 권장된다. 그러나, IHC 및 FISH 분석을 수행하기 위해 통상적으로 2개의 환자 샘플이 사용되고, 이것은 두 결과가 잠재적으로 일치하지 않을 수 있다. 이상적으로는, 두 분석은 동일한 샘플에 대해 세포 대 세포 수준에서 수행되어야 한다.
위 또는 위식도 접합부의 진행성 또는 전이성 암의 환자에서, 약 20%는 HER2-양성 질환을 갖는다. 선암종은 미분화된 암종 및 혼합 종양보다 통상적으로 더 HER2-양성이고; 위식도 접합부의 암은 위의 종양보다 HER2-양성일 가능성이 더 크다. 트라스투주맙(Trastuzumab)™은 위 또는 위식도 접합부의 HER2-양성 진행 또는 전이성 암 환자의 생존을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 연구는 유전자 증폭 (FISH) 및 단백질 과다발현 (면역형광 검출 이용)이 유방암에 있어서 상관성이 없고, 따라서 HER-2 상태를 결정하기 위해서 단일 방법이 사용되어서는 안 된다는 것을 입증하였다.
다양한 방법이 생물학적 샘플에서 상이한 표적을 관찰하기 위해 생물학 및 의학에서 사용될 수 있지만, 많은 현재의 기술은 단일 샘플에서 한번에 단지 일부의 표적만을 검출할 수 있다 (예컨대, 검출가능한 표적의 수가 형광 기반 검출 시스템에 의해 제한되는 면역형광 (IF)). 표적에 대한 추가의 분석은 공급원으로부터 추가의 생물학적 샘플의 사용을 필요로 할 수 있고, 이것은 표적의 상대적인 특징, 예컨대 생물학적 샘플 내의 여러 생물학적 표적의 존재, 부재, 농도 및/또는 공간적 분포를 결정하는 능력을 제한한다. 또한, 특정 경우에, 샘플의 제한된 양이 분석에 이용가능할 수 있거나 또는 개개의 샘플은 다른 관심 있는 단백질, 예컨대 세포 주기 또는 다른 암 바이오마커에 대한 추가의 분석을 필요로 할 수 있다. 따라서, 개개의 샘플을 반복적으로 분석할 수 있는 방법, 작용제 및 장비가 필요하다.
몇몇 실험실은 단일 샘플에 대해 단백질 발현 및 DNA 기반 분석을 조합하고자 시도하였다. 로트너 (Lottner) 등은 단일 조직 샘플에 대해 FISH를 먼저 수행한 후, HER2의 IF를 수행하고, 이어서 영상 분석을 수행하는 프로토콜을 설명하였다 (J Pathol. 2005; 205(5):577-84; doi: 10.1002/path.1742). 저자들은 FISH 전에 IF를 수행하면 보다 높은 형광 및 보다 약한 면역형광이 생성된다고 언급하였다. 레이센비클러 (Reisenbichler) 등은 단일 샘플에 대해 HER2에 대한 면역조직화학 (IHC) 및 발색 (chromogenic) 계내 (in situ) 혼성화 (CISH)의 조합을 실험하였다 (Am J Clin Pathol 2012; 137:102-110; doi: 10.1309/AJCPLNHINN9O6YSF). 저자들은 먼저 CISH 샘플을 영상화한 후, IHC 샘플을 영상화함으로써 신호를 얻는 한편, IHC를 CISH 후에 수행할 때 보다 우수한 영상이 얻어졌고, 또한 샘플은 모든 습식 실험실 실험을 완료할 때까지 (즉, 중간 영상화 단계 없이) 영상화됨을 발견하였다. 중요한 사실은, 레이센비클러 등은 이들이 IHC를 샘플에 대해 먼저 수행한 후 CISH를 수행할 때에는 CISH 신호를 얻을 수 없었다는 것이다.
가이세르 (Gaiser) 등은 동일한 조직 샘플 내의 유전자 증폭에 대해 단백질 발현에 의해 국소화된 조직 구조의 분석 방법을 설명하였다. 저자들은 먼저 모노클로날 항체 및 FITC-표지된 2차 항체를 사용하여 결장암 조직 샘플에서 CD133 발현을 검출하였다. 40x 배율을 사용하여, 관심 있는 영역을 수동으로 선택하고 기록하였다. 영상화 후에, FISH 분석을 증폭된 cMyc 종양 유전자 및 ZNF217에 대해 동시에 수행하였다. 샘플을 다시 동일한 영역에서 40x 배율로 영상화하였다. 타일 (tile) 기반 FISH 분석에 대해 자동 현미경 및 맞춤형 분류기 (custom designed classifier)를 사용하여 영상을 분석하였다 (Anal Cell Pathol (Amst). 2010; 33(2): 105-112; doi: 10.3233/ACP-CLO-2010-0532).
동일한 생물학적 샘플에서 다중 표적의 검출, 및 세포 대 세포 기반 (cell by cell basis)으로 발현을 비교하여 단백질 발현, 아폽토시스 (apoptosis) 등을 기초로 한 세포의 포함 또는 제외를 허용하는 복합 영상의 생성을 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 계속 존재한다.
발명의 개요
본 발명의 한 측면에서, 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 다음 순서의 단계를 포함하는 단일 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하는 방법을 제공한다: (1) 생물학적 샘플의 제1 영상의 생성 단계; (2) 생물학적 샘플의 제2 영상의 생성 단계; 및 (3) 표적 단백질 및 표적 핵산 둘 모두의 상대적인 위치를 제공하는 복합 영상의 생성 단계. 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계는 (a) 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고; (c) 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계는 (a) 단계 (1)로부터의 동일한 샘플을 적어도 하나의 표적 핵산 서열 각각에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 표적 핵산 서열과 혼성화하고; (b) 임의로, 샘플을 형광 마커로 염색하고; (c) 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복합 영상은 제1 영상으로부터의 하나 이상의 신호를 제2 영상으로부터의 하나 이상의 신호와 조합함으로써 생성된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 다음 단계를 포함하는, 단일 생물학적 샘플의 제1 및 제2 영상을 생성하는 방법을 제공한다: (1) (a) 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고; (c) 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성한 후; (2) (a) 단계 (1)로부터의 동일한 샘플을 적어도 하나의 표적 핵산 서열 각각에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 표적 핵산 서열과 혼성화하고; (b) 임의로, 샘플을 형광 마커로 염색하고; (c) 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계.
본 발명의 또 다른 측면에서, 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하고, 복합 영상으로부터 관심 있는 핵산 서열 및 단백질의 발현을 분석하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플의 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 위한 키트를 제공한다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 본 발명의 신규한 방법을 수행하기 위한 구성요소를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 위한 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 신규한 방법을 수행하기 위한 수단을 포함하는 시스템을 제공한다.
도 1은 본 발명의 실시양태에 대한 핵심 단계를 보여주는 흐름도이다.
도 2a: 10x에서 영상화된 유방암 조직을 보여주는 의사 컬러 (pseudocolor) 영상. 조직 절편을 Cy3 표지된 사이토케라틴 (Cytokeratin) 항체, Cy5 표지된 Her2 항체 및 DAPI를 사용하여 염색하였다. 면역형광 영상을 흑백 카메라로 수집하고, 디지탈 방식으로 오버레이하고(overlay), 다음과 같이 착색하였다: DAPI, 청색; 사이토케라틴, 녹색; Her2, 적색. 도 2에 제시된 ROI의 선택은 담청색 직사각형으로 제시된다.
도 2b: 도 1a로부터의 DAPI 및 사이토케라틴 영상 및 녹색 채널에서 배경 형광을 제시하는 영상은 설명되는 바와 같이 가상 H&E 영상을 형성하기 위해 전환되었다.
도 2c: 1a의 DAPI 및 Her2 영상으로부터 생성된 가상 DAB 영상.
도 3: 도 2에 제시된 조직으로부터 선택된 40x ROI의 조합된 Her2 면역형광 (황색), DAPI (청색), Her2 FISH (적색) 및 동원체 17 FISH (녹색).
발명의 상세한 설명
정의:
본 발명의 주제를 보다 분명하게 상세하게 설명하고 제시하기 위해서, 다음 정의가 다음 설명 및 첨부되는 청구 범위에 사용되는 특정 용어에 대해 제공된다.
단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 그렇지 않음이 분명한 경우를 제외하고 복수의 대상을 포함한다. 본원 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 근사치 용어는 관련되는 기본적인 기능의 변화를 야기하지 않으면서 허용가능하게 변경될 수 있는 임의의 정량적 표시를 수식하기 위해 적용될 수 있다. 따라서, 예컨대 "약"과 같은 용어에 의해 수식되는 값은 특정된 정확한 값으로 제한되지 않아야 한다. 달리 나타내지 않으면, 명세서 및 특허청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대, 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 그 반대를 나타내지 않으면, 하기 명세서 및 특허청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 발명의 실시양태에 의해 얻고자 하는 요구되는 특성에 따라 상이할 수 있는 근사치이다. 적어도 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유의한 숫자의 수에 비추어, 통상적인 반올림 기술을 적용함으로써 고려되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고체 지지체"는 생물학적 샘플이 고정될 수 있고 단백질 및 표적 핵산 서열이 본원에 개시된 방법에 의해 후속적으로 검출될 수 있는 물품을 의미한다. 생물학적 샘플은 물리적 흡착에 의해, 공유 결합 형성에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 고정될 수 있다. 고체 지지체는 중합체, 유리, 또는 금속성 물질을 포함할 수 있다. 고체 지지체의 예는 막, 미량역가판, 비드, 필터, 시험 스트립, 슬라이드, 커버 슬립, 및 시험관을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형광 마커"는 특정 세포내 소기관 구획을 선택적으로 염색하는 형광단을 의미한다. 적합한 형광 마커 (및 그의 표적 세포, 세포내 소기관 구획, 또는 적용가능할 경우 세포 성분)의 예는 다음을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (핵산), 에오신 (알칼리성 세포 성분, 세포질), 획스트 (Hoechst) 33258 및 획스트 33342 (2개의 비스벤즈이미드) (핵산), 프로피듐 아이오다이드 (핵산), 퀴나크린 (핵산), 플루오레세인-팔로이딘 (액틴 섬유), 크로모마이신 A 3 (핵산), 아크리플라빈-포일겐 (Feulgen) 반응 (핵산), 아우라민 O-포일겐 반응 (핵산), 에티듐 브로마이드 (핵산), 니슬 (Nissl) 염색 (뉴런), 높은 친화도 DNA 형광단, 예컨대 POPO, BOBO, YOYO 및 TOTO 등, 및 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 히스톤)에 융합된 녹색 형광 단백질, ACMA, 및 아크리딘 오렌지. 바람직하게는, 형광 마커는 핵을 염색한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형광단"은 특정 파장의 빛에 대한 노출에 의해 여기될 때 광 (상이한 파장의)을 방출하는 화학적 화합물을 의미한다. 용어 "형광", "형광", 또는 "형광 신호"는 모두 여기된 형광단에 의한 광의 방출을 의미한다. 형광단은 그의 방출 프로파일, 또는 "색상"의 측면에서 설명될 수 있다. 녹색 형광단 (예를 들어 Cy3, FITC, 및 오레곤 (Oregon) 그린)은 일반적으로 515-540 나노미터 범위 파장에서의 방출을 특징으로 할 수 있다. 적색 형광단 (예를 들어 텍사스 (Texas) 레드, Cy5, 및 테트라메틸로다민)은 일반적으로 590-690 나노미터 범위 파장에서의 방출을 특징으로 할 수 있다. 형광단의 예는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다: 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디술폰산, 아크리딘, 아크리딘의 유도체 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디술포네이트 (루시퍼 (Lucifer) 옐로우 VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 (Brilliant) 옐로우, 쿠마린, 쿠마린 유도체, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-트리플루오로메틸쿨루아린 (쿠마란 151), 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인 (브로모피로갈롤 레드), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)4-메틸쿠마린, 4,4'-디이소티오시아나토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산, 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드 (DNS, 단실 클로라이드), 에오신, 에오신의 유도체, 예컨대 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신, 에리트로신의 유도체, 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일) 아미노플루오레세인 (DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), QFITC (XRITC); 플루오레사민 유도체 (아민과 반응시 형광); IR144; IR1446; 말라카이트 (Malachite) 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르토 크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드, B-피코에리트린; o-프탈디알데히드 유도체 (아민과 반응시 형광); 피렌 및 유도체, 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 (Reactive) 레드 4 (시바크론(Cibacron)™, 브릴리언트 레드 3B-A), 로다민 및 유도체, 예컨대 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민 (R6G), 리싸민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체 (텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA); 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC); 리보플라빈; 로졸산 및 라타나이드 킬레이트 유도체, 퀀텀 도트 (quantum dot), 시아닌, 및 스쿠아레인. 몇몇 실시양태에서, 형광단은 예를 들어 면역형광 분석에서 항체에 부착될 수 있는 형광단을 본질적으로 포함할 수 있다. 항체에 접합될 수 있는 적합한 형광단은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드, Cy2, Cy3, Cy5, 벡터 (VECTOR) 레드, ELF™ (효소-표지된 형광), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, 플루오르엑스 (FluorX), 칼세인, 칼세인-AM, 크립토플루오르(CRYPTOFLUOR)™'S, 오렌지 (42 kDa), 탠저린 (Tangerine) (35 kDa), 골드 (Gold) (31 kDa), 레드 (42 kDa), 크림슨 (Crimson) (40 kDa), BHMP, BHDMAP, Br-오레곤, 루시퍼 옐로우, 알렉사 (Alexa) 염료 패밀리, N-[6-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]카프로일] (NBD), BODIPY., 보론 디피로메텐 디플루오라이드, 오레곤 그린, 미토트래커 (MITOTRACKER), 레드, DiOC7 (3), DiIC18, 피코에리트린, 피코빌리단백질 BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa), 스펙트럼 (Spectrum) 블루, 스펙트럼 아쿠아, 스펙트럼 그린, 스펙트럼 골드, 스펙트럼 오렌지, 스펙트럼 레드, NADH, NADPH, FAD, 적외선 (IR) 염료, 시클릭 GDP-리보스 (cGDPR), 칼코플루오르 화이트 (Calcofluor White), 리싸민, 움벨리페론, 티로신 또는 트립토판. 몇몇 실시양태에서, 형광단은 본질적으로 시아닌 염료를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 형광단은 본질적으로 하나 이상의 시아닌 염료 (예를 들어, Cy3 염료, Cy5 염료, 또는 Cy7 염료)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 또 다른 분자의 특정 공간적 및 극성 구조에 특이적으로 결합하여 이와 상보성인 것으로 규정되는 이뮤노글로불린을 의미한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 당업계에 잘 공지된 기술, 예컨대, 숙주의 면역화 및 혈청의 수집 (폴리클로날)에 의해, 또는 연속적인 하이브리드 세포주를 제조하고 분비된 단백질의 수집 (모노클로날)에 의해, 또는 적어도 천연 항체의 특이적 결합을 위해 필요한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 돌연변이된 형태를 클로닝하고 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 항체는 완전한 이뮤노글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 이뮤노글로불린은 다양한 클래스 및 이소형, 예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM을 포함한다. 기능적 항체 단편은 전장 항체에 유사한 친화도에서의 결합을 보유할 수 있는 항체의 일부 (예를 들어, Fab, Fv 및 F(ab')2, 또는 Fab')를 포함할 수 있다. 또한, 이뮤노글로불린 또는 그의 단편의 응집체, 중합체, 및 접합체는 적절한 경우, 특정 분자에 대한 결합 친화도가 실질적으로 유지된다면 사용될 수 있다.
"표적"은 본원에서 사용되는 바와 같이 일반적으로 생물학적 샘플 내에 존재할 때 검출될 수 있는 생물학적 샘플의 성분을 의미한다. 표적은 그에 대한 천연적으로 발생하는 특이적 결합제 (예를 들어, 항체)가 존재하거나, 또는 그에 대한 특이적 결합제 (예를 들어, 소분자 결합제)가 생산될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 일반적으로, 결합제는 표적의 하나 이상의 별개의 화학적 모이어티 (moiety) 또는 표적의 3차원 구조 성분 (예를 들어, 펩티드 폴딩 (folding)에 의한 3D 구조)을 통해 표적에 결합할 수 있다. 표적은 하나 이상의 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 아피바디 (affibody), 또는 앱타머 (aptamer)), 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 또는 앱타머); 다당류 (예를 들어, 렉틴 또는 당), 지질, 효소, 효소 기질, 리간드, 수용체, 항원, 또는 합텐을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적은 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합제"는 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 생물학적 분자를 의미한다. 결합제는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합한 결합제는 하나 이상의 천연 또는 변형된 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 아피바디, 또는 앱타머), 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 또는 앱타머); 다당류 (예를 들어, 렉틴, 당), 지질, 효소, 효소 기질 또는 억제제, 리간드, 수용체, 항원, 합텐 등을 포함할 수 있다. 적합한 결합제는 분석되는 샘플 및 검출을 위해 이용가능한 표적에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 샘플 내의 표적은 리간드를 포함할 수 있고 결합제는 수용체를 포함할 수 있거나 또는 표적은 수용체를 포함할 수 있고 프로브는 리간드를 포함할 수 있다. 유사하게, 표적은 항원을 포함할 수 있고 결합제는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있거나 또는 그 반대일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적은 핵산을 포함할 수 있고 결합제는 상보성 핵산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 및 결합제 둘 모두는 서로 결합할 수 있는 단백질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 2개의 상이한 분자 중 한 분자에 대한 실질적으로 더 작은 인식에 비해 다른 하나에 대한 특이적 인식을 의미한다. 분자는 정전기적 상호작용, 수소 결합 또는 소수성 상호작용 중 하나 이상에 의해 발생하는 2개의 분자 사이의 특이적 인식을 생성하는, 그 표면 상의 또는 공동 내의 영역을 가질 수 있다. 특이적 결합의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 항체-항원 상호작용, 효소-기질 상호작용, 폴리뉴클레오티드 상호작용 등. 몇몇 실시양태에서, 결합제 분자는 주위 조건 (즉, 약 6 내지 약 8의 pH 및 약 0℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도) 하에 약 105 M-1보다 낮지 않은, 표적에 대한 고유 평형 회합 상수 (KA)를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "계내"는 일반적으로 본래의 위치, 예를 들어 무손상 장기 또는 조직에서 또는 장기 또는 조직의 대표적인 분절에서 발생하는 사건을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 표적의 계내 분석은 유기체, 장기, 조직 샘플, 또는 세포 배양액을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래된 세포에 대해 수행될 수 있다. 계내 분석은 표적이 그의 본래 부위로부터 제거될 때 상실될 수 있는 맥락 관련 (contextual) 정보를 제공한다. 따라서, 표적의 계내 분석은 표적-결합 프로브가 세포 내에 유지될 경우에 세포막이 완전히 무손상이거나 부분적으로 무손상이거나 상관없이 전체 세포 또는 조직 샘플 내에 위치하는 표적-결합 프로브의 분석을 설명한다. 또한, 본원에 개시된 방법은 고정되거나 고정되지 않은 세포 또는 조직 샘플에서 표적을 계내에서 분석하기 위해 사용될 수 있다.
"화학 작용제"는 형광단 또는 형광단과 결합제 사이의 절단가능한 링커 (존재할 경우)를 변형할 수 있는 하나 이상의 화학물질을 포함할 수 있다. 화학 작용제는 고체, 용액, 겔, 또는 현탁액의 형태로 형광단과 접촉될 수 있다. 신호 변형에 유용한 적합한 화학 작용제는 pH를 변경하는 작용제 (예를 들어, 산 또는 염기), 전자 공여자 (예를 들어, 친핵체), 전자 수여자 (예를 들어, 친전자체), 산화제, 환원제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 염기, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화암모늄, 탄산칼륨, 또는 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 아세트산, 포름산, 트리플루오로아세트산, 또는 디클로로아세트산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 친핵체, 예를 들어, 시아나이드, 포스핀, 또는 티올을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 환원제, 예를 들어, 포스핀, 티올, 나트륨 디티오나이트, 또는 물의 존재 하에 사용될 수 있는 히드라이드, 예컨대 보로히드라이드 또는 시아노보로히드라이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 산화제, 예를 들어, 활성 산소종, 히드록실 라디칼, 단일체 산소, 과산화수소, 또는 오존을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 플루오라이드, 예를 들어 테트라부틸암모늄 플루오라이드, 피리딘-HF, 또는 SiF4를 포함할 수 있다.
하나 이상의 상기 언급한 화학 작용제는 화학 작용제에 대한 형광단, 결합제, 표적, 또는 생물학적 샘플의 감수성에 따라 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본질적으로 결합제, 표적, 및 생물학적 샘플의 일체성에 영향을 주지 않는 화학 작용제가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합제와 표적 사이의 결합 특이성에 영향을 주지 않는 화학 작용제가 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 2개 이상의 형광단이 동시에 사용될 수 있는 경우에, 화학 작용제는 하나 이상의 신호 생성기를 선택적으로 변형할 수 있다. 상이한 신호 생성기의 화학 작용제에 대한 감수성은 신호 생성기의 농도, 온도, 또는 pH에 따라 부분적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 2개의 상이한 형광단은 염기의 농도에 따라 염기에 대한 상이한 감수성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "명시야형 (brightfield type) 영상" 또는 "가상 염색 영상" (VSI)은 명시야 염색 프로토콜로부터 얻은 영상을 시뮬레이션한 생물학적 샘플의 영상을 의미한다. 영상은 명시야 영상과 유사한 콘트라스트, 강도, 및 색상을 갖는다. 이를 통해, 생물학적 샘플, 예를 들어 핵, 상피, 기질 내의 특징부 또는 임의의 종류의 세포외 기질 물질 특징부는 마치 명시야 염색 프로토콜이 생물학적 샘플에 대해 직접 사용된 것처럼 특성화될 수 있다.
본 발명의 일반적인 설명
본 발명은 일반적으로 면역형광 검출을 형광 기반 핵산 분석과 조합한, 분석, 진단 또는 예후 용도에 적용가능한 방법에 관한 실시양태를 포함한다. 개시된 방법은 일반적으로 단일 생물학적 샘플로부터의 상이한 종류의 표적 (즉, 단백질 및 핵산)의 검출 및 상관성에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 동일한 검출 채널을 사용하여 동일한 종류의 다중 표적 (즉, 각각 단백질 또는 핵산)을 검출하는 방법이 개시된다. 상기 실시양태에서, 상관성은 상이한 종류의 다중 표적 사이에서 유도될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플의 일체성에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않으면서 동일한 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출을 허용할 수 있다. 동일한 생물학적 샘플 내의 표적의 검출은 생물학적 샘플 내의 표적에 대한 상대적인 공간 정보를 추가로 제공할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 또한 제한된 양의 생물학적 샘플이 분석을 위해 이용가능하고 동일한 샘플이 다중 분석을 위해 처리되어야하는 분석 용도에 적용될 수 있다. 또한, 동일한 검출 채널이 샘플 내의 상이한 표적의 검출을 위해 사용될 수 있고, 이것은 다중 표적의 분석을 위한 화학적 요건을 감소시킬 수 있다. 방법은 또한 분석가능한 신호의 제한 때문에 동시에 검출가능한 표적의 수가 제한될 수 있는 검출 방법을 기초로 한 분석을 용이하게 할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 다중 표적을 검출하는 방법은 생물학적 샘플에서 표적의 순차적인 검출을 포함한다. 방법은 일반적으로 생물학적 샘플에서 제1 표적을 검출하고, 임의로 제1 표적으로부터의 신호를 변형하고, 생물학적 샘플에서 제2 표적을 검출하는 단계를 포함한다. 방법은 제1 또는 제2 표적으로부터의 신호의 변형, 이어서 생물학적 샘플에서 상이한 표적의 검출 단계 등을 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 다음 순서의 단계를 포함하는 단일 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하는 방법을 제공한다: (1) 생물학적 샘플의 제1 영상의 생성; (2) 생물학적 샘플의 제2 영상의 생성; 및 (3) 표적 단백질 및 표적 핵산 둘 모두의 상대적인 위치를 제공하는 복합 영상의 생성. 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계는 (a) 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고; (c) 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계는 (a) 단계 (1)로부터의 동일한 샘플을 적어도 하나의 표적 핵산 서열 각각에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 표적 핵산 서열과 혼성화하고; (b) 임의로, 샘플을 형광 마커로 염색하고; (c) 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복합 영상을 생성하는 단계는 복합 영상을 생성하기 위해 제1 영상의 생성 및 제2 영상의 생성에서 얻은 신호 정보의 사용을 포함한다. 특정 실시양태에서, 복합 영상을 생성하는 단계는 단계 (1)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치를 단계 (2)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치와 함께 정합시키는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 단계 (1)(d)는 (i) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 초기 영상을 생성하고; (ii) 초기 영상으로부터 관심 있는 영역을 선택하고, 초기 영상보다 고해상도의 제1 영상을 생성하기 위해 적어도 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 복합 영상은 고해상도의 영상 및 제2 영상으로부터의 신호 정보를 조합함으로써 생성된다. 다른 실시양태에서, 복합 영상은 고해상도의 영상에서의 형광 마커로부터의 신호의 위치를 제2 영상에서의 형광 마커로부터의 신호의 위치와 함께 정합시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 복합 영상의 생성은 단계 (1)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치를 단계 (2)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치와 함께 정합시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 다음 단계를 포함하는, 단일 생물학적 샘플의 제1 및 제2 영상을 생성하는 방법을 제공한다: (1) (a) 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고; (c) 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성한 후; (2) (a) 단계 (1)로부터의 동일한 샘플을 적어도 하나의 표적 핵산 서열 각각에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 표적 핵산 서열과 혼성화하고; (b) 임의로, 샘플을 형광 마커로 염색하고; (c) 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계.
구체적인 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 마커 및 형광 마커 (예를 들어, DAPI) 염색을 위해 면역형광에 의해 염색된 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 조직 샘플의 제1 저배율 영상을 생성하고; 저배율 영상으로부터 가상 H&E 또는 가상 DAB 영상을 생성하고 염색 강도 또는 형태를 기초로 하여 관심 있는 영역을 선택하기 위해 이를 이용하고; FISH 및 형광 마커 염색에 의해 염색된 샘플의 제2 영상을 생성하고; 복합 영상을 생성하기 위한 좌표로서 형광 마커 염색을 사용하여 얻은 공통 영상을 기초로 하여 영상을 오버레이하거나 정합시키는 것을 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 복합 영상은 명시야형 영상, 예컨대, 가상 H&E 또는 가상 DAB 영상이다. 특정 실시양태에서, 방법은 개별 세포에서 단백질 발현 및 표적 핵산 서열의 양을 측정하기 위해 영상을 분석하는 것을 추가로 포함한다.
생물학적 샘플
본 발명의 한 실시양태에 따른 생물학적 샘플은 고체 또는 유체일 수 있다. 생물학적 샘플은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 얻은 생물학적 조직 또는 유체 기원의 샘플을 비롯하여 생물학적 대상체로부터 얻은 샘플을 의미한다. 생물학적 샘플의 적합한 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 혈액, 타액, 뇌척수액, 흉수, 젖, 림프, 가래, 정액, 소변, 대변, 눈물, 바늘 흡인물, 피부의 외부 절편, 호흡관, 장관 및 비뇨생식관, 종양, 장기, 세포 배양액, 또는 고체 조직 절편. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 그 자체로, 즉 관심 있는 표적의 수거 및/또는 단리 없이 분석될 수 있다. 대체 실시양태에서, 샘플의 수거는 분석 전에 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플의 시험관내 분석을 위해 특히 적합할 수 있다. 생물학적 샘플은 고체 지지체 상에, 예컨대 유리 슬라이드, 미량역가, 또는 ELISA 플레이트에 고정될 수 있다.
생물학적 샘플은 그의 물리적 상태, 예컨대 동결 또는 염색 또는 달리 처리된 상태 (이로 제한되지 않음)와 무관하게 임의의 상기 언급한 샘플을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 자연에서 샘플과 천연적으로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대, 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 포함할 수 있다.
생물학적 샘플은 원핵 기원 또는 진핵 기원 (예를 들어, 곤충, 원생동물, 조류, 어류, 파충류)의 것일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 소, 개, 당나귀, 기니 피그, 또는 토끼)의 것이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 영장류 기원 (예를 들어, 침팬지 또는 인간)의 것이다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 전체 세포, 세포 구성 성분, 세포 원심분리물 (cytospin), 또는 세포 도말을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 본질적으로 조직 샘플을 포함한다. 조직 샘플은 유사한 기능을 가질 수 있는 생물학적 대상체의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 샘플은 인간의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 포함할 수 있다. 적합한 인간 조직의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: (1) 상피; (2) 혈관, 뼈 및 연골을 포함하는 결합 조직; (3) 근육 조직; 및 (4) 신경 조직. 조직 샘플의 공급원은 신선한, 냉동 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터 얻은 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성 성분; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액, 또는 간질액; 또는 대상체의 임신 또는 발생의 임의의 시기로부터의 세포일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 샘플은 일차 또는 배양된 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다.
조직 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 샘플은 고정되고 파라핀에 포매될 수 있다. 조직 샘플은 고정되거나 통상적인 방법에 의해 달리 보존될 수 있고, 고정제의 선택은 조직이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 의해 결정될 수 있다. 고정 길이는 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정제에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 중성 완충 포르말린, 보우인 (Bouin) 또는 파라포름알데히드가 조직 샘플을 고정하거나 보존하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 정상 또는 암 기원의 조직 절편, 예컨대 결장, 유방, 전립선, 폐, 간, 및 위로부터의 조직 절편을 포함한다. 조직 절편은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 얇은 절편을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 샘플의 다중 절편을 채취하고, 본원에 개시된 방법이 적어도 2개의 상이한 표적 (즉, 이 중 하나는 단백질 기원의 것이고 또 다른 하나는 핵산 기원의 것임)에 대해 조직 샘플의 동일한 절편의 분석을 위해 사용될 수 있으면 분석될 수 있다. 생물학적 샘플로서 이용될 경우 조직 절편의 두께는 약 100 마이크로미터 미만 범위, 약 50 마이크로미터 미만 범위, 약 25 마이크로미터 미만 범위, 또는 약 10 마이크로미터 미만 범위일 수 있다.
표적 단백질
본 발명의 실시양태에 따른 표적 단백질은 생물학적 샘플의 표면 상에 (예를 들어, 조직 절편의 표면 상의 항원) 또는 샘플의 대부분에 (예를 들어, 완충제 용액 내의 항체) 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 단백질은 생물학적 샘플의 표면에 본래 존재하지 않을 수 있고, 생물학적 샘플은 표적 단백질을 표면 상에 이용가능하도록 처리되어야 할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 단백질은 조직에, 세포 표면 상에, 또는 세포 내에 존재할 수 있다.
분석할 표적 단백질의 적합성은 생물학적 샘플에 요구되는 분석의 종류 및 특성에 의해 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적은 생물학적 샘플 내의 분석물의 존재 또는 부재에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 단백질은 생물학적 샘플의 상태에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 조직 샘플을 포함하는 경우에, 본원에 개시된 방법은 상이한 종류의 세포 또는 조직를 비교하거나, 상이한 발생기를 비교하거나, 질환 또는 이상의 존재를 검출하거나, 또는 질환 또는 이상의 종류를 결정할 때 도움을 줄 수 있는 표적 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
적합한 표적 단백질은 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 아피바디, 또는 앱타머), 효소, 리간드, 수용체, 항원, 또는 합텐 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 언급한 표적 단백질 중 하나 이상은 특정 세포에 특유한 반면, 다른 표적 단백질은 특정 질환 또는 병태와 연관될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 검출되고 분석될 수 있는 조직 샘플 내의 표적 단백질은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 예후 마커, 예측 마커, 호르몬 또는 호르몬 수용체, 림포이드 (lymphoid), 종양 마커, 세포 주기 연관 마커, 신경 조직 및 종양 마커, 또는 분화 집단 (cluster differentiation) 마커.
적합한 예후 마커의 예는 효소 표적, 예컨대 갈락토실 트랜스퍼라제 II, 뉴런 특이적 에놀라제, 양성자 ATPase-2, 또는 산 포스파타제를 포함할 수 있다. 다른 예후 단백질 또는 유전자 마커의 예는 Ki67, 사이클린 E, p53, cMet를 포함한다.
예측 마커 (약물 반응)의 적합한 예는 단백질 또는 유전자 표적, 예컨대 EGFR, Her2, ALK를 포함할 수 있다.
적합한 호르몬 또는 호르몬 수용체의 예는 인간 융모성 성선자극호르몬 (HCG), 부신 피질 자극 호르몬, 암배아 항원 (CEA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, gC1q-R/p33 보체 수용체, IL-2 수용체, p75 신경영양인자 수용체, PTH 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 또는 인슐린 수용체를 포함할 수 있다.
적합한 림포이드의 예는 알파-1-항키모트립신, 알파-1-항트립신, B 세포 표적, bcl-2, bcl-6, B 림프구 항원 36 kD, BM1 (골수성 표적), BM2 (골수성 표적), 갈렉틴-3, 그랜자임 (granzyme) B, HLA 클래스 I 항원, HLA 클래스 II (DP) 항원, HLA 클래스 II (DQ) 항원, HLA 클래스 II (DR) 항원, 인간 호중구 데펜신, 이뮤노글로불린 A, 이뮤노글로불린 D, 이뮤노글로불린 G, 이뮤노글로불린 M, 카파 경쇄, 카파 경쇄, 람다 경쇄, 림프구/조직구 항원, 대식세포 표적, 무라미다제 (리소자임), p80 역형성 림프종 키나제, 형질 세포 표적, 분비성 백혈구 프로테아제 억제제, T 세포 항원 수용체 (JOVI 1), T 세포 항원 수용체 (JOVI 3), 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제, 또는 비군집 B 세포 표적을 포함할 수 있다.
적합한 종양 마커의 예는 알파 페토단백질, 아포지단백질 D, BAG-1 (RAP46 단백질), CA19-9 (시알릴 루이스에이), CA50 (암종 연관 뮤신 항원), CA125 (난소암 항원), CA242 (종양 연관 뮤신 항원), 크로모그라닌 A, 클러스테린 (아포지단백질 J), 상피 막 항원, 상피-관련 항원, 상피 특이적 항원, 총 낭포성 질환 유체 단백질-15, 간세포 특이적 항원, 헤레굴린, 인간 위 뮤신, 인간 유지방구, MAGE-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 멜란 A, 흑색종 표적 (HMB45), 메소텔린, 메탈로티오네인, 소안구 전사 인자 (MITF), Muc-1 코어 당단백질, Muc-1 당단백질, Muc-2 당단백질, Muc-5AC 당단백질, Muc-6 당단백질, 미엘로퍼옥시다제, Myf-3 (횡문근육종 표적), Myf-4 (횡문근육종 표적), MyoD1 (횡문근육종 표적), 미오글로빈, nm23 단백질, 태반 알칼리성 포스파타제, 프리알부민, 전립선 특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 전립선 인히빈 펩티드, PTEN, 신장 세포 암종 표적, 소장 점액 항원, 테트라넥틴, 갑상선 전사 인자-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 2의 조직 억제제, 티로시나제, 티로시나제-관련 단백질-1, 빌린, 또는 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자를 포함할 수 있다.
세포 주기 연관 마커의 적합한 예는 아폽토시스 프로테아제 활성화 인자-1, bcl-w, bcl-x, 브로모데옥시우리딘, CAK (cdk-활성화 키나제), 세포 아폽토시스 감수성 단백질 (CAS), 카스파제 2, 카스파제 8, CPP32 (카스파제-3), CPP32 (카스파제-3), 사이클린 의존성 키나제, 사이클린 A, 사이클린 B1, 사이클린 D1, 사이클린 D2, 사이클린 D3, 사이클린 E, 사이클린 G, DNA 단편화 인자 (N-말단), Fas (CD95), Fas-연관 치사 도메인 단백질, Fas 리간드, Fen-1, IPO-38, Mcl-1, 미니염색체 유지 단백질, 미스매치 (mismatch) 복구 단백질 (MSH2), 폴리 (ADP-리보스) 중합효소, 증식성 세포 핵 항원, p16 단백질, p27 단백질, p34cdc2, p57 단백질 (Kip2), p105 단백질, Stat 1 알파, 토포이소머라제 I, 토포이소머라제 II 알파, 토포이소머라제 III 알파, 또는 토포이소머라제 II 베타를 포함할 수 있다.
신경 조직 및 종양 마커의 적합한 예는 알파 B 크리스탈린, 알파-인터넥신, 알파 시누클레인, 아밀로이드 전구체 단백질, 베타 아밀로이드, 칼빈딘, 콜린 아세틸트랜스퍼라제, 흥분성 아미노산 수송체 1, GAP43, 신경교 섬유질 산성 단백질, 글루타메이트 수용체 2, 미엘린 염기성 단백질, 신경 성장 인자 수용체 (gp75), 신경모세포종 표적, 신경 미세섬유 68 kD, 신경 미세섬유 160 kD, 신경 미세섬유 200 kD, 뉴런 특이적 에놀라제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 알파4, 니코틴 아세틸콜린 수용체 베타2, 페리페린, 단백질 유전자 생성물 9, S-100 단백질, 세로토닌, SNAP-25, 시냅신 I, 시냅토피신, 타우, 트립토판 히드록실라제, 티로신 히드록실라제, 또는 유비퀴틴을 포함할 수 있다.
적합한 분화 집단 마커의 예는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3델타, CD3엡실론, CD3감마, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8알파, CD8베타, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CDw93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CDw125, CD126, CD127, CDw128a, CDw128b, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CDw150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, 및 TCR-제타를 포함할 수 있다.
다른 적합한 표적 단백질은 동원체 단백질-F (CENP-F), 기안틴, 인볼루크린, 라민 A&C (XB 10), LAP-70, 뮤신, 핵공 복합체 단백질, p180 라멜라체 단백질, 란 (ran), 카텝신 D, Ps2 단백질, Her2-neu, P53, S100, 상피 표적 항원 (EMA), TdT, MB2, MB3, PCNA, Ki67, 사이토케라틴, PI3K, cMyc 또는 MAPK를 포함한다.
또 다른 적합한 표적 단백질은 Her2/neu (유방암 및 위암에서 과다발현되는 표피 성장 인자, 모노클로날 항체에 의한 요법은 종양 성장을 느리게 함); EGF-R/erbB (표피 성장 인자 수용체); ER (양성 환자에서 에스트로겐 제한 요법을 결정하기 위한, 핵에 위치하고 ISH로 검출되는 일부 유방암 종양의 성장을 위해 필요한 에스트로겐 수용체); PR (프로게스테론 수용체는 DNA에 결합하는 호르몬임); AR (안드로겐 수용체는 안드로겐 의존성 종양 성장에 관여함); β-카테닌 (암에서 종양 유전자는 세포막으로부터 핵으로 이동하고, 세포 부착에서 및 잠재적인 유전자 조절 단백질로서 기능); 포스포-β-카테닌: 인산화됨 (β-카테닌의 형태는 시토졸에서 분해되고 핵으로 이동하지 않음); GSK3β (Wnt 경로에서 글리코겐 합성효소 키나제-3β 단백질은 선구동물에서 신속한 분해를 위해 β-카테닌을 인산화함 (포스포-β-카테닌)); PKCβ (매개인자 G-단백질 커플링된 수용체); NFKβ (핵으로 이동할 때 염증에 대한 핵 인자 카파 B 마커); VEGF (혈관신생과 관련된 혈관 내피 성장 인자); E-카드헤린 (상피 세포에서 발현되는 세포 대 세포 상호작용 분자, 그 기능은 상피 암에서 상실됨); c-met (티로신 키나제 수용체)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 단백질은 HER2이다.
표적 핵산 서열
본 발명의 실시양태에 따른 표적 핵산 서열은 생물학적 샘플 내의 핵산 분자에 함유된 관심 있는 서열을 의미한다. 핵산 분자는 생물학적 샘플의 세포의 핵 (예를 들어, 염색체 DNA)에 존재하거나 세포질 (예를 들어, mRNA)에 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 분자는 생물학적 샘플의 표면에 본래 존재하지 않을 수 있고, 생물학적 샘플은 핵산 분자를 프로브에 의해 접근가능하도록 처리되어야 할 수 있다. 예를 들어, 샘플의 프로테아제 처리는 표적 핵산 서열을 쉽게 제시할 수 있다.
분석할 핵산 분자의 적합성은 생물학적 샘플에 요구되는 분석의 종류 및 특성에 의해 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 분석은 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 서열의 유전자 발현 수준에 대한 정보를 제공할 수 있다. 다른 실시양태에서, 분석은 염색체 DNA의 존재 또는 부재 또는 증폭 수준에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 조직 샘플을 포함하는 경우에, 본원에 개시된 방법은 표적 핵산 서열을 보유하는 특정 염색체 절편의 증가된 카피수를 갖는 세포를 확인할 수 있는 표적 핵산 서열을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 검출되고 분석될 수 있는 조직 샘플 내의 표적 핵산 서열은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 예후 마커, 호르몬 또는 호르몬 수용체, 림포이드, 종양 마커, 세포 주기 연관 마커, 신경 조직 및 종양 마커, 또는 분화 집단 마커에 대한 핵산 서열. 이들 마커의 예는 "표적 단백질" 섹션에서 설명되었다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 표적 핵산 서열 표적은 EGFR, TOP2A, cMyc, ALK, FGFR1 또는 HER2 유전자에 대한 서열이다.
특정 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 표적 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 일부인 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 표적 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 일부인 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 표적 핵산 서열은 표적 단백질과 상이한 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 일부인 서열을 포함할 수 있다.
표적 핵산 서열에 대한 프로브
몇몇 실시양태에서, 프로브는 표적 핵산 서열을 검출하기 위해 사용된다. 프로브는 관심 있는 서열을 함유하는 핵산 분자의 영역에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 프로브는 서열-특이적이다. 서열-특이적 프로브는 핵산을 포함할 수 있고, 프로브는 뉴클레오티드 또는 그의 유도체의 특정 선형 배열을 인식할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 선형 배열은 프로브 내의 대응하는 상보성 뉴클레오티드에 각각 결합할 수 있는 연속적인 뉴클레오티드 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다. 대체 실시양태에서, 서열은 프로브 상의 대응하는 상보성 잔기를 갖지 않을 수 있는 1, 2 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 존재할 수 있기 때문에 연속적이지 않을 수 있다. 프로브의 적합한 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA) 서열, 잠금 (locked) 핵산 (LNA) 서열, 또는 앱타머. 몇몇 실시양태에서, 적합한 프로브는 핵산 유사체, 예컨대, 디옥시게닌 dCTP, 비오틴 dcTP 7-아자구아노신, 아지도티미딘, 이노신, 또는 우리딘을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 프로브는 표적 핵산 서열과 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 결합을 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프로브는 표적 핵산 서열과 훅스틴 (Hoogsteen) 결합을 형성하여 삼중체를 형성할 수 있다. 훅스틴 결합에 의해 결합하는 프로브는 핵산 서열의 주 그루브 (major groove)에 들어가서 여기에 위치하는 염기와 혼성화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로브는 표적 핵산 서열과 왓슨-크릭 및 훅스틴 결합 둘 모두를 형성할 수 있다 (예를 들어, 비스 PNA 프로브는 핵산 분자에 대해 왓슨-크릭 및 훅스틴 결합 둘 다를 형성할 수 있다).
몇몇 실시양태에서, 프로브는 핵산 프로브, 펩티드 핵산 프로브, 잠금 핵산 프로브, mRNA 프로브, miRNA 프로브 또는 siRNA 프로브를 포함할 수 있다.
또한, 프로브의 길이는 결합 특이성을 결정할 수 있다. 프로브와 표적 핵산 서열 사이의 단일 미스매치의 에너지 비용은 보다 긴 서열보다 더 짧은 서열에 대해 비교적 높을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 보다 작은 프로브의 혼성화는 보다 긴 프로브의 혼성화보다 더 특이적일 수 있고, 그 이유는 보다 긴 프로브는 미스매치할 가능성이 더 클 수 있고, 조건에 따라 핵산에 계속 결합할 수 있기 때문이다. 특정 실시양태에서, 보다 짧은 프로브는 제시된 온도 및 염 농도에서 보다 낮은 결합 안정성을 보일 수 있다. 짧은 서열에 결합하기 위한 보다 큰 안정성을 보일 수 있는 프로브가 이 경우에 사용될 수 있다 (예를 들어, 비스 PNA). 몇몇 실시양태에서, 프로브의 길이는 약 4개 뉴클레오티드 내지 약 12개 뉴클레오티드, 약 12개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드, 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250개 뉴클레오티드 내지 약 500개 뉴클레오티드, 또는 약 500개 뉴클레오티드 내지 약 1000개 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프로브의 길이는 약 1000개 뉴클레오티드 초과 범위일 수 있다. 프로브의 길이에도 불구하고, 프로브의 모든 뉴클레오티드 잔기가 표적 핵산 서열 내의 상보성 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 것은 아니다. 예를 들어, 프로브는 50개 뉴클레오티드 잔기 길이를 가질 수 있고, 이 중 단지 25개의 잔기만이 표적 핵산 서열에 혼성화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 잔기는 서로 연속적일 수 있다. 프로브는 단일 가닥일 수 있거나 또는 2차 구조를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 샘플을 포함할 수 있고, 생물학적 샘플은 프로브를 사용하여 계내 혼성화 (ISH)에 적용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 샘플은 조직 샘플에 대한 요구되는 정보를 얻기 위해 면역형광 (IF)에 추가로 계내 혼성화에 적용될 수 있다.
프로브의 종류 및 표적 핵산 서열과 무관하게, 프로브와 핵산 서열 사이의 결합 특이성은 또한 결합 조건, 예를 들어 상보성 핵산의 경우에 혼성화 조건에 따라 영향받을 수 있다. 적합한 결합 조건은 pH, 온도, 또는 염 농도 중 하나 이상을 조정함으로써 달성될 수 있다.
프로브는 형광단으로 내인성으로 (프로브의 합성 동안 부착된 형광단) 또는 외인성으로 (보다 후기 단계 동안 부착된 형광단) 표지될 수 있다. 예를 들어, 내인성으로 표지된 핵산은 형광단-표지된 뉴클레오티드를 성장하는 핵산 사슬 내로 직접 도입하는 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프로브는 형광단이 보다 후기 단계에서 도입될 수 있는 방식으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 후자의 표지는 활성 아미노 또는 티올기를 핵산 사슬 내로 도입함으로써 화학적 수단에 의해 달성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, DNA)과 같은 프로브는 그에 대한 적절한 화학을 사용하여 직접 화학적으로 표지될 수 있다.
결합제
본원에 개시된 방법은 특이적인 방식으로 표적에 물리적으로 결합하는 결합제의 사용을 수반한다. 몇몇 실시양태에서, 결합제는 표적에 충분한 특이성으로 결합할 수 있고, 즉, 결합제는 임의의 다른 분자에 대한 것보다 더 큰 친화도로 표적에 결합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합제는 다른 분자에 결합할 수 있지만, 결합은 비-특이적 결합이 배경 수준이거나 배경 수준 근처일 수 있도록 하는 것일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 관심 있는 표적에 대한 결합제의 친화도는 다른 분자에 대한 그의 친화도의 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 가장 큰 차별적인 친화도를 갖는 결합제가 사용될 수 있지만, 이 결합제는 표적에 대한 가장 큰 친화도를 갖는 것이 아닐 수 있다.
표적과 결합제 사이의 결합은 물리적 결합에 의해 영향받을 수 있다. 물질적 결합은 비공유 상호작용에 의한 결합을 포함할 수 있다. 비공유 상호작용은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 소수성 상호작용, 이온 상호작용, 수소 결합 상호작용, 또는 친화도 상호작용 (예컨대, 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 복합체화). 몇몇 실시양태에서, 표적 및 결합제는 둘 사이의 특이적 인식을 유도하여 물리적 결합을 생성하는 영역을 그 표면 상에 또는 공동 내에 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합제는 그 분자 형태의 일부에 대한 상호 맞음성을 기초로 하여 생물학적 표적에 결합할 수 있다.
결합제 및 그의 대응하는 표적은 결합쌍으로 간주될 수 있고, 그의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 면역형 결합쌍, 예컨대, 항원/항체, 항원/항체 단편, 또는 합텐/항-합텐; 비면역형 결합쌍, 예컨대, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 엽산/엽산염 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/특이적 탄수화물, 효소/효소, 효소/기질, 효소/기질 유사체, 효소/위 (pseudo)-기질 (효소 활성에 의해 촉매될 수 없는 기질 유사체), 효소/보조 인자, 효소/조정제, 효소/억제제, 또는 비타민 B12/내인성 인자. 결합쌍의 다른 적합한 예는 상보성 핵산 단편 (DNA 서열, RNA 서열, PNA 서열, 및 펩티드 핵산 서열, 잠금 핵산 서열 포함); 단백질 A/항체; 단백질 G/항체; 핵산/핵산 결합 단백질; 또는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 결합제는 서열- 또는 구조-특이적 결합제일 수 있고, 여기서 결합제에 의해 인식되고 결합되는 표적의 서열 또는 구조는 그 표적에 충분히 특유할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 결합제는 구조-특이적일 수 있고, 표적의 1차, 2차, 또는 3차 구조를 인식할 수 있다. 표적의 1차 구조는 그의 원자 조성 및 이 원자를 연결하는 화학 결합의 내역 (입체화학 포함), 예를 들어 단백질 내의 아미노산의 선형 배열의 종류 및 특성을 포함할 수 있다. 표적의 2차 구조는 생체분자의 절편의 전체적인 3차원 형태를 의미할 수 있고, 예를 들어 단백질의 경우 2차 구조는 먼 아미노산을 서로 근접하게 만들 수 있는 다양한 입체형태로의 펩티드 "골격" 사슬의 폴딩을 의미할 수 있다. 2차 구조의 적합한 예는 다음을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다: 알파 나선, 베타 병풍 구조 (pleated sheet), 또는 랜덤 코일. 표적의 3차 구조는 그의 전체적인 3차원 구조일 수 있다. 표적의 4차 구조는 하나 이상의 다른 표적 또는 거대분자와의 그의 비공유 상호작용 (예컨대, 단백질 상호작용)에 의해 형성된 구조일 수 있다. 4차 구조의 예는 헤모글로빈을 형성하는 4-글로빈 단백질 하위단위에 의해 형성된 구조일 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따른 결합제는 임의의 상기 언급한 구조에 특이적일 수 있다.
구조-특이적 결합제의 예는 단백질 표적에 결합할 수 있는 단백질-특이적 분자를 포함할 수 있다. 적합한 단백질-특이적 분자의 예는 항체 및 항체 단편, 핵산 (예를 들어, 단백질 표적을 인식하는 앱타머), 또는 단백질 기질 (비-촉매가능한)을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 표적은 항원을 포함할 수 있고, 결합제는 항체를 포함할 수 있다. 적합한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 표적 항원에 특이적으로 결합한다면 항체 단편을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 표적은 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 의미할 수 있고, 즉 집단을 이루는 개개의 항체는 소량 존재할 수 있는, 천연적으로 발생하는 가능한 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 특이성이 높고, 단일 항원 부위에 대해 작용한다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용할 수 있다. 모노클로날 항체는 임의의 공지의 방법, 예컨대 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있거나, 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 샘플을 포함할 수 있고, 본원에 개시된 방법은 면역형광 (IF)에 사용될 수 있다. 면역화학은 조직 또는 세포 (예를 들어, 이환된 세포 대 정상 세포)에 대한 정보를 제공하기 위해 항체-기반 결합제에 대한 표적 항원의 결합을 수반할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 대한 결합제로서 적합한 항체 (및 대응하는 질환/질환 세포)의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 항-에스트로겐 수용체 항체 (유방암), 항-프로게스테론 수용체 항체 (유방암), 항-p53 항체 (다발성 암), 항-Her-2/neu 항체 (다발성 암), 항-EGFR 항체 (표피 성장 인자, 다발성 암), 항-카텝신 D 항체 (유방암 및 다른 암), 항-Bcl-2 항체 (아폽토시스성 세포), 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체 (난소암 및 다른 암), 항-CA15-3 항체 (유방암), 항-CA19-9 항체 (결장암), 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체 (MDR, 다제 내성), 항-CEA 항체 (암배아 항원), 항- 망막모세포종 단백질 (Rb) 항체, 항-ras 종양단백질 (p21) 항체, 항-루이스 (Lewis) X (CD15로도 알려짐) 항체, 항-Ki-67 항체 (세포 증식), 항-PCNA (다발성 암) 항체, 항-CD3 항체 (T-세포), 항-CD4 항체 (헬퍼 T 세포), 항-CD5 항체 (T 세포), 항-CD7 항체 (흉선세포, 미성숙 T 세포, NK 킬러 세포), 항-CD8 항체 (억제자 T 세포), 항-CD9/p24 항체 (ALL), 항-CD10 (CALLA로도 불림) 항체 (공통 급성 림프모세포성 백혈병), 항-CD11c 항체 (단핵구, 과립구, AML), 항-CD13 항체 (골수단핵구 세포, AML), 항-CD14 항체 (성숙 단핵구, 과립구), 항-CD15 항체 (호지킨 (Hodgkin) 질환), 항-CD19 항체 (B 세포), 항-CD20 항체 (B 세포), 항-CD22 항체 (B 세포), 항-CD23 항체 (활성화된 B 세포, CLL), 항-CD30 항체 (활성화된 T 및 B 세포, 호지킨 질환), 항-CD31 항체 (혈관신생 마커), 항-CD33 항체 (골수성 세포, AML), 항-CD34 항체 (내피 줄기 세포, 기질 종양), 항-CD35 항체 (수지상 세포), 항-CD38 항체 (형질 세포, 활성화된 T, B, 및 골수성 세포), 항-CD41 항체 (혈소판, 거핵세포), 항-LCA/CD45 항체 (백혈구 공통 항원), 항-CD45RO 항체 (헬퍼, 인듀서 T 세포), 항-CD45RA 항체 (B 세포), 항-CD39, CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체 (아폽토시스), 항-CD99 항체 (유잉 (Ewing) 육종 마커, MIC2 유전자 생성물), 항-CD106 항체 (VCAM-1; 활성화된 내피 세포), 항-유비퀴틴 항체 (알쯔하이머 (Alzheimer) 질환), 항-CD71 (트랜스페린 수용체) 항체, 항-c-myc (종양단백질 및 합텐) 항체, 항-사이토케라틴 (트랜스페린 수용체) 항체, 항-비멘틴 (내피 세포) 항체 (B 및 T 세포), 항-HPV 단백질 (인간 유두종 바이러스) 항체, 항-카파 경쇄 항체 (B 세포), 항-람다 경쇄 항체 (B 세포), 항-멜라노좀 (HMB45) 항체 (흑색종), 항-전립선 특이적 항원 (PSA) 항체 (전립선 암), 항-S-100 항체 (흑색종, 타액, 신경교 세포), 항-타우 항원 항체 (아밀로이드 연관 질환), 항-피브린 항체 (상피 세포), 항-케라틴 항체, 항-사이토케라틴 항체 (종양), 항-알파-카테닌 (세포막), 또는 항-Tn-항원 항체 (결장 암종, 선암종, 및 췌장암).
적합한 항체의 다른 구체적인 예는 다음을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다: 항 증식성 세포 핵 항원, 클론 pc10 (시그마 알드리치 (Sigma Aldrich), P8825); 항 평활근 알파 액틴 (SmA), 클론 1A4 (시그마, A2547); 토끼 항 베타 카테닌 (시그마, C 2206); 마우스 항 판 사이토케라틴, 클론 PCK-26 (시그마, C1801); 마우스 항 에스트로겐 수용체 알파, 클론 1D5 (다코 (DAKO), M 7047); 베타 카테닌 항체, 클론 15B8 (시그마, C 7738); 염소 항 비멘틴 (시그마, V4630); 사이클 안드로겐 수용체 클론 AR441 (다코, M3562); 폰 빌레브란트 인자 7, 케라틴 5, 케라틴 8/18, e-카드헤린, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, p53, 프로게스테론 수용체, 베타 카테닌; 당나귀 항-마우스 (잭슨 이뮤노리써치 (Jackson Immunoresearch), 715-166-150); 또는 당나귀 항 토끼 (잭슨 이뮤노리써치, 711-166-152).
결합제의 종류 및 표적과 무관하게, 결합제와 표적 사이의 결합 특이성은 또한 결합 조건 (예를 들어, 상보성 핵산의 경우에 혼성화 조건)에 따라 영향받을 수 있다. 적합한 결합 조건은 pH, 온도, 또는 염 농도 중 하나 이상을 조정함으로써 달성될 수 있다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 결합제는 형광단으로 내인성으로 (결합제의 합성 동안 부착된 형광단) 또는 외인성으로 (보다 후기 단계 동안 부착된 형광단) 표지될 수 있다. 예를 들어, 단백질-기반 결합제의 경우, 내인성으로 표지된 결합제는 형광단 표지된 아미노산을 사용하여 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합제는 형광단이 보다 후기 단계에서 도입될 수 있는 방식으로 합성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 단백질 (예를 들어, 항체) 또는 핵산 (예를 들어, DNA)과 같은 결합제는 그에 대한 적절한 화학을 사용하여 직접 화학적으로 표지될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 보다 큰 특이성 또는 특정 실시양태에서 신호의 증폭을 제공할 수 있는 결합제의 조합이 사용될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 결합제의 샌드위치가 사용될 수 있고, 여기서 제1 결합제는 표적에 결합하고 2차 결합을 제공하기 위해 기능할 수 있고, 2차 결합제는 형광단을 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 3차 결합 (필요한 경우)을 추가로 제공할 수 있고, 여기서 3차 결합 멤버가 형광단을 포함할 수 있다.
결합제 조합의 적합한 예는 1차 항체-2차 항체, 상보성 핵산, 또는 다른 리간드-수용체 쌍 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘)을 포함할 수 있다. 적합한 결합제 쌍의 다른 구체적인 예는 다음을 포함할 수 있다: c-myc 에피토프를 갖는 재조합 발현된 단백질에 대한 마우스 항-myc; His-태그 에피토프를 갖는 재조합 단백질에 대한 마우스 항-HisG, 에피토프-태그를 갖는 재조합 단백질에 대한 마우스 항-엑스프레스 (xpress), 염소 IgG 1차 분자에 대한 토끼 항-염소, 핵산에 대한 상보성 핵산 서열; 티오레독신 융합 단백질에 대한 마우스 항-티오, 융합 단백질에 대한 토끼 항-GFP, α-D-갈락토스에 대한 자칼린; 및 탄수화물-결합 단백질, 당, 니켈 커플링된 매트릭스 또는 헤파린에 대한 멜리비오스.
몇몇 실시양태에서, 1차 항체 및 2차 항체의 조합은 결합제로서 사용될 수 있다. 1차 항체는 표적의 특정 영역에 결합할 수 있고, 2차 항체는 1차 항체에 결합할 수 있다. 2차 항체는 1차 항체에 결합하기 전에 형광단에 부착될 수 있거나 또는 보다 후기 단계에서 형광단에 결합할 수 있다. 대체 실시양태에서, 1차 항체 및 특이적 결합 리간드-수용체 쌍 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘)이 사용될 수 있다. 1차 항체는 쌍의 한 멤버 (예를 들어 비오틴)에 부착될 수 있고, 다른 멤버 (예를 들어 스트렙타비딘)는 형광단으로 표지될 수 있다. 2차 항체, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 비오틴은 각각 독립적으로 형광단으로 표지될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 면역형광 절차에서 사용될 수 있고, 1차 항체는 조직 샘플 내의 표적 항원에 특이적으로 결합하기 위해 사용될 수 있다. 2차 항체는 1차 항체에 특이적으로 결합하여, 1차 항체와 존재할 경우의 후속 시약 (예를 들어 형광단) 사이의 가교를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 1차 항체는 마우스 IgG (마우스에서 생성된 항체)일 수 있고, 대응하는 2차 항체는 마우스 IgG 내의 영역에 결합할 수 있는 영역을 갖는 염소 항-마우스 (염소에서 생성된 항체)일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 신호 증폭은 몇몇 2차 항체가 1차 항체 상의 에피토프에 결합할 수 있을 때 얻을 수 있다. 면역형광 절차에서, 1차 항체는 절차에서 사용되는 제1 항체일 수 있고, 2차 항체는 절차에서 사용되는 제2 항체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 1차 항체가 IF 절차에서 사용되는 유일한 항체일 수 있다.
생물학적 샘플의 제1 영상의 생성
본 발명의 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 제1 영상은 (a) 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고; (c) 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성함으로써 생성된다. 특정 실시양태에서, 방법은 또한 제1 단계에서, 샘플을 추가의 형태학적 정보를 제공하는 적어도 하나의 추가의 결합제와 접촉시키고; 형광에 의해 적어도 하나의 추가의 결합제로부터의 신호를 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)는 또한 적혈구, 피브로스, 및 리포푸신 과립과 같은 구조로부터 발생하는 내인성 형광 신호 (자가형광으로도 알려짐)를 형광에 의해 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 영상의 생성 (단계 (d))은 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 보다 낮은 배율에서 초기 영상을 생성하고; 초기 영상으로부터 관심 있는 영역을 선택하고, 초기 영상보다 고해상도의 제1 영상을 생성하기 위해 적어도 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하는 것을 포함한다. "관심 있는 영역의 선택"은 (1) 사용자가 초기 영상을 기초로 하여 관심 있는 영역을 선택하거나; (2) 컴퓨터 (즉, 방법을 실행하는 영상화 시스템)가 초기 영상, 알고리즘, 및 컴퓨터가 수용하는 명령을 기초로 하여 관심 있는 영역을 선택하거나; 또는 (3) 컴퓨터가 초기 영상 및 알고리즘을 기초로 하여 관심 있는 영역을 선택하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 제1 영상이 반드시 생성되는 초기 영상을 참고로 하는 것은 않음이 이해되어야 한다. 이와 유사하게, 제2 영상은 문자 그대로 방법의 실시양태에 의해 생성된 제2 영상 그 자체를 나타내는 것이 아니다.
특정 실시양태에서, 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하는 방법은 (a) 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고; (c) 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 제1 결합제 및 임의로 형광 마커의 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 따라서, 상기 실시양태에서, 제1 영상은 본원에서 규정된 바와 같이 영상이 정합되도록 허용하기 위해 형광 마커로부터 얻어지는 신호를 얻으면서 샘플 내의 표적 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 초기 영상은 명시야 염색 프로토콜과 유사한 하나 이상의 명시야형 영상일 수 있다. 따라서, 초기 형광 영상 데이타는 알고리즘을 통해 시뮬레이션된 (가상/분자) 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 영상을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 시뮬레이션된 (가상/ 분자) 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 영상은 유사한 알고리즘을 통해 생성될 수 있다. 형광 영상 데이타를 명시야형 영상으로 전환하기 위한 상세한 방법은 "영상 획득 및 분석"의 표제 하에 아래에서 설명된다. 이어서, 명시야형 영상은 관심 있는 영역의 선택을 위해 사용된다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전체 세포, 조직 샘플 또는 마이크로어레이 (microarray)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플을 포함할 수 있다. 조직 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 동결될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 샘플은 고정되고 파라핀에 포매될 수 있다. 조직 샘플은 고정되거나 통상적인 방법에 의해 달리 보존될 수 있고, 고정제의 선택은 조직이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 의해 결정될 수 있다. 고정 길이는 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정제에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 중성 완충 포르말린, 보우인 또는 파라포름알데히드가 조직 샘플을 고정하거나 보존하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조직 샘플은 먼저 고정된 후, 상승하는 계열의 알콜을 통해 탈수시키고, 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질을 사용하여 침투 및 포매할 수 있다. 대체 실시양태에서, 조직 샘플은 절편화된 후 고정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 샘플은 파라핀 내에 포매되고 처리될 수 있다. 사용될 수 있는 파라핀의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 파라플라스트 (Paraplast), 브롤로이드 (Broloid), 및 티슈칸 (Tissuecan). 일단 조직 샘플이 포매된 후에, 샘플은 두께가 약 3 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터 범위인 절편으로 박절기 (microtome)에 의해 절편화될 수 있다. 절편화된 후, 절편은 접착제를 사용하여 슬라이드에 부착될 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-라이신을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 파라핀이 포매 물질로 사용되는 경우에, 조직 절편은 탈파라핀화되고, 물에 재수화될 수 있다. 조직 절편은 예를 들어 유기 작용제 (예컨대, 자일렌 또는 점진적으로 하강하는 계열의 알콜)를 사용함으로써 탈파라핀화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 논의한 샘플 제조 절차 이외에, 조직 절편은 면역형광 검정 전에, 동안 또는 후에 추가의 처리에 적용될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 조직 절편은 에피토프 (즉, 항원) 복구 (retrieval) 방법, 예컨대, 시트레이트 완충제 내에서 조직 샘플의 가열에 적용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 절편은 임의로 임의의 비-특이적 결합을 최소화하기 위해 차단 단계에 적용될 수 있다.
샘플의 제조 후에, 샘플을 결합제가 표적 단백질 (예를 들어, 면역형광 절차에서 항원)에 결합하기 위해 충분한 시간 동안 및 적합한 조건 하에 결합제 용액 (예를 들어, 면역형광 절차에서 표지된-항체 용액)과 접촉시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 접촉 단계에서 하나 초과의 결합제와 접촉될 수 있다. 다수의 결합제가 생물학적 샘플 내의 상이한 표적 단백질과 결합할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 2개의 표적 단백질, 즉 표적 1 및 표적 2를 포함할 수 있고, 이 경우 다음과 같은 2 세트의 결합제가 사용될 수 있다: 결합제 1 (표적 1에 결합가능) 및 결합제 2 (표적 2에 결합가능). 다수의 결합제가 생물학적 샘플과 동시에 접촉될 수 있다 (예를 들어, 단일 혼합물로서).
샘플을 하나 이상의 표적에 대한 하나 이상의 결합제와 접촉시키는 것에 추가로, 샘플은 또한 형태학적 정보를 제공하는 적어도 하나의 추가의 결합제로 염색될 수 있다. 한 실시양태에서, 형태학적 정보를 제공하는 결합제는 표적에 대한 결합제와 동시에 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이들은 결합제-표적 반응 후에 샘플을 염색하기 위해 사용될 수 있다.
형태학적 정보는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 조직 형태 정보, 예컨대 조직 종류 및 기원, 특정 세포의 기원에 대한 정보, 세포의 세포내 소기관 구조, 예컨대 막, 세포질 또는 핵에 대한 정보, 세포 분화 상태, 세포 주기 단계, 세포 대사 상태, 세포 괴사 또는 아폽토시스, 세포 종류, 및 종양, 정상 및 기질 영역에 대한 정보. 예를 들어, 형태학적 정보는 상피 기원의 세포의 세포질 위치에 대한 정보를 포함할 수 있거나 또는 종양의 분화가 불량한 또는 괴사 영역의 위치를 나타낼 수 있다.
형태학적 정보는 생물학적 샘플 내의 특이적 표적에 결합하는 적어도 하나의 추가의 결합제에 의해 제시될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 결합제는 다음 표적 단백질 (이로 제한되지 않음)에 결합하는 항체이다:
사이토케라틴: 상피 세포에 대한 마커
판 (pan)-카드헤린: 세포막에 대한 마커
Na+K+ATPase 세포막에 대한 마커
평활근 액틴: 평활근 세포, 근섬유모세포 및 근상피 세포
CD31 혈관에 대한 마커
리보좀 단백질 S6: 세포질에 대한 마커
글루트 1 저산소증에 대한 마커
Ki67 증식 세포에 대한 마커
콜라겐 IV 기질
형태학적 정보를 제공하는 다른 표적은 또한 케라틴 15, 19, E-카드헤린, 클라우딘 1, EPCAM, 피브로넥틴 및 비멘틴을 포함할 수 있다.
조직의 내인성 형광 (자가형광)은 연구 중인 샘플 내의 적혈구, 리포푸신 과립 및 피브로스를 포함하고 이로 제한되지 않는 추가의 형태학적 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일례로서, 적어도 하나의 추가의 결합제는 판-사이토케라틴 항체 (예를 들어, 한 반응에서 사이토케라틴 이소형의 보다 큰 적용 범위를 허용하는 사이토케라틴 항체의 칵테일)를 포함할 수 있다. 사이토케라틴은 세포골격의 일부이고, 상피 내의 세포의 세포질에 위치한다. 따라서, 상기 항체는 상피 세포의 세포질을 염색한다. 종양 샘플에서, 상기 항체는 기질 또는 다른 지지체 조직/영역과 대조적으로 종양의 상피 세포를 염색한다. 따라서, 적어도 하나의 추가의 결합제, 예컨대 판-사이토케라틴 마커의 사용은 추가의 분석을 위한 종양의 상피 세포 영역의 선택을 허용한다.
바람직하게는, 결합제는 형광단으로 표지된다. 하나 초과의 표적이 검출될 경우, 각각의 표적에 대한 결합제는 바람직하게는 신호가 독립적으로 검출될 수 있고 실질적으로 중첩되지 않도록 상이한 방출 파장을 갖는 상이한 형광단으로 표지된다. 또한, 바람직하게는, 형태학적 정보를 제공하는 결합제는 또한 상이한 방출 파장을 갖도록 다른 결합제와 상이한 형광단으로 표지된다.
충분한 시간이 결합 작용을 위해 제공된 후에, 샘플은 임의의 미결합 프로브를 세척하기 위해 세척 용액 (예를 들어 적절한 완충제 용액)과 접촉될 수 있다. 사용된 프로브의 농도 및 종류에 따라, 생물학적 샘플은 많은 세척 단계에 적용될 수 있고, 동일한 또는 상이한 세척 용액이 각각의 단계에 사용될 수 있다.
결합제 및 표적 단백질 및 임의의 형태학적 마커 사이의 반응 후에, 샘플을 추가의 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 추가로 염색한다. 용어 "형광 마커"는 조직 또는 다른 생물학적 샘플의 특정 부분, 예컨대 특정 세포내 소기관 형태를 선택적으로 염색하는 형광단을 의미한다. 적합한 형광 마커 (및 그의 표적 세포, 세포내 소기관 구획, 또는 적용가능할 경우 세포 성분)의 예는 다음을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다: 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (핵산), 에오신 (알칼리성 세포 성분, 세포질), 획스트 33258 및 획스트 33342 (2개의 비스벤즈이미드) (핵산), 프로피듐 아이오다이드 (핵산), 퀴나크린 (핵산), 플루오레세인-팔로이딘 (액틴 섬유), 크로모마이신 A 3 (핵산), 아크리플라빈-포일겐 반응 (핵산), 아우라민 O-포일겐 반응 (핵산), 에티듐 브로마이드 (핵산), 니슬 염색 (뉴런), 높은 친화도 DNA 형광단, 예컨대 POPO, BOBO, YOYO 및 TOTO 등, 및 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 히스톤)에 융합된 녹색 형광 단백질, ACMA, 및 아크리딘 오렌지. 바람직하게는, 형광 마커는 핵을 염색한다. 보다 바람직하게는, 형광 마커는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 포함한다.
생물학적 샘플에 적용될 수 있는 결합제 및 형광 마커의 총 수는 사용되는 형광단으로부터 스펙트럼에 의해 분석가능한 형광 신호에 의해 달성될 수 있는 스펙트럼 해상도에 따라 결정될 수 있다. 다수의 형광단에 대해 스펙트럼에 의해 분석가능한은 각각의 형광단이 표준 광검출 시스템을 사용하여 각각의 형광단에 의해 생성된 형광 신호를 기초로 하여 구별될 수 있도록, 형광단의 형광 방출 밴드가 충분히 특유함, 즉 충분히 비-중첩됨을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 검출 시스템에 의해 각각의 라운드의 검출에서 10개 또는 10개 미만의 형광단과 반응할 수 있다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 검출 시스템에 의해 각각의 라운드의 검출에서 6개 또는 6개 미만의 형광단과 반응할 수 있다.
결합제-표지된 형광단으로부터의 신호, 형광 마커, 및 샘플의 자가형광은 검출 시스템을 사용하여 검출될 수 있다. 검출 시스템은 형광 검출 시스템을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호 강도, 신호 파장, 신호 위치, 신호 주파수, 또는 신호 이동이 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호의 하나 이상의 상기 언급한 특징이 관찰되고, 측정되고, 기록될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 형광 파장 또는 형광 강도는 형광 검출 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호는 계내에서 관찰될 수 있고, 즉, 신호는 생물학적 샘플 내의 표적에 결합제를 통해 결합한 형광단으로부터 직접 관찰될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 신호의 관찰은 생물학적 샘플의 영상의 캡쳐 (capture)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 영상화 기기에 연결된 현미경이 본원에 개시된 방법에 따라 검출 시스템으로서 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 형광단은 여기될 수 있고, 얻어진 형광 신호는 관찰되고 디지탈 신호 (예를 들어, 디지탈화된 영상)의 형태로 기록될 수 있다. 동일한 절차는 적절한 형광 필터를 사용하여 샘플에 결합된 상이한 형광단에 대해 및 샘플의 자가형광에 대해 반복될 수 있다.
형광 검출을 위한 방법 및 시스템, 및 샘플의 제1 영상을 생성하기 위한 방법 및 시스템에 대한 추가의 상세한 내용은 " 영상 획득 및 분석 "의 표제 하에 아래에서 제시된다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플의 제1 영상이 검출된 형광 신호로부터 생성된 후에, 결합제로부터의 형광 신호는 변형된다. 이어서, 하나 이상의 추가의 영상을 상기 설명한 방법에 따라 얻는다. 즉, 각각의 추가의 영상은 (a) 고체 지지체 상의 샘플을 상이한 표적 단백질에 대한 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플을 추가의 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고; (c) 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호로부터 샘플의 영상을 생성함으로써 생성된다.
화학 작용제는 형광 신호를 변형하기 위해 생물학적 샘플에 적용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호 변형은 신호 특징의 변화, 예를 들어 신호 강도 감소, 신호 피크 이동, 공진 주파수 변화, 또는 신호 생성기의 절단 (제거)에 의한 신호 제거 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 화학 작용제는 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어, US 특허 7629125를 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 용액의 형태로 존재할 수 있고, 생물학적 샘플은 소정의 시간 동안 화학 작용제 용액과 접촉할 수 있다. 화학 작용제 용액의 농도 및 접촉 시간은 요구되는 신호 변형의 종류에 따라 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제의 접촉 조건은 결합제, 표적, 생물학적 샘플, 및 결합제와 표적 사이의 결합이 영향받지 않도록 선택될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 화학 작용제는 단지 형광단에만 영향을 줄 수 있고, 화학 작용제는 표적/결합제 결합 또는 결합제 일체성에 영향을 주지 않을 수 있다. 따라서, 예를 들어 결합제는 1차 항체 또는 1차 항체/2차 조합물을 포함할 수 있다. 화학 작용제는 단지 형광단에만 영향을 줄 수 있고, 1차 항체 또는 1차 항체/2차 항체 조합물은 본질적으로 영향받지 않은 상태로 유지될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합제 (예컨대, 1차 항체 또는 1차 항체/2차 항체 조합물)는 샘플을 화학 작용제와 접촉시킨 후에 생물학적 샘플 내의 표적에 결합된 상태로 유지될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 결합제는 샘플을 화학 작용제와 접촉시킨 후에 생물학적 샘플 내의 표적에 결합된 상태로 유지될 수 있고, 결합제 일체성은 본질적으로 영향받지 않은 상태로 유지될 수 있다 (예를 들어, 항체는 화학 작용제의 존재 하에 실질적으로 변성되거나 용리되지 않을 수 있다).
몇몇 실시양태에서, 신호의 특징은 신호 변형의 효과를 측정하기 위해 샘플을 화학 작용제와 접촉시킨 후 관찰될 수 있다. 예를 들어, 형광 신호 생성기로부터의 형광 강도는 화학 작용제와 접촉하기 전 및 화학 작용제와 접촉한 후 관찰될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 소정량의 신호 강도의 감소는 신호 변형으로 언급될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호 변형은 약 50% 초과 범위량 만큼의 신호 강도의 감소를 의미할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호 변형은 약 60% 초과 범위량 만큼의 신호 강도의 감소를 의미할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호 변형은 약 80% 초과 범위량 만큼의 신호 강도의 감소를 의미할 수 있다. 특정 실시양태에서, 신호 변형은 산화, 스트리핑 (stripping), 광표백 (photobleaching), 또는 이의 혼합을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화학 작용제는 수산화나트륨, 과산화수소, 또는 과요오드산나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 신호 변형은 그 전부가 본원에 참조로 포함된, 2011년 12월 23일 출원된 US 특허 출원 13/336409 (발명의 명칭 "PHOTOACTIVATED CHEMICAL BLEACHING OF DYES FOR USE IN SEQUENTIAL ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES")에 보다 자세히 기재되어 있는 바와 같이 샘플을 광 및/또는 화학 작용제와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.
생물학적 샘플의 제2 영상의 생성
본 발명의 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 제2 영상은 제1 영상을 얻은 후에 생성된다. 제2 영상은 (a) 샘플을 적어도 하나의 표적 핵산 서열 각각에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 핵산 서열과 혼성화하고; (b) 임의로, 샘플을 제1 영상의 생성시에 사용된 형광 마커로 염색하고; (c) 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (d) 검출된 형광 신호 또는 신호들로부터 샘플의 제2 영상을 생성함으로써 생성된다.
특정 실시양태에서, 제2 영상을 생성하는 단계 전에, 방법은 샘플을 프로테아제에 의해 소화시키는 것을 포함한다. 프로테아제 소화에 의한 펩티드 결합의 파괴는 신호의 질에 직접 영향을 주고, 이것은 프로브의 표적 핵산에 대한 접근을 용이하게 하고 무손상 단백질에 의해 생성된 자가형광을 감소시키기 때문이다. 또한, 프로테아제 소화는 결합제를 표적 단백질(들)로부터 제거하는 기능을 하고, 따라서 제1 영상과 연관된 면역형광 신호를 제거한다. 프로테아제 소화를 위한 예시적인 프로테아제는 세린 프로테아제, 예컨대, 프로테이나제 K이다. 또 다른 예시적인 프로테아제는 카르복실 프로테아제, 예컨대, 펩신이다.
특정 실시양태에서, 제1 영상을 얻은 후, 제2 영상을 생성하는 단계 전에, 방법은 제1 결합제로부터의 형광 신호를 변형하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 신호 변형은 산화, 스트리핑, 광표백, 또는 이의 혼합을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화학 작용제는 수산화나트륨, 과산화수소, 또는 과요오드산나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
표적 핵산 서열 및 프로브는 앞에서 상세하게 설명한 바와 같다. 바람직하게는, 프로브는 형광 표지된다.
특정 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 염색체 수준에서 게놈 변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 게놈 변이는 염색체 이상이다. 예시적인 염색체 이상은 염색체 전위, 염색체 결실, 염색체 삽입 및 염색체 역위, 및 유전자 증폭 사건을 포함한다. 다른 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 개별적인 유전자 수준에서의 게놈 변이, 예컨대, 단일 뉴클레오티드 다형성, 작은 결실, 삽입, 및 점 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 프로브는 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 서열의 상보성 가닥에 혼성화한다. 프로브 및 표적 핵산 서열은 적합한 혼성화 조건 하에 혼성체를 형성할 수 있다. 혼성화 기술의 당업자는 혼성화의 엄격도를 부과하거나 제어하기 위해 통상 사용되는 인자가 포름아미드 농도 (또는 다른 화학적 변성제 시약), 염 농도 (즉, 이온 강도), 혼성화 온도, 세제 농도, pH 및 카오트로프 (chaotrope)의 존재 또는 부재를 포함함을 인식할 것이다. 또한, 차단 프로브는 단지 엄격도 인자의 최적화에 의해 가능한 한계를 초과하여 구별을 개선하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 혼성체 조합물을 형성하기 위한 최적 엄격도는 몇몇의 상기 언급한 엄격도 인자를 고정한 후, 단일 엄격도 인자의 변화 효과를 결정하는 공지의 기술에 의해 파악할 수 있다. 동일한 엄격도 인자가 조절되어 PNA 또는 LNA의 핵산에 대한 혼성화의 엄격도를 제어할 수 있지만, 예외적으로 PNA의 혼성화는 이온 강도와는 매우 독립적이다. 검정을 위한 최적의 또는 적합한 엄격도는 요구되는 수준의 구별이 달성될 때까지 각각의 엄격도 인자의 조사에 의해 실험을 통해 결정될 수 있다.
핵산 서열의 검출 방법, 예컨대, 혼성화는 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 특이적 핵산 서열은 FISH (또는 FISH의 변형, 예컨대, IQ-FISH), 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (또는 PCR의 변형, 예컨대, 계내 PCR), RCA (롤링 써클 (rolling circle) 증폭) 또는 PRINS (프라이밍된 (primed) 계내 표지)에 의해 검출된다. 예시적인 실시양태에서, 특이적 핵산 서열은 FISH에 의해 검출된다. 따라서, 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 서열은 계내에서 변성되고, 변성된 형광 표지된 프로브와 혼성화한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 표적 핵산 서열이 FISH에 의해 분석될 때, 염색체 특이적 프로브, 예컨대, 동일한 염색체에 대한 동원체 프로브가 표적 핵산 서열에 대한 프로브와 함께 사용된다. 염색체 특이적 프로브로부터의 신호는 표적 핵산 서열이 동일한 염색체 상에 존재하는지 보여준다. 바람직하게는, 염색체 특이적 프로브는 표적 핵산 서열에 대한 프로브의 것과 구분되는 신호를 생성하는 형광단으로 표지된다.
혼성화 반응 후에, 샘플을 임의로 추가의 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색한다. 형광 마커는 바람직하게는 제1 영상을 얻기 위해 사용된 것과 동일한 것이다. 별법으로, 형광 마커는 제1 영상을 얻기 위해 사용된 것과 상이하지만, 동일한 세포내 소기관 구획을 염색한다. 특정 실시양태에서, 제1 영상에 대한 염색으로부터의 형광 신호는 충분히 유지되고, 따라서 상기 단계는 임의의 선택적 단계이다. 다른 실시양태에서, 제1 영상에 대한 염색으로부터의 형광 신호는 약해졌고, 샘플은 본원에서 제시되는 바와 같이 염색된다.
특정 실시양태에서, 형광 마커는 세포의 핵을 염색하는 것이 바람직하다. 따라서, 염색은 FISH 신호의 초점 조정 (focusing)을 돕는다. 초점 조정된 핵을 얻음으로써, FISH 신호는 초점 조정된 핵의 위 및 아래에서 몇몇의 초점면을 영상화함으로써 캡쳐될 수 있다. 또한, 염색은 FISH 신호의 계수를 돕는다. FISH 신호는 핵 전체에 걸쳐서 산재될 수 있기 때문에, 단일 초점면을 사용하여 수행한 도트 계수 (dot counting)는 계수 오류를 야기할 수 있다. 그러나, 각각의 시야 내에서 몇몇 z-스택 (stack)을 캡쳐함으로써, 가능한 한 근접한 핵의 3차원 사진을 생성하기 위한 보다 많은 데이타를 제공한다. 따라서, FISH 신호를 계수하는 보다정확한 방법이 제공된다.
동일한 세포내 소기관 구획을 염색하는 동일한 형광 마커 또는 형광 마커들로 생물학적 샘플을 염색하는 것은 또한 제1 영상 및 제2 영상을 오버레이하기 위한 기준점을 제공하는 기능을 한다. 따라서, 이것은 복합 영상의 생성을 용이하게 한다. 제1 및 제2 영상의 오버레이에 대한 상세한 내용은, 하기 섹션 " 영상 획득 및 분석 "을 참조한다.
바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 FFPE 조직 샘플이고, 제1 결합제는 HER2에 대한 항체이고, 선택적인 하나 이상의 추가의 결합제는 판-사이토케라틴 항체 칵테일이고, 형광 마커는 DAPI이고, 표적 핵산 서열은 HER2이다.
프로브-표지된 형광단 및 형광 마커로부터의 신호는 상기 논의된 바와 같은 검출 시스템을 사용하여 검출될 수 있다. 형광 검출을 위한 방법 및 시스템, 및 샘플의 제2 영상을 생성하기 위한 방법 및 시스템에 대한 추가의 상세한 내용은 " 영상 획득 및 분석 "의 표제 하에 아래에서 제시된다.
몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플의 제2 영상이 검출된 형광 신호로부터 생성된 후에, 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브로부터의 형광 신호는 예를 들어 산화, 스트리핑, 광표백, 또는 이의 혼합에 의해 변형된다. 그 후에, 하나 이상의 추가의 영상을 본원에서 앞서 설명된 방법에 따라 얻는다. 즉, 각각의 추가의 영상은 (1) 샘플을 각각의 적어도 하나의 추가의 표적 핵산 서열에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 서열과 혼성화하고; (2) 임의로, 샘플을 형광 마커로 염색하고; (3) 각각의 추가의 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고; (4) 검출된 형광 신호로부터 샘플의 영상을 생성함으로써 생성된다.
영상 획득 및 분석
특정 실시양태에서, 단일 생물학적 샘플의 영상을 제공하는 방법은 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하고 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 것을 포함한다. 상기 제1 및 제2 영상은 (1) 생물학적 샘플로부터의 신호의 형광 검출, 및 (2) 각각 검출된 형광 신호로부터 샘플의 제1 및 제2 영상의 생성에 의해 생성된다. 이들 단계는 바람직하게는 형광 현미경을 사용하여 수행되고, 접촉 및 염색 단계에서 사용되는 각각의 형광단에 대해 반복된다. 따라서, 각각의 형광단은 여기되고, 그의 형광 방출은 표준 장비, 예컨대 CCD 카메라 또는 형광 스캐너를 사용하여 그의 파장에서 측정된다. 임의로, 생물학적 샘플의 자가형광이 또한 측정되고, 특정 형광단의 측정에 대한 그의 효과가 고려된다. 예를 들어, 하나 이상의 방출 파장에서 배경 자가형광을 빼기 위해 알고리즘이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 전체 생물학적 샘플의 제1 영상 및 제2 영상 둘 모두는 고해상도로 얻어진다. 따라서, 각각의 형광단으로부터의 방출은 그의 방출 파장에서 고해상도로 측정된다. 고해상도는 영상이 75-375 nm의 화소 크기를 지지하는, 0.5 내지 1.4의 개구수 (numerical aperture)에 대응하는 20X 내지 100X의 해상도로 얻어짐을 의미한다. 바람직하게는, 영상은 약 0.85의 개구수 및 약 170 nm의 화소 크기에서 40X로 얻어진다. 40X에서의 영상 캡쳐가 바람직하고, 그 이유는 60x 또는 100x에 비해 비교적 큰 FOV를 캡쳐하면서 해상도가 FISH 신호를 캡쳐하기에 충분히 높기 때문이다.
다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고체 지지체의 전체 표면을 점유하지 않을 수 있거나, 또는 전체 생물학적 샘플의 고해상도 영상이 필요하지 않을 수 있다. 따라서, 제1 영상을 얻으면서, 고체 지지체의 전체 표면이 먼저 예컨대 2X에서 저해상도에서 스캐닝될 수 있다. 이어서, 영상 분석 알고리즘이 저해상도 영상에 적용되고, 생물학적 샘플을 함유하는 영역을 검출한다. 생물학적 샘플의 경계를 나타내는 좌표가 캡쳐되고, 후속적인 보다 고해상도의 스캔(들)을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 한 형광단으로부터의 방출의 측정은 샘플의 경계에 대한 좌표를 얻기에 충분할 수 있다.
따라서, 생물학적 샘플을 함유하는 영역은, 적어도 하나의 프로세서를 사용하여 생물학적 샘플의 영상을 얻고; (a) 마르코프 임의 장 (Markov Random Field) (MRF)을 사용한 최대 귀납 주변 확률 (MPM) 과정, 또는 (b) 마르코프 임의 장 (MRF)을 사용한 최대 귀납 확률 (MAP) 추정을 사용하여 영상을 프로세서로 다수의 영역으로 분할하고; 2원 마스크 (binary mask)를 형성하기 위해 복수의 영역을 배경 영역 및 조직 영역으로 분류하는 것을 포함하는 컴퓨터 구현 방법에 의해 검출될 수 있다. 또한, 방법은 생물학적 샘플 경계를 선명하게 하기 위해 능동 외곽선 (active contour) 방법을 2원 마스크에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 전체 생물학적 샘플의 보다 고해상도의 영상이 필요하지 않을 수 있다. 오히려, 보다 고해상도의 영상은 단지 샘플의 선택된 관심 있는 영역 (ROI)에 대해서만 필요하다. 따라서, 제1 영상을 생성하면서, 생물학적 샘플은 먼저 ROI 선택을 가능하게 하는 보다 저해상도에서 (예컨대, 보다 고해상도에 비해 10X에서) 영상화된다. 임의로, 보다 저해상도에서의 영상화는 접촉 및 염색 단계에서 사용되는 각각의 형광단에 대한 스캔을 포함한다. 하나 이상의 ROI는 기정의된 기준 (예를 들어, 샘플 일체성, 표현형, 예컨대, 종양 또는 정상, 근육 또는 도관 조직 등)을 기초로 하여 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, ROI는 적어도 부분적으로는, 제1 결합제로부터 검출된 표적 단백질(들)의 단백질 발현 수준을 기초로 하여 선택된다. 따라서, 특정 ROI는 제1 역치에 비해 더 낮은 표적 단백질 발현 수준에 대해 선택될 수 있는 반면, 다른 ROI는 제2 역치 (제1 역치와 상이할 수 있음)에 비해 더 높은 단백질 발현 수준에 의해 선택될 수 있다. ROI의 좌표는 단지 ROI에 대한 보다 고해상도의 스캐닝을 유도하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 제2 영상은 제1 영상에 대한 ROI에 대해 얻은 영상과 동일한 보다 높은 해상도에서 ROI에 대해서만 얻어진다.
상기 설명한 바와 같이, 특정 실시양태에서, 초기 영상 (즉, 보다 저해상도 영상)은 먼저 명시야 염색 프로토콜과 유사한 하나 이상의 명시야형 영상으로 전환된다. 따라서, 초기 형광 영상 데이타는 알고리즘을 통해 시뮬레이션된 (가상/분자) 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 영상을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 시뮬레이션된 (가상/분자) 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 영상은 유사한 알고리즘을 통해 생성될 수 있다. 명시야형 영상으로의 형광 영상 데이타 전환을 위한 상세한 방법은 아래에서 설명된다. 이어서, 명시야형 영상은 적어도 부분적으로는, 형태학적 정보를 기초로 하여 관심 있는 영역의 선택을 위해 사용된다.
특정 실시양태에서, 전체 생물학적 샘플 또는 샘플 내의 선택된 ROI의 영상은 현미경 시야 (FOV)의 제한 때문에 단일 스캔으로 획득가능하지 않을 수 있다. 즉, 영상화되는 영역은 현미경 FOV가 캡쳐할 수 있는 것보다 더 클 수 있다. 이 경우에, 요구되는 영상은 슬라이드 또는 선택된 ROI에 걸쳐 다중 FOV를 캡쳐함으로써 획득될 수 있다. 상기 FOV의 처리되지 않은 (raw) 영상은 시계 변이를 조정하기 위해 교정되고, 이어서 별개의 FOV를 전체 슬라이드 또는 ROI의 단일 영상으로 정렬하는 알고리즘에 따라 함께 스티칭 (stitching)될 수 있다. 상기 영상 스티칭 알고리즘은 당업자에게 공지되어 있고, 미국 특허 6,674,884를 참조한다. 흑백 카메라는 그의 보다 높은 감도, 및 적절한 여기 및 방출 필터를 이색성 거울 (dichroic mirror)과 함께 이용함으로써 소정의 파장을 캡쳐하는 능력 때문에 형광 영상화에 종종 사용된다. 따라서, 개별적인 채널에 대한 그레이 스케일 (gray scale) 영상이 생성된다. 각각의 형광 채널에 대한 그레이 스케일 디지탈 영상은 의사 컬러화되고, 요구되는 영상을 얻기 위해 합쳐진다.
바람직한 실시양태에서, 제1 영상의 생성은 (1) 임의로 전체 고체 지지체의 저해상도 영상을 생성하고 샘플을 고체 지지체 상에 위치시키고; (2) 샘플의 중간 해상도 영상을 생성하고; (3) 소정의 기준에 따라 관심 있는 영역 (ROI)을 확인하고; 각각의 ROI에 대해 보다 고해상도의 영상을 생성하는 것을 포함한다. 생성된 제2 영상은 제1 영상의 생성 동안 선택된 각각의 ROI의 보다 고해상도의 영상이다. 상기 실시양태에서, 용어 저, 중간, 고는 특정 배율로 제한되지 않는다. 오히려, 이들 용어는 서로 상대적이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 저해상도 영상은 2X 영상이고; 중간 해상도 영상은 10X 영상이고, 고해상도 영상은 40X 영상이다.
특정 실시양태에서, 표적 단백질 또는 표적 핵산의 특징을 보다 분명하게 제시하기 위해 컴퓨터 지원 수단에 의해 영상을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 예는 표적 단백질 발현 수준이 참조 색상 검색표 (reference color lookup table)에 매핑(mapping)되는 RGB 색상 블렌드 히트맵 (color blend heatmap) 영상을 생성한다. 상기 검색표의 예는 상이한 수준의 염색 강도를 갖는 영역의 보다 용이한 확인을 위해 낮은 수준 강도를 청색 색조에, 중간 강도를 황색 색조에, 높은 강도를 적색 색조에 매핑할 것이다. 또 다른 예에서, 색상 혼합 복합 영상은 표적 단백질, 형태학적 결합제, 및 형광 마커 사이의 공간 관계를 보다 잘 제시하기 위해 제1 영상에 대해 생성된다. 예를 들어, 표적 단백질 결합제는 황색으로 착색되고, 형태학적 결합제는 청색으로 착색되고, 따라서 표적 단백질이 형태학적 결합제 표시된 영역에서 발현되는 경우에 염색은 용이하고 특이적인 확인을 위해 녹색으로 나타날 것이다. 또 다른 예에서, 특정 형광단 채널의 의사 컬러 영상이 생성될 수 있다. 예를 들어, 관심 있는 유전자에 대한 FISH 신호는 적색으로 착색되고 동일한 염색체의 또 다른 영역은 녹색으로 착색되어, 제시된 세포 또는 조직의 영역에서 2 종류의 신호의 상대적인 양을 쉽게 구별할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 영상은 바람직하게는 적어도 부분적으로는 형광 마커로부터 검출된 신호로부터 얻은 일부 영상에 따라 정렬된다. 바람직하게는, 제1 및 제2 영상을 오버레이하고, 복합 영상을 추가로 생성한다. 복합 영상은 제1 영상으로부터 얻은 결과를 제2 영상의 결과와 세포 대 세포 기준으로 직접 비교하는 것을 허용한다.
복합 영상은 제1 또는 제2 영상의 전체 영상, 또는 제1 영상 또는 제2 영상의 생성시에 획득한 모든 신호를 포함하지는 않을 수 있다. 형광 마커로부터 얻은 영상은 임의의 형태학적 정보를 포함할 수 있고, 생물학적 샘플로부터의 특정 세포내 소기관 성분, 예컨대, 세포 핵의 영상을 포함할 수 있다. 따라서, 알고리즘은 제1 및 제2 영상에서 형태학적 정보 (예를 들어, 세포내 소기관 성분)로부터 좌표를 획득하고, 이를 제1 및 제2 영상을 정렬하기 위해 사용한다. 바람직한 실시양태에서, 영상의 정렬을 위해 사용되는 형태학적 정보는 세포 수준의 정보이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 영상의 정렬을 위해 사용되는 형태학적 정보는 세포내 소기관 수준의 정보이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 영상의 정렬을 위해 사용되는 형태학적 정보는 세포 핵의 형광 신호로부터 유래된다.
복합 영상은 제1 또는 제2 영상의 전부, 또는 제1 영상 또는 제2 영상의 생성시에 획득한 모든 신호를 포함하지는 않을 수 있다. 슬라이드 및 현미경 단의 위치의 이동 때문에, 제2 영상은 제1 영상에 대해 회전하거나 변형될 수 있고, 상기 회전 또는 변형은 복합 영상의 생성 전에 두 영상을 정렬하거나 정합시키기 위해 교정되어야 한다.
영상을 정합시키기 위해, 제1 영상 및 제2 영상에 동일한 형태학적 마커를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 마커의 예는 세포 핵을 표지하고 후속적인 표백, 염색 및 다른 처리 동안 샘플에 유지되는 DAPI이다. 형광 마커로부터 얻은 영상은 두 영상에서 특정 세포내 소기관 구획에 대한 형태학적 정보를 제공하고, 상기 세포내 소기관 구획의 상대적인 위치는 두 영상에서 실질적으로 변하지 않은 상태로 유지된다. 따라서, 알고리즘은 (a) 두 영상의 푸리에 (Fourier) 변환을 계산하고; (b) 크기 성분을 로그-극좌표 (log-polar coordinate)로 푸리에 변환하고, 두 영상 각각의 변형-불변 시그너쳐 (signature)를 생성하고; (c) 제2 푸리에 변환을 2개의 시그너쳐에 적용하고; (d) 2개의 시그너쳐 사이의 상관 함수를 계산하고; (e) 상관 함수를 역 푸리에 변환하고, 2개의 영상 사이의 회전 및 스케일링 (scaling)을 해결하고; (f) 2개의 영상이 모두 동일하게 회전하고 스케일링되도록 회전 및 스케일을 제2 영상에 적용하고; (g) 동일하게 스케일링된 영상 사이의 교차 파워 (cross-power) 상관 함수를 계산하고; 및 (h) 교차 파워 상관성을 역 푸리에 변환하여, 제1 영상과 제2 영상 사이의 변형을 생성함으로써 제1 영상과 제2 영상 사이의 좌표 변환을 확립하기 위해 상기 공간 정보를 이용할 수 있다. 이어서, 변형, 회전 및 스케일을 사용하여, 복합화를 위해 동일하게 정렬된 (정합된) 영상을 생성한다. 교차 파워 상관성은 통상적인 곱 모멘트 (product-moment) 상관성에 바람직하고, 그 이유는 이 상관성이 2개의 영상 사이의 강도 차이 및 현미경의 시야에 걸쳐 느리게 변하는 강도 차이에 민감하지 않기 때문이다.
특정 실시양태에서, 생성된 제1 및 제2 영상, 및 임의의 복합 영상은 표적 단백질의 발현, 및 표적 핵산 서열을 특성화하기 위해 이용된다. 따라서, 단백질 발현 수준은 신호의 강도 값 (예를 들어, 형광 강도)을 생물학적 샘플 내의 표적의 양과 연관시킴으로써 분석될 수 있다. 표적의 양 및 신호 강도 사이의 상관성은 교정 표준을 이용하여 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 대조군 샘플이 이용될 수 있다. 샘플 (관심 있는 생물학적 샘플 대 대조군) 내의 신호의 존재 또는 부재를 관찰함으로써, 생물학적 샘플에 관한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들어, 이환된 조직 샘플 대 정상 조직 샘플을 비교함으로써, 이환된 조직 샘플에 존재하는 표적에 대한 정보를 얻을 수 있다. 유사하게, 샘플 (즉, 관심 있는 샘플 및 하나 이상의 대조군) 사이의 신호 강도를 비교함으로써, 샘플 내의 표적의 발현에 대한 정보를 얻을 수 있다.
표적 핵산 서열은 그의 존재, 부재, 발현 또는 증폭 수준에 의해 분석될 수 있다. 관심 있는 DNA 서열의 분석을 위해, 분석은 세포 핵 내의 신호에 집중될 수 있다. 따라서, 관심 있는 DNA 서열이 FISH에 의해 검출될 때, 많은 핵은 바람직하게는 먼저 적어도 부분적으로는 형광 마커 (예를 들어, DAPI 염색)로부터 얻은 영상을 기초로 하여 개별적으로 분할된다. 각각의 핵 내에, 표적 핵산 서열에 대한 FISH 스팟 (spot) 및 임의로 대응하는 염색체에 대한 (염색체 특이적 프로브로부터의) FISH 스팟이 위치한다. FISH 스팟은 추가로 분석된다. 예를 들어, 스팟의 비는 표적 유전자 증폭 또는 재배열 상태를 평가하기 위해 계산된다.
단백질 발현 데이타 및 핵산 분석 데이타는 조합된 데이타세트를 제공하기 위해 추가로 비교될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 생물학 및 의학에서 분석, 진단, 및 치료 용도에서 유용할 수 있다. 본원에서 설명되는 방법에 따른, 환자로부터의 세포 또는 조직 샘플의 분석은 진단 목적으로 (예를 들어, 특정 질환을 갖거나, 특정 독소에 노출되었거나 또는 특정 치료 또는 장기 이식에 잘 반응하는 환자를 확인하기 위해) 및 예후 목적으로 (예를 들어, 특정 질환이 발생할 가능성이 있거나, 특정 치료에 잘 반응하거나 또는 특정 장기 이식을 허용하는 환자를 확인하기 위해) 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 동일한 생물학적 샘플로부터의 다수의 표적 (예를 들어, 질환 마커)의 정확하고 신뢰가능한 분석을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 형광 영상은 명시야 염색 프로토콜과 유사한 명시야형 영상으로 전환된다. 따라서, 형태학적 정보, 형광 마커, 및 생물학적 샘플의 임의의 자가형광을 제공하는 하나 이상의 추가의 결합제로부터 검출된 형광 신호는 알고리즘을 통해 시뮬레이션된 (가상/분자) 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 영상을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 시뮬레이션된 (가상/분자) 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 영상은 유사한 알고리즘을 통해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 가상 H&E 영상은 형광 마커 (예를 들어, DAPI), 추가의 형태학적 정보를 제공하는 적어도 하나의 추가의 결합제 (예를 들어, 항-판 사이토케라틴 항체), 및 자가형광으로부터의 신호를 포함한다. 특정 실시양태에서, 가상 DAB 영상은 형광 마커 및 표적 단백질에 대한 결합제 (항-HER2 항체)로부터의 신호를 포함한다.
형광 영상을 의사 명시야 영상으로 전환하는 방법은 알려져 있다. 또한, 마치 영상이 특정 명시야 염색 프로토콜로부터 직접 얻어진 것처럼 생물학적 샘플의 구조적 특징 및 상세한 내용이 확인되는, 형광 영상으로부터 명시야 영상을 생성하는 방법도 알려져 있다. US 특허 출원 12/569396을 참조한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 그 전부가 본원에 참조로 포함된, 2011년 8월 17일 출원된 케이. 케니 (K. Kenny)의 US 특허 출원 13/211725 (발명의 명칭: "SYSTEM AND METHODS FOR GENERATING A BRIGHTFIELD IMAGE USING FLUORESCENT IMAGES")에 보다 자세히 설명된 바와 같이, 생물학적 샘플의 명시야 염색 프로토콜과 유사한 명시야형 영상을 생성하기 위한 개선된 방법이 사용된다. 방법은 생물학적 샘플의 명시야 영상으로부터 얻거나 미리 선택된 또는 요구되는 색상을 사용하여 규정된 교정 기능의 사용을 수반한다. 미리 선택된 또는 요구되는 색상은 표준 생물학적 염색 프로토콜을 잘 알고 있는 병리학자 또는 현미경학자일 수 있는 조작자에 의해 선택될 수 있다. 교정 기능은 3개의 파라미터, 즉 "소광 계수"로 불리는 a[적색], a[녹색], a[청색]을 사용하여 형광 영상을 명시야 색상 공간으로 매핑하는 강도 변환을 평가한다.
평가된 파라미터는 가시적인 염료, 예컨대, 헤마톡실린, 에오신, 또는 디아미노벤지딘 (DAB)으로 표지된 관심 있는 바이오마커의 광범위한 염색 강도로 하나 이상의 생물학적 시료를 제조함으로써 유도할 수 있다. 이어서, 샘플을 명시야에서 영상화하고, 적색, 녹색, 및 청색 화소 강도 수준의 분포를 계산할 수 있고; 화소 강도 수준을 간격 [0,1]로 정규화한다. 평균(log 강도)에 대해 가장 작은 값을 갖는 색상이 확인된다. 일반성을 잃지 않으면서, 특정 색상을 가정할 수 있다. 예를 들어, 색상이 녹색이면, (log 적색 / log 녹색) 및 (log 청색 / log 녹색)의 평균 값이 계산되고, 삼중값 (평균[log 적색 / log 녹색], 1, 평균[log 청색 / log 녹색])이 소광 계수로서 사용된다.
별법으로, 소광 계수는 실제 명시야 염료와 관계없이 유도될 수 있다. 대신에, 설계자는 중간 강도 염색에 대해 사용되어야 하는 색상을 선택할 수 있다. 색상이 선형 색상 모델에서 (R, G, B)이면 (여기서, 채널 R, G, 및 B는 간격 [0,1]로 정규화됨), 소광 계수는 간단히 (log R, log G, log B)이다. 상기 방식에 따르면, 방법을 통해 자연에서 존재하지 않는 염료를 사용하여 명시야 염색의 시뮬레이션이 가능하다.
이어서, 형광 영상 내의 점의 대응도는 2개의 방법: 즉, 강도-기반 및 특징-기반 방법에 의해 확립될 수 있다.
특징-기반 방법에서, 핵, 상피, 기질 또는 임의의 종류의 세포외 기질 물질의 영상은 형광 영상 및 명시야 영상 둘 모두에 대해 획득될 수 있다. 특징-기반 구조는 수동 과정을 사용하거나 자동적으로 선택될 수 있다. 대응 구조는 두 양상 모두로부터의 영상에서 선택된다. 형광 영상의 경우, 영상은 제시된 바이오마커에 대해 조정된 적절한 여기 에너지원 및 방출된 광을 수집하기에 적절한 필터와 함께 형광 현미경을 사용하여 캡쳐될 수 있다. 이어서, 샘플의 명시야 영상을 얻을 수 있고, 이는 이어서 적색 (R), 녹색 (G) 및 청색 (B) 채널 및 측정되는 특징-기반 구조의 색상 및 강도로 분할될 수 있다.
강도-기반 방법에서, 현미경 아래의 샘플 영역의 위치는 샘플 영역이 다음 영상 획득을 위해 동일한 위치에 근접하여 반복적으로 위치할 수 있도록 전자, 자기, 광학 또는 기계적 센서로 제어될 수 있다. 강도 기반 정합은 일반적으로 넓은 클래스의 바이오마커에 적용가능하다. 일반적으로, TMA, 슬라이드, 웰, 또는 그리드를 포함하고 이로 제한되지 않는 기재 상에 고정되거나 다른 방식으로 제공된 생물학적 샘플은 분자 바이오마커로 표지되고, 형광 현미경을 통해 영상화된다.
강도-기반 또는 특징-기반 방법에서, 형광 영상으로부터 명시야 색상 공간으로의 변환은 비선형 변환식 내의 추정된 매핑 파라미터를 이용한다. 비선형 변환식은 적색, 녹색, 청색 값 또는 색상 공간 (R, G, B)를 사용하여 제시될 수 있고, 변환은 다음 식으로 제시될 수 있다:
R = 255 exp(- a[염료1]*z[염료1] - a[염료2]z[염료2] - ...)
G = 255 exp(- b[염료1]*z[염료1] - b[염료2]z[염료2] - ...)
B = 255 exp(- c[염료1]*z[염료1] - c[염료2]z[염료2] - ...)
상기 식에서, 스칼라 (scalar) z[염료1], z[염료2] 등은 제시된 화소 위치에서 관찰된 형광 염료의 양이다. 삼중값 (a[염료n], b[염료n], c[염료n])은 미리 선택된 또는 요구되는 색상을 사용하여 규정된 가상 염색에서 n번째 염료의 소광 계수 x 상수이다. 상수는 출력 색상 값 (R, G, B)가 영상에서 판독가능한 범위의 콘트라스트를 보이도록 선택된다. R, G, 및 B는 명시야형 영상에서 생성되는 적색, 녹색 및 청색 화소 값이고; z는 제시된 화소 위치에서 관찰된 형광 염료 양에 대한 스케일링 계수이고; a, b, 및 c는 명시야 색상 공간에 대응하는 소광 계수이고, 삼중값 a[염료n], b[염료n], c[염료n]은 미리 선택된 또는 요구되는 색상을 사용하여 규정된 가상 염색에서 n번째 염료의 소광 계수 x 상수이다.
바람직하게는, 0.995 분위수 (quantile)는 z[염료1], z[염료2], ...에 대해 관찰되고, 상수는 다음과 같이 되도록 선택된다:
min(exp(-a[염료n]*z[염료n]), exp(-b[염료n]*z[염료n]), exp(-c[염료n]*z[염료n])) = 1/255.
이것은 출력 색상의 동적 범위 (dynamic range)가 8-비트 영상의 가능한 동적 범위를 거의 충족하도록 유도하고, 강한 콘트라스트를 생성한다.
선명화 변환 (sharpening transform)을 영상이 합성된 후에 가상 염색 영상에 적용할 수 있다. 한 실시양태에서, 선명화 변환은 그의 커널 (kernel)이 다음 매트릭스인 선형 컨볼루션 (convolution) 필터로서 실행될 수 있다:
Figure pct00001
선명화 변환의 적용은 출력 영상에게 보다 선명한 엣지 (edge) 및 보다 가시적인 미세한 세부적인 부분과 함께 보다 분명한 외형을 제공한다.
변환 파라미터가 계산된 후에, 샘플의 하나 이상의 선택된 영역은 가상 H&E 매핑 또는 유사한 시각적 영상, 예컨대 갈색 DAB 염색을 사용하여 한 세트의 형광 영상의 VSI로의 변환을 위해 사용될 수 있다. 분자 바이오마커는 명시야 영상만을 사용할 때 가시적이지 않은 기능 및 구획 정보를 유리하게 제공한다. 예를 들어, 영상 분석 알고리즘은 병리학자 또는 조작자에게 명시야 양상 (H&E)을 나타내는 영상 강도 값을 계속 제공하면서 샘플 구획을 분리하기 위해 추가된 채널로부터 이익을 얻을 수 있다. 예를 들어, 케라틴에 대한 DAB 염색 프로토콜을 나타내는 VSI는 세포 핵을 자주색 색조로, 상피 세포 및 섬유모세포의 세포골격을 갈색 색조로 보여줄 것이다.
별법으로, 매핑 파라미터가 평가된 후, 변환 알고리즘을 다른 형광 영상에 적용하여 VSI를 생성할 수 있다. 다른 형광 영상은 동일한 생물학적 샘플의 상이한 영역의 것일 수 있다. 별법으로, 다른 형광 영상은 상이한 생물학적 샘플의 것일 수 있다. 상이한 생물학적 샘플은 유사한 기능을 가질 수 있는 생물학적 대상체의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 포함할 수 있다.
따라서, 명시야형 영상의 생성 방법은 생물학적 샘플 상의 고정된 영역의 2 이상의 형광 영상의 영상 데이타를 획득하고, 매핑 파라미터가 비선형 추정 모델을 포함하는 매핑 파라미터를 생성하기 위해, 적어도 부분적으로는 특징-기반 정보 또는 화소 강도 데이타 정보를 이용하여 영상 데이타를 분석하고, 매핑 파라미터를 형광 영상에 적용하고, 2 이상의 형광 영상을 명시야 색상 공간으로 변환하고, 명시야형 영상을 생성하는 단계를 포함한다. 방법은 선명화 변환 교정을 명시야형 영상에 적용하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 설명한 방법에 따라 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하고, 복합 영상으로부터 관심 있는 핵산 서열 및 단백질의 발현을 분석하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플의 분석 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플의 분석 방법은 제1 결합제로부터의 형광 신호를 참조 색상 검색표에 매핑함으로써 표적 단백질 발현 수준의 RGB 색상 블렌드 히트맵 영상을 생성하는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플의 분석 방법은 제1 영상에 대해 색상 혼합된 복합 영상을 생성하는 것을 추가로 포함하고, 복합 영상은 표적 단백질의 영상, 적어도 하나의 추가의 결합제, 및 형광 마커에 의해 제시되는 형태학적 정보를 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 샘플을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 (FFPE) 조직 샘플을 포함한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 조직 샘플이고, 제1 결합제는 HER2에 대한 항체이고, 하나 이상의 추가의 결합제는 판-사이토케라틴 항체 칵테일이고, 형광 마커는 DAPI이고, 관심 있는 핵산 서열은 HER2이다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 위한 키트가 제공된다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 위한 구성요소를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면에서, 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 위한 시스템이 제공된다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 수행하기 위한 수단을 포함하는 시스템을 제공한다.
설명된 방법을 수행할 때, 특정 완충제, 배지, 시약, 세포, 배양 조건, pH 등의 언급은 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 하고, 당업자가 제시되는 특정 문맥에서 관심이 있거나 가치가 있는 것으로 인식할 모든 관련 물질을 포함하도록 해석되어야 한다. 예를 들어, 하나의 완충제 시스템 또는 배양 배지를 또 다른 것으로 치환하고, 동일하지는 않지만 유사한 결과를 계속 달성하는 것이 종종 가능하다. 당업자는 본원에 개시된 방법 및 절차를 사용할 때 그 목적을 위해 최적으로 기능할 상기 치환을 과도한 실험 없이 시행할 수 있도록 상기 시스템 및 방법에 대한 충분한 지식을 갖고 있을 것이다. 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 발명에 대한 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.
실시예
다음 실시예는 본 발명에 따른 방법 및 실시양태를 단지 예시하기 위한 것이고, 따라서 특허청구범위에 대한 제한을 제시하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
본 발명의 한 실행에서, 유방암 조직은 표준 조직학 방법에 의해 통상적인 조직학 시료로부터 얻었다: 수술에 의해 절제된 종양의 작은 부분을 10% 중성 완충 포르말린 내에서 8 시간 동안 고정한 후, 증가하는 에탄올 농도 (50%, 75%, 80%, 95%, 100%)의 용액, 이어서 자일렌에 순차적으로 통과시켜 탈수시켰다. 이어서, 샘플을 파라핀 내에 포매하고, 4 마이크로미터 두께의 절편을 박절기를 사용하여 절편화하였다. 절편을 수조에 띄우고, 표준 현미경 슬라이드 상에 한꺼번에 수거하였다. 슬라이드를 말리고, 2 시간 동안 60℃ 오븐에서 소성한 후, 자일렌에 통과시켜 탈파라핀화하고, 에탄올, 이어서 에탄올 농도가 감소하는 일련의 물-에탄올 혼합물에 통과시켜 재수화하고, 최종적으로 PBS로 세척하였다. 이어서, 슬라이드를 결합 에피토프 복구 (Bond Epitope Retrieval) 용액 (레이카 (Leica)) 내에서 100℃에서 20 min 동안 가열함으로써 슬라이드를 항원 복구 절차에 적용하였다. 이어서, 슬라이드를 Cy3과 접합된 사이토케라틴 항체의 칵테일과 조합된 Cy5와 접합된 Her2 항체로 염색한 후, DAPI로 역염색하였다. 슬라이드에 커버슬립을 덮고, 전체 슬라이드를 1.25x 배율 대물렌즈 및 DAPI 필터세트가 구비된 형광 현미경을 사용하여 영상화하였다. 영상을 디지탈 흑백 카메라를 사용하여 캡쳐한 후, 전체 슬라이드의 하나의 스티칭된 영상을 형성하기 위해 컴퓨터에 의해 조합하였다. 상기 스티칭된 전체 슬라이드 영상으로부터 조직 절편의 위치를 결정하고, 조직 절편만의 영상화를 위한 좌표를 기록하였다. 이 방법은 후속 영상을 수집하기 위해 필요한 시간을 유의하게 단축시킨다.
이어서, 조직 절편 영역의 10x 영상을 각각 핵, 사이토케라틴 및 Her2 단백질 염색에 특이적인 영상을 얻기 위한 DAPI, Cy3 및 Cy5 필터세트를 사용하여 수집하였다. 상기 개개의 마커 영상을 스티칭하여 하나의 영상을 형성한 후 오버레이하여, 형광 의사 컬러 영상 및 가상 H&E 및 가상 DAB 영상을 형성하였다. 스티칭된 조합 영상을 통해, 병리학자는 침습성 종양을 특이적으로 함유하는 조직 절편으로부터 관심 있는 영역을 선택할 수 있다. 상기 침습성 종양 영역의 좌표를 기록하고, 앞에서와 같이 DAPI를 포함하는 모든 형광단에 대해 40x 배율 및 필터세트를 사용하여 영상을 수집하였다.
후속 FISH 염색을 허용하기 위해 커버슬립을 2xSSC 완충제 내에서 인큐베이션함으로써 제거하고, 슬라이드를 핵 DNA에 대한 접근을 허용하기 위해 단백질 구조를 부분적으로 제거하는 0.05% 펩신으로 10 min 처리하였다. 이어서, 슬라이드를 4% 포름알데히드 수용액을 사용하여 10 min 동안 고정하고, 세척하고, 스펙트럼오렌지 (SpectrumOrange)로 표지된 Her2 유전자 및 스펙트럼그린 ((SpectrumGreen) (애보트 몰레큘라 (Abbott Molecular, 미국 일리노이주 데스플레인스))으로 표지된 염색체 17 동원체에 대한 FISH 프로브를 사용한 혼성화에 적용하였다. 혼성화는 증가하는 농도의 일련의 에탄올의 수용액, 이어서 100% 에탄올에 통과시켜 슬라이드를 탈수시켜 수행한 후, 짧게 건조하였다. 프로브 혼합물을 조직 절편을 함유하는 슬라이드의 영역에 적용한 후, 커버 슬립으로 덮고, 슬라이드를 가열하고 냉각할 수 있는 슬라이드 인큐베이터에 두었다. 프로브 혼합물을 담은 슬라이드를 10 min 동안 80℃로 가열하여 DNA 혼성체를 변성시키고, 37℃로 냉각하였다. 이어서, 슬라이드를 상기 온도에서 16시간 동안 유지하였다. 이어서, 슬라이드를 0.3%의 세제 NP-40을 함유하는 2xSSC 완충제 내에서 세척하고, 72℃에서 0.3% NP-40을 함유하는 2xSSC 내에서 2 min 동안 세척한 후, DAPI로 역염색하였다. 이어서, 침습성 종양을 갖는 조직 절편의 영역을 면역형광 단계에서 기록된 좌표를 사용하여 영상화하였다. 영상 세트는 스펙트럼오렌지, 스펙트럼그린 및 DAPI에 특이적인 필터세트를 사용하여 40x에서 기록하였다.
이어서, 면역형광 영상 세트 및 FISH 영상 세트를 각각 각각의 라운드로부터의 DAPI 영상을 사용하여 정렬한 후, 오버레이하고, 특수 가시화 소프트웨어를 사용하여 가시화하였다 (도 2 및 3). 상기 방법은 침습성 종양 영역의 정확한 확인 및 Her2 단백질 발현 및 유전자 증폭에 대한 세포 대 세포 비교를 허용한다. 이전의 실시되는 방법은 연속적인 절편 사이의 면역염색 및 FISH의 비교를 제한하고, 직접적인 세포 대 세포 상관성이 확인될 수 없다.
실시예 2
제2 실행에서, 상기한 바와 같이 폐암 종양 생검을 유리 슬라이드 상에 얻고, 탈파라핀화하고, 수화하고 항원을 복구하였다. 이어서, 슬라이드를 각각 Cy3 및 Cy5와 접합된 사이토케라틴-7 및 EGFR에 대한 항체를 사용하여 염색한 후, DAPI로 염색하였다. 조직 절편을 20x 배율에서 형광 현미경을 사용하여 영상화하고, 디지탈 카메라를 사용하여 기록하였다. 조직 절편의 대표적인 영역을 Cy5, Cy3 및 DAPI에 대한 필터세트를 사용하여 영상화하였다. 이어서, 슬라이드를 그 전부가 본원에 참조로 포함된, 2011년 12월 23일 출원된 US 특허 출원 13/336409 (발명의 명칭 "PHOTOACTIVATED CHEMICAL BLEACHING OF DYES FOR USE IN SEQUENTIAL ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES")에 보다 자세히 기재되어 있는 바와 같이 염료 불활성화 절차에 적용하고, 각각 Cy3 및 Cy5와 접합된 NaKATPase 및 IFG1R에 대한 항체로 염색하고, DAPI로 역염색하였다. 조직 절편을 이전 라운드와 동일한 영역 상에 수집하도록 정렬하고, 상기한 바와 같이 각각의 형광 채널에 대해 20x 배율을 사용하여 다시 영상화하였다.
이어서, 슬라이드를 상기 실시예에서처럼 펩신 처리 및 고정을 실시한 후, EGFR (플래티넘브라이트(PlatinumBright)415), cMet (플래티넘브라이트550) 및 염색체 7 동원체 (플래티넘브라이트495)에 대한 FISH 프로브와 혼성화하고, DAPI로 역염색하였다. 면역형광 영상화 라운드에서 얻은 영역 내에 포함된 종양 영역의 선택된 영역을 DAPI 및 청색, 녹색 및 적색 형광단에 특이적인 필터세트를 사용하여 40x에서 영상화하였다. 이어서, 모든 영상화 라운드의 절편을 영상을 정렬하기 위해 각각의 영상화 라운드 세트의 DAPI 영상을 사용하여 정합시키고, 핵, 세포질 및 세포막의 세포 구획에 의한 세포의 동시적인 가시화 및 EGFR 및 IFG1R 단백질의 발현을 허용하기 위해 단일 시야 영상에 합하였다 (데이타 미제시). 또한, 영상은 cMet 및 EGFR 유전자에 대한 FISH 신호의 가시화를 허용하고, 따라서 동일한 조직 절편에 대한 가능한 유전자 증폭 및 단백질 과다발현의 상관성을 허용하였다 (데이타 미제시).
실시예 3
본 발명의 또 다른 실행에서, 현미경 슬라이드 상의 종양 절편을 상기한 바와 같이 탈파라핀화 및 재수화한 후, 항원 복구시켰다. 샘플은 Cy5 접합된 EGFR 항체와 조합된 Cy3 접합된 사이토케라틴-7 항체로 염색하고, DAPI로 역염색하였다. 샘플 전체를 DAPI, Cy3 및 Cy5 필터세트를 사용하여 영상화하고, 영상을 디지탈 방식으로 기록하였다. 염료 불활성화 후에, 샘플을 제2 세트의 마커, 즉 Cy5 접합된 NaKATPase 항체 및 Cy3 접합된 IGF1R 항체로 염색하고 DAPI로 역염색하였다. 샘플을 DAPI, Cy3 및 Cy5 필터세트를 사용하여 제1 라운드와 동일한 위치에서 영상화하고, 영상을 상기한 바와 같이 디지탈 방식으로 저장하였다.
이어서, 샘플에 대해 상기 실시예 1에서 설명한 바와 같이 펩신 소화 및 Her2 및 염색체 17의 동원체에 대한 DNA 프로브를 사용한 혼성화 및 DAPI 역염색을 실시하였다. 이어서, 샘플을 각각의 FISH 프로브 및 DAPI에 대한 필터세트를 사용하는 형광 현미경을 사용하여 영상화하고, 영상을 디지탈 방식으로 저장하였다.
이어서, 샘플을 염료 불활성화에 적용한 후, EGFR 및 염색체 7의 동원체에 대한 프로브세트를 사용한 FISH 혼성화의 제2 라운를 실시하였다. 이것은 증가하는 농도의 일련의 에탄올 수용액, 이어서 100% 에탄올에 통과시켜 슬라이드를 탈수시켜 수행한 후, 짧게 건조하였다. 제2 프로브 혼합물을 조직 절편을 함유하는 슬라이드의 영역에 적용한 후, 커버슬립으로 덮고, 슬라이드를 가열하고 냉각할 수 있는 슬라이드 인큐베이터에 두었다. 프로브 혼합물을 담은 슬라이드를 10 min 동안 80℃로 가열하여 DNA 혼성체를 변성시키고, 불활성화된 프로브를 제1 FISH 라운드로부터 제거하였다. 이어서, 슬라이드를 37℃로 냉각한 후, 16시간 동안 상기 온도에서 유지하였다. 이어서, 슬라이드를 0.3%의 세제 NP-40을 함유하는 2xSSC 완충제 내에서 세척하고, 72℃에서 0.3% NP-40을 함유하는 2xSSC 내에서 2 min 동안 세척한 후, DAPI로 역염색하였다.
이어서, 슬라이드를 제2 세트의 FISH 프로브 및 DAPI에 대한 필터세트를 사용하여 영상화하였다. 이어서, 모든 영상화 라운드는 DAPI 영상을 사용하여 정렬하고, FISH 및 IF 신호를 IF 영상으로부터의 유전자 발현 및 FISH 채널로부터의 유전자 증폭에 대해 분석하였다. 이것은 IF 염색의 다중 라운드의 세포 대 세포 상관성 및 따라서 다중 단백질 마커의 발현 상태 및 FISH 염색의 다중 라운드 및 따라서 다중 유전자의 증폭 상태를 허용한다.
본 발명의 특정 실시양태를 제시하고 설명하였지만, 본 발명의 교시내용으로부터 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 상기 설명 및 첨부 도면에 제시된 내용은 단지 예시를 위해 제시된 것으로서, 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 본 발명의 실제 범위는 선행 기술을 기초로 하여 그의 적절한 관점에서 살펴볼 때 다음 특허청구범위에서 규정됨이 의도된다.

Claims (46)

  1. (1) a. 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고;
    b. 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고;
    c. 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고;
    d. 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계; 이어서
    (2) a. 단계 (1)로부터의 동일한 샘플을 적어도 하나의 표적 핵산 서열 각각에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 표적 핵산 서열과 혼성화하고;
    b. 임의로, 샘플을 형광 마커로 염색하고;
    c. 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고;
    d. 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계; 및
    (3) 표적 단백질 및 표적 핵산 둘 모두의 상대적인 위치를 제공하는 복합 영상을 생성하는 단계
    를 포함하는, 단일 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 복합 영상의 생성이 제1 영상의 생성 및 제2 영상의 생성시에 얻은 신호 정보를 사용하여 복합 영상을 생성하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 복합 영상의 생성이 단계 (1)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치를 단계 (2)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치와 함께 정합시키는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)(d)가
    (i) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 초기 영상을 생성하고;
    (ii) 초기 영상으로부터 관심 있는 영역을 선택하고, 초기 영상보다 고해상도의 제1 영상을 생성하기 위해 적어도 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하는 것
    을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 복합 영상이 고해상도의 영상 및 제2 영상으로부터의 신호 정보를 조합함으로써 생성되는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 고해상도의 영상에서의 형광 마커로부터의 신호의 위치를 제2 영상에서의 형광 마커로부터의 신호의 위치와 함께 정합시키는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 영상의 생성시의 검출 단계 또는 제2 영상의 생성시의 검출 단계가 생물학적 샘플의 자가형광의 검출을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 복합 영상의 생성이 단계 (1)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치를 단계 (2)에서 얻은 형광 마커로부터의 신호의 위치와 함께 정합시키는 것을 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 영상의 생성 단계가, 샘플의 영상을 생성하기 전에, 전체 고체 지지체의 저해상도 영상을 생성하고 샘플을 고체 지지체 상에 위치시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 영상의 생성 및/또는 제2 영상의 생성이 명시야 염색과 유사한 명시야형 영상을 생성하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제11항에 있어서, 명시야형 영상이 시뮬레이션된 H&E 영상과 유사한 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 명시야형 영상이 시뮬레이션된 DAB 영상과 유사한 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 있는 영역이 적어도 부분적으로는 제1 영상의 명시야형 영상으로부터의 형태학적 정보를 기초로 하여 선택되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계 (1)(a) 전에 항원 복구 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)(a)에서 제1 결합제를 표적 단백질과 물리적으로 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가 표적 단백질에 특이적인 항체인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체가 형광단으로 표지된 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질이 사이토케라틴, 사이클린 D1, 사이클린 B1, Ki67, ER, AR, PI3K, cMET, EGFR, cMyc, PTEN, MAPK, EGFR 및 HER2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)(a)에서, 샘플이 또한 추가의 형태학적 정보를 제공하는 적어도 하나의 추가의 결합제와 접촉되고; 단계 (1)(c)에서, 적어도 하나의 추가의 결합제로부터의 신호가 또한 형광에 의해 검출되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 결합제가 케라틴 15, 19, E-카드헤린, Na+K+ATPase, 클라우딘 1, 콜라겐 IV, EPCAM, 피브로넥틴, 글루트 (glut) 1, SMA, 비멘틴, 평활근 액틴, CD31에 대한 항체 및 판-사이토케라틴 항체를 포함하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 추가의 형태학적 정보가 조직 기원, 세포 기원, 종양, 정상, 및 기질 영역, 세포 종류, 및 세포내 소기관 구조, 예컨대 세포막, 세포질, 핵을 포함하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 추가의 형태학적 정보가 상피 기원의 세포의 세포질 위치에 대한 정보를 포함하는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)(a)에서, 제1 결합제를 단백질과 물리적으로 결합시키고, 적어도 하나의 추가의 결합제를 샘플의 특정 구획에 위치하는 단백질과 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 마커가 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 에오신, 획스트 (Hoechst) 33258 및 획스트 33342 (2개의 비스벤즈이미드), 프로피듐 아이오다이드, 퀴나크린, 플루오레세인-팔로이딘, 크로모마이신 A 3, 아크리플라빈-포일겐 (Feulgen) 반응, 아우라민 O-포일겐 반응 및 에티듐 브로마이드를 포함하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 마커가 세포의 핵을 염색하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)(a) 전에 샘플을 프로테이나제로 소화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)(a)에서, 상기 혼성화 반응이 FISH, IQ-FISH, 계내 (in-situ) PCR, 롤링 써클 (rolling circle) 증폭 및 프라이밍된 (primed) 계내 표지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화 반응이 FISH이고, 반응이 관심 있는 핵산 서열이 존재하는 각각의 염색체를 확인하는 프로브를 추가로 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브가 핵산 프로브, 펩티드 핵산 프로브, 잠금 핵산 프로브, mRNA 프로브, miRNA 프로브 또는 siRNA 프로브를 포함하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브가 형광 표지된 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산이 EGFR, TOP2A, cMyc, ALK, FGFR1 및 HER2에 대한 핵산 서열을 포함하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)(d) 후에, 제1 결합제로부터의 형광 신호가 변형되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 형광 신호가 화학 작용제에 의해 변형되는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 단계 (1)(a) 내지 (1)(d)가 상이한 단백질에 대한 또 다른 결합제를 사용하여 반복되는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)(d) 후에, 프로브로부터의 형광 신호가 산화, 스트리핑 (stripping), 광표백 (photobleaching), 또는 이의 혼합에 의해 변형되고, 단계 (2)(a) 내지 (2)(d)가 추가의 관심 있는 핵산 서열에 대한 프로브를 사용하여 반복되는 방법.
  36. 제1항에 따라 생물학적 샘플의 복합 영상을 제공하고, 복합 영상으로부터 관심 있는 핵산 서열 및 단백질의 발현을 분석하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플의 분석 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 샘플이 세포 또는 조직 샘플을 포함하는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 샘플이 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 (FFPE) 조직 샘플을 포함하는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)(a)에서, 샘플이 또한 추가의 형태학적 정보를 제공하는 적어도 하나의 추가의 결합제와 접촉되고; 단계 (1)(c)에서, 적어도 하나의 추가의 결합제로부터의 신호가 또한 형광에 의해 검출되는 것인 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합제로부터의 형광 신호를 참조 색상 검색표 (reference color lookup table)에 매핑(mapping)함으로써 표적 단백질 발현 수준의 RGB 색상 블렌드 히트맵 (color blend heatmap) 영상을 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제39항에 있어서, 제1 영상에 대해 색상 혼합된 복합 영상을 생성하는 것을 추가로 포함하고, 상기 복합 영상은 표적 단백질의 영상, 적어도 하나의 추가의 결합제, 및 형광 마커에 의해 제시되는 형태학적 정보를 포함하는 것인 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 FFPE 조직 샘플이고, 제1 결합제가 HER2에 대한 항체이고, 하나 이상의 추가의 결합제가 판-사이토케라틴 항체 칵테일이고, 형광 마커가 DAPI이고, 관심 있는 핵산 서열이 HER2인 방법.
  43. 동일한 생물학적 샘플에서 단백질의 형광 검출 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 위한 구성요소를 포함하는 키트.
  44. 동일한 생물학적 샘플에서 단백질 및 표적 핵산 서열의 형광 검출을 수행하기 위한 수단을 포함하는 시스템.
  45. (1) a. 고체 지지체 상의 샘플을 표적 단백질에 대한 제1 결합제와 접촉시키고;
    b. 샘플을 형태학적 정보를 제공하는 형광 마커로 염색하고;
    c. 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고;
    d. 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제1 영상을 생성하는 단계; 이어서
    (2) a. 단계 (1)로부터의 동일한 샘플을 적어도 하나의 표적 핵산 서열 각각에 대한 프로브와 접촉시켜 프로브를 표적 핵산 서열과 혼성화하고;
    b. 임의로, 샘플을 형광 마커로 염색하고;
    c. 각각의 표적 핵산 서열에 대한 프로브 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하고;
    d. 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플의 제2 영상을 생성하는 단계
    를 포함하는, 단일 생물학적 샘플의 제1 및 제2 영상을 생성하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 제1 영상의 생성이, 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출한 후,
    (i) 검출된 형광 신호로부터 적어도 일부의 샘플의 초기 영상을 생성하고;
    (ii) 초기 영상으로부터 관심 있는 영역을 선택하고, 초기 영상보다 고해상도의 제1 영상을 생성하기 위해 적어도 제1 결합제 및 형광 마커로부터의 신호를 형광에 의해 검출하는 것
    을 포함하는 방법.
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