KR20140120218A - 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 및 이를 이용하여 제작된 인공 조직 - Google Patents

혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 및 이를 이용하여 제작된 인공 조직 Download PDF

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Abstract

온도민감성 리포좀, 혈관세포 특이적 항체, 및 혈관신생 유도 물질을 포함하는 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물 를 이용하여 얻어진 조직 배양물, 상기 조직 배양물을 포함하는 인공 조직, 및 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 이용하여 혈관이 형성된 인공 조직을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 및 이를 이용하여 제작된 인공 조직 {Composition for delivery of angiogenesis inducing molecule and artificial tissue prepared by the composition}
온도민감성 리포좀, 혈관세포 특이적 항체, 및 혈관신생 유도 물질을 포함하는 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 이용하여 얻어진 조직 배양물, 상기 조직 배양물을 포함하는 인공 조직, 및 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 이용하여 혈관이 형성된 인공 조직을 제조하는 방법이 제공된다.
조직공학적 측면에서, 두께가 100 um(micrometer) 이상인 삼차원 조직을 제조 및 배양할 때, 조직 내부까지 산소 및 영양의 공급이 원활하게 이루어지지 못함에 따라서, 조직 내부로 들어갈 수록 세포 괴사율이 높아지게 되고, 결국 조직 전체가 활성과 기능성을 잃게 되는 문제점이 있어 왔다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 3차원 인공 구조물(scaffold)에 혈관신생 인자 (angiogenesis factor)를 처리하여 혈관을 형성시킴으로써 생체 조직 내의 혈관 구조를 모방한 인공 조직을 제작하는 기술이 제안되었다 (Advanced Drug Delivery Reviews (2007) Volume 59, 249-262). 그러나, 이러한 기술은 인공 구조물에 세포를 seeding하기 전에 혈관을 형성시키기 때문에, 이후 seeding되는 세포와 이미 형성된 혈관과의 공간적인 경쟁이 유발되는 문제가 있다. 또한 이와 같이 제작된 인공 조직은 생체 내 조직의 혈관 구조를 모방하였으나, 생체 적합도가 낮다는 문제점이 있다.
따라서, 내부 혈관 형성이 성공적으로 이루어지고 생체 적합성도 우수한 인공 조직의 제작 기술의 개발이 요구된다.
일 예는 온도민감성 리포좀, 혈관세포 특이적 항체, 및 혈관신생 유도 물질을 포함하는 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 및 혈관세포와 조직 세포를 포함하는 세포 혼합물을 함께 배양하여 얻어지는 조직 배양물을 제공한다.
다른 예는 상기 조직 배양물을 포함하는 인공 조직을 제공한다.
다른 예는 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 및 혈관세포와 조직세포를 포함하는 세포 혼합물을 함께 배양하는 단계, 및 열처리 하는 단계를 포함하는, 혈관이 형성된 인공 조직의 제조 방법을 제공한다.
조직공학분야에서 3차원 세포기반 인공조직을 제조할 때, 제조된 세포기반 인공 조직이 특정 조직으로서의 기능성을 지니게 하기 위해 기본적으로 요구되는 조직 내 높은 세포 활성을 갖도록 하는 기술에 관한 것이다. 이를 위하여, 인공 조직 내부까지 자연스럽게 산소 및 영양을 골고루 전달하기 위한 내부 혈관 형성 유도 시스템이 제공된다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 예는 온도민감성 리포좀, 혈관세포 특이적 항체, 및 혈관신생 유도 물질을 포함하는 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 제공한다. 상기 혈관 세포 특이적 항체는 상기 온도 민감성 리포좀의 표면에 접합되어 있고, 상기 혈관신생 유도 물질은 상기 온도민감성 리포좀의 내부에 봉입되어 있는 것일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀은 지질 이중층, 및 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드(예컨대, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (elastin-like polypetide: ELP), 류신 지퍼 등)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 온도민감성 리포좀은 지질 이중층 안정화제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀에서, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 지질 이중층을 구성하는 지질 분자 사이사이에 충진되어 있고, 여기에 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 등의 온도감응성 펩타이드는 리포좀 내부 또는 외부에 노출되어 있는 형태일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "지질 이중층 (lipid bi-layer)"은 지질 분자의 2개 층으로 구성된 막을 나타낸다. 지질 이중층은 자연적으로 존재하는 세포막과 유사한 두께를 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 지질 이중층의 두께는 10nm 이하, 예를 들면, 1nm 내지 9nm, 2nm 내지 8nm, 2nm 내지 6nm, 2nm 내지 4nm 또는 2.5 nm 내지 3.5 nm 정도일 수 있다.
지질 이중층은 지질분자, 예컨대, 인지질을 포함하여 구성될 수 있다. 인지질은 친수성 헤드 (head)와 2개의 소수성 테일을 갖는다. 인지질이 수성 환경에 노출되는 경우, 두 개의 인지질 분자의 소수성 테일 부분은 서로 마주보고 친수성인 헤드는 수성 환경과 접촉하는 바깥쪽을 향하는 이중 구조를 기본 단위로 하여 이중층으로 배열된다. 이러한 지질 이중층은 리포좀 구조를 형성할 수 있다.
상기 지질 이중층을 구성하는 "지질 분자"는 친수성 헤드와 소수성 테일을 가진 모든 지질 분자 중에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 지질 분자는 C12 내지 C50의 탄소 원자를 갖는 인지질, 스핑고 지질, 당지질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 상기 지질 분자는 인지질일 수 있으며, 상기 인지질은 C12 내지 C22, 예컨대 C14 내지 C20의 탄소 원자를 갖는 탄화수소를 포함하는 것일 수 있다. 상기 인지질은 2개의 아실기를 갖는 포화 또는 불포화 탄화수소를 포함하는 것일 수 있다. 상기 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민, 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 또한, 상기 인지질은 약 10℃ 내지 약 70℃, 구체적으로, 약 20℃ 내지 약 65℃, 예컨대, 약 24℃ 내지 약 55℃, 약 35℃ 내지 약 45℃, 약 38℃ 내지 약 45℃, 약 38℃ 내지 약 42℃, 약 39℃ 내지 약 45℃, 또는 약 39℃ 내지 약 42℃의 상전이 온도를 갖는 것일 수 있다. 상기 인지질은 2 이상의 인지질 분자의 혼합물일 수 있다. 2 이상의 인지질 분자의 혼합에 의하여 다양한 상전이 온도를 갖는 지질 이중층이 생성될 수 있다.
인지질 분자는 예를 들면, 2개의 아실기를 갖는 것으로서, C12 포화된 사슬 인지질 (예컨대, Tc = 10℃), C14 포화된 사슬 인지질 (예컨대, Tc = 24℃), C16 포화된 사슬 인지질 (예컨대, Tc = 41℃), C18 포화된 사슬 인지질 (예컨대, Tc = 55℃), C20 포화된 사슬 인지질 (예컨대, Tc = 65℃), C22 포화된 사슬 인지질 (예컨대, Tc = 70℃), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. C16 포화된 사슬 인지질의 예는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)일 수 있다. DPPC는 약 41.5℃의 상전이 온도를 갖는 포화 사슬 (C16) 인지질이다. C18 포화된 사슬 인지질의 예는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DSPC)일 수 있다. DSPC는 약 55.10℃의 상전이 온도를 갖는 포화 사슬 (C18) 인지질이다. 구체예에서, 상기 지질 분자는 DPPC일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 인지질은 DPPC와 DSPC의 혼합물인 것일 수 있다. 상기 인지질은 DPPC: DSPC가 1: 0 내지 0.5, 예를 들면, 1: 0.1 내지 0.5의 몰비인 것일 수 있다.
상기 지질 분자로서 인지질과 유사한 사슬 길이에 따른 상전이 온도 변화 양상을 갖는, 스핑고미엘린과 같은 스핑고지질, 강글리오시드와 같인 당지질 등도 사용될 수 있다.
상기 지질 이중층은 인지질 외에 다른 막-형성 물질을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 지질 이중층은 고상 막을 형성하는 볼라 지질, 박테리아 지질, 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 지질 이중층은 수용성 폴리머 (예, 폴리에틸렌글리콜) 및 수불용성 폴리머 (예, 폴리프로필렌옥시드, 폴리에틸에틸렌 등)을 포함하는 블록공중합체를 포함할 수 있다.
지질 이중층은 온도에 따라 다른 상 거동(phase transition behavior)을 나타낼 수 있다. 즉, 지질 이중층은 주어진 온도에서 액체 또는 젤 (고체) 중 하나의 상으로 존재할 수 있다. 이는 상기 지질 이중층을 구성하는 지질 분자가 젤상으로부터 액체상으로 전이하는 특성 온도 (characteristic temperature)을 갖기 때문이다.
용어 "상전이온도 (phase transition temperature)"는 물질이 고체상에서 액체상으로 또는 액체상에서 고체상으로 상이 변하는 온도를 나타낸다(용융 온도 (melting temperature)라고도 함).
상기 지질 이중층은 상전이온도 이상이 되면 이를 구성하는 지질 분자가 액체상으로 변하면서 분해된다. 상기 지질 이중층이 상전이온도가 상이한 두 종류 이상의 지질 분자로 이루어진 경우, 상전이온도가 낮은 지질 분자부터 분해되어 점진적인 지질 이중층의 분해가 일어난다. 따라서, 지질 이중층을 구성하는 지질 분자의 구성을 조절함으로써 이중층이 분해되는 온도 및 분해 정도를 조절할 수 있다. 이와 같이 상전이 온도 이상의 조건에서 지질 이중층이 분해되면, 리포좀 내부에 봉입되어 있는 혈관신생 유도 물질의 방출이 일어난다. 따라서, 온도 조절에 의하여 리포좀 내부에 봉입된 물질의 방출 조절이 가능하다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 이중층은 예컨대, 친수성 중합체로 유도체화된 지질 유도체, 예를 들면, 인지질 유도체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 올리고사카라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 친수성 중합체는 평균분자량이 100 내지 100,000 Da인 것일 수 있다. 상기 친수성 중합체로 유도된 지질 유도체는, 지질 부분이 지질 이중층을 구성하는 지질 분자 사이사이에 위치하여 지질 이중층 구성에 참여하고, 친수성 중합체가 리포좀 외부에 노출된 형태로, 리포좀에 포함될 수 있다. 상기 친수성 중합체로 유도된 지질 유도체는 C4-C30, 예를 들면 C16-C24의 탄소를 포함하는 인지질에 PEG가 접합된 것일 수 있다. 상기 유도체는 DPPC-PEG, 또는 DSPE-PEG인 것일 수 있다. 구체예에서, 상기 PEG는 분자량 180 내지 50,000 Da인 것일 수 있다.
상기 리포좀은 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도 감응성 펩타이드를 포함하고, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층에 충진되어 있는 것일 수 있다. 상기 온도 감응성 펩타이드는 온도가 증가함에 따라서 펩타이드 분자 내 (intra-molecular) 또는 분자 간 (inter-molecular) 수소 결합이 변화함으로써 구조적 변화가 발생하는 모든 펩타이드일 수 있다. 상기 온도 감응성 펩타이드는 온도가 증가함에 따라서 상기와 같은 구조 변화에 의하여 Random coil이 α-helix 또는 β-turn로 변화하여, 리포좀의 상전이에 기여할 수 있다. 예컨대, 상기 온도 감응성 펩타이드는 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (elastin-like polypeptide; ELP), 류신 지퍼 모티프 (Leucine zipper motif), 실크-유사 펩타이드 (silk-like peptide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 구체적으로 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (elastin-like polypeptide; ELP) 또는 류신 지퍼 모티프 (Leucine zipper motif)일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 소수성 효과에 의하여 상기 지질 이중층의 지질 분자 사이사이에, 즉 지질 이중층의 내부(지질 이중층의 각 층의 소수성 테일이 위치하는 부위)에 충진되어 지질 이중층의 구성에 참여하고, 거기에 접합된 온도감응성 펩타이드를 상기 지질 이중층에 고정하는 역할을 하는 것으로, 예를 들면 소수성 특성을 가진 분자일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층을 구성하는 지질 분자와 동일하거나 다른 종류의 지질 분자일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 소수성 부분으로만 구성된 소수성 분자 및 소수성 부분과 친수성 부분을 포함하는 양친매성 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 소수성 부분과 친수성 부분을 포함하는 양친매성 분자의 경우, 소수성 부분은 지질 이중층의 내부 방향으로 배치되어 있고 친수성 부분은 지질 이중층의 외부 방향으로 배치되어 있고, 온도감응성 펩타이드는 상기 친수성 부분에 접합되어 지질 이중층의 외부 (즉, 리포좀의 내부 또는 외부)에 노출되어 있을 수 있다. 소수성 분자와 온도감응성 펩타이드가 접합된 경우에는 소수성 분자가 지질 이중층의 내부 방향으로 배치되고, 온도감응성 펩타이드는 외부 방향에 위치하여 리포좀 외부에 노출되어 있을 수 있다. 여기서, "외부 방향"이라는 지질 이중층의 내부(지질 이중층의 각 층의 소수성 테일이 위치하는 부위)로부터 외부(친수성 헤드가 위치하는 부위) 방향을 나타내는 것으로, 리포좀의 내부 방향 또는 리포좀의 외부 방향을 나타낸다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 생체막에 천연적으로 존재하는 지질 분자이거나 생체막에 천연적으로 존재하지는 않지만 지질 이중층을 구성할 수 있는 지질 분자들 중에서 선택된 것일 수 있다.
상기 생체막에 천연적으로 존재하는 지질 분자는 인지질 또는 그의 유도체, 스테롤 또는 그 유도체, 스핑고지질 또는 그 유도체 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 인지질 또는 그 유도체는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 스테롤 또는 그 유도체는 콜레스테롤 또는 그의 유도체, 또는 스쿠알렌 또는 그 유도체일 수 있다. 상기 스핑코지질은 스핑고미엘린 또는 강글리오시드 또는 이들의 유도체일 수 있다. 소수성기를 포함하는 모이어티로서의 상기 인지질, 스테롤 또는 스핑고지질은 생체내 합성과정에서 생성되는 중간체 또는 전구체를 포함한다. 예를 들면, 상기 중간체 또는 전구체는 포스포글리세리드, 스핀고신, 세라미드, 세레브로시드 등일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 C4-C30, 예를 들면, C14-C24의 탄소수, 또는 C16-C24의 탄소수를 갖는, 포화 또는 불포화 탄화수소, 포화 또는 불포화 아실 분자 또는 포화 또는 불포화 알콕시 분자일 수 있다.
소수성기를 포함하는 모이어티와 온도감응성 펩타이드의 접합은 생리적 또는 병적 조건에서 절단 가능한 결합에 의하여 이루어진 것일 수 있다. 상기 절단 가능한 결합의 예는, pH 절단가능한 링커, 열전달가능한 링커, 광 (radiation) 절단가능한 링커, 수용액에서 전달되는 링커를 매개하여 이루어진 결합일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드는 상기 소수성기를 포함하는 모이어티가 상기 온도감응성 펩타이드의 측쇄 또는 측쇄가 아닌 말단에 접합되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 온도감응성 펩타이드의 N 말단의 N 또는 C 말단의 카르보닐 (-C(O)-)기와의 결합에 의하여 접합되어 있는 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 온도감응성 펩타이드의 측쇄 중의 반응성 작용기, 예를 들면, 아미노기, 카르보닐기, 히드록시기, 티올기, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 작용기와의 반응에 의하여 형성된 결합에 의하여 연결된 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 온도감응성 펩타이드의 N 원자와의 아민 또는 아미드 결합을 통하여 접합되어 있는 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 온도감응성 펩타이드의 C 말단의 카르보닐기와 아미드 또는 에스테르 결합을 통하여 접합되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 하나의 사슬을 가진 소수성기를 포함하는 모이어티일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는, 소수성기 부분이 C4-C30, 예를 들면, C14-C24의 탄소수, 또는 C16-C24의 탄소수를 갖는 지방족 탄화수소일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는, 예를 들면, 미리스토일 (C14), 팔미토일 (C16), 스테아로일 (C18), 아라키도닐 (C20), 베헤노닐 (C22) 또는 리그노세로일 (C24)일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 소수성 효과 (hydrophobic effect)에 의하여 지질 이중층에 충진될 수 있으며, 그에 따라 상기 소수성기를 포함하는 모이어티에 접합된 온도감응성 펩타이드는 상기 리포좀에 고정되어질 수 있다.
상기 온도감응성 펩타이드는 온도에 따라 구조 (conformation) 변화를 하는 아미노산 중합체를 의미하는 것으로, 예컨대 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (elastin-like polypeptide; ELP)", "류신 지퍼 모티프(Leucine zipper motif)" 및 "실크-유사 펩타이드(silk-like peptide)" 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 류신 지퍼 모티프, 및 실크-유사 펩타이드 등의 온도감응성 펩타이드는 "역상전이 거동 (inverse phase transitioning behavior)"를 갖는 폴리머일 수 있다. 역상전이 거동이란 "역상전이 온도 (inverse phase transition temperature: Tt)" 이하의 온도에서는 수성 용액에 용해성이고, 온도가 역상전이 온도 보다 높은 온도로 상승하는 경우, 불용성으로 되는 것을 나타낸다. 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 온도가 상승함에 따라 고도로 용해성인 긴 사슬 (elongated chain)으로부터 크게 감소된 용해도를 갖는 단단하게 접혀진 응집체 (tightly folded aggregate)로 전이할 수 있다. 이러한 역상전이는 온도의 상승에 따라 엘라스틴-유사 폴리펩타이드의 구조가 β-턴 (turn) 및 찌그러진 β-구조 (distorted β-structure)를 더 많이 가지게 됨으로써 유도되는 것일 수 있다. 일부의 경우에, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 상전이가 일어나는 온도 범위에 기초하여 정의될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 상기 상전이는 약 10℃ 내지 약 70℃, 예컨대 약 35℃ 내지 약 45℃, 약 38℃ 내지 약 45℃, 약 39℃ 내지 45℃, 약 38℃ 내지 약 42℃, 또는 약 39℃ 내지 약 42℃의 온도 범위에서 일어날 수 있다.
역상전이 거동 특성은 온도감응성 펩타이드가 지질 이중층의 구성 성분에 연결되어 있는 경우, 온도가 온도감응성 펩타이드의 Tt 보다 낮은 온도에서 높은 온도로 상승함에 따라 온도감응성 펩타이드의 수축 및 자가 조립으로 인하여, β 지질 이중층을 파괴할 수 있다. 상기 지질 이중층의 파괴는 지질 이중층의 투과성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 지질 이중층을 포함하는 리포좀에 봉입된 활성성분은 더 높은 효율(투과도)로 리포좀으로부터 외부로 방출될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 리포좀에서의 활성성분의 방출이 이러한 특정 작용 기작에 한정되는 것은 아니다.
온도감응성 펩타이드의 역상전이 거동에 의한 리포좀을 구성하는 지질 이중층의 파괴는 지질 이중층을 구성하는 지질 분자들, 즉 지질 이중층의 상전이온도에 따라 달라질 수 있다. 지질 이중층은 그의 상전이 온도 이하에서는 젤상, 그 이상에서는 액체 (결정성) 상으로 존재한다. 지질 이중층이 젤상으로 존재하는 경우, 온도감응성 펩타이드가 역상전이 거동에 의하여 β-턴 구조를 갖는 구조로 변경되더라도, 지질 이중충의 파괴는 일어나지 않거나 제한적일 수 있다. 반면, 지질 이중층이 액체 상으로 존재하는 경우, 온도감응성 펩타이드 역상전이 거동에 의하여 β-턴 구조를 갖는 구조로 변경됨에 따라, 지질 이중충의 파괴가 유도될 수 있다. 즉, 지질 이중층이 젤상으로 존재하는 경우에 비하여 액체상으로 존재하는 경우, 온도감응성 펩타이드의 역상전이는 지질 이중층의 파괴를 더 효율적으로 유도한다. 따라서, 리포좀에 포함된 활성 성분의 방출 온도는 리포좀의 지질 이중층의 상전이온도 및 온도감응성 펩타이드의 역상전이 온도를 조절함으로써, 조절될 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀에 포함된 혈관신생 유도 물질의 방출 온도는 리포좀의 지질 이중층의 상전이온도 및 온도감응성 펩타이드의 역상전이 온도를 조절함으로써, 조절될 수 있다. 예를 들면, 온도감응성 펩타이드를 포함한, 지질 이중층 또는 리포좀의 상전이 온도는 약 10℃ 내지 약 70℃, 예를 들면 약 10℃ 내지 약 60℃, 약 10℃ 내지 약 55℃, 약 10℃ 내지 약 45℃, 약 20℃ 내지 약 60℃, 약 20℃ 내지 약 55℃, 약 30℃ 내지 약 55℃, 약 30℃ 내지 약 45℃, 약 35℃ 내지 약 45℃, 약 38 내지 약 45℃, 약 39℃ 내지 약 45℃, 약 38℃ 내지 약 42℃, 또는 약 39℃ 내지 약 42℃일수 있다.
일 예에 따른 온도감응성 펩타이드를 포함하는 리포좀은 온도감응성 펩타이드를 포함하지 않고 지질 이중층만을 포함하는 리포좀에 비하여, 리포좀에 포함된 활성 성분을 효율적으로 방출하는데 사용될 수 있다. 이는 단순히 지질 이중층의 지질 분자의 상전이를 이용하는 경우에는 리포좀에 포함된 활성 성분의 리포좀 외부로의 방출은 지질 분자의 확산(상전이에 의한 분해)에 의하여 유도되는 반면, 온도감응성 펩타이드를 포함하는 리포좀의 경우, 지질 분자의 확산에 의하여 유도되는 것에 더하여, 온도감응성 펩타이드의 역상전이 거동, 즉 수축 및 조립 (assembly)에 의한 지질 이중층 파괴에 의하여 추가적으로 활성성분의 방출이 유도되기 때문일 수 있다. 여기서, 상기 활성 성분은 리포좀의 내부 공간 또는 지질 이중층의 내부에 포함된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 아미노산 서열에 의하여 정의될 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 일부분 또는 전체가 VPGXG (서열번호 1), PGXGV (서열번호 2), GXGVP (서열번호 3), XGVPG (서열번호 4), GVPGX (서열번호 5) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위를 1개 이상 포함하고, 여기서 V는 발린, P는 프롤린, G는 글리신, X는 프롤린이 아닌 아미노산(알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글라이신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 또는 라이신)으로, 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 여기서, 각 반복 단위의 X는 동일하거나 다른 아미노산일 수 있다. 예컨대, 각 반복 단위의 X는 각각 독립적으로 발린 또는 알라닌일 수 있다.
상기 반복 단위는 엘라스틴-유사 폴리펩타이드의 상전이 특성을 유지하면서 하나 이상의 아미노산 또는 다른 링커 모이어티에 의하여 서로 분리되거나, 말단이 부분이 상기 하나 이상의 아미노산 또는 다른 링커 모이어티로 될 수 있다. 예컨대, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드에 포함된 상기 서열번호 1 내지 5의 반복단위 중 하나 이상에서 X로서 아민을 측쇄로 갖는 아미노산, 예컨대, 라이신, 아르기닌 등의 아미노산을 가질 수 있다. 이 경우 상기 치환된 아민기를 측쇄로 갖는 아미노산의 말단의 아민기에 지질 또는 지질과 같이 리포좀 멤브레인에 끼어들어갈 수 있는 링커가 결합되어 있을 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 X는 발린, 알라닌 또는 측쇄에 아민기를 갖는 아미노산, 예컨대, 라이신 또는 아르기닌일 수 있다.
상기 반복 단위 대 측쇄에 아민기를 갖는 아미노산 또는 링커 모이어티의 비율은 상기 반복 단위와 측쇄에 아민기를 갖는 아미노산을 기준으로 약 0.1% 내지 약 99.9%의 상기 반복 단위로 된 것일 수 있다. 상기 선택된 반복 단위는 2 이상 반복, 예를 들면 2 내지 200회 반복되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 또는 이들의 조합이 1회 이상 직렬 반복된 블록 (tandemly-repeated blocks)이거나 또는 VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 또는 이들의 조합이 1회 이상 직렬 반복된 블록을 포함하는 것일 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 역상전이 거동 현상이 유지되는 한, VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 또는 이들의 조합만으로 구성된 것뿐만 아니라, 분자 내부에 그외의 다른 부분 (portion), 예를 들면, 앞서 설명한 링커 및/또는 차단기를 포함할 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 N 말단 또는 C 말단이 소수성기를 포함하는 모이어티와 결합되어 있는 것일 수 있다. 또한, 소수성기를 포함하는 모이어티는 엘라스틴-유사 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 반응성기 또는 말단과의 결합에 의하여 접합될 수 있다. 상기 측쇄 중의 반응성기는 아미노기, 히드록실기, 티올기 또는 카르복실기일 수 있다.
엘라스틴-유사 폴리펩타이드에서 소수성기를 포함하는 모이어티와 결합되어 있지 않은 반대편 말단은 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 예를 들면, 소수성기를 포함하는 모이어티와 엘라스틴-유사 폴리펩타이드가 엘라스틴-유사 폴리펩타이드의 N 말단을 통하여 결합된 경우, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드의 C 말단의 카르복실기는 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 상기 차단은 생체적합하거나, 면역원성이 없거나, 특이적 전달에 도움을 주거나, 생체 분해 시스템으로부터 회피될 수 있는 물질과 결합 또는 반응되어 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드의 C 말단의 카르복실기와 아미노기와의 결합에 의하여 아미드 결합을 형성함으로써 이루어질 수 있다. 상기 아미노기는 암모니아 분자, 일차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민일 수 있다. 상기 일차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민은 각각 C1-C10, 예를 C1-C6의 탄소수를 갖는 것일 수 있다.
상기 반복 단위는 서로 독립적으로 1 이상의 정수회 반복되어 포함될 수 있다. 상기 반복회수는 서로 독립적으로 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 10, 1 내지 12, 1 내지 8, 1 내지 6, 2 내지 200, 2 내지 100, 2 내지 80, 2 내지 60, 2 내지 40, 2 내지 10, 2 내지 12, 2 내지 8, 2 내지 6, 4 내지 100, 8 내지 80, 10 내지 60, 12 내지 40, 20 내지 40, 4 내지 10, 4 내지 8, 또는 4 내지 6의 정수인 것일 수 있다.
예컨대, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 팔미토일-(VPGXG)n 또는 스테아로일-(VPGXG)n (n은 1 내지 12의 정수, 예컨대 2 내지 12의 정수 또는 2 내지 6의 정수)일 수 있다.
한편, 류신 지퍼(Leucin zipper)는 7개의 아미노산 heptad repeat (abcdefg로 표현)로 구성되어 있으며, a와 d 위치에 소수성 아미노산이 위치하고, 보통 d 위치에 류신이 위치한다. 류신 지퍼는 상전이온도(Transition temperature)에서 α-helix conformation 으로 변하고 이때 a와 d 는 helix 구조의 한쪽 면에 위치하면서 coiled-coil 구조를 형성한다. 상전이 온도 이상에서는 coiled-coil 구조가 dissociation 되고 disordered peptide 가 된다.
상기 류신 지퍼는 N 말단 또는 C 말단에서 소수성기를 포함하는 모이어티와 결합될 있는 것일 수 있다. 또한, 소수성기를 포함하는 모이어티는 류신 지퍼의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 반응성기 또는 말단과의 결합에 의하여 접합될 수 있다. 상기 측쇄 중의 반응성기는 아미노기, 히드록실기, 티올기 또는 카르복실기일 수 있다. 류신 지퍼에서 소수성기를 포함하는 모이어티와 결합되어 있지 않은 반대편 말단은 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 예를 들면, 소수성기를 포함하는 모이어티와 류신 지퍼의 N 말단을 통하여 결합된 경우, 류신 지퍼의 C 말단의 카르복실기는 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 상기 차단은 생체 적합하거나, 면역원성이 없거나, 특이적 전달에 도움을 주거나, 생체 분해 시스템으로부터 회피될 수 있는 물질과 결합 또는 반응되어 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 류신 지퍼의 C 말단의 카르복실기와 아미노기와의 결합에 의하여 아미드 결합을 형성함으로써 이루어질 수 있다. 상기 아미노기는 암모니아 분자, 일차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민일 수 있다. 상기 일차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민은 각각 C1-C10, 예를 C1-C6의 탄소수를 갖는 것일 수 있다.
상기 류신 지퍼는 반복단위 [XSZLESK](서열번호 6)이 n회 반복된 [XSZLESK]n으로 표현될 수 있으며, 각 반복단위에 있어서, X는 각각 독립적으로 발린(V) 또는 라이신(K)일 수 있고, Z는 각각 독립적으로 세린(S) 또는 라이신(K)일 수 있으며, n은 반복 단위의 반복 회수를 나타내는 것으로 1 이상의 정수일 수 있다. 상기 반복 단위가 2회 이상 반복되는 경우 각각의 반복되는 반복 단위는[XSYLESK]는 각각 동일하거나 상이한 서열을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 반복회수는 서로 독립적으로 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 10, 1 내지 12, 1 내지 8, 1 내지 6, 2 내지 200, 2 내지 100, 2 내지 80, 2 내지 60, 2 내지 40, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 4 내지 100, 8 내지 80, 10 내지 60, 12 내지 40, 20 내지 40, 4 내지 10, 4 내지 8, 또는 4 내지 6의 정수인 것일 수 있다. 구체예에서, 상기 류신 지퍼는, 예를 들면, [VSSLESKVSKLESKKSKLESKVSKLESKVSSLESK](서열번호 7)-NH2 일수 있다.
상기 리포좀에 있어서, 지질 이중층의 주 지질 분자(예컨대, 인지질):소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드 (예컨대, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 또는 류신 지퍼)의 몰비는 선택되는 지질 이중층의 특성 및 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드의 특성에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 주 지질 분자:소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드의 몰비는 50 내지 99.9:0.1 내지 50의 몰비일 수 있다. 예를 들면, 주 지질 분자 (DPPC 또는 DPPC와 DSPC의 혼합물): 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (팔미토일(VPGXG)m 또는 스테아로일(VPGXG)n, n은 각 반복 단위의 반복 회수로서 2 내지 12의 정수) 또는 류신 지퍼(팔미토일[XSZLESK]n 또는 스테아로일 [XSZLESK]n, X는 발린(V) 또는 라이신(K), Y는 세린(S) 또는 라이신(K), n은 반복 회수로서 2 내지 12의 정수)의 몰비는 50 내지 99.9: 0.1 내지 50일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀은 지질 이중층 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 또는 류신 지퍼와 같은 온도감응성 펩타이드를 포함하는 리포좀의 경우, 지질 이중층 중에 지질 이중층의 안정성을 높이기 위하여 도입된 지질 이중층 안정화제가 존재하는 경우, 활성 성분을 효율적으로 방출할 수 있다. 상기 안정화제는 지질 이중층의 상전이온도 이상의 상전이 온도, 예컨대, 지질 이중층의 상전이온도보다 높은 상전이 온도를 갖는 지질일 수 있다. 상기 지질 이중층 안정화제는 스테로이드, 당지질, 스핑코지질 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 상기 지질 이중층 안정화제는 지질 이중층에 삽입 (incorporation)될 수 있는 특성을 가진 스테로이드 계열의 화합물일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 용어 "스테로이드 (steroid)"란 융합된 4개의 시클로알칸 고리의 형태 즉, 왼쪽으로부터 오른쪽으로 A, B 및 C 고리로 명명된 3개의 시클로헥산 고리와 하나의 시클로펜탄 고리 (D 고리)를 포함하는 고난 (gonane) 또는 그로부터 유래된 골격을 포함하는 유기 화합물을 나타낸다. 여기서 "그로부터 유래된 골격"이란 상기 고간 골격에 불포화 결합이 도입된 것을 포함한다. 상기 스테로이드는 4개의 고리에 부착된 관능기 및 고리의 산화 상태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 스테로이드는 상기 고리에 친수성 관능기를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 스테로이드는 상기 고리에 히드록실기를 갖는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 스테로이드는 스테롤일 수 있다. 용어 "스테롤(sterol)"이란 스테로이드의 한 형태로서, 3번 위치에 히드록실기를 갖고 콜레스탄 (cholestane)으로부터 유래된 골격을 갖는 것을 나타낸다. 여기서 "유래된 골격"이란 콜레스탄 골격에 불포화 결합이 도입된 것을 포함한다. 상기 스테로이드는 식물, 동물 및 곰팡이에서 발견되고 있는 스테로이드를 포함한다. 예를 들면, 동물 또는 곰팡이에서와 같이 라노스테롤 또는 식물에서와 같이 시클로아르테놀 (cycloartenol)으로부터 만들어진 것일 수 있다. 상기 스테롤은 콜레스테롤 또는 그의 유도체일 수 있다. 여기서 "유도체 (derivative)"란 콜레스테롤의 유도체로서 지질 이중층에 삽입되는 성질을 유지하고 있는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 상기 안정화제는 콜레스테롤, 시스토스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤, 4,22-스티그마스타디엔-3-온, 스티그마스테롤 아세테이트, 라노스테롤, 시클로아르테놀 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 안정화제, 예를 들면, 콜레스테롤은 지질 이중층을 강화하고 투과도를 낮추는 것을 도울 수 있다. 따라서, 상기 안정화제, 예를 들면 콜레스테롤은 정상적인 체내 온도에서 리포좀이 안정적으로 존재하도록 할 수 있다.
온도감응성 펩타이드를 포함하는 리포좀의 경우, 지질 이중층 안정화제를 사용함으로써 지질 이중층 또는 리포좀의 안정성을 유지하면서도, 활성성분을 효율적으로 방출할 수 있다. 특히, 좁은 온도 범위에서, 예를 들면 약 38℃ 내지 약 45℃, 약 39℃ 내지 약 45℃, 약 38℃ 내지 약 42℃, 또는 약 39℃ 내지 약 42℃의 범위에서 약물을 효율적으로 방출할 수 있다.
상기 구성 성분이 수성 환경에서 소망하는 리포좀을 형성하기 위하여 각 성분 간의 함량비가 적절하게 조절되는 것이 좋다.
예컨대, 지질 이중층(예컨대, 인지질), 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드 (예컨대, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 또는 류신 지퍼), 및 임의로 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체를 포함하는 리포좀 내의 인지질:소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드:친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체의 몰비는 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀이 이중층 안정화제 (예컨대, 콜레스테롤)을 추가로 포함하는 경우, 인지질:소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드:친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체:지질 이중층 안정화제의 몰비는 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 0.1 내지 50, 예를 들면, 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 1 내지 30, 또는 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 1 내지 20, 또는 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 1 내지 15일 수 있으며, 보다 구체적으로, 약 50 내지 60:0.1 내지 1:0 내지 5:8 내지 12 정도일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀은 유니라멜라 소포 (unilamellar vesicle: SUV) 또는 멀티소포성 소포 (multivesicular vesicles)일 수 있다. 상기 온도민감성 리포좀은 직경 50nm 내지 500nm, 예를 들면, 50nm 내지 400nm, 50nm 내지 300nm, 50nm 내지 200nm, 100nm 내지 500nm, 100nm 내지 400nm, 100nm 내지 300nm, 또는 100nm 내지 200nm일 수 있다.
일 구체예는 상기 온도민감성 리포좀은 인지질, 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드, 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체, 및 콜레스테롤을 포함하는 것일 수 있다. 상기 각 성분에 대한 설명은 상기한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 인지질은 DPPC 또는 DPPC와 DSPC의 혼합물일 수 있다. 상기 인지질은 DPPC: DSPC가 1: 0 내지 0.5, 예를 들면, 1: 0.1 내지 0.5의 몰비인 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩타이드의 소수성기를 포함하는 모이어티는 아실기이고, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 (VPGXG)n 또는 (GVPGX)m를 포함하고, X는 프롤린이 아닌 아미노산이고, n 또는 m은 반복 회수로서 1 이상의 정수일 수 있다. X는 발린 또는 알라닌일 수 있다. n은 1 내지 12 또는 2 내지 12의 정수이고, m은 1 내지 12 또는 2 내지 12의 정수일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 스테아로일-(GVPGX)2-6인 것일 수 있다. 스테아로일-(GVPGX)2-6의 카르복실 말단의 카르복실기는 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 상기 차단은 카르복실기와 아미노기 (예, 암모니아)의 결합에 의한 아미드 결합에 의하여 차단되어 있을 수 있다. 상기 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체는 DPPC-PEG, 또는 DSPE-PEG일 수 있다. 상기 PEG는 분자량 180 내지 50,000 Da일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀은 양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 양이온성 지질은, 혈관신생 유도 물질이 음전하를 갖는 경우, 정전기적 상호작용(인력)에 의해 복합체를 형성하여, 혈관신생 유도 물질을 리포좀 내부에 봉입하는데 도움을 줄 있고, 상전이 온도 이상에서 지질 이중층이 분해되는 경우에도 음전하를 갖는 혈관신생 유도 물질에 정전기적 인력을 미쳐서 상기 물질이 급속하게 방출되는 것을 방지할 수 있도록 한다. 즉, 상기 양이온성 지질은 음전하를 갖는 혈관신생 유도 물질을 봉입하는데 도움을 주는 역할 뿐 아니라, 표적 부위(혈관세포)에서 지질 이중층이 분해되어 혈관신생 유도 물질이 방출되는 경우에 급속한 초기 방출을 방지하고, 그 함량을 조절함으로써 방출 속도를 조절할 수 있게 하는 역할을 할 수 있다.
따라서, 상기 양이온성 지질은 음전하를 갖는 물질과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 지질 종류일 수 있다. 예컨대, 상기 양이온성 지질은, 예컨대, 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane; DPTAP), 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane; DOTAP), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드, N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민 (COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤), N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 상기 양이온성 지질은 아르기닌, 히스티딘, 라이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 양이온성 아미노산이 1 내지 10개, 예컨대 1 내지 9개, 3 내지 9개, 또는 3 내지 5개 반복된 펩타이드가 C12 내지 C22, 예컨대, C14 내지 C20 또는 C16 내지 C18의 지방산과 접합된 지질 접합체 형태일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 지질은 DPTAP, DOTAP, 또는 양이온성 펩타이드(예컨대, 아르기닌)가 1 내지 9개 반복된 펩타이드와 C16 내지 C18의 지방산(예컨대 스테아릴산)이 접합된 지질 접합체일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀 양이온성 지질을 포함하는 경우, 지질 이중층 내의 인지질과 양이온성 지질의 합계 100몰 중의 지질 이중층의 인지질:양이온성 지질의 몰비는 85 내지 99:1 내지 15, 구체적으로 90 내지 99:1 내지 10일 수 있다.
상기 혈관세포 특이적 항체는 혈관세포(예컨대, 혈관내피세포)의 세포막에 특이적으로 발현하는 단백질 (예컨대, 수용체)를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 모든 항체일 수 있다. 상기 항체가 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 혈관세포는 혈관을 구성하는 모든 세포일 수 있으며, 예컨대, 혈관내피세포일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 혈관 세포는 혈관 내피세포이고, 상기 세포막에 특이적으로 발현하는 단백질은 CD31, CD144(VE-Cadherin), CD102, CD106, Tie-2 등 일 수 있으며, 상기 단백질은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스, 래빗 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다. 상기 혈관세포에 특이적인 항체는 항 CD31 항체, 항 CD144(VE-Cadherin) 항체, 항 CD102 항체, 항 CD106 항체, 항 Tie-2 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
상기 혈관세포 특이적 항체는 상기 온도민감성 리포좀의 표면에 접합된 것일 수 있다. 상기 혈관세포 특이적 항체의 온도민감성 리포좀의 표면에의 접합은 작용기를 통한 화학적 결합 (예컨대, amide 결합)에 의할 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 리포좀 표면에 노출된 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 통하여 결합된 것일 수 있다. 이와 같이 항체가 폴리에틸렌글리콜을 통하여 리포좀 표면에 결합하여 리포좀 표면을 수식함으로써, 리포좀의 표적화 효율을 보다 증진시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 리포좀 표면에 노출된 친수성 중합체(예컨대, PEG)의 말단과 항체의 중쇄(Fc 부위)의 C-말단에 아민기 (-NH2) 등의 작용기를 각각 독립적으로 도입하고, 상기 친수성 중합체의 말단과 항체의 말단에 각각 독립적으로 티올기, 말레이미드기(maleimide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 도입하고, 이들 작용기간 아미드(amide) 결합 또는 티오에테르(thioether) 결합을 형성시킴으로써, 항체를 리포좀 표면에 접합시킬 수 있다. 일 실시예에 따른 항체를 리포좀 표면에 접합시키는 과정을 도 1에 모식적으로 나타내었다.
상기 혈관신생 유도 물질은 프탈이미드 신생혈관 인자(phthalimide neovascular factor; PNF) (예컨대, PNF1 등) 등의 혈관신생 유도성 소분자(angiogenesis-inducible small molecule; 분자량 약 5,000 Da 이하, 예컨대 약 100 내지 약 5,000 Da), 혈관내피세포성장인자 (VEGF; 예컨대GenBank Accession Number NM_001025366.2, NM_001025367.2, NM_001025368.2, NM_001025369.2, NM_001025370.2, NM_001033756.2, NM_001171622.1, NM_001171623.1, NM_001171624.1, NM_001171625.1, NM_001171626.1, NM_001171627.1, NM_001171628.1, NM_001171629.1, NM_001171630.1, NM_001204384.1, NM_001204385.1, NM_003376.5 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열(mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 PNF1은 다음의 화학식으로 표현된다:
Figure pat00001
상기 온도민감성 리포좀과 혈관세포 특이적 항체 간의 비율은 온도민감성 리포좀의 조성 및 구조, 항체의 종류 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대 질량 기준으로 10 내지 1000:1 (온도민감성 리포좀 질량:항체 질량), 구체적으로 50 내지 500:1, 100 내지 400:1, 또는 200 내지 300:1 정도의 범위에서 적절하게 조절될 수 있다. 또한 상기 온도민감성 리포좀과 혈관신생 유도물질 간의 비율은 온도민감성 리포좀의 조성 및 구조, 혈관신생 유도물질의 종류 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대 온도민감성 리포좀 내의 인지질 함량을 기준으로 질량비로 1 내지 50:1 (온도민감성 리포좀 내의 인지질 질량:혈관신생 유도물질 질량), 구체적으로, 1 내지 20:1 또는 5 내지 15:1 정도의 범위에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀은 약 10℃ 내지 약 70℃의 상전이 온도, 예를 들면, 10℃ 내지 60℃, 10℃ 내지 55℃, 10℃ 내지 45℃, 20℃ 내지 60℃, 20℃ 내지 55℃, 20℃ 내지 45℃, 30℃ 내지 60℃, 30℃ 내지 55℃, 30℃ 내지 45℃, 35℃ 내지 45℃, 38℃ 내지 45℃, 38℃ 내지 42℃, 39℃ 내지 45℃, 또는 39℃ 내지 42℃의 상전이 온도 갖는 것일 수 있다. 상전이 온도는 지질 이중층을 이루는 지질 분자의 탄소 사슬 길이, 불포화 결합의 수, 2개 이상의 지질 분자의 혼합 및 이들의 조합에 의하여 조절될 수 있다. 예를 들면, 상전이 온도가 낮은 DPPC에 DPPC 보다 높은 DSPC를 혼합하는 경우, DPPC와 DSPC의 혼합물로 구성된 리포좀은 DPPC만으로 구성된 리포좀 보다 상전이 온도가 높아질 수 있다. 상기 온도민감성 리포좀은 실온에서 젤상인 것일 수 있다.
상기 온도민감성 리포좀은 표면에 접합된 혈관세포 특이적 항체를 통하여 혈관세포에 특이적으로 결합하고, 온도가 리포좀의 지질 이중층의 상전이 온도 이상으로 올라가면 지질 이중층의 분해가 일어나 내부에 봉입되어 있던 혈관신생 유도 물질이 방출되어 리포좀이 결합되어 있던 혈관 세포에 특이적으로 작용할 수 있다. 이와 같은 혈관 세포 특이적 혈관 신생 유도 물질 방출에 의하여, 혈관 신생이 보다 효과적으로 일어날 수 있다. 도 2는 일 구체예에 따른 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물에서의 온도 증가에 따른 온도민감성 리포좀의 분해 및 이를 통한 혈관신생 유도 물질의 방출 기작을 모식적으로 보여준다.
따라서, 상기 온도민감성 리포좀, 혈관세포 특이적 항체, 및 혈관신생 유도 물질을 포함하는 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 혈관세포 및 조직세포를 포함하는 세포 혼합물과 함께 배양하면, 혈관신생 유도 물질이 혈관세포에 선택적으로 일시에 높은 농도로 작용할 수 있으므로, 혈관이 성공적으로 생성된 목적 조직 배양물을 얻을 수 있다.
따라서, 또 다른 예는 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 및 혈관세포와 조직 세포를 포함하는 세포 혼합물을 함께 배양하여 얻어지는 조직 배양물을 제공한다.
상기 세포 혼합물에 포함된 혈관세포는 혈관을 이루는 모든 세포를 의미하는 것으로, 예컨대, 혈관내피세포, 평활근세포(smooth muscle cell), 골수 전구세포(common myeloid progenitor) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포, 또는 상기 1종 이상의 세포로 분화 가능한 세포 (예컨대, 만능배아줄기세포, 배아줄기세포 등의 줄기세포)일 수 있다. 상기 조직 세포는 목적하는 조직, 즉 세포 배양을 통하여 얻고자 하는 조직의 세포, 또는 상기 조직으로 분화 가능한 세포 (예컨대, 만능배아줄기세포, 배아줄기세포 등의 줄기세포)일 수 있다. 예컨대, 상기 조직 세포는 목적 조직의 이식이 필요한 환자로부터 유래하는 세포일 수 있다. 예컨대, 상기 조직은 내부혈관이 형성된 (pre-vascularization) 심근, 골, 근육, 피부 조직 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명에 따라 배양된 조직 배양물은 내부혈관이 형성된 (pre-vascularization) 심근, 골, 근육, 피부 조직 등으로 이루어진 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
혈관세포가 보다 성공적으로 형성된 조직 배양물을 얻기 위하여, 배지 내의 상기 혈관 신생 유도 물질 전달용 조성물의 농도는 상기 조성물에 포함된 혈관신생 유도물질, 예컨대 PNF1의 농도를 기준으로, 1 내지 100uM(micromole), 구체적으로 10 내지 50uM로 하고, 상기 혈관 세포와 조직 세포를 포함하는 세포 혼합물 내의 혈과 세포의 농도는 세포 개수 기준으로 1 내지 30%, 2 내지 20%, 또는 5 내지 15%일 수 있다.
일 예에서, 상기 예컨대, 혈관 세포와 조직 세포를 포함하는 세포 혼합물로서 만능배아줄기세포를 사용할 수 있다. 이 경우 초기 접종 농도는 1x105 cells/ml 내지 1x109 cells/ml, 또는 1x106 cells/ml 내지 1x108 cells/ml, 예컨대, 약 107cells/ml 정도로 할 수 있다. 상기 만능배아줄기세포를 배상체 배양을 통하여 원하는 조직 세포 (예컨대, 심근조직, 골조직, 근육조직, 피부조직 등)로 분화하도록 할 수 있으며, 이 때 자연적으로 발생하는 혈관 세포의 증식을 선택적으로 자극하여 혈관 세포의 양이 상기한 범위 (세포 개수 기준으로 1 내지 30%, 2 내지 20%, 또는 5 내지 15%)가 되도록 조절할 수 있다.
상기 세포 배양은 혈관 세포 및 조직 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 배지 및 배양 조건에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 혈관 세포 배양에 사용되는 배지는 Endothelial cell growth medium 을 근간으로 하는 EGM-2 bullet kit (Lonza) 을 사용할 수 있고, 배양 온도는 약 37℃로 할 수 있으며, 배양 시간은 배양되는 세포의 growth kinetics에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 상기 배양 조건들은 배양되는 세포 종류 및 목적하는 조직의 종류에 따라서 적절하게 선택될 수 있다.
상기 배양시에 온도를 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물에 포함된 온도민감성 리포좀의 상전이온도 이상으로 올리면, 상기 온도민감성 리포좀이 분해되면서, 내부에 봉입되어 있던 혈관신생 유도 물질이 혈관세포에 선택적으로 일시에 높은 농도로 작용하여, 조직 배양물 내부에 높은 효율로 혈관을 형성시킬 수 있다. 도 3 및 도 4는 이와 같은 혈관 세포 특이적인 혈관신생 유도 물질 방출 및 작용 기작을 각각 2차원 구조 및 3차원 구조에서 각각 예시적으로 보여준다.
상기 얻어진 조직 배양물은 2차원 구조 또는 3차원 입체 구조를 갖는 구조체일 수 있다. 예컨대, 배양된 조직 세포가 배아줄기세포(Embryonic stem cells)인 경우, 상기 조직 배양물은 배상체(embryoid body)라고 하는 구상 3차원 입체구조 조직(spheroid-like 3D tissue)을 형성할 수 있다. 상기 조직 배양물은 100 마이크로미터 이상의 두께를 갖는 경우라도 내부에 혈관이 성공적으로 형성된 것일 수 있다. 상기 조직 배양물은 내부에 성공적으로 형성된 혈관을 통하여 필요한 산소와 영양분을 공급 받고 노폐물을 배출함으로써, 세포의 괴사를 막을 수 있다.
도 5은 일 구체예에 따른 세포 배양물 및 여기서 일어나는 생명 유지 활동을 모식적으로 보여준다.
상기 얻어진 조직 배양물은 생체 조직과 유사하게 혈관이 생성되어 있는 완전한 조직 또는 완전한 조직의 일부의 형태를 갖는 것일 수 있다.
따라서, 다른 예는 상기 조직 배양물을 포함하는 인공 조직을 제공한다. 상기 인공 조직은 생체 이식을 위한 것일 수 있다. 상기 인공 조직은 2차원 또는 3차원 구조를 갖는 것일 수 있으며, 완전한 조직 또는 완전한 조직의 일부의 형태를 갖는 것일 수 있다. 상기 인공 조직은 생체 조직과 유사하게 혈관이 생성되어 있으므로, 생체에 이식시 부작용을 줄이고 이식 성공률을 높일 수 있다.
다른 예는 상기 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물 및 혈관세포와 조직세포를 포함하는 세포 혼합물을 함께 배양하는 단계 (배양 단계), 및 열처리하는 단계 (열처리 단계)를 포함하는, 혈관이 형성된 인공 조직의 제조 방법을 제공한다.
상기한 바와 같이, 상기 배양 단계는 배지 1mL 당 상기 혈관 신생 유도 물질 전달용 조성물의 농도는 상기 조성물에 포함된 혈관신생 유도물질, 예컨대 PNF1의 농도를 기준으로, 1 내지 100uM(micromole), 구체적으로 10 내지 50uM로 하고, 상기 혈관 세포와 조직 세포를 포함하는 세포 혼합물 내의 혈과 세포의 농도를 세포 개수 기준으로 1 내지 30%, 2 내지 20%, 또는 5 내지 15% 정도로 하여, 35 내지 38℃에서 수행될 수 있으며, 그 외 조건은 일반적인 조직 형성 실험 조건을 참조하여 적절히 조절할 수 있다. 상기 배양은 2차원 배양 용기에서 진행되는 2차원 세포 배양 또는 3차원 배양 용기(예컨대, 적절한 스캐폴드)에서 진행되는 3차원 세포 배양일 수 있다.
상기 열처리 단계는 온도를 앞서 설명한 리포좀의 상전이 온도 이상으로 유지하는 것을 의미하며, 예컨대 약 39℃ 내지 약 70℃, 약 39℃ 내지 약 60℃, 약 39℃ 내지 약 55℃, 약 39℃ 내지 약 45℃, 또는 약 39℃ 내지 약 42℃ 정도로 유지하는 것일 수 있다. 상기 열처리 단계는 상기 배양 단계와 동시에 또는 상기 배양 개시 후 약 10분 내지 약 300분, 약 60분 내지 약 200분, 약 90분 내지 약 150분, 또는 약 110분 약 130분 이후에 수행할 수 있으며, 약 1분 내지 약 120분, 약 2분 내지 약 60분, 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 7분 내지 약 15분 동안 수행할 수 있다. 상기 열처리는 초음파, 예를 들면, 고강도 집중된 초음파 (high intensity focused ultrasound), 또는 자기장, 예를 들면, 증폭된 자기장 (amplified magnetic field: AMF), 초단파 (microwave) 및/또는 고주파 (rafiofrequency)를 가하는 것 등에 의하여 이루어질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 혈관세포 및 조직 세포를 포함하는 세포 혼합물을 2차원 배양용기에 혼합 배양 및 열처리하고, 혈관 세포의 증식 및 분화가 선택적으로 증가된 것을 확인하고, 3차원적으로 고밀도 조직배양함으로써, 조직 내의 3차원 혈관형성을 유도/촉진시킨 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 세포 혼합물은 상기 혈관세포 및 조직 세포 이외에 다양한 조직으로 분화 가능한 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법을 통하여, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물에 포함된 항체가 세포 혼합물 중 혈관세포에만 특이적으로 결합하고, 열처리에 의하여 온도민감성 리포좀이 분해되면서 리포좀 내부에 봉입된 혈관신생 유도 물질이 혈관 세포에 특이적으로 고농도로 작용함으로써, 혈관이 성공적으로 생성된 2차원 또는 3차원 구조의 인공 조직을 얻을 수 있다.
본 발명은 조직공학분야에서 3차원 세포기반 조직을 제조하는 데에 있어 근본적인 문제가 되어왔던, 조직 내로의 영양 및 산소 전달 부족과 그로 인한 조직 내 세포 괴사의 문제를 해결하여, 이식 가능한 기능성 세포기반 인공 조직 제조에 기여한다. 본 발명에서 제안되는 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물 및 혈관이 형성된 인공 조직의 제조 방법은 혈관생성인자를 혈관에 특이적인 항체의 작용에 의하여 혈관 특이적으로 전달할 수 있다 (spatially controlled delivery).
도 1은 일 실시예에 따른 온도민감성 리포좀에 항체를 접합시키는 과정을음이 모식적으로 보여준다.
도 2는 일 실시예에 따른 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물의 온도 변화에 따른 봉입된 혈관신생 유도 물질의 방출 거동을 모식적으로 보여준다.
도 3은 일 실시예에 따른 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 이용한 2차원 세포 배양에서 혈관세포가 선택적으로 증식 및 분화하는 과정을 모식적으로 보여준다.
도 4는 일 실시예에 따른 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물을 이용한 3차원 세포 배양에서 혈관세포가 선택적으로 증식 및 분화하는 과정을 모식적으로 보여준다.
도 5는 일 실시예에 따라 제조된 혈관이 형성된 세포 배양물 또는 이를 포함하는 3차원적 인공 조직의 모습을 모식적으로 보여준다.
도 6 내지 8은 일 실시예에 따른immuno-liposome(항체 접합 리포좀)을 이용한 FACS 분석 결과를 나타낸 것으로, 도 6은 immuno-liposome을 처리하지 않은 대조군에서의 결과, 도 7은 CD31 양성 세포인 HUVEC 세포에서의 결과, 도 8은 CD31 음성 세포인 MCF-7 세포에서의 결과를 보여준다.
도 9는 일 실시예에 따른 immuno-liposome을 처리한 HUVEC 세포 및 MCF-7 세포를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 온도민감성 리포좀의 제조
스테아로일-VPGVG VPGVG VPGVG-NH2 (이하 "SA-V3-NH2"라고도 한다), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (암모늄 염) [1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)] (DSPE-PEG-PDP), 및 콜레스테롤을 0.55:18.3:36.7:2:10 몰비로 사용하여 유니라멜라 소포 형태 (unilamellar vesicle)의 리포좀을 제조하였다.
구체적으로, SA-V3-NH2을 메탄올에 1mg/mL의 농도로 용해시키고, DSPC, DPPC, DSPE-PEG-PDP 및 콜레스테롤은 클로로포름에 10mg/mL의 농도로 용해시켰다. 상기 메탄올 용액과 클로로포름 용액을 둥근 바닥 플라스크에서 혼합한 후 회전 증발기 (rotary evaporater)를 사용하여 상온에서 용매를 증발시켜 상기 용기의 내벽 상에 지질 박막을 형성시켰다.
상기 지질 박막이 형성된 용기에 생리 식염수(pH 7.3-7.6)를 인지질 농도가 10mg/mL이 되도록 하는 양으로 상온에서 첨가하여 수화시켰다. 상기 얻어진 수화된 용액을 상온에서 공극 크기 100nm의 폴리카르보네이트 막을 통과시켜 유니라멜라 소포 형태의 리포좀을 제조하였다.
실시예 2: 항체 접합 및 혈관신생 유도 물질의 봉입
상기 실시예 1에서 제작된 리포좀의 표면에 항-CD31 항체(ab9498, Abcam)를 접합시키고, 내부에 PNF1(phthalimide neovascular factor 1; Tissue engineering, 12, 1903, 2006)를 봉입시켰다.
상기 항체의 접합 과정은 도 1에 도시한 과정에 의하여 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 리포좀을 25mM 디티오트레톨 (Dithiothretol; DTT) 0.2 mL로 30분간 처리한 후, 탈염 컬럼(desalting column; GE healthcare)을 투과시켜 정제함으로써, 리포좀 표면에 -SH기가 생성되도록 하였다. 항-CD31 항체(ab9498, Abcam) 0.075mg을 PBS 1mL에 녹이고, DMF에 녹인 25mM SMPB(4-(4-Maleimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester)와 1:20 (항체:SMPB)의 몰비로 상온에서 30분간 반응시켜, SMPB가 conjugation된 항-CD31 항체를 제작하였다. 상기 제작된 SMPB가 conjugation된 항-CD31 항체를 탈염 컬럼(desalting column)을 투과시켜 정제하였다. 표면에 ?H기가 도입된 리포좀과 SMPB가 접합된 항-CD31 항체를 질량비 250:1 (리포좀 질량:항체 질량)로 상온에서 12시간동안 반응시켜, 표면에 항체가 접합된 리포좀을 제작하였다.
PNF1는 상기 실시예 1의 리포좀 제작과정에서 메탄올에 1mg/mL의 농도로 녹여, 상기 준비된 메탄올 용액 및 클로로포름 용액과 함께 증발(evaporation)시켜, 리포좀에 봉입하였다. 이 때 인지질:PNF1의 질량비를 10:1로 하였다.
그 결과, 온도민감성 리포좀 표면에 항 CD31 항체가 접합되고 내부에 PNF1이 봉입된 온도민감성 리포좀 복합체를 제조하였다.
실시예 3: 혈관세포 표적화 시험
상기 항 CD31 항체가 접합된 온도민감성 리포좀의 항체 친화도를 측정하여 표적화 능력을 시험하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에 기재된 방법을 참조하여, 온도민감성 리포좀에 항 CD31 항체(ab9498, Abcam)를 접합시키고, PNF1 대신에 형광물질(DPPE-cy5.5)을 전체 리포좀 중량 대비 1중량%의 양으로 멤브레인에 봉입시켜 형광물질 봉입된 immuno-liposome을 제조하였다. 　
상기 제조된 형광물질 봉입된 immuno-liposome을 30ug/ml의 농도로 세포배양액 2ml에 섞어서, HUVEC 세포 (endothelial cell: CD31 positive cell; ATCC) 약 3x105개와 MCF-7 세포 (epithelial cell: CD31 negative cell; ATCC) 약 3x105개에 각각 처리한 후, FACS와 공초점 현미경을 이용하여 항체의 친화도를 확인하였다. 보다 구체적으로 위와 같이 항체가 접합된 리포좀을 각 세포에 결합 시킨 후 세포에 결합되지 않은 잉여 리포좀을 세척하고 0.05%(w/v) 트립신을 이용하여 single cell suspension을 만든 후, cy5.5에 맞는 레이저를 이용하여 형광을 측정하여 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) 분석을 수행하였다.
상기 FACS 분석 결과를 도 6 내지 8에 나타내었다. 도 6은 immuno-liposome을 처리하지 않은 대조군에서의 결과, 도 7은 CD31 양성 세포인 HUVEC 세포에서의 결과, 도 8은 CD31 음성 세포인 MCF-7 세포에서의 결과를 보여준다. 도 6 내지 8에서 알 수 있는 바와 같이, CD31 음성인　MCF-7 보다 CD31 양성인 HUVEC 세포에 더 많은 immuno-liposome이 결합되어 있는 것으로 확인되었다.
상기 공초점 현미경 분석 결과를 도 9에 나타내었다 (size bars: 40 um). 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, CD31 음성 세포인　MCF-7에서는 immuno-liposome이 거의 검출되지 않은 것에 반하여, CD31 양성 세포인　HUVEC에서는 immuno-liposome이 다량 결합된 것이 확인되었다. 이러한 결과는 상기 FACS 분석에서와 같은 결과이다. 특히, immuno-liposome은 주로 HUVEC 세포의 세포막 경계부위에서 확인 되었다. 이는 immuno-liposome의 표적 친화도가 항 CD31 항체의 세포막 특이적 결합에 의한 것임을 보여준다.
실시예 4: 인공 조직의 제조
상기 실시예 2에서 제조된 온도민감성 리포좀 복합체를 이용하여 혈관세포와 줄기세포로부터 유도된 다른 종류의 세포들이 혼합된 세포 혼합물을 배양하여 인공 조직을 제조하였다.
구체적으로, E14Tg2a (murine embryonic stem cell line, ATCC)를 0.1%(w/v) 젤라틴 (Sigma) 코팅된 조직 배양 플라스크(gelatin coated tissue culture flasks)에서 high glucose Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; Invitrogen) (supplemented with 10%(v/v) ESC qualified-fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen), 100 U/mL 페니실린, 100 ug(microgram)/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen), 1 mM L-글루타민 (Invitrogen), 0.1 uM(micromole) 베타-머캅토에탄올 (Sigma), 및 1,000 U/mL 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor; LIF; Chemicon))를 이용하여 배양하였다. 상기 배양은 일반적으로 embryonic stem cell을 조직 형성 실험을 하기 위한 세포수를 확보할 때까지 pluripotency (stemness)를 유지하면서 expansion하는 방법에 따라서 수행하였다. 구체적으로, 상기 세포 배양 플라스크 75cm2 에 상기 E14Tg2a 세포를 100,000 개정도 시딩하여 37℃ 및 CO2 5%의 인큐베이터에서 2-3일 정도 배양하여 세포가 70% 정도 confluent 해지면, 다시 동일한 세포 농도로 새로운 세포 배양 플라스크로 옮겨서 expansion 시켰다.
한편, 줄기세포로부터 분화한 혈관세포를 포함한 세포 혼합물을 배상체(embryoid body) 배양으로부터 얻었다. 구체적으로, 배상체(embryoid body)는 bacterial grade non-tissue culture treated petri-dish 에 embryonic stem cell(CRL-1821, ATCC)을 single cell suspension 배양하여 spontaneous 조직 형성을 유도하였다. 구체적으로, 상기 세포 배양 방법을 참조하여 세포 배양 플라스크 75cm2 에 상기 embryonic stem cell(CRL-1821, ATCC)을 100,000 개정도 시딩하여 37℃ 및 CO2 5%의 인큐베이터에서 2-3일 정도 배양하여 세포가 70% 정도의 confluency를 보일 때 trypsinization (0.05% Trypsin, Invitrogen) 후 pipetting을 통해 single cell suspension을 만든 후, bacterial grade petri-dish에 상기 suspension을 뿌려주어 자발적으로 배상체를 형성시켰다. 상기 얻어진 배상체는 alpha Minimal Essential Medium (MEM; Invitrogen) (15% heat-inactivated FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 ug/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen) 함유)을 이용하여 매일 배지 교환해주면서 배양하였다.
상기와 같이 배상체를 현탁 (suspension) 배양한 후 5일째(혈관생성)에 상기 배양액에 상기 실시예 2에서 제작된 표면에 항 CD31 항체가 접합되고 내부에 혈관분화자극약물 (PNF1)이 봉입된 온도민감성 리포좀 복합체를 첨가하였다. 상기 온도민감성 리포좀 복합체의 첨가량은 PNF1이 10-50uM의 농도로 각 배양 용기내에 전달 될 수 있도록 하는 양으로 조절하였다.
온도민감성 리포좀 복합체 처리 후 약 2시간 동안 CO2 인큐베이터에서 incubation을 한 이 후에 washing을 하여 혈관에 항체 특이적으로 결합된(antibody-specifically binding) 리포좀만을 남기고, 약 10분간 39℃ 정도로 열처리를 하였다. 이와 같은 열처리에 의하여 온도민감성 리포좀이 분해되어 온도민감성 리포좀에 봉입되어 있던 PNF1이 방출되며, 상기 온도민감성 리포좀은 표면에 결합된 항체가 혈관에 특이적으로 결합되어 있으므로, 상기 PNF1은 혈관에서 특이적으로 방출되게 된다.
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Composition for delivery of angiogenesis inducing molecule and artificial tissue prepared by the composition <130> DPP20127511KR <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unit of elastin-like polypetide, wherein Xaa is an amino acid except proline <400> 1 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unit of elastin-like polypetide, wherein Xaa is an amino acid except proline <400> 2 Pro Gly Xaa Gly Val 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unit of elastin-like polypetide, wherein Xaa is an amino acid except proline <400> 3 Gly Xaa Gly Val Pro 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unit of elastin-like polypetide, wherein Xaa is an amino acid except proline <400> 4 Xaa Gly Val Pro Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unit of elastin-like polypetide, wherein Xaa is an amino acid except proline <400> 5 Gly Val Pro Gly Xaa 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unit of Leucin zipper, wherein Xaa at 1st position is Val or Lys and Xaa at 3rd position is Ser or Lys <400> 6 Xaa Ser Xaa Leu Glu Ser Lys 1 5 <210> 7 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leucin zipper <400> 7 Val Ser Ser Leu Glu Ser Lys Val Ser Lys Leu Glu Ser Lys Lys Ser 1 5 10 15 Lys Leu Glu Ser Lys Val Ser Lys Leu Glu Ser Lys Val Ser Ser Leu 20 25 30 Glu Ser Lys 35

Claims (21)

  1. 온도민감성 리포좀, 혈관세포 특이적 항체, 및 혈관신생 유도 물질을 포함하고, 상기 혈관세포 특이적 항체는 상기 온도민감성 리포좀의 표면에 접합되어 있고, 상기 혈관신생 유도물질은 상기 온도민감성 리포좀의 내부에 봉입되어 있는, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 온도민감성 리포좀은 지질 이중층, 및 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 온도감응성 펩타이드를 포함하는 것인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 온도민감성 리포좀은 지질 이중층 안정화제를 추가로 포함하고, 상기 지질 이중층 안정화제는 스테로이드, 당지질, 및 스핑코지질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 지질 이중층에 삽입된 것인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 지질 이중층 안정화제는 콜레스테롤, 시스토스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤, 4,22-스티그마스타디엔-3-온, 스티그마스테롤 아세테이트, 라노스테롤, 및 시클로아르테놀로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 온도 감응성 펩타이드는 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (elastin-like polypeptide; ELP) 및 류신 지퍼 (Leucine zipper)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 엘라스틴-유사 폴리펩타이드는 VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 반복 단위가 1 내지 200회 반복된 것이고, V는 발린이고, P는 프롤린이며, G는 글리신이고, 각 반복단위의 X는 각각 독립적으로 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글라이신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 및 라이신로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 류신 지퍼는 반복단위 [XSZLESK]이 n회 반복된 [XSZLESK]n으로 표현되며, 각 반복단위에 있어서, X는 각각 독립적으로 발린 또는 라이신이고, Z는 각각 독립적으로 세린 또는 라이신이고, n은 1 내지 200의 정수인,
    혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 인지질, 스테롤, 스핑고지질, C4-C30의 포화 또는 불포화 탄화수소, C4-C30의 포화 또는 불포화 아실 분자, 또는 포화 또는 C4-C30의 불포화 알콕시 분자인, 리포좀.
  9. 제2항에 있어서, 상기 지질 이중층은 C12-C22의 탄소원자를 포함하는 인지질을 포함하는 것인 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 및 포스파티딜 에탄올아민으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  11. 제2항에 있어서, 상기 지질 이중층은 친수성 중합체로 유도체화된 인지질을 추가로 포함하는 것인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 올리고사카라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 온도민감성 리포좀은 38℃ 내지 45℃의 상전이 온도를 갖는 것인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 혈관세포 특이적 항체는 CD31, CD144(VE-Cadherin), CD102, CD106, 또는 Tie-2에 결합하는 항체인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 혈관신생 유도 물질은 분자량 100 내지 5,000 Da의 혈관신생 유도성 소분자 및 혈관내피세포성장인자 (VEGF)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 혈관신생 유도성 소분자는 물질은 프탈이미드 신생혈관 인자(phthalimide neovascular factor; PNF)인, 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물, 및 혈관세포와 조직 세포를 포함하는 세포 혼합물을 함께 배양하여 얻어지는 조직 배양물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 혈관세포는 혈관내피세포, 평활근세포(smooth muscle cell), 및 골수 전구세포(common myeloid progenitor)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포, 또는 상기 1종 이상의 세포로 분화 가능한 줄기세포인, 조직 배양물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 조직세포는 목적하는 조직의 세포 또는 상기 조직으로 분화 가능한 줄기세포인, 조직 배양물.
  20. 제17항의 조직 배양물을 포함하는 인공 조직.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 혈관신생 유도 물질 전달용 조성물 및 혈관세포와 조직세포를 포함하는 세포 혼합물을 함께 배양하는 단계, 및 38℃ 내지 45℃로 열처리하는 단계를 포함하는, 혈관이 형성된 인공 조직의 제조 방법.
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