KR20140119174A - 지연성 골절 치유를 예측하기 위한 마커로서 cd8+ t 세포의 서브세트 - Google Patents

지연성 골절 치유를 예측하기 위한 마커로서 cd8+ t 세포의 서브세트 Download PDF

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스벤 가이슬러
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샤리떼 우니베지테츠메디친 베를린
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Abstract

본 발명은, 개체로부터 수득한 샘플에서, CD8+CD57+, CD8+CD28- 및 CD8+CD28/CD57+로 구성된 제1 군으로부터 선택되는 CD8+ 세포의 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 포함하는, 지연성 골절 치유의 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 지연성 골절 치유를 예측하기 위한 시스템 및 키트, 및 지연성 골절 치유를 예방하기 위한 결과 옵션에 관한 것이다.

Description

지연성 골절 치유를 예측하기 위한 마커로서 CD8+ T 세포의 서브세트 {CD8+ T-CELL SUBSETS AS MARKERS FOR PREDICTION OF DELAYED FRACTURE HEALING}
본 발명은 지연성 골절 치유를 예방 및 예측하기 위한 방법, 시스템 및 키트에 관한 것이다.
골절 치유는 순차적이고, 중첩되는 단계들로 구성된 생리적인 프로세스로, 골 조직을 회복시키는 것이다. 그러나, 심각한 골절, 노령, 스테로이드 치료 또는 당뇨병과 같은 일부 위험 요인들에서는, 이러한 프로세스가 지연되거나 심지어 불완전 (비-유합성 치유)하여, 장기적인 성과가 불량하며, 사회 경제적인 충격이 큰 편이다. 지연 치유 또는 불완전 치유는 장골이 골절된 환자들 중 대략 5-10%에서 관찰할 수 있다.
치유 불량의 기저 메카니즘에 대해서는 한정된 정보만 이용가능하다. 상해에 따른 골 회복 프로세스에 염증과 T-세포 반응이 주요한 역할을 한다는 것을 시사해주는 증거들이 축적되고 있는데, T-세포 반응은 주화성, 즉, 결과적으로 혈관신생을 자극하게 되는 다른 면역 세포와 간엽 세포의 동원과 같은 프로세스에 영향을 미치게 되며, 궁극적으로 세포외 기질 합성을 강화한다 (Schmidt-Bleek et al., J Orthop Res.; 27(9):1147-51; Kolar et al., Tissue Eng Part B Rev.; 16(4):427-34; Toben et al. J Bone Miner Res., Jan;26(1):113-24).
최근 데이타에 따르면, 후천적으로 면역성이 결핍된 마우스가 대조군에 비해 무기물화 (mineralisation)에 대한 효율이 낮음에도 불구하고, 강화된 골 치유를 나타낸다 (Colburn et al. Arthritis Rheum.; 60(6):1694-703; Schmidt-Bleek et al. Cell Tissue Res; DOI 10.1007/s00441-011-1205-7). 아울러, 지연성/손상성 치유를 보이는 양의 경우, 엄격하게 고정시킨 동물과 비교하여, 회전 불안성이 높은 기계적으로 임계적인 외부 고정기를 이용한 치료시, 혈종내 세포독성 T 세포의 퍼센트가 유의하게 높은 것으로 확인되었다.
지연성 골절 치유를 예측하는 마커로서 오스테오칼신 (osteocalcin)과 골 알칼리 포스파타제가 연구되고 있다. 그러나, 단지 오스테오칼신은 정상 환자와 지연성 골절 치유를 보이는 환자 간에 차이가 매우 적고, 골절 발생 후 42일전 까지는 차이가 없었다. 아울러, 형질전환 성장인자 β 1 (TGF-beta 1) 역시 또 다른 잠재적인 바이오마커로서 논의되고 있다. 실험들을 통해, 지연성 골절 치유를 보이는 환자에서 골절 발생 4주 이후의 TGF-β 1 수준이 정상적인 치유를 보이는 환자의 수준 보다 낮다는 것이 확인되었다. 그러나, 이들 파라미터들은 환자 간 상당한 편차, 사이토카인의 짧은 반감기 및 골절 치유기 과정 중의 늦은 예측 시점으로 인해, 골 치유를 예측하는 유효성은 제한적일 뿐이다.
값은 비싸지만 부작용이 없는 BMP (골 형태형성 단백질)와 같은 성장 인자 등의 보완 치료제를 가능한 조기에 투여하기 위한, 골절의 경과를 예측하는 바이오마커에 대한 요구가 충족되지 않고 있다.
본 발명의 과제는 지연성 골절을 예측하기 위한 수단과 방법을 제공하는 것이다.
이를 위한 연구 과정에서, 본 발명에서는, 치유 프로세스 중의 임상적으로 적절한 전형적인 시점에서, 근위 경골 골절 환자의 말초혈에서 염증 반응과 면역 세포 조성을 분석하게 되었다. 골절 치유 프로세스의 진행 중에, 말초혈에서, 지연성 치유와 관련있는 면역 세포의 조성에 의미있는 차이가 확인되었다.
총 T 세포 카운트 (CD3+) 또는 주요 서브세트 분포 (CD3+4+ 및 CD3+8+)에 있어서는 그룹 간 (정상 대 지연성 치유군)에 차이가 없었다. 그러나, 놀랍게도, 지연성 치유가, 상해/수술 이후의 여러 시점에서 (<1주 - >18주), CD8+ TEMRA 세포에 해당되는, 표현형 CD8+11a++28- 및/또는 CD8+11a++57+ 및/또는 CD8+11a++CD28-57+를 발현하는 최종 분화된 CD8+ 작동자 T 세포의 유의한 수적 증가와 밀접하게 연관되어 있다는 것을 확인하게 되었다 (CD57+8+ 지연성 치유 대 정상: 1.6 - 1.8 배, CD28-8+ 지연성 치유 대 정상: 1.5 - 1.6배; CD11++8+ 지연성 치유 대 정상: 1.2 - 1.3 배). 또한, CD8+ TEMRA 세포는 마커 표현형 CCR7-CD45RA+CD45RO-를 발현한다. 이러한 차이는 18주의 추적 기간 동안 안정적이어고, 이는 골절로 인한 외상 후 반응이라기 보다는 개체의 면역 경험이라는 것을 시사해준다.
CD8+ TEMRA 세포는 이의 (염증성) 조직의 회귀 특성과 강력한 방관자 반응성 (bystander responsiveness)을 특징으로 한다. 이 세포는 또한 IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IL-23 또는 TNFα 등의 사이토카인에 의한 항원-비의존적인 양상으로 이의 T 세포 수용체 (TCR)와는 독립적으로 촉발될 수 있다. 이들 사이토카인은 toll-유사 수용체 분자 (TLR)와 손상-관련 분자 패턴 (DAMP) 간의 상호작용의 결과로서, 골절 혈종에서 촉발된 선천적인 면역계 세포에 의해 공급된다. 아울러, 대식세포와 수지상 세포도 CD8+TEMRA 세포에 의한 염증성 사이토카인 (예,IFN-γ)의 분비를 촉발시켜, 대규모의 염증 및 섬유증 뿐만 아니라 골 생성의 저해를 지원한다. 부가적으로, 이들 세포는 HIV, 결핵 또는 사이토메갈로바이러스와 같은 감염성 질환 등의 만성적인 면역 활성화 상태에서 상향-조절된다.
놀랍게도, 말초혈에서, 소위 더블 포지티브 CD4+8+ T 세포라고 하는, CD3+ T 세포의 또 다른 소규모 서브세트들의 빈도가 지연성 치유 환자에서 증가된다는 것도 발견하게 되었다.
본 발명의 제1 측면에서, 개체로부터 수득한 샘플에서 CD8+CD57+ 세포, CD8+CD28- 세포 및/또는 CD8+CD28-CD57+ 세포로 구성된 제1 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포의 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 포함하는, 지연성 골절 치유를 예측하기 위한 생체외 (ex vivo) 방법을 제공한다.
본 발명의 제1 측면에 대한 대안적인 예로서, 개체로부터 수득한 샘플에서 CD8+CD11a+CD57+ 세포, CD8+ CD11a+CD28- 세포 및/또는 CD8+ CD11a+CD28-CD57+ 세포를 포함하는 제1 그룹으로부터 선택되는 CD8+ T 세포의 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 포함하는, 지연성 골절 치유를 예측하기 위한 생체외 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 샘플은 혈액 샘플이며, 특히 말초혈에서 수득한 혈액 샘플 또는 골절부 근처 영역에서, 특히 염증성의 골절 주위 혈종으로부터 수득한 생검 샘플이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 방법은, 골절 이후의 예후 (outcome)를 예측하거나 또는 개체로부터 수득한 샘플을 분류하는데 사용되며, 상기 샘플에는 골절의 예후 가능성이 할당된다.
본 발명에서, 빈도는, 전체 한정가능한 집단의 세포 수에 대한, 세포 표면에 제시되는 특정 마커 분자에 의해 한정되는 세포의 수를 의미한다. 예를 들어, CD3+ 세포의 CD8+CD4+ 아집단 빈도가 5%라는 것은, 전체 CD3+ 세포들 중 5%가 CD8+CD4+ 아집단에 속한다는 의미이다.
일부 경우에, 세포는 약어 형태로 분화 포지티브/네거티브 클러스터를 표시함으로써 본원에서 특정될 수 있다: CD4+8+는 CD4+CD8+와 동일한 의미이다.
일반적으로, 본원에 기술된 방법에서, 소정의 아집단의 빈도는 샘플에서 모 집단 (각 표에서 각각 CD3+ 또는 CD8+ 세포로 표시된 바와 같이)의 전체 수에 대해 정해진다.
임의의 세포 집단이 본원에서 특정 마커 분자에 대하여 "포지티브"인 것으로 지정되어 있다면, 이런 지정은 상기 세포 집단이 상기 마커 분자에 대해 공통 형광-염료-표지된 항체에 의해 염색되며, 비-표지 세포 또는 상기 마커 분자를 발현하지 않는 것으로 일반적으로 공지되어 있는 상기 동일 항체로 표지된 세포 또는 이소형 대조군 항체 (isotype control antibody)로 표지된 세포와 비교하여, 적어도 1, 2 또는 3 log 이상 강한 형광 신호를 나타낼 것이라는 것을 의미한다. 반대의 경우에도 마찬가지로, 특정 마커 분자에 대해 "네거티브"인 것으로 지정된 임의의 세포 집단은, 전술한 바와 같이, 상기 마커 분자에 대한 형광-염료-표지된 항체로 염색될 수 없다. 특정 마커 분자에 대해 "더블 포지티브" 또는 "++"로 표시된 세포는, 전자 게이팅에 의해 구분되는 아집단으로서 분리할 수 있는 이러한 특정 마커 분자를 높은 수준으로 발현하는 세포를 의미한다. "++" 세포는 1 포지티브 "+" 게이트의 하단의 세포 보다 현저하게 강력한 형광 신호를 나타낸다. "++" 현상은 전형적으로 별개의 클러스터로서 구분할 수 있다. 소정의 마커에 대해 더블 포지티브 "++"인 세포는 그 마커에 대한 포지티브 "+" 집단의 일부이다. 도 12는 CD8/CD11 포지티브 및 더블 포지티브 세포들의 히스토그램을 보여주는데, CD11a 포지티브 세포들 모두 2개의 히스토그램 예들에서 원 안에 존재하며, 수직 바의 우측 상의 세포는 "++" 집단을 형성하고 있다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 방법은 CD8+CD11a++, CD8+CD11a++CD28-, CD8+CD11a++CD57+ 및 CD8+CD11a++CD28-CD57+ T 세포들로 구성된 제2 군으로부터 선택되는 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 상기 측면과 구현예에 따른 방법은 CD3+ 세포의 CD8+/CD4+ 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법에 대한 예측 또는 진단적 가치는 전술한 바와 같이 부가적인 아집단의 빈도를 확인함으로써 높아질 수 있다. 부가적인 아집단의 빈도는 연속적으로 또는 동시에 확인할 수 있다. 동시에 확인하는 것이 바람직하다.
일부 구현예들에서, 본 방법은 말초혈에서 IL-6의 수준을 확인하는 단계를 더 포함한다. 즉, 본 발명의 상기 측면과 구현예에 따른 방법의 예측 가치는, 전신 염증에 대한 면역학적 마커로서 IL-6를 확인함으로써 더욱 높일 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 수준은 농도로 표시하고, pg/ml 또는 mol/l와 같은 단위로 표시할 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 방법은, 샘플에, CD4 (Uniprot ID P01730), CD11a (Uniprot ID P20701), CD28 (Uniprot ID P10747), CD57 및 IL-6 (Uniprot ID P05231)으로 구성된 마커 군으로부터 선택되는 마커 분자에 특이적으로 반응하는 제1 리간드를 접촉시키는 단계, 및 상기 제1 리간드로 표식 (marking)된 상기 마커 분자를 제시하는 세포의 빈도를 확인하거나 또는 상기 마커 분자에 결합된 상기 제1 리간드의 빈도를 확인하는 단계에 의해 수행된다.
일부 구현예들에서, 제1 리간드는 항체, 항체 단편, 항체-유사-분자, 아미노산 6-30개로 이루어진 올리고펩타이드, 및 뉴클레오티드 10-75개로 이루어진 핵산 앱타머 분자로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이때 상기 리간드는 앞 단락에 기술된 마커 군에 속하는 구성원에 10-8 mol/l 이하의 해리 상수로 결합할 수 있다.
일부 구현예들에서, 항체 단편은 항체의 Fab 도메인 (항체의 항원 결합부) 또는 단쇄 항체 (scFv), 항체의 경쇄와 중쇄의 가변부들이 펩타이드 링커에 의해 연결된 융합 단백질이다. 항체 단편 또는 항체-유사 분자는 재조합 단백질 발현 등의 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 제1 리간드는, 파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이 또는 SELEX 등의 진화적인 방법 (evolutive method)으로 개발할 수 있는데, 이때 폴리펩타이드 또는 올리고뉴클레오티드는 대상 타겟에 대한 이들의 결합 친화성에 따라 선택된다. 또한, 친화성이 더 높은 저해제는 반복적인 진화 라운드와 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 선별에 의해 동정할 수 있다.
일부 구현예들에서, 전술한 아미노산 6-30개로 이루어진 올리고펩타이드는, 전술한 마커 군의 구성원에 의해 인지되는, 리간드의 일부로부터 유래된 펩타이드이다.
일부 구현예들에서, 전술한 마커 군의 구성원에 의해 인지되는 리간드는, CD28의 리간드인 CD80 (Uniprot ID P33681) 또는 CD86 (Uniprot ID P42081), 또는 CD11a 리간드인 CD54 (Uniprot ID P05362)로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 제1 리간드는 CD4, CD11a, CD28, CD57에 반응하는 항체이며, 전술한 단락에 따른 마커 분자가 이러한 항체에 결합되는, 광학적 검출을 위한 형광 모이어티를 추가로 포함하며, 마커 분자를 제시하는 세포는 형광 활성화된 세포 분류 등의 형광을 이용한 유세포 측정 방법으로 계수할 수 있다.
일부 구현예들에서, 제1 리간드는 IL-6에 반응하는 항체이며, 효소 활성을 포함할 수 있으며, 이러한 효소 활성은 분광측정으로 관찰가능한 반응의 촉매 활성이다.
일부 구현예들에서, 제1 리간드는, 효소 활성 또는 형광 모이어티를 포함하는 제2 리간드에 의해, 특이적으로 결합된다.
각각의 리간드가 개별 마커 분자에 특이적으로 결합하는 복수의 서로 상이한 제1 리간드를 이용함으로써, 복수의 다양한 마커 분자들을 결정할 수 있다.
일부 구현예들에서, 복수의 제1 리간드에서 각각의 제1 리간드는, 복수의 제1 리간드들 중 서로 다른 제1 리간드의 효소 활성 또는 형광 모이어티와 분광측정에 의해 구분될 수 있는, 전술한 바와 같은 효소 활성 또는 형광 모이어티를 포함한다.
일부 구현예들에서, 각각의 제1 리간드는, 서로 다른 제2 리간드의 효소 활성 또는 형광 모이어티와 분광측정에 의해 구분될 수 있는, 특정한 효소 활성 또는 형광 모이어티를 가진 특이적인 제2 리간드에 결합한다.
일부 구현예들에서, 제1 리간드 및 제2 리간드 또는 복수 리간드들은 항체이며, 효소-연계된 면역흡착 분석에 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 전술한 측면에 따른 아집단의 빈도는, 유세포 측정 분석으로 CD4, CD8, CD11a, CD28 및 CD57로 구성된 군으로부터 선택되는 마커 분자에 대한 형광 항체로 표지된 세포를 계수함으로써, 측정한다.
일 구현예에서, 본 방법은 본 발명의 전술한 측면에 따른 개체의 칼로리-스코어 (Calori-Score)를 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명에서, 칼로리-스코어는, 비-유합성의, 골절된 후 영구적인 치유 부전에 대한 척도이며, 골질, 골 정렬, 일차적인 개입의 비-침습성 또는 임상적인 감염 상태 등의 관련 골절 치유 인자를 분석하는 방법에 의해 결정할 수 있다. 칼로리-스코어가 표준 보다 적어도 5% 높은 개체는 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정된다. 이런 방법에 대한 상세한 설명은 Calori et al., Injury, 39, Supp 2, S59-63, 2008에서 볼 수 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 확정된 빈도, 수준 또는 칼로리-스코어를 표준과 비교하는 단계를 더 포함한다.
본 발명에서 표준은 정상이거나 또는 지연성 골절 치유를 나타내지 않는 개체의 샘플을 의미한다. 다른 구현예에서, 표준은 정상적인 골절 치유를 보이는 개체일 수 있다. 특히, 개체의 골절 치유는 다음과 같은 기준들 중 어느 것에도 부합되지 않는다면 정상으로 간주된다:
i) 가골 형성을 기준으로 수술한 지 12주 이후에도 불완전한 골절 치유,
ii) 수술한 지 12주 이후에도 골절 틈이 1 mm 보다 큰, 불완전한 골절 치유,
iii) 골 흡수 영역 또는 불완전한 가골 형성이 존재함,
iv) 1-3개의 피질이 가교 (bridging)되어 있는 것을 의미하는, 불완전한 가교 형성,
v) 가교 형성 안됨, 즉 피질이 가교되어 있지 않음.
바람직한 구현예에서, 정상적인 골절 치유를 보이는 다수의 환자들에서 측정한 표준과 비교하여, CD8+/CD4+ 세포 빈도가 2배 높은 샘플은, 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정된다.
일부 구현예들에서, 정상적인 골절 치유를 보이는 다수의 환자들에서 (후향적으로) 측정된 표준과 비교하여, CD11a++, CD28- 또는 CD57+인 T 세포 빈도가 적어도 10% 높은 샘플은, 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정된다.
일부 구현예들에서, CD8+ T 세포 중에서 CD28- 또는 CD57+인 세포의 빈도가 적어도 30%인 샘플은 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정되며, CD8+ T 세포 중에서 CD11a++인 세포의 빈도가 적어도 65%인 샘플은 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정되며, CD8+ T 세포 중에서 CD4+인 세포의 빈도가 적어도 5%인 샘플은 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 방법은 CD4+CD57+ 세포 및 CD4+CD28- 세포로부터 선택되는 CD4+ T 세포의 아군의 빈도를 확인하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 하기를 포함하는 지연성 골절 치유를 진단하기 위한 시스템을 제공하며:
- 개체의 샘플에서 세포 집단의 빈도 또는 IL-6을 측정하기 위한 디바이스, 및
- 프로그램화된 마이크로프로세서 (programmed microprocessor),
상기 프로그램화된 마이크로프로세서는 본 발명의 전술한 측면들과 구현예들에 따른 방법을 수행하도록 장착되고 설계된다.
일부 구현예들에서, 상기 디바이스는, 세포를 이송하고 정렬하기 위한 플로우 셀(flow cell), 레이저 등의 광원, 및 광 또는 임피던스 등의 다른 생물물리학적 파라미터를 측정하는데 적합한 검출기를 포함하는, 유세포 측정기이다. 상기한 디바이스는 본 발명의 전술한 측면들과 구현예들에 따라 CD8+ 세포의 아집단들의 빈도를 측정하는데 사용할 수 있다.
일부 구현예들에서, 디바이스는, 큐벳 또는 마이크로타이터 플레이트와 같은, 샘플을 수용하는 구획, 광원 및 다이오드 어레이와 같은 흡광 또는 형광을 측정하는데 적합한 UV/Vis 검출기를 포함하는, 분광광도계 또는 플레이트 판독기일 수 있다.
일부 구현예들에서, 디바이스는 본 발명의 상기한 측면들 또는 구현예들에 따라 IL-6의 수준을 측정하는데 사용된다.
일부 구현예들에서, 프로그램화된 마이크로프로세서는 선행 단락들에 기술된 디바이스에 통합되거나, 또는 디바이스를 작동시키기 위한 컨트롤 유닛 또는 컴퓨터의 일부이다.
일부 구현예들에서, 전술한 디바이스는 본 발명의 상기한 측면들 또는 구현예들에 따라 CD8+ T 세포의 아집단의 빈도를 측정하도록 장착 및 설계된다.
본 발명의 다른 측면은, 항-CD8-항체, 항-CD4-항체, 항-CD11a-항체 및 항-CD28-항체를 포함하며, 전술한 항체가 형광을 토대로 한 유세포 측정에 적합한, 지연성 골절 치유를 진단하기 위한 부품 키트 (kit of parts)를 제공한다.
일 구현예에서, 본 키트는 항-CD57-항체를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 상기 측면에 따른 항체는 뮤라인 기원의 단일클론 항체이며, APC (알로피코시아닌), FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트) 또는 PE (피코에리트린) 등의, 유세포 측정에서 광학적 검출을 위한 형광 모이어티를 포함한다.
일부 구현예들에서, 항체는, PE-Cy7과 마우스 항-인간 CD4 IgG1의 접합체, 뮤라인 단일클론 항체와 PE-Cy7(시아닌 염료) 탠덤 형광단 (tandem fluorophor)의 접합체, APC-Cy7-표지된 마우스 항-인간 CD8 IgG1, 뮤라인 단일클론 항체와 텐덤 형광단 APC-Cy7의 접합체, FITC-표지된 마우스 항-인간 CD57 IgM, 뮤라인 단일클론 항체, APC-H7 마우스 항-인간 CD28 IgG1, 뮤라인 단일클론 항체와 APC-Cy7의 유사체이며 동일한 분광광도 특성을 가진 텐덤 형광단 APC-H7의 접합체, 및 FITC-표지된 마우스 항-인간 CD11a (항-LFA-1a, 백혈구 기능 관련 항원-1, 알파 폴리펩타이드) IgG2a, 뮤라인 단일클론 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, IFN-γ (Uniprot P01579) 또는 TNF-α (Uniprot P01375)의 저해제는 지연성 골절 치유를 치료하는 방법에 사용하기 위해 제공되는 것이며, 상기 저해제는 항체, 항체 단편, 항체-유사-분자, 가용성 수용체 구조체, 아미노산 6-30개로 이루어진 올리고펩타이드, 및 뉴클레오티드 10-75개로 이루어진 핵산 앱타머 분자, IFN-γ 또는 TNF-α의 분비 저해제(예, si-RNA 또는 소형 분자, 예를 들어, 칼시뉴린 (calcineurin) 저해제)로 구성된 군으로부터 선택되는, IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 리간드로서, 상기 리간드 (저해제)는 해리 상수 10-8 mol/l 이하로 IFN-γ 또는 TNF-α에 선택적으로 결합할 수 있으며, IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 상기 리간드 (저해제)는 또한 IFN-γ 또는 TNF-α의 생물학적 효과를 무력화하거나 또는 억제할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에 대한 일부 구현예들에서, 상기 저해제는 IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 단일클론 항체이다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 키메라, 인간화된, 또는 인간 단일클론 항체이다.
저해제가 항체 단편인 본 발명의 이러한 측면에 대한 일부 구현예들에서, 저해제는 IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 항체의 Fab 도메인 (항체의 항원 결합부) 또는 단쇄 항체 (scFv), 즉, 항체의 경쇄와 중쇄의 가변부들이 펩타이드 링커에 의해 연결된 융합 단백질이다. 항체 단편 또는 항체-유사 분자는 재조합 단백질 발현과 같은 적절한 방법으로 제조할 수 있다.
일 구현예에서, 저해제는, 인간 면역글로불린의 Fc-도메인에, IFN-γ 또는 TNF-α에 선택적으로 결합하는 항원 결합-도메인을 연결시킨, 키메라 구조체이다. 이러한 구조체의 일 예는 약물 에타너셉트 (CAS No. 185243-69-0)이다.
본 발명의 이 측면에 따른 저해제는, 또한, 파지 디스플레이, 리소좀 디스플레이 또는 SELEX 등의 진화적인 방법 (evolutive method)으로 개발할 수 있으며, 이때 폴리펩타이드 또는 올리고뉴클레오티드는 IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 결합 친화성에 따라 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 언급된 아미노산 6-30개로 이루어진 올리고펩타이드는, IFN-γ 또는 TNF-α에 의해 선택적으로 인지되는, IFN-γ 또는 TNF-α의 생리학적 결합 파트너의 일부로부터 유래되는 펩타이드이다. 일부 구현예들에서, IFN-γ 또는 TNF-α의 합성은 칼시뉴린 저해제, 포스포다이에스테라제 저해제 등의 소분자 약물 또는 si-RNA에 의해 차단할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, CD8+ 세포의 저해제는 지연성 골절 치유의 치료법 또는 요법에 사용하기 위해 제공된다. 대안적인 일 예로, 이러한 CD8+ 세포 저해제는, 항체, 항체 단편, 항체-유사-분자, 아미노산 6-30개로 이루어진 올리고펩타이드 및 뉴클레오티드 10-75개로 이루어진 핵산 앱타머 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, CD8에 대한 리간드이며, 리간드 (저해제)는 해리 상수 10-8 mol/l 이하로 CD8에 선택적으로 결합할 수 있으며, CD8에 대한 리간드 (저해제)는 또한 CD8+ T 세포의 생물 효과를 무력화 또는 억제할 수 있으며, 특히 상기 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 또는 TNF-α의 분비를 저해할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에 대한 일부 구현예들에서, 저해제는 CD8에 대한 단일클론 항체이다. 일 구현예에서, 저해제는 항-흉선세포 글로불린 (antithymocyte globuline) 등의 CD8에 대한 키메라, 인간화된 또는 인간 단일클론 항체이다.
본 발명의 이러한 측면에 대한 일부 구현예들에서, 저해제는 CD11a/CD18 (LFA-1)에 대한 항체이다. 본 발명의 이러한 측면에 대한 일 구현예에서, 저해제는 CD49d (VLA-4)에 대한 항체이다. 본 발명의 이러한 측면에 대한 일 구현예에서, 저해제는 CD137 (4-1BB)에 대한 항체이다.
본 발명의 이러한 측면에 대한 일 구현예에서, 저해제는, 비제한적인 예로, CD11a/CD18 (LFA-1), CD49d (VLA-4) 또는 CD137 (4-1BB) 등의, 활성화된 CD8 상의 분자에 대한 단일클론 항체이다. 일 구현예에서, 저해제는 키메라, 인간화된 또는 인간 단일클론 항체이다. 본 발명의 이러한 측면에 대한 일 구현예에서, 저해제는, 인간 면역글로불린의 Fc-도메인에, CD11a/CD18 (LFA-1), CD49d (VLA-4), CD137 (4-1BB) 등의 CD8 또는 CD8-특이적인 활성화 항원에 선택적으로 결합하는 항원 결합-도메인을 연결시킨, 키메라 구조체이다. 이러한 구조체의 일 예는 약물 알레파셉트 (alefacept) (CAS No. 222535-22-0)이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 상기한 측면들 중 임의 한가지 측면에 따른, IFN-γ 또는 TNF-α 또는 CD8의 저해제 (또는 리간드)를 포함하는, 지연성 골절 치유를 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
일부 구현예들에서, 약학 조성물은 피하, 정맥내, 간내, 근육내 또는 국소 골절내 투여 등의 비경구 투여용으로 제형화된다.
일부 구현예들에서, 약학 조성물은 활성 성분을 약 0.1% - 약 10%로 포함한다. 일부 구현예들에서, 약학 조성물은 활성 성분 (동결건조물)을 약 10% - 약 100%로 포함한다.
일부 구현예들에서, 약학 조성물은 IFN-γ의 저해제 또는 TNF-α의 저해제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 약학 조성물은 CD8의 저해제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 약학 조성물은 IFN-γ에 대한 단일클론 항체 또는 그외 중화제와 TNF-α에 대한 단일클론 항체 또는 중화제 (예, TNF-α에 대한 Fc-Ig 구조체, 예, 에타너셉트)를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 상기 측면들 중 임의의 한가지 측면에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제 (또는 리간드)를 포함하는, 지연성 골절 치유를 치료하기 위한 투약 형태 (dosage form)를 제공한다.
투약 형태는 코, 볼, 직장, 경피 또는 경구 투여 등의 경장 (enteral) 투여를 위한 것이거나, 또는 흡입 형태 또는 좌제로서 투여하기 위한 것일 수 있다. 다른 예로, 피하, 정맥내, 간내 또는 근육내 주사 형태 등의 비경구 투여도 이용할 수 있다. 선택적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제도 존재할 수 있다.
IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제 (또는 리간드), 또는 본 발명의 상기한 측면들 중 임의의 한가지 측면에 따른 약학 조성물 또는 투약 형태를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 지연성 골절 치유를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법도 본 발명의 범위에 포함된다. 마찬가지로, CD8 항체와 같이, 상기 환자에서 CD8+ T 세포를 고갈시킬 수 있는 물질을, 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 지연성 골절 치유를 앓고 있는 환자의 치료 방법도 고려된다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 상기한 측면들 중 임의의 한가지 측면에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제 (또는 리간드)의 사용을 포함하는, 지연성 골절 치유를 치료하기 위한 약제의 제조 방법을 제공한다.
이에, 본원에 개시된 본 발명의 치료학적 용도와 관련된 내용은 다음과 같다:
1. 지연성 골절 치유의 치료법 또는 요법에 사용하기 위한 IFN-γ (Uniprot P01579) 또는 TNF-α (Uniprot P01375)의 저해제로서, 상기 저해제는
a. 해리 상수 10-8 mol/l 이하로 IFN-γ 또는 TNF-α에 선택적으로 결합할 수 있는, IFN-γ 또는 TNF-α의 리간드이며, 상기 저해제는
b. IFN-γ 또는 TNF-α의 생물 효과를 무력화 또는 억제할 수 있음.
2. 상기 저해제가 항체, 항체 단편, 항체-유사-분자, 가용성 수용체 구조체, IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 수용체로부터 유래된 아미노산 6-30개로 이루어진 올리고펩타이드 및 뉴클레오티드 10-75개로 이루어진 핵산 앱타머 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 제1 항목에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제.
3. 상기 저해제가 IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 단일클론 항체인, 제1 또는 제2 항목에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제.
4. 상기 저해제가 키메라 (일부 인간), 인간화된, 또는 인간 단일클론 항체인, 상기 임의 항목에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제.
5. 상기 저해제가, 인간 면역글로불린의 Fc-도메인에, IFN-γ 또는 TNF-α에 선택적으로 결합하는 항원 결합-도메인이 연결된, 키메라 구조체인, 상기 임의 항목에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제.
6. 상기 저해제가 에타너셉트 (etanercept) (CAS No. 185243-69-0)인, 제5 항목에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제.
7. 지연성 골절 치유를 치료하는 방법에 사용하기 위한, IFN-γ 또는 TNF-α를 코딩하는 mRNA를 타겟팅하는 저해성 RNA 또는 DNA 분자 (si-RNA, mi-RNA, sh-RNA, 안티센스 DNA)인, IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제.
8. 지연성 골절 치유를 치료하는 방법에 사용하기 위한 활성화된 CD8+ 세포의 저해제로서,
상기 저해제는 활성화된 CD8 T 세포의 세포 표면에 선택적으로 결합할 수 있으며,
상기 저해제는 또한 활성화된 CD8+ T 세포의 생물 효과를 무력화 또는 억제할 수 있으며, 특히 상기 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 또는 TNF-α의 분비를 저해할 수 있는, 저해제.
9. 상기 저해제가 CD8, CD11a/CD18 (LFA-1), CD49d (VLA-4), CD137 (4-1BB)을 포함하는 CD8 마커 군에 포함된 구성원에 대해 리간드이며, 상기 저해제가 해리 상수 10-8 mol/l 이하로 상기 마커 군의 구성원에 선택적으로 결합할 수 있는, 제8 항목에 따른 활성화된 CD8+ T 세포의 저해제.
10. 상기 저해제가 항체, 항체 단편, 항체-유사-분자, 가용성 수용체 구조체, IFN-γ 또는 TNF-α에 대한 수용체로부터 유래된 아미노산 6-30개로 이루어진 올리고펩타이드 및 뉴클레오티드 10-75개로 이루어진 핵산 앱타머 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 제8 또는 제9 항목에 따른 활성화된 CD8+ T 세포의 저해제.
11. 상기 저해제가 CD8, CD11a/CD18 (LFA-1), CD49d (VLA-4) 또는 CD137 (4-1BB)에 대한 단일클론 항체인, 제8 내지 제10 항목 중 임의 한가지 항목에 따른 활성화된 CD8+ T 세포의 저해제.
12. 상기 저해제가 키메라 (일부 인간), 인간화된 또는 인간 단일클론 항체인, 제8 내지 제10 항목 중 임의 한가지 항목에 따른 활성화된 CD8+ T 세포의 저해제.
13. 상기 저해제가 알레파셉트 (alefacept) (CAS No. 222535-22-0)인, 제12 항목에 따른 활성화된 CD8+ T 세포의 저해제.
14. CD8, CD11a/CD18 (LFA-1), CD49d (VLA-4) 또는 CD137 (4-1BB)를 코딩하는 mRNA를 타겟팅하는 저해성 RNA 또는 DNA 분자 (si-RNA, mi-RNA, sh-RNA, 안티센스 DNA)인, 지연성 골절 치유의 치료 방법에 사용하기 위한 활성화된 CD8+ T 세포의 저해제.
15. 상기 항목들 중 임의의 한가지 항목에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제 또는 활성화된 CD8 T 세포의 저해제를 포함하는, 지연성 골절 치유를 치료하기 위한 약학 조성물.
16. 상기 조성물이 IFN-γ의 저해제 및 TNF-α의 저해제를 포함하는, 제15 항목에 따른 약학 조성물.
17. 상기 조성물이 제8 내지 제14 항목 중 임의 한가지 항목에 따른 활성화된 CD8 T 세포의 저해제를 포함하는, 제15 항목에 따른 약학 조성물.
18. 하기 a, b 또는 c를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 지연성 골절 치유를 앓고 있는 환자의 치료 방법:
a. 제1 내지 제7 항목 중 임의의 한가지 항목에 따른 IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제, 또는
b. 제8 내지 제14 항목 중 임의의 한가지 항목에 따른 활성화된 CD8+ T 세포의 저해제, 또는
c. 제15 내지 제17 항목 중 임의의 한가지 항목에 따른 약학 조성물 또는 투약 형태.
19. 상기 항목들 중 임의의 한가지 항목에 따른, IFN-γ 또는 TNF-α의 저해제, 또는 활성화된 T 세포의 저해제의 사용을 포함하는, 지연성 골절 치유를 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
예를 들어, 마커 분자 또는 저해제와 같이 하나씩 분리가능한 특징들에 대한 대안들이 본원에서 "구현예"로 제공된 어떤 경우에도, 이러한 대안들은 자유롭게 조합하여 본원에 기술된 개별 구현예들을 구성할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은 추가적인 구현예와 이점이 명시될 수 있는 후술하는 실시예들과 도면을 통해 추가로 예시된다. 이들 실시예들은 본 발명을 예시하지만 그 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
도 1은 정상 및 지연성 치유 환자의 칼로리-스코어 (4분위 중앙, 하위 및 상위)를 도시한다.
도 2는 수술한 지 6, 12 및 18주 후 정상 및 지연성 치유 환자의 최고 지면 반력 (ground reaction force) (A) 및 평균 보행 속도 (B) (4분위 중앙, 하위 및 상위)를 도시한 것이다.
도 3은 정상 및 지연성 치유 환자 집단들의 CD3+ T-세포에서 CD8+CD4+ 세포의 빈도를 도시한 것이다 (상위 도표 중앙값, 하위 및 상위 4분위수, 하위 도표 평균 값).
도 4는 정상 및 지연성 치유 환자와 통합한 건강한 대조군의 CD8+ T-세포 집단에서 CD11a++ 세포 빈도를 도시한 것이다 (중앙, 하위 및 상위 4분위수).
도 5는 정상 및 지연성 치유 환자와 통합한 건강한 대조군의 CD8+ T-세포 집단에서 CD57+ 세포 빈도를 도시한 것이다 (중앙, 하위 및 상위 4분위수).
도 6은 정상 및 지연성 치유 환자와 통합한 건강한 대조군의 CD8+ T-세포 집단에서 CD28- 세포 빈도를 도시한 것이다 (중앙, 하위 및 상위 4분위수).
도 7은 정상 및 지연성 치유 환자의 혈액 샘플에서 사이토카인 발현 (A IL6; B IL-8) (중앙, 하위 및 상위 4분위수)을 도시한 것이다.
도 8은 골절 혈종으로의 CD8+ TEMRA 이동 (migration) (비율)을 도시한 것이다.
도 9는 말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 및 인간 골수 간엽 기질 세포 (BM-MSC)에서 CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 CD8+CD57+CD28- 세포 중 IFN-γ 생산 세포의 비 (중간값)를 도시한 것이다.
도 10은 TNF-α 및 IFN-γ에 의한 골수 간엽 기질 세포의 골 형성 저해를 도시한 것이다.
도 11은 마우스 모델에서 CD8+ 고갈과 골절 치유의 개선을 도시한 것이다.
도 12는 CD11a++ 세포를 측정하는 일 예를 도시한 것이다.
도 13은 수술 전과 후의 혈액에서, 그리고 골절 혈종 (FH)에서 골절 환자의 CD8+ T-세포 집단 중 CD57+ 세포 빈도를 도시한 것이다.
도 14는 수술 전과 후의 혈액에서, 그리고 골절 혈종 (FH)에서 골절 환자의 CD8+ T-세포 집단 중 CD28- 세포 빈도를 도시한 것이다.
도 15는 수술 전과 후의 혈액에서, 그리고 골절 혈종 (FH)에서 골절 환자의 CD4+ T-세포 집단 중 CD57+ 세포 (상단 패널) 및 CD28- 세포 (하단 패널)의 빈도를 도시한 것이다.
재료 및 방법
개체 및 실험 프로토콜
2008년 7월에서 2010년 8월까지, 본 실험에 단발적이고 폐쇄된 경골 근위부 골절을 가진 환자 15명 (23세 - 64세, 남성 9명, 여성 8명)이 참여하였다.
신체 역학적 기능과 면역학적 파라미터에 대한 평가에 따라, 임의의 만성 질환 (예, 골다공증, 당뇨병, 류마티스 관절염, 암성 심부전, 신부전), 특히 인간 면역결핍성 바이러스 또는 간염에 감염된 환자는 본 실험에서 제외시켰다. 아울러, 수개의 골절을 가지고 있거나, 또는 고관절, 어깨 관절 또는 발목 관절에 골절이 생긴 환자도 실험에서 제외시켰다.
본 실험은 헬싱키 임상 시험 관리 기준과 선언에 대한 국제 표준화 가이드라인 기구 (International Conference on Harmonisation Guidelines for Good Clinical Practice and the Declaration of Helsinki)에 준하여 수행하였다. 모든 환자들에게는 서면으로 동의를 구하였으며, 실험은 베를린 샤리테 대학의 윤리 위원회로부터 승인받았다 (Nr. EA1/006/08).
프로토콜과 평가 계획
골절 치유와 골절 치유 중에 확립된 임상 실험 포인트와의 조화를 초기 단계들에서 평가하기 위해, 수술한 지 3-5일 후 (이하, "첫주"라 함), 2주 후, 4주 후, 6주 후, 12주 후 및 18주 후에 환자들을 조사하였다. 매 검사 시점에, 환자들 모두 다음과 같은 방법을 수행하였다.
혈액 샘플
각 검사 일에는 오전 9:00 - 12:00 사이에 혈액 샘플을 채혈하고, 반듯이 누운 자세로 15분간 휴식을 취하였다. 혈액 샘플들 모두 즉시 어둡고, 공기 통제된 룸으로 이동시켜, 2시간 이내에 실험실에 보내었다. 아울러, 혈장과 혈청 샘플을 분액들에서 취하여, -80℃에 냉동시켰다.
전체 혈액 카운트와 표준 임상 변수 (적혈구, 헤모글로빈, 헤마토크릿, 혈소판, 크레아티닌, 소듐, 포타슘, 요산, ostase, CRP)를 표준 실험 조작 공정 (SOP)에 따라 혈장과 혈청 샘플에서 측정하였다. 오스테오칼신을 측정하기 위한 혈청 샘플을 즉시 원심분리하여 (3500rpm/15분), 사전-냉동시킨 분액으로 저장하여 3시간 이내에 실험실로 이송하였다.
반자동 시스템을 이용하여 혈장 샘플에서 사이토카인 (TNFα, IL-6, 총 IL-8, IL-10)을 측정하였다. 세포내 사이토카인을 염색하기 위한 항체와 관련 시약들은 BD Pharmingen에서 구입하였다.
T-세포 관련 클러스터 분화를 조사하여, CD3, CD4, CD8, CD11a+, CD57+ 및 CD28+ 등의 후천적인 숙주 방어 면역을 평가하였다. BD FACSAria II 유세포 측정기를 이용하여 세포 분류하였으며, 수득한 분획들의 순도를 BD LSRII 유세포 측정으로 결정하였다.
MSC 분화를 위한 CD8+ TEMRA 세포 컨디셔닝화된 매질
T 세포 수용체 활성화된 CD8+ TEMRA 세포 (CD62L-CD45RA+)의 컨디셔닝화된 매질을, 사전 동의를 구하고 인간 실험에 대한 지역 윤리 위원회로부터 승인을 받은 후, 2명의 공여자로부터 입수하였다. CD62L+ 및 CD45RO+ 세포의 고갈 후, CD62L-CD45RO- 분획에서 CD8+ 세포를 포지티브 선별하였다. CD8+ T 세포 (1 x 106 cells/ml DMEM + 10% FCS)를 CD3CD28CD2로 코팅된 비드를 이용하여 24시간 자극하였다.
골수 유래 간엽 기질 세포의 분리 및 배양 (BM-MSC)
전술한 바와 같이 둔부 수술을 받고 있는 환자 5명 (공여자의 연량: 39-90세, 평균 73세, 성별: 여성 2명 및 남성 3명)으로부터 대퇴골 골수의 세척액에서 BM-MSC를 분리하였다. 유세포 측정 분석을 이용한 세포 표면 마커의 발현을 분석함으로써 BM-MSC의 동종 집단을 검증하였다 [Glaeser, J.D., S. Geissler, A. Ode, C.J. Schipp, G. Matziolis, W.R. Taylor, P. Knaus, C. Perka, G.N. Duda, and G. Kasper, Modulation of matrix metalloprotease-2 levels by mechanical loading of three-dimensional mesenchymal stem cell constructs: impact on in vitro tube formation. Tissue Eng Part A. 16(10): p. 3139-48 (2010)]. 후술한 모든 세포 분석들은 3번의 기술적 반복으로 4명 이상의 공여체로부터 수득한 3-4 계대의 BM-MSC를 이용하여 수행하였다.
골형성 분화 분석
IFN-γ 또는 TNF-α가 각각 다른 농도로 첨가된 골형성 배지 (OM)를 이용하여, 컨플루언트 BM-MSC의 골형성 분화를 유도하였다. 생체외 자극하여 분류한 CD8+ TEMRA의 CM을 이용한 실험에서, CM을 2배 농도의 OM으로 1:2로 희석하였다. 매트릭스 무기질화를 알리자린 레드 염색으로 가시화하였다. 10% 세틸피리디늄 클로라이드로 추출한 후, 알리자린 레드 (ODAR)의 흡광도를 측정함으로써, 정량하였다. 수득한 수치는 alamarBlue으로 측정한 살아있는 세포의 수로 표준화하였다.
BM-MSC 생존 및 생활성 분석
세포 생활성 분석을 위해, 실험 전날 96웰 플레이트에 2400 BM-MSC/cm2를 접종하였다. 다음 날, 배지를 교체하고, 여러가지 농도의 IFN-γ 또는 TNF-α (0, 1, 10 및 100 ng/ml)가 포함된 EM에서 3일간 세포를 배양하였다. 세포 생활성을 alamarBlue 세포 생활성 분석을 이용하여 측정하였다. 제조사 설명서에 따라 CyQuant 분석을 이용하여 접종한 후 다음 날 동등한 세포 접종을 검증하였다.
BM-MSC 세포자살 분석
세포의 세포자살 분석을 위해, 24웰 플레이트에 2400 BM-MSCs/cm2를 접종하였다. BM-MSC는 각각 지정된 농도의 IFN-γ 또는 TNF-α가 함유된 배지와 함께 2일간 배양하였다. 이후, 배지를 제거한 다음, 카스파제-3와 -7의 활성을 제조사의 설명서에 따라 카스파제-Glo® 3/7 분석을 이용하여 세포 용혈물에서 측정하였으며, CyQuant 분석으로 측정된 세포 수로 값을 표준화하였다.
마우스 실험
동물 복지법, 실험 동물 사용과 관리에 대한 NIH 가이드 및 국립 동물 복지 가이드라인에 따라 확립된 정책과 원칙에 따라, 12주령의 C57BL/6 마우스 (n=19)를 이용하여 마우스 실험을 수행하였다. CD8- T 세포에서의 CD8+ 면역 세포 고갈은 항체 (mCD8 (YTS 169.4), BioXCell) 주입 (마지막 날이 수술일인 4일 연속 동안 주입 당 200 ㎍ mCD8)으로 달성하였다.
CD8+ 세포 고갈은 CD3, CD8a 및 CD4에 대한 특이 항체를 이용한 FACS 분석 (LSR II 유세포 측정기)을 통해 모니터링하였다. CD8+ T 세포 군에는 수술 전날 2.5 x 106개의 CD8+ 세포 200 ㎕를 꼬리 정맥에 정맥내 주사로 투여하였다. MouseExFix 시스템을 이용하여 좌측 대퇴골에 대해 골절술을 수행하였다. 3D 화소 크기가 10.5 ㎛, 55 keVp, 145 ㎂이고 대상 부피 (VOI)가 센터에서 골절단 갭 2 mm인 대퇴골에 대해 μCT 분석 (Viva μCT 40)을 수행하였다. 골절단 후 21일째의 치유 결과를 맹검 평가로 3명의 다른 정형외과에 의한 브릿지 또는 비-브릿지로 평가하였다.
치유 분류 및 데이타 수집
각각의 환자에게 수차례 X선 분석을 수행하여, 실험 기간 동안의 임플란트 안정성과 골절 갭을 평가하였다. X선 검사는 3명의 맹검 상태의 다른 분야의 의사들 (정형 외과, 방사선 전문의)에 의해 수행하여, 환자의 정확한 치유 결과와 분류를 확보하였다. 아울러, 기능성 데이타 (보행 분석) 분석으로 수술한 지 12주 후에 통증없이 전체 무게를 견디는 지를 평가하였다. 지연성 치유 프로세스의 정의를 충족하기 위해, 환자는 다음과 같은 기준들 중 한가지 이상에 해당되어야 한다. 문헌에 확립되어 있으며 임상에서 사용되는 바와 같이, 지연성 치유 프로세스에는 시간 의존적이고 방사선학적인 기준이 존재한다.
지연성 골절 치유에 대한 시간 의존적인 기준:
가골 형성을 토대로 한, 수술 12주 후 불완전한 골절 치유.
지연성 골절 치유에 대한 방사선학적 기준 :
1) 수술한 지 12주 후 골절 갭이 > 1 mm인, 불완전한 골절 치유.
2) 흡수 영역 또는 불완전한 가골 형성의 존재.
3) 불완전한 브릿징, 즉 1-3개의 피질이 브릿징됨.
4) 브릿징되지 않음, 피질이 브릿징되지 않음.
수술 후 환자의 개개 상태를 정량하기 위해, 칼로리로 비-유합 점수 체계를 이용하였다.
아울러, 환자의 인구 통계 데이타, ASA 분류, 주요 진단, 수술과 임플란트의 타입, 동반 질환 및 미생물 데이타는 차트들에서 유래하였으며, 데이타베이스에 취합하였다. 표 1에 모든 환자 특징들을 열거한다.
환자 번호 연령 체중 (kg) 신장 (cm) BMI 흡연 치유 상태
1 47 60 159 23,733 o 지연
2 62 90 183 26,874 x 정상
4 57 53 153 22,641 x 지연
5 39 80 168 28,345 x 정상
7 59 62 158 24,836 x 지연
8 23 75 192 20,345 o 정상
9 58 97 168 34,368 o 정상
10 24 60 159 23,733 o 정상
11 46 80 176 25,826 o 정상
12 45 92 188 26,03 x 지연
13 46 86 174 28,405 o 정상
14 62 66 162 25,149 x 지연
16 25 90 185 26,297 x 정상
17 49 81 172 27,38 o 지연
18 64 70 180 21,605 x 지연
표 1: 환자 특징
보행 분석
샘플링 속도 120 Hz로 적외선 카메라 12개와 제1 및 제5 중족골 두부 및 뒷꿈치의 피부에 붙인 역반사 마커를 이용하여, 3-D 모션 분석을 수행하였다. 지면 반력을 960 Hz에서 2개의 힘판 (force platform)으로 수집하였다.
각 검사일에, 환자에게 자신이 선택한 속도로 10 m를 따라 걸게 하였다. 운동학적 데이타는 보행 속도, 걸음 및 보폭, 보속, 보폭 높이 (stride height) 및 유각기와 입각기의 지속 기간 등의 보행 파라미터를 컴퓨터로 계산할 수 있다. 아울러, 지면반력을 취합하여, 골절된 하지와 반대쪽 하지에 대한 최고 수직력 (peak horizontal force)과 스탠스 지속시간 (stance duration)을 컴퓨터로 계산하였다.
또한, 분리된 힘판 위에서 발 한쪽 씩 올려놓고, 의사에 앉고 서기 검사를 수행하여, 하지들 간의 힘의 최고치 (peak force) 차이 뿐만 아니라 지면반력으로 반영되는 앉고 서기 검사의 지속 시간을 결정하였다.
통계학적 분석
모든 데이타는 평균 ± 표준 편차로 제시한다. 카이-제곱 검사를 적용하여, 그룹들간에 연령과 성별 비-독립성을 분석하였고, 콜모고로브-스미르노브 (Kolmogorov-Smirnov) 검사를 이용하여 정상적으로 분포되지 않은 값들을 식별하였다. 그룹 간의 비교에는 만-휘트니 U 검사를 이용하였다. 본페로니 보정을 이용한 ANOVA-반복 측정을 적용하여 여러가지 실험 시간대들 간의 각 그룹의 변이성을 스캐닝하였다.
2종의 환자 군들 간의 차별적으로 발현되는 유전자들 모두에 대해 ROC (receiver operation characteristic-곡선) 분석을 수행하였다. 양성 및 음성 예측 값에 대한 판단을 위해, ROC-곡선 분석으로부터 유래된 각 유전자의 민감성과 특이성을 적용하였다.
모든 통계학적 분석은 StatView 4.5 (Abacus Concepts Inc., Berkeley, USA)를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05에서 표시되었다.
각 박스 플롯은 4분위수 중앙값, 하위 및 상위를 도시한다.
유의성 수준: p < 0.05 = * / p < 0.01 = ** / p < 0.0001 = ***
실시예
실시예 1: 칼로리 스코어
정상인과 지연성 치유 환자는 연령, 성별, 신장 및 체중이 비슷하였다. ASA 분류, 골질, 골 결손부 갭, 수술 기법, 개입 횟수 및 흡연 상태에는 군들 간에 차이가 없었다.
칼로리-스코어는 하기 인자들로 계산하며, 이들 인자를 합한 후 2를 곱한다.
a) 골 인자:
골질 우수 (0 Pt), 보통 (예, 경미한 골다공성, 1 Pt), 나쁨 (예. 골 소실, 2 Pt), 매우 나쁨 (예, 괴사, 무혈관성 3 Pt.)
원발성 골절 폐쇄됨 (0 Pt), 1도 (1 degree) 개방 (1 Pt), 2-3도 개방 A 등급 (3 Pt), 3도 개방 B-C 등급 (5 Pt)
추가적인 개입 없음 (1Pt), < 2 (2 Pt), < 4 (3 Pt), > 4 (4 Pt)
OP-침습성 침습 최소 (예, 스크류, 0 Pt), 체내 골수강내 (internal intramedular) (예, 금속정 (nail), 1 Pt), 체내 골수외 (internal extramedular) (2 Pt), 골 합성 (예, 골 그래프팅, 3 Pt)
OP-적합성 안정성 적합 (0 Pt), 안정성 부적합 (1 Pt)
Weber & Cech 비후 (1 Pt), 빈 영양 (oligotroph) (3 Pt), 위축 (5 Pt)
골-배향 해부학적 (0 Pt), 비-해부학적 (1Pt)
골절 갭 0.5-1 cm (2 Pt), 1-3 cm (3Pt), > 3 cm (5 Pt)
b) 연조직
상태 온전 (0 Pt), 발병없이 최근 치료 (2 Pt), 조직 결함에 대해 최근 치료 (예, 다발성 절개, 구획 증후군, 3 Pt), 최근 합병증 치료 (4 Pt), 혈관 분호 불량 (정맥 부전, 모세관 충전 불량, 5 Pt), 다발성 피부 상해 또는 결함 (예, 궤양, 임플란트 플레이트 (implant plate) 발생 6 Pt)
c) 환자
ASA 등급 1급 또는 2급 (0 Pt), 3급 또는 4급 (1 Pt)
당뇨병 없음 (0 Pt), 있음 - 잘 조절됨 = HbA1c < 10 (1 Pt), ja - 조절 불량 HbA1c > 10 (2Pt)
혈액 검사 염증 WCC > 12 또는 ESR > 20 또는 CRP > 20 (1 Pt)
감염 없음 (0 Pt), 최근 감염 또는 감염 추정 (1 Pt), 패혈증 (4 Pt)
약물 스테로이드 (1 Pt), 비-스테로이드계 (1 Pt)
흡연자 흡연 안함 (0 Pt), 흡연 함 (5 Pt).
지연성 치유 환자는 고도의 연조직 결함을 가지고 있었으며, 보다 복합적인 치료를 받으며, 보다 심각한 임상적인 감염 상태이며, 더 많은 스테로이드계 또는 비-스테로이드계 항염증제들을 복용하였다 (표 2).
파라미터 지연성 치유 환자 정상 치유 환자
원발성 손상 (폐쇄됨) 100 % (7/7) 100% (8/8)
골절 유형 AO - B 57.1% (4/7) 62.5 % (5/8)
골절 유형 Moore 42.9% (3/7) 37.5% (3/8)
ASA 클래스 1 또는 2 100% (7/7) 100% (8/8)
Weber & Cech
(비후성)		 14.3% (1/7) 25% (2/8)
Weber & Cech
(빈영양성 (oligotrophic))		 85.7% (6/7) 75% (6/8)
골절 갭 (0.5 - 1.0 cm) 57.1% (4/7) 75% (6/8)
골절 갭 (1.0 - 3.0 cm) 42.9% (3/7) 25% (2/8)
외과적 방법 (경피) 0% (0/7) 12.5% (1/8)
외과적 방법 (Pin) 0% (0/7) 12.5% (1/8)
외과적 방법 (ORIF) 100% (7/7) 75% (6/8)
개입 횟수 (< 2) 85.7% (6/7) 100% (8/8)
개입 횟수 (2-4) 14.3% (1/7) 0% (0/8)
골질 (양호) 71.4% (5/7) 87.5% (7/8)
골질 (보통) 28.6% (2/7) 12.5% (1/8)
연조직 결함 (보편적인 수술) 14.3% (1/7) 87.5% (7/8)
연조직 결함 (소규모 치료) 28.6% (2/7) 12.5% (1/8)
연조직 결함 (복합적인 치료) 42.9% (3/7) 0% (0/8)
연조직 결함 (혈관 분포도 불량) 14.3% (1/7) 0% (0/8)
임상적인 감염 상태 (깨끗함) 85.7% (6/7) 100% (8/8)
임상적인 감염 상태 (이미 감염됨) 14.3% (1/7) 0% (0/8)
스테로이드/NSAID 치료 14.3% (1/7) 0% (0/8)
흡연 상태 25% (1/7) 37.5% (3/8)
표 2
도 1은 수술 후 치유 합병증 발병 위험성을 나타내는, "칼로리 스코어"를 도시한 것으로, 이는 정상 치유 환자에 비해 지연성 치유 환자에서 유의하게 높았다 (스코어 32.6 ± 6.3 대 25.8 ± 5.1; p = 0.05).
실시예 2: 보행 분석
수술 6, 12 및 18 주에 보행 분석을 수행하여, 환자의 기능적인 상태를 평가하였다 (도 2). 이에 의해, 지연성 치유 환자는 유의하게 느린 보행 속도와 최고 지면 반력을 나타내었으며, 2종의 다른 군들의 방사선학적 분류가 입증되었다. 아울러, 지연성 치유군에서는 치유 시간의 연장이 명확하게 확인되었다. 놀랍게도, 수술 후 18주째에서야 지연성 치유 환자는 정상 치유 군에서의 수술 후 6주차의 보행 속도 수준에 해당되었다.
실시예 3: CD3+ T 세포 집단에서의 CD8+/CD4+ 세포의 빈도
CD3+T- 세포 중 CD8+/CD4+ 퍼센트에 대한 유의한 차이가 2종의 군들 간에 확인되었다 (도 3). 지연성 치유 환자는 정상 치유 환자와 비교하여 전체 시간대들에서 CD3+ T 세포 중 CD8+/CD4+ 퍼센트가 지속적으로 더 높게 나타났다. 아울러, 시간 경과에 따라 양쪽 군들에서는 CD3+ T 세포 중 CD8+/CD4+ 퍼센트에 대한 차이는 관찰되지 않았다. 각 군과 시간대 별 단일 세포 값을 표 3에 나타낸다.
실시예 4: CD8+ T-세포 집단에서 CD11a++ 세포의 빈도
18주의 전체 실험 기간 동안, CD11a++ T-세포의 발현은 지연성 치유 군이 정상 치유 환자 보다 유의하게 더 높았다 (도 4). 아울러, 지연성 치유 환자는 기준 범위 (점선) 보다 병리학적으로 증강된 CD11a++ T-세포 수준을 나타내었다. 또한, 이들은 통합한 건강 대조군 (unfractured healthy control group)과 비교하여 현저하게 높은 값을 나타내었다. 지연성 치유 환자 3명과 정상 치유 환자 3명을 수술 후 60주간 평가하였다. 양쪽 군은, 동일한 CD11a++ T-세포 농도를 나타내었다. 시간 경과에 따라 각 군에서 차이는 확인되지 않았다. 각 군과 시간대의 단일 세포 값들을 표 4에 나타낸다. 인간 환자에서 CD11a++ (고 양성) 및 CD11a+ (양성) 분획에 대한 2번의 측정과 분석에 대한 예를 도 12에 도시한다.
실시예 5: CD8+-T-세포 집단에서 CD57+ 세포의 빈도
CD8+ T 세포에서 CD57+의 발현에 대해 지연성 치유 환자와 정상 치유 환자들 간에 현저한 차이가 관찰되었다 (도 5). 현저하게도, 지연성 치유 환자는 정상 치유 환자 또는 건강한 사람의 정상치와 비교하여 55%-73% 보다 높은 CD57+ 퍼센트를 나타내었다. 또한, 정상 치유 환자는 기준 범위내였지만, 지연성 치유 환자는 결과적으로 이러한 기준 범위 (점선) 보다 높은 CD8+CD28- 수준을 나타내었다. 아울러, 이러한 차이는 18주의 전체 실험 시간 동안 안정적이었다. 수술 후 첫주에 약간의 차이를 시작으로, 이러한 차이는 입원한 2주 동안 유의해졌다. 실험 기간 동안, 각 군에서 CD8+CD57+ 차이는 발견되지 않았는데, 이는 골절에 대한 반응이라기 보다는 오히려 개별 면역 경험임을 반영해준다. 각 군과 시간대 별 단일 세포 값들을 표 5에 도시한다.
실시예 6: CD8+-T 세포 집단에서 CD28- 세포의 빈도
CD8+CD28- T-세포들에서도 비슷한 양상이 확인되었다 (도 6). 본 실시예에서, 지연성 치유 환자는, 정상 치유 환자 또는 건강한 사람의 수치 보다, 각각 29%-34% 높은 CD8+CD28- T-세포 수준을 지속적으로 나타내었다. CD8+CD57+ T-세포의 결과와 마찬가지로, CD8+CD28- T-세포 퍼센트의 차이는 입원한 2주차 동안에 유의하게 되었으며, 이러한 차이는 또한 전체 실험 기간 동안, 그리고 수술 후 60주 동안 안정적이었다. 또한, 실험하는 동안 각 군내에서도 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 각 군과 시간대 별 단일 세포 값들을 표 6에 나타낸다.
실시예 7: 사이토카인 발현 IL-6, IL-8, TNFα
수술 후 1주차와 2주차 사이에 IL-6 수준은 양쪽 군에서 유의하게 감소되었다 (지연성 환자 p = 0.03; 정상 환자 p = 0.003) (도 7). 그러나, 수술 후 2번째 주 이후에는 지연성 치유 환자의 IL-6 수준이, 정상 치유 환자의 수술 후 첫번째 주의 IL-6 수준 보다 한층 더 높았다. 각 군과 시간대 별 단일 세포 값들을 표 7에 나타낸다.
군들 간에는 유의한 IL-8 수준 차이가 없었지만, IL-8 수준이 양쪽 군에서 수술한 지 1주 - 2주에 현저하게 감소되었다 (지연성 환자 281.4 ± 162.7 vs. 195.4 ± 77.3 pg/mL; p = 0.04 및 정상 치유 환자 219.3 ± 66.8 vs. 182.9 ± 55.9 pg/mL; p = 0.01).
TNFα 수준의 경우, 실험 기간 동안 양 군들 간 및 군내에서 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 8: 말초혈에서 혈종으로의 CD8+ TEMRA 이동
골절 혈종은 골절 치유의 초기 단계에 나타나므로, 따라서 치료 성과에 대한 지침을 제공하는 키-플레이어 (key-player)일 수 있다. 즉, CD8+TEMRA 서브세트가, 이의 고유착 분자 (예, CD11a) 발현으로 인해, 골절부에 농화될 수 있는지를 평가하였다. 폐쇄성 경골 근위부 골절을 가진 다른 4명의 환자의 말초혈과 골절 혈종 샘플 쌍들을 분석하였다 (도 8). 서브세트 분석을 통해 모든 환자들의 골절 혈종에서 CD28- CD8+TEMRA의 농화가 말초혈에 비해 1.8-2.5배 (p<0.05) 농화된 것으로 드러났다. 비슷한 결과들은 1.4 - 3.7배의 농화 (p=0.07)를 보이는 CD57+ CD8+TEMRA 서브세트들에서도 확인되었다.
실시예 9: CD8+ TEMRA 세포에 의한 강한 IFN-γ 생산
CD8+ TEMRA 세포는 강력한 사이토카인 생산자인 것으로 간주된다. 실제, 플레이트에 코팅한 항-CD3/28 mAb에 의해 T 세포를 생체외 자극한 후, CD3+8+57+28- 서브세트 안에서 가장 강력한 사이토카인 반응 (>50% IFN-γ 생산 세포)이, 다른 T 세포 서브세트들 (CD4+, 전체 CD8+, CD8+57-28+ T-세포; 18-35% IFN-γ 생산 세포)과 비교하여, 관찰되었다 (도 9). 흥미롭게도, 골 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 T 세포 증식을 저해할 수 있는, 인간 골수 유래 MSC (BM-MSC)는, 기억 T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 억제할 수 없었는데, 이는 이들 면역 세포가 조직 인자들에 의한 네거티브 신호에 내성을 나타낸다는 것을 입증해준다 (도 9).
실시예 10: TNF-α 및 IFN-γ에 의한 골수 간엽 기질 세포의 골형성 저해
다음으로, 골 세포에 대한 IFN-γ 및 TNF-α의 효과를 시험관내 골원성 분화 및 생존 분석을 이용하여 조사하였다.
도 10은, (CD3+8+) CD11a++, CD57+ 및 CD28- T 세포들이 IFN-γ 및 TNF-α를 통해 BM-MSC의 골 형성을 저해한다는 것을 보여준다. 도 10 B와 C는 IFN-γ 및 TNF-α가 각각 지정된 농도로 첨가된 골형성 매질을 처리한 이후의, BM-MSC에 대한 대표적인 사진 (상단 패널)을 도시한 것이다. 다이아그램은 세포 수로 표준화한 알리자린 레드 (ODAR)의 광학 밀도 값을 나타낸다. 도 10 D와 E는 사이토카인이 지정된 농도로 첨가된 매질에서 배양한 다음 alamarBlue(R)로 측정한 BM-MSC 생존성을 도시한 것이다. 도 10 F는 CyQuantTM으로 측정한 총 DNA 양에 대해 표준화한 카스파제-GloTM 3/7 분석의 상대적인 형광 값을 도시한 것이다. 도 10 G는 생체외 자극하여 분류한 CD8+ TEMRA의 컨디셔닝화된 매질 (CM)에서 배양한 후, BM-MSC의 매트릭스 무기질화를 CM을 사용하지 않은 대응되는 대조군에 대해 상대적으로 도시한 것이다. a-f에서 n=4이고, g의 경우 n= 3이다. CM 처리 세포 대 무처리 대조군의 본페로니 보정을 이용한 분산 분석 * P<0.05, ** P<0.01, # P<0.05. 점선은 무처리 대조군의 값을 표시한다.
사이토카인 둘다의 첨가는 농도 의존적인 방식으로 인간 BM-MSC의 골형성 분화를 저해하였다 (도 10A 및 10B). 흥미롭게도, IFN-γ는 그렇지 않았지만, TNF-α는 10-100 ng/ml 농도에서 인간 BM-MSC의 생존성을 현저하게 감소시켰다 (도 10C 및 10D). 이러한 관찰 결과를 검증하기 위해, 세포자살율 (도 10E)을 구하였다. 예상한 바와 같이, TNF-α는 농도-의존적인 방식으로 인간 BM-MSC에서 카스파제3/7의 활성을 증가시켰지만, IFN-γ는 효과가 없었다.
CD8+ TEMRA 세포들, 이들의 특이적인 사이토카인 분비 및 매트릭스 무기질화에 대한 부정적인 효과 간의 잠재적인 고리를 추가로 조사하기 위해, 생체외에서 자극하여 분류한 CD8+ TEMRA 세포의 컨디셔닝화된 매질 (CM)을 사용하였다. 골원성 분화가 이루어지는 동안, BM-MSC를 2배 농축된 골형성 배지로 1:2로 희석한 CM에서 배양하였다. 미리, CM에서의 IFN-γ와 TNF-α의 농도를 측정하였고 (Donor 1: cIFN-γ=1.6ng/ml, cTNF-α=1.8ng/ml; Donor 2: cIFN-γ=2.1ng/ml, cTNF-α=5.1ng/ml), 무자극 세포의 CM에 비해 명확하게 증가됨을 확인하였다 (Donor 2: cIFN-γ=0.4ng/ml, cTNF-α=0.2ng/ml).
양쪽 공여자의 생체외 자극한 CD8+ TEMRA 세포로부터 유래된 CM은 BM-MSC 분화를 완전히 저해하였지만, 무자극 CD8+ TEMRA 세포의 CM은 표준 골형성 매질과 비교하여 유의한 효과를 나타내지 않았다 (도 10F-H). 더욱이, IFN-γ 또는 TNF-α 중 어느 하나에 대한 중화 항체를 자극된 CD8+ TEMRA 세포에 첨가하면, 매트릭스 무기질화가 약간 증가하였다. 하지만, 이들 항체들을 조합하면 BM-MSC의 매트릭스 무기질화가 거의 완전히 역전되었다.
요컨대, 이들 결과는, IFN-γ와 TNF-α가 둘다 골형성을 저해할 수 있으며, 따라서 골 치유를 지연하는 잠재적으로 기여한다는 것을 보여준다. TNF-α의 저해 효과는 적어도 부분적으로는 세포자살 유도로 인한 것으로 보이는 반면, IFN-γ는 골원성 분화를 직접 방해하는 것일 수 있다.
실시예 11: CD8+ 고갈은 마우스 모델에서 골절 치유를 향상시킨다
기억 CD8+ T-세포와 골절 치유 불량의 발생 간의 잠재적인 인과 관계를 마우스 모델에서 더욱 조사하였다.
도 11은, CD8+ 고갈이 마우스에서 골절 치유를 개선함을 도시한 것으로, A)는 CD8+ T 세포가 고갈된 동물 (CD8-, n=6), 비변형된 면역 세포 스펙트럼을 가진 동물 (WT, n=6), 반-무균 조건 하에 사육한 동물 (WTexp, n=4) 및 CD8+ T-세포를 후천적으로 전이시킨 동물 (CD8+, n=3)의 골수 (BM)에서, CD3+TCRα/β T-세포들 중 CD8+ 수준을 도시하며, B)는 표시된 군의 BM에서 CD3+ T 세포들 중 CD62L-CD8+의 양을 도시한다. C와 D는 A에 기술된 군들에 대한 정량적인 μCT 평가 결과를 도시하며, E-H는 표시된 군의 대표적인 μCT 이미지를 도시한다. 본페로니 보정을 이용한 분산 분석 * P<0.05, ** P<0.01.
첫번째 동물 군의 경우, 항체 요법으로 CD8+ 세포를 고갈시켰으며 (CD8- group), 그 결과 골 치유가 개선될 것으로 예상하였다. 성공적인 고갈은 유세포 측정에 의해 혈액에서 확인하였다. 거의 완전한 CD8+ T-세포 고갈은 수술 당일에 달성되었고, 12일간의 치유 기간 동안 부분적으로 회복되었다 (고갈 직전 CD3+CD8+ 20.8%, 수술일 CD3+CD8+ 0.07%, 21일 CD3+CD8+ 6.1%). 2번째 군은 비변형된 면역 세포 스펙트럼을 가지고 있었으며 (WT-group, n=6), 특이 병원체가 없는 장벽-유사 하우징 조건 (SPF) 하에 생장시키고 유지시켰다. 이 군의 경우, 동물의 면역계는 병원체에 대한 접촉이 매우 제한되어 있어, CD62L-CD8+ 기억 T-세포의 퍼센트가 매우 낮았다. 3번째 군 (WT)의 경우, 마우스를 장벽이 없는 반-무균 조건 하에 4주 이상 두었다. 이 동물은 병원체들에 광범위하게 노출되어, 강화된 CD62L-CD8+ 기억 T-세포 수준을 나타내었다. 마지막 군 (CD8+)은 CD8+ T-세포의 수를 더욱 증가시키기 위해 CD8+ T-세포를 후천적으로 전이시켰다.
수술한 지 21일 후에, 골수에서 CD8+ T 세포의 양을 측정하였다. 예상한 바대로, CD8+ T 세포의 퍼센트는 다른 모든 군들과 비교하여 CD8- 군에서 눈에 띄게 낮았다 (도 11a). 아울러, BM내 CD8+ T 세포는 CD8- 군 (13 ± 6.6), WT 군 (30 ± 5.8), WTexp 군 (37 ± 2.8)으로 점진적으로 증가하여, CD8+ 군 (40 ± 3.6)에서 최고 %로 검출되었다. 비슷한 결과는 기억 CD62L-CD8+ T 세포 아집단에서도 확인되었으며, 또한 이는 CD8- 군이 다른 모든 군들에 비해 현저하게 낮았다 (도 11b).
이에, 골절 가골 품질에 대한 μCT 평가에서 골 체적/총 체적 비 (BV/TV)와 골 체적 밀도의 CD8- 군에서 CD8+ 군까지로의 점진적인 감소가 확인되었다 (도 11c-h). 이들 결과는 기억 CD8+ T 세포의 농화와 골질 저하 간의 인과 관계를 입증해준다.
실시예 12: 수술 전과 후 혈액 및 골절 혈종 (FH)에서의, 골절 환자의 CD8+ T 세포 집단 중 CD57+ 세포 빈도.
도 13은, 이러한 세포 표현형이 수술 전과 후의 값이 비슷한 사실을 통해 외과적 개입에 의해 영향을 받지 않으며, 따라서 수술전 예후 마커로서 적합하다는 것을 보여준다. 아울러, 지연성 골절 치유를 예상하기 위한 계산된 후향적 컷 오프 수치를 이용하여, 환자들 중 3명에서 지연성 치유 프로세스를 예상할 수 있다 (화살 표시됨).
즉, 혈액 및 골절 혈종에서의 CD8+CD57+ 세포의 빈도는 장골 골절 환자에서 지연성 치유 프로세스에 대한 적합한 척도이다.
실시예 13: 수술 전과 후 혈액에서, 및 골절 혈종 (FH)에서의, 골절 환자의 CD8+ T 세포 집단 중 CD28- 세포.
CD45+3+8+28- T-세포에 대해 비슷한 결과가 확인되었다 (도 14). 즉, 이 표현형은 외과적 개입에 의해 영향을 받지 않으며, 전술한 바와 같이 동일한 3명의 환자에서 지연성 치유 프로세스를 예상할 수 있다.
실시예 14: 수술 전과 후 혈액에서, 및 골절 혈종 (FH)에서의, 골절 환자의 CD4+ T 세포 집단 중 CD57+ 세포 및 CD28- 세포의 빈도.
CD8+ TEMRA 세포는 골절 치유 프로세스에서 중요한 네거티브 역할을 수행한다. 따라서, 작동자/기억 및 조절 T-세포 (Tregs)는 치유 프로세스를 강화하여, 보다 빠르고 성공적인 치유 결과를 도출한다. 도 15는, 이들 세포가 외과적 개입에 영향을 받지 않으며, 골절 혈종으로 현저하게 이동되었음을 보여준다.
개념과 증거
장골의 지연성 또는 심지어 불완전 (비-유합 치유) 치유는 환자의 약 5-10%에서 발생하며, 장기적인 성과 불량과 연관되어 있으며 사회-경제적인 부담도 높다. 본 발명에서는, 참여한 환자들 중 41%가, 골절 갭 또는 가골 형성 및 일차 수술 개입 후 18주 동안의 신체 기능 저하로 확인되는 바와 같이, 지연성 치유를 나타내었다. 특히, 지연성 치유 환자는 수술 18주 차의 보행 속도가 정상 치유 군의 수술 6주차 수준과 비슷하였다.
가장 중요한 점은, 지연성 치유가 증폭되고 연장된 염증성 반응과 밀접한 관계가 있으며, 표현형 CD3+8+11a++28-57+ (CD8+ TEMRA)를 발현하는 최종 분화된 CD8+ 작동자 T 세포의 빈도가 현저하게 증가 (>2배)된다는 것이다. 이 차이는 시간 경과에 따라 안정적이었는데, 이는 골절에 대한 반응이라기 보다는 개체의 면역 경험이라는 것을 의미한다.
CD8+CD57+를 발현하는 림프구는 정상 세포자살 경로의 조절 장애에 의해 후기 만성 (바이러스) 감염에서 증식된다. 임상적인 개입은 환자의 치유 과정에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다. 본 실험에서, 개입 횟수, 수술 방법 또는 양 그룹 간의 골질에는 차이가 발견되지 않았다.
부가적으로, 상해로 인한 중증 연조직 결함은 경골 골절에서 흔한 것으로 알려져 있는데, 환자가 위험 군인지에 대한 추가적인 표시를 제공할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 측정한 이러한 위험의 존재 여부가 유익할 수 있다.
소규모 환자 카운트와는 독립적으로, 데이타를 통해, 개별 면역 프로파일 (CD8+TEMRA의 빈도)가 골절 치유 결과를 예측하는 신뢰성 있는 바이오마커이며, 따라서 조기 개입이 가능하다는 것을 입증해준다.
환자 번호 CD3+ TC 중 CD4+CD8+ TC %
1주 		CD3+ TC 중 CD4+CD8+ TC %
2주 		CD3+ TC 중 CD4+CD8+ TC %
4주		 CD3+ TC 중 CD4+CD8+ TC %
6주		 CD3+ TC 중 CD4+CD8+ TC %
12주		 CD3+ TC 중 CD4+CD8+ TC %
18주		 CD3+ TC 중 CD4+CD8+ TC %
15개월
1 3.01 2,32 . . . . .
2 0,87 0,9 0,57 0,85 0,69 3,62 .
4 0,52 0,84 0,93 1,14 0,84 1,35 1,22
5 0,76 0,53 0,52 1,15 1,36 1,11 .
7 1,88 2,46 3,26 2,4 2,44 4,27 .
8 0,45 0,84 1,07 0,47 0,62 0,64 .
9 0,55 0,48 0,44 0,37 0,84 0,55 .
10 0,92 1,33 2,13 1,01 1,42 0,86 1,25
11 4,11 4,16 4,07 4,38 3,83 4,33 .
12 1,55 1,66 1,84 1,32 1,35 1,85 .
13 2,72 3,16 3,47 2,61 2,97 3,17 .
14 11,6 13,27 9,47 7,65 8,28 10,55 11,67
16 0,71 1 0,6 0,86 0,83 0,94 0,56
17 1,62 2,79 2,24 1,84 1,89 1,78 .
18 28,96 26,12 27,19 23,77 18,94 19,56 21,26
표 3 (수술 후 지정된 모든 시간대; TC: T-세포)
환자 번호 CD8+ TC 중 CD11a+ %
1주		 CD8+ TC 중 CD11a+ %
2주		 CD8+ TC 중 CD11a+ %
4주		 CD8+ TC 중 CD11a+ %
6주		 CD8+ TC 중 CD11a+ %
12주		 CD8+ TC 중 CD11a+ %
18주		 CD8+ TC 중 CD11a+ %
15개월
1 66 60 . . . . .
2 60 69 . 64 67 76 .
4 78 81 84 87 87 91 88
5 63 64 63 69 71 61 .
7 84 85 88 85 91 86 .
8 29 33 38 30 28 28 .
9 43 62 75 48 57 63 .
10 49 40 38 45 36 46 38
11 67 66 67 69 65 67 .
12 66 68 64 72 62 62 .
13 48 46 46 42 44 47 .
14 78 84 79 70 75 79 79
16 58 49 52 47 49 45 52
17 74 76 71 78 77 78 .
18 92 87 90 90 88 88 86
표 4 (수술 후 지정된 모든 시간대; TC: T-세포)
환자 번호 CD8+ TC 중 CD57+ %
1주		 CD8+ TC 중 CD57+ %
2주		 CD8+ TC 중 CD57+ %
4주		 CD8+ TC 중 CD57+ %
6주		 CD8+ TC 중 CD57+ %
12주		 CD8+ TC 중 CD57+ %
18주		 CD8+ TC 중 CD57+ %
15개월
1 56 48 . . . . .
2 52 44 . 32 40 42 .
4 20 27 38 31 35 39 29
5 30 30 29 41 30 30 .
7 24 28 33 35 32 33 .
8 7 8 6 4 5 4 .
9 12 13 18 18 17 16 .
10 5 6 6 5 6 6 2
11 23 22 21 16 16 22 .
12 39 38 38 46 32 36 .
13 36 23 20 22 23 27 .
14 52 51 48 40 44 50 43
16 39 28 32 29 32 31 29
17 36 40 36 37 36 37 .
18 74 72 73 68 59 59 45
표 5 (수술 후 지정된 모든 시간대; TC: T-세포)
환자 번호 CD8+ TC 중 CD28- %
1주		 CD8+ TC 중 CD28- %
2주		 CD8+ TC 중 CD28- %
4주		 CD8+ TC 중 CD28- %
6주		 CD8+ TC 중 CD28- %
12주		 CD8+ TC 중 CD28- %
18주		 CD8+ TC 중 CD28- %
15개월
1 59 49
2 60 54 40 49 56
4 24 34 55 41 46 49 40
5 34 34 32 34 33 35
7 33 31 35 37 35 40
8 10 11 12 10 9 10
9 11 14 14 18 16 16
10 16 16 16 12 19 14 11
11 17 20 12 12 16 17
12 39 43 41 46 32 40
13 29 25 20 20 26 28
14 59 56 50 46 51 56 56
16 40 29 32 30 32 35 40
17 39 40 36 37 38 37
18 78 75 77 71 62 63 63
표 6 (수술 후 지정된 모든 시간대; TC: T-세포)
환자 번호 IL-6, pg/ml
1주		 IL-6, pg/ml
2주		 IL-6, pg/ml
4주		 IL-6, pg/ml
6주		 IL-6, pg/ml
12주		 IL-6, pg/ml
18주		 IL-6, pg/ml
15개월
1 31,2 7,6
2 4,8 3,9 2 2 2 3,6
4 5,4 2 2 2,2 2 2 2
5 7,3 2 2 2 2 2
7 6,3 6 6 7,6 6,8 4
8 9,3 2 2 2 2 2
9 9,8 6,3 2,7 4,4 3,5 6,5
10 3,8 3 2 2 2 2 2
11 3,8 2 2 2 2 2
12 27,5 23,2 3,3 2 4 2
13 2,7 2 2 2 2 2
14 2 2 2 2 2 2 2
16 8,8 2,8 4,2 2 2 2 2
17 9,7 7,5 4,5 3,6 2,7 2
18 35,7 4,6 2,5 3,2 2,7 2,7 5,7
표 7 (수술 후 지정된 모든 시간대)

Claims (14)

  1. 지연성 골절 치유 (delayed bone fracture healing)의 예후를 예상/예측하기 위한 방법으로서,
    개체로부터 수득한 샘플에서, CD8+CD57+, CD8+CD28- 및 CD8+CD28-CD57+로 구성된 제1 군으로부터 선택되는 CD8+ 세포의 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플에서 CD8+CD11a++, CD8+CD11a++CD28-, CD8+CD11a++CD57+ 및 CD8+CD11a++CD28-CD57+로 구성된 제2 군으로부터 선택되는 CD8+ 세포의 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 샘플에서 CD3+ 세포의 CD8+CD4+ 아집단의 빈도를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 말초혈 샘플에서 IL-6의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체의 칼로리-스코어 (Calori-Score)를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 CD8+ 세포의 아집단의 빈도, 상기 IL-6의 수준 또는 상기 칼로리-스코어를 표준과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    CD8+CD4+ 세포의 빈도가, 정상적인 골절 치유를 나타내는 대규모 환자 집단에서 결정된 표준 값과 비교하여, 2배 이상인 샘플은, 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    CD11a++, CD28- 또는 CD57+인 세포의 빈도가, 정상적인 골절 치유를 나타내는 대규모 환자 집단에서 결정된 표준 값과 비교하여, 10% 이상인 샘플은, 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    - CD8+ 세포들 중 CD28- 또는 CD57+인 세포의 빈도가 30% 이상인 샘플은 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정되고,
    - CD8+ 세포들 중 CD11a++인 세포의 빈도가 65% 이상인 샘플은 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정되고,
    - CD3+ 세포들 중 CD4+인 세포의 빈도가 5% 이상인 샘플은 지연성 골절 치유 가능성이 높은 군으로 지정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 지연성 골절 치유에 대한 진단 시스템으로서,
    - 개체로부터 수득한 샘플에서 세포 집단의 빈도 또는 IL-6의 수준을 측정하기 위한 디바이스, 및
    - 프로그램화된 마이크로프로세서를 포함하며,
    상기 프로그램화된 마이크로프로세서는 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따른 방법을 수행하기 위해 장착되고 설계된 것임을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 상기 디바이스는 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따라 상기 아집단의 빈도를 확인하기 위해 장착되고 설계된 것임을 특징으로 하는 시스템.
  13. 지연성 골절 치유를 진단하기 위한 부품 키트 (kit of parts)로서,
    항-CD8-항체, 항-CD4-항체 및 항-CD11a-항체를 포함하며,
    상기 항체는 형광을 이용한 유세포 측정에 적합한 것임을 특징으로 하는, 부품 키트.
  14. 제13항에 있어서, 항-CD57 항체 및/또는 항-CD28-항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201418896D0 (en) * 2014-10-23 2014-12-10 Isis Innovation Biomarker and therapy intervention for malignancy risk patients
US11164082B2 (en) * 2017-02-28 2021-11-02 Anixa Diagnostics Corporation Methods for using artificial neural network analysis on flow cytometry data for cancer diagnosis
US11802873B2 (en) 2017-05-29 2023-10-31 Charité Universitätsmedizin Berlin CD8 T cell subsets as a biomarker for predicting non-fusion after spinal fusion surgery
EP3499236A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-19 Charité - Universitätsmedizin Berlin Cd8 t cell subsets as a biomarker for predicting non-fusion after spinal fusion surgery
DE102017125150B4 (de) * 2017-10-26 2019-10-10 Epiontis Gmbh Endosialin (CD248) als epigenetischer Marker zur Identifizierung von Immunzellen, insbesondere naïver CD8+ T-Zellen
WO2023110942A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Charité-Universitätsmedizin Berlin Prevention of impaired fracture healing

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6180403B1 (en) * 1999-10-28 2001-01-30 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of tumor necrosis factor alpha converting enzyme (TACE) expression
JPH11183481A (ja) * 1997-12-25 1999-07-09 Teijin Ltd 骨折治癒早期診断法
WO2002024228A1 (fr) 2000-09-21 2002-03-28 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Méthode de régulation de la formation d'ostéoclastes
ATE441857T1 (de) * 2001-07-10 2009-09-15 Univ Leland Stanford Junior Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis des aktivierungszustands multipler proteine in einzelzellen
US20030129665A1 (en) * 2001-08-30 2003-07-10 Selvan Gowri Pyapali Methods for qualitative and quantitative analysis of cells and related optical bio-disc systems
BR0315629A (pt) * 2002-11-15 2005-08-23 Warner Lambert Co Método para baixar a cpr e reduzir a inflamação sistêmica
CA2505534A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Anthrogenesis Corporation Cytotherapeutics, cytotherapeutic units and methods for treatments using them
GB0314461D0 (en) * 2003-06-20 2003-07-23 Isis Innovation Suppression of transplant rejection
NZ554065A (en) * 2004-10-07 2010-12-24 Univ Zuerich Use of an anti-interferon-alpha antibody for prevention and treatment of psoriasis
US20090305308A1 (en) * 2005-03-21 2009-12-10 Walter Schubert Method for identifying cell-specific protein combination patterns
AU2006230419A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Targeted Genetics Corporation Methods for lowering the level of tumor necrosis factor (TNF) in TNF-associated disorders
CN101238218A (zh) * 2005-05-20 2008-08-06 维克西斯公司 初级细胞的转导
JP2007089788A (ja) * 2005-09-28 2007-04-12 Asahi Kasei Corp ＣＤ４９ｄ強陽性細胞除去材料
US20100129460A1 (en) * 2005-10-14 2010-05-27 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compounds and methods for peptide ribonucleic acid condensate particles for rna therapeutics
EP2271671A2 (en) * 2008-03-24 2011-01-12 Abbott Biotechnology Ltd. Tnf-alpha inhibitors for treating bone loss
FR2953023B1 (fr) * 2009-11-23 2011-12-09 Commissariat Energie Atomique Utilisation d'une isoforme d'hla-g comme marqueur de l'osteogenese
US20120014947A1 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 The University Of Chicago Methods and compositions to reduce liver damage associated with conditions or therapies that affect the immune system

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