KR20140116103A

KR20140116103A - 치료 방법

Info

Publication number: KR20140116103A
Application number: KR1020147019564A
Authority: KR
Inventors: 에인절 로페즈; ?튼 쉬바르쯔
Original assignee: 메드벳 싸이언스 피티와이. 리미티드
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-10-01
Also published as: CA2859213A1; IN2014DN05769A; CN104540938A; EP2791324B1; AU2012350357A1; US20140348793A1; EP2791324A4; JP2015500297A; WO2013086574A1; EP2791324A1

Abstract

본 발명은 일반적으로 포유류에서 해마를 재생시키는 방법 및 그에 사용하기 위한 제제에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 신경능 줄기 세포의 하위군을 투여함으로써 포유류에서 해마를 재생시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 해마 손상으로 특징지워지는 질환, 예컨대 신경정신병적 장애의 치료에 유용하다.

Description

치료 방법{METHOD OF TREATMENT}

[0001] 본 발명은 일반적으로 포유류에서 해마를 재생시키는 방법 및 그에 사용하기 위한 제제에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 신경릉 줄기 세포 (neural crest stem cells)의 하위군 (sub-population)을 투여함으로써 포유류의 해마를 재생시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 해마 손상으로 특징지워지는 질환들, 예컨대 신경정신계 질병들의 치료에 유용하다.

[0001] 본 명세서에서 저자에 의해 언급된 공개문헌들의 서지적 상세는 본 기재의 말미에 알파벳 순으로 모아져 있다.

[0002] 본 명세서 중 임의의 선행 기술에 대한 언급은 그 선행 기술이 호주에서 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 승인 또는 좌우간의 제시가 아니며, 그로써 받아들여져서는 아니된다.

[0003] 정신분열증 (Schizophrenia)은 인간에게 알려진 가장 무기력하고 감정적으로 가장 파괴적인 병들 중 하나이다. 불행하게도, 정신분열증은 아주 오랫동안 오인되었기 때문에 상대적으로 거의 주목받지 못하였고, 이로 인한 희생자들은 가치없게 비난받았었다. 사실, 정신분열증은 아주 일반적인 질환이다. 정신분열증은 남성 및 여성 모두에게 동일하게 영향을 미치고 전세계적으로 약 1%의 인구에서 발병한다. 다른 약 2-3%는 보다 가벼운 형태의 질병인 분열성 인격장애 (schizotypal personality disorder)를 가진다. 정신분열증의 유병률 (prevalence) 및 심각성으로 인해, 상기 질병을 진단하기 위한 보다 나은 기준들을 개발하기 위한 노력으로 정신분열증이 심층적으로 연구되어 왔다.

[0004] 정신분열증은 일단 (constellation)의 독특하고 예측가능한 증상들로 특징지워진다. 상기 질병과 가장 일반적으로 연관된 증상들은 소위 양성 증상들 (positive symptoms)로, 이는 심하게 비정상적인 행동의 존재를 의미한다. 이들은 사고 장애 (따라가기 어려운 말 또는 어떠한 논리적인 연결 없이 하나의 주제로부터 다른 주제로 건너뛰는 것), 망상 (학대, 죄책감, 위엄 또는 조절을 벗어난 존재에 대한 잘못된 믿음) 및 환각 (시각적 또는 청각적)을 포함한다. 사고 장애는 명확하고 논리적으로 생각하는 능력이 감소된 것이다. 종종, 사고 장애는 정신분열증을 가진 사람을 대화에 참여할 수 없게 만드는, 단절되고 무의미한 언어로 드러남에 따라 그의 가족, 친구들 및 사회로부터 그 사람의 소외를 초래한다. 망상은 정신분열증을 앓는 사람들에게서 공통적이다. 발병된 사람은 그가 어떠한 음모를 꾸미고 있다 ("편집광의 망상 (paranoid delusion)"으로 불림)고 믿을 수 있다. "사고전파 (broadcasting)"는 망상의 한 타입으로, 이 질병을 앓는 사람은 그의 생각이 다른 이들에게 들릴 수 있다고 믿는다. 환각은 들리거나, 보이거나 또는 심지어 느껴질 수 있다. 가장 빈번하게는, 환각은 오직 유병자에게만 들리는 목소리 형태를 가진다. 그러한 목소리들은 사람의 행태를 묘사하거나, 그에게 위험을 경고하거나, 또는 그에게 해야할 무언가를 얘기할 수도 있다. 때때로, 그 사람은 대화를 동반하는 여러 목소리들을 들을 수 있다. 상술한 "양성 증상들" 및 "사고장애"보다 덜 명확하지만 정상 행동의 부재를 나타내는 결손 또는 음성 증상들 (deficit or negative symptoms)도 동일하게 심각하다. 상술한 결손 또는 음성 증상들은 강직된 또는 둔마된 정동 (flat or blunted affect; 즉, 감정적 표현의 부재), 무관심 (apathy), 사회적 회피 (social withdrawal) 및 통찰력의 결여 (lack of insight)를 포함한다.

[0005] 나이든 사람들에게서 발병되는 것으로 알려져 있지만, 정신분열증의 개시는 보통 청소년기 또는 초기 성인기 중에 발생한다. 개시는 수주 동안 발병하는 급성 증상들과 함께 빠르게 진행될 수 있거나, 또는 수개월 또는 심지어는 수년 동안 발병 과정이 천천히 진행될 수 있다. 정신분열증은 인생의 어느 시점에서든 누군가에게든 영향을 줄 수 있지만, 일반적으로 후기 청소년기 또는 초기 성인기에 발생하는 초기 정신병적 에피소드 (first psychotic episode)와 함께 유전적으로 상기 질병에 더 걸리기 쉬운 사람들에게서 어느 정도 더 흔하다. 아무도 정신분열증을 가지지 않았던 두 명의 부모의 자손으로서 정신분열증이 발병할 가능성은 1%이다. 한 명이 정신분열증을 가진 부모의 자손으로서 정신분열증이 발병할 가능성은 약 13%이다. 양쪽 모두 정신분열증을 가진 부모의 자손으로서 정신분열증이 발병할 가능성은 약 35%이다. 이는 유전적 연결점 (link)의 존재를 나타낸다.

[0006] 정신분열증을 가진 사람들의 3/4은 16세와 25세 사이에 발병하게 된다. 30세 이후에는 개시가 흔하지 않고 40세 이후에는 드물다. 16-25세 연령 그룹에서, 정신분열증은 여성들보다 남성들에 더 영향을 끼친다. 25-30세 그룹에서는 발병 (incident)은 남성들에서보다 여성들에게서 더 높다.

[0007] 일반적으로, 어떠한 질병에 대한 연구는 진단을 위하여 우수한 기준들이 있어야할 필요가 있다. 사실, 진단은 결국 원인들, 즉 질병이 유전적 결함, 바이러스 또는 박테리아 감염, 독성물질 또는 스트레스로부터 야기되는지 여부에 기반해야 할 것이다. 불행하게도, 대부분의 정신병적 질병들의 원인들은 알려져 있지 않고 이로 인해 상술한 질환들은 여전히 4개의 주요 정신적 능력들 중 어느 것이 영향받는 지에 따라 그룹화되고 있다:

(i) 사고 (thinking) 및 인지 (cognition)에 관한 질환들

(ii) 감정 (mood)에 관한 질환들

(iii) 사회적 행동에 관한 질환들; 및

(iv) 학습 (learning), 기억 및 지성에 관한 질환들.

[0008] 상술한 상태들의 생물학적 원인들에 대해 거의 알려져 있지 않기 때문에, 그에 따라 상술한 질병들이 유도되고 진행되는 메커니즘을 설명하는 것에 대해 계속적 요구가 있다.

[0009] 14-3-3 단백질들은 발생 과정 동안 및 성인 조직에서 풍부하게 발현되는 매우 보존된 조절성 분자들의 패밀리로 구성된다. 상술한 단백질들은 세포주기 조절, 증식, 이동, 분화 및 세포자멸사 (apoptosis)를 조절하는 기능적으로 다양한 다수의 시그널링 분자들에 결합하는 7개의 유별한 이소형들 (isoforms; β, ζ, ε, γ, η, τ, σ)을 포함한다 (Berg et al. Nat Rev Neurosci 2003; 4(9):752-762; Fu et al. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2000; 40:617-647; Toyo-oka et al. Nat Genet 2003 Jul; 34(3): 274-285; Aitken A., Semin Cancer Biol 2006; 16(3):162-172; Rosner et al. Amino Acids 2006; 30(1):105-109).

[0010] 정신분열증에서 상기 단백질 14-3-3 패밀리의 분자들의 역할이 있다면, 그것은 지금까지 밝혀지지 않았다. 이제까지 결론을 내지 못하고 있을지라도, 일부 연구는 정신분열증과 같은 신경정신병적 상태를 발병시키는 소인과 연관된 단일 염기 다형성 (single nuclear polymorphism)을 동정하는 데 집중하였다. 단백질 14-3-3 이소형 분자들이 돌연변이 되었는지 아닌지와 관계없이, 상기 단백질 이소형들의 수준 변화를 조사하는데 목적을 둔 연구들은, 지금까지 에타 (eta) 및 세타 (theta) 이소형들이 신경정신병적 상태의 개시에 대한 신뢰할만한 마커들이라는 어떤 결정적인 증거가 없었음에도 불구하고 이들의 수준 변화에 주력하는 경향이 있었다. 베타 및 제타 같은 상기 단백질 14-3-3 이소형들 중 다른 단백질과 관련하여, Wong 등 (2005)은 정신분열증 및 양극성 장애에서 그 발현 수준에서 어떠한 변화도 발견하지 못했다. Middleton 등 (2005)은 재차 확인하여 상술한 특정 이소형들이 정신분열증을 발병의 유전적 위험과 직접적으로 연관되어 있지 않은 것 같고 어떠한 마커도 정신분열증과 강한 연관성을 제공하지 않았다고 명시하였다.

[0011] 그럼에도 불구하고, 상술한 발견들에 반하여, 본 발명의 실마리가 되는 작업에서는, 단백질 14-3-3ζ/DISC1 형성의 특정 수준에 있어서 단백질 14-3-3ζ의 기능적 수준에서의 감소가 정신분열증의 하나 이상의 증상들로 특징지워지는 상태 같은 신경정신병적 질환의 개시 또는 개시로의 소인과 연관된다는 것이 확인되었다.

[0012] 이러한 발견들이 틀림없이 정신분열증 개시에 대한 감수성을 예단하기 위한 진단 개발이라는 관점에서 고도로 연관된 것이라고 하여도, 이 기술 분야의 숙련자라면 진단적 증상의 존재가 반드시 잠재적 치료법에 대한 교시를 주는 것은 아님을 이해할 것인데, 이는 검출 가능한 진단 마커들 그 자체가, 믿을만한 마커라고 하더라도, 종종 그 질병의 실제 원인에 대하여는 2차적이기 때문이다. 질병 상태와 관련한 "원인과 효과"의 직접적인 지식 없이는, 유효한 치료법의 설계는 사실상 불가능하게 된다. 이를 위하여, 신경정신병적 질환, 예컨대 정신분열증을 효과적으로 치료하는 방법의 계발이 오래도록 추구되어 왔다.

[0013] 이를 위하여, 본 발명에 이르는 추가적인 작업에 있어서, 14-3-3ζ 및 14-3-3ζ/DISC1 복합체 기능의 결함이 비정상적 신경 세포 이동으로부터 발생하는 해마의 발생 이상을 일으키는 것으로 확인되었다. 더욱이, 해마 발생의 관점에서, Nrp2⁺ 신경릉 줄기 세포가, 이는 신경릉 줄기 세포의 하위군인데, 특이적으로 해마의 신경 세포로 분화하며 상기 해마를 효과적으로 재생시킨다는 것이 확인되었다. 그러므로, 이것이 정신분열증과 같은 신경정신병적 질환의 치료적 처리에 대한 설계를 용이하게 하고 있다.

[0014] 문맥이 특별하게 언급하지 않는 한 본 명세서 및 이어지는 청구항 전반에 걸쳐서, 단어 "포함하다 (comprise)" 및 "포함하다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)" 같은 변이형들은 지시된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 함유를 내포하는 것으로 이해될 것이지만, 다른 어떤 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 다른 어떤 그룹의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.

[0015] 본 명세서에서 사용되는 용어 "로부터 유래된 (derived from)"은 특정 정수 또는 정수들의 그룹이 명시된 종들로부터 유래하지만 반드시 상기 명시된 소스로부터 직접적으로 얻어지는 것일 필요는 없다는 것을 지시하는 것으로 받아들여질 것이다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "하나 (a)", "및 (and)" 및 "그 (the)"의 단수 형태들은 문맥이 특별히 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상들을 포함한다.

[0016] 다르게 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.

[0017] 본 발명의 한 측면은 해마 결손으로 특징지워지는 질환을 앓는 포유류를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 한동안 그리고 해마의 효과적인 재생에 충분한 조건 하에서 상기 포유류에게 유효한 숫자의 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그 돌연변이체 또는 변이체를 투여하는 것을 포함한다.

[0018] 다른 측면에 있어서, 해마 결손으로 특징지워지는 질환을 앓는 인간을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 한동안 그리고 해마의 효과적인 재생에 충분한 조건 하에서 상기 포유류에게 유효한 숫자의 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그 돌연변이체 또는 변이체를 투여하는 것을 포함한다.

[0019] 그러므로, 또 다른 측면에 있어서, 해마 결손으로 특징지워지는 질환을 앓는 포유류를 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 한동안 그리고 해마의 효과적인 재생에 충분한 조건 하에서 상기 포유류에게 유효한 숫자의 성인 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그 돌연변이체 또는 변이체를 투여하는 것을 포함한다.

[0020] 본 발명의 또 다른 측면은 해마 결손으로 특징지워지는 포유류의 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그 돌연변이체 또는 변이체의 용도에 관한 것으로서, 상기 줄기 세포는 해마를 재생시키는 것이다.

[0021] 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포를 포함하는 단리된 세포군에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

[0022] 도 1: 14-3-3ζ-결손 마우스는 비정상적인 인지 및 행동 특성들을 보인다.

(a) 14-3-3ζ^062-/- 마우스 (개방된 막대; n = 11)가 OFT (open field test)에서 14-3-3ζ^062+/+ 마우스 (채워진 막대; n = 11)보다 5-30주령에서 더 큰 탐사 행동 (exploratory behaviour)을 가진다. (b) 14-3-3ζ^062-/- 마우스 (개방된 막대; n = 12)가 고가 플러스 미로 (elevated plus maze, EPM)의 개방된 팔 (open arm)에서 14-3-3ζ^062+/+ 마우스 (채워진 막대; n = 12)보다 더 많은 시간을 소모한다. (c) 14-3-3ζ^062-/- 마우스 (개방된 막대; n = 12)가 교차 미로 탈출 업무 테스트 (cross maze escape task test)에서 공간 학습 (제1일-제6일) 및 기억 (M1 및 M2) 모두에 대해 14-3-3ζ^062+/+ 마우스 (채워진 막대; n = 12)보다 더 낮은 능력을 가진다. (d) 14-3-3ζ^062+/+ 마우스 (채워진 막대; n = 11)와 비교하여, 상기 14-3-3ζ^062-/- 마우스 (개방된 막대; n = 11)는 70 dB의 기준선 (baseline)보다 2, 4, 8 및 16 dB의 높은 PP (prepulse)와 100 msec의 자극-간 간격(inter-stimulus interval, ISI)에서 감소된 PPI (prepulse inhibiton)를 가진다. 모든 PP 강도들로부터 얻어진 데이터의 평균 (Avg)도 제시된다. 수컷 마우스 및 암컷 마우스로부터 얻어진 데이터가 모든 그래프들에서 수집된다. 오차 막대는 평균값 ± SEM으로 제시된다. *, p< 0.05; **, p < 0.01; ***, p< 0.001.

[0023] 도 2: 14-3-3ζ가 암몬각 ( Ammon's horn )의 피라미드 세포 (pyramidal cells ) 및 치아 이랑 ( dentate gyrus )의 과립형 뉴런들에서 발현된다.

(a) (i) 해마의 다른 부위들을 묘사하는 14.5 dpc (days post coitum) 배아 마우스 뇌를 가로지르는 관상 절편 (coronal section)의 도식적 제시. V, 뇌실 (ventricle); IZ, 중간대 (intermediate zone); VZ, 뇌실대 (ventricular zone). (ii) P0 마우스 해마를 가로지르는 관상 절편의 도식적 제시. 해마원기 (hippocampal primordium)로부터 얻어진 뉴런들은 뇌실의 신경상피 (옅은 파란색) 및 해마술 (fimbria)에 인접한 신경상피 (짙은 파란색)로부터 유래한다. 암몬각 (Ammon's horn) 및 이의 층들 (so, 지향층 (stratum oriens); sp, 피라미드층 (stratum pyramidale); sl, 투명층 (stratum lucidum); sr, 방사층 (stratum radiatum))을 구성하는 암몬각 (cornu ammonis; CA1-3)의 피라미드 뉴런들을 포함하는 3개의 소구역들 (subfields)이 치아이랑 (DG) 내 과립형 뉴런들의 위치에 대해 상대적으로 묘사된다. (b) (i-ii) 14-3-3ζ 면역활성이 해마를 발생시키는 14.5 dpc의 중간대에서 검출되었다. (iii-iv) P0 시기에, 14-3-3ζ-양성 뉴런들이 피라미드세포 층에 위치한다. (v) 상기 피라미드형 뉴런들 (별표)의 더 높은 확대는 14-3-3ζ가 반점 모양의 세포질 내 위치를 가진다는 것을 보여준다. (c) X-gal 염색은 P0, P7 및 성체 14-3-3ζ^062+/- 해마에서 14-3-3ζ의 내인성 발현을 나타낸다. 높은 수준의 14-3-3ζ-lacZ 발현이 피라미드형 및 과립형 뉴런들에서 명백하다. (d) 해마 뉴런 배양. (i) EB1을 통한 14-3-3ζ 염색 (빨간색). (ii) MAP2-양성 해마 뉴런들 (녹색). (iii) 14-3-3ζ와 MAP2의 오버레이 (overlay)는 MAP2-양성 신경돌기들 (화살표)에서의 공동-발현을 강하게 나타낸다. (e) 14-3-3ζ 단백질 (27 kDa)은 야생형 (WT) 마우스의 암몬각 및 치아 이랑에서 발현된다. 성체 WT 및 14-3-3ζ^062-/- 마우스로부터 얻어진 용해물에 대한 웨스턴 블랏은 14-3-3ζ에 대한 항체 (EB1)로 면역블랏팅하여 프루브를 붙였다. 항-β-액틴(42 kDa) 항체는 로딩 대조군으로 이용되었다. 축척 막대 = 100 ㎛ (bi-iv; c; di-iii), 25 ㎛ (bv).

[0024] 도 3: 14-3-3ζ-손상된 마우스는 해마의 층상배열 결손 ( lamination defects)을 나타낸다.

(a) Niss1 염색은 14.5 dpc부터 생후 56일 (P56)까지의 WT 및 14-3-3ζ^062-/- 마우스의 해마 발생을 보여준다. 해마성 세포들은 14-3-3ζ^062-/- 마우스 (iv, vi, viii)의 피라미드층 (sp)에서 사라진다. 화살표 머리는 방사층 (sr) 내 해마 피라미드형 뉴런들의 이중 층을 강조하는 것이다. 별표는 지향층 (so) 내 이상적으로 (ectopically) 위치된 피라미드 세포들을 강조하고 있다. 화살표는 치아 이랑에서 느슨하게 배열된 과립형 뉴런들을 지시한다. (b) 14-3-3ζ⁰⁶²백그라운드로 도입된 Thy1-YFP 트랜스유전자 발현은 14-3-3ζ^062-/-마우스의 해마 피라미드형 뉴런들의 심각한 붕괴 (disorganization)를 나타냈다. 파란색, DAPI; 녹색, Thy1 발현. (c) 지시된 유전형의 P0 (i-iv) 및 P56 (v-vi) 마우스로부터 얻어진 해마의 관상 절편들. 더 깊은 피라미드층이 CA1부터 CA3까지 균일한 성숙 영역을 형성하는 WT 해마들 (iii, 황색 화살표 머리)에서 NeuN-양성 피라미드 세포들에 의해 점유되어 있다. 14-3-3ζ^062-/-마우스의 해마들에서, CA3 내 피라미드층의 더 깊은 지역 (노란색 화살표 머리)과 표재성 지역 (superficial zone; 하얀색 화살표 머리) 모두에서 이상적으로 위치되는 일부 NeuN-양성 성숙 피라미드세포들과 함께 성숙 지역이 덜 균일하였다. P56 14-3-3ζ^062-/-마우스에서, NeuN에 대한 면역염색은 이중의 CA3 소구역들에서 피라미드 세포들을 강조하였다 (vi). 축척 막대: 100 ㎛.

[0025] 도 4: BrdU -펄스 ( pulse )- 체이스 ( chase ) 분석은 14-3-3ζ-손상된 마우스에서 뉴런 이동 결함을 나타낸다.

14.5 dpc:P7 (i-v) 및 16.5dpc:P7 (vi-x)에서의 BrdU-펄스-체이스 분석은 BrdU-양성 세포 들(검은색)이 WT 해마의 CA3 소구역들에서 피라미드층 (sp) 안에 위치한다는 것을 증명한다 (ii & vii). (v) 그래프는 14.5dpc:P7에서 이상 (ectopic) 해마 뉴런들의 백분율을 요약한 것이다. P56 14-3-3ζ^062-/-마우스의 BrdU-표지된 세포들은 이상적으로 위치되었다. 뉴런들은 지향층 (so)에서 멈춰지거나, 또는 피라미드층을 넘어 투명층 (sl) 내로 이동하였다 (iv & ix 내 화살표 머리). (x) 그래프는 16.5dpc:P7에서 이상 해마 뉴런들의 백분율을 요약한 것이다. 축척 막대: 100 ㎛.

[0026] 도 5: 14-3-3ζ-손상된 마우스에서 비정상적인 이끼 섬유 ( mossy fibre) 경로들.

14-3-3ζ^062+/+마우스 (i, iii, v 및 vii) 및 14-3-3ζ^062-/-마우스(ii, iv, vi 및 viii)에서 피라미드 아래 (infrapyramidal) 이끼 섬유 궤적 (IPMF, 노란색 화살표 머리) 및 피라미드 위 (suprapyramidal) 이끼 섬유 궤적(SPMF, 하얀색 화살표 머리)의 칼빈딘 면역 염색. WT 대조군들과 유사하게도, 14-3-3ζ^062-/- 손상된 신경돌기들은 치아 이랑 (DG)으로부터 떨어져 나온 후 처음부터 두 갈래, SPMF 및 IPMF 가지들로 나뉘어진다. 하지만, 14-3-3ζ^062-/-마우스의 IPMF 가지는 피라미드 세포 세포체 (somata)들 사이로 비정상적으로 돌아다녔다 (sp, 하얀색 화살표). 또한, 14-3-3ζ^062-/-마우스의 분산된 SPMF 가지는 CA3 소구역들에서 이중 피라미드 세포층을 침입하였다 (vi). 축척 막대: 100 ㎛.

[0027] 도 6: 이상 ( ectopic ) CA3 피라미드 세포와 잘못 인도된 ( misrouted ) 이끼 섬유 간의 기능적 시냅스 연결.

(a) (i-iv) 시냅토피신 (synaptophysin, Syp)에 대한 항체들로 염색된 P56 14-3-3ζ^062+/+ 마우스의 해마 절편들은 IPME (하얀색 화살표 머리) 및 SPMF (노란색 화살표 머리) 모두에서 면역 활성을 나타낸다. Syp 염색은 CA3의 피라미드 세포체 주변인 지향층 (so) 및 투명층 (sl) 모두에 위치한다. (v-viii) 14-3-3ζ^062-/-마우스로부터 얻어진 해마 절편들에 대한 Syp 염색은 CA3의 피라미드층 내에서 비정상적으로 돌아다니는 상기 이끼 섬유들 (별표, v, vii)이 기능적 시냅스들을 형성한다는 것을 보여준다. (ix-xii) 이상 성숙한 CA3 피라미드 세포 (NeuN에 의해 염색됨; 별표와 함께 묘사됨)가 잘못 인도된 이끼 섬유들로부터 유래된 시냅스 단백질 (synaptic protein; Syp, 녹색)과 상호 소통한다. 축척 막대 = 100 ㎛. (b) 골지 염색은 WT 또는 14-3-3ζ^062-/-성체 마우스 (P35)의 피라미드 세포들의 수지상 돌기의 가지 뻗기 (dentritic arborization)를 나타낸다. 잘못 인도된 이끼 섬유 시냅스성 말단 (synaptic boutons)과 접촉점을 나타내는 하나의 세트의 가시 형태의 이상 성장물들 (thorny excrescences; MFB, 비스듬한 선)이 WT 뉴런들 내 CA3 피라미드세포의 선단수상돌기 중심부 쪽 (apical proximal dendrites)에 위치된다. 두 개의 세트의 가시 형태의 이상 성장물들이 14-3-3ζ^062-/-마우스의 선단수상돌기 트리에 위치하는 데, 하나는 선단수상돌기 중심부 쪽에, 그리고 다른 하나는 원거리 수상돌기 가지들 (*)에 위치한다. (c) 도식적 도해는 WT 해마에서 비교된 것과 같이 14-3-3ζ^062-/-마우스에서 이상 CA3 피라미드세포들과 상호소통하는 잘못 인도된 이끼 섬유 궤적들 및 이끼 섬유 말단의 비정상적 시냅스성 지점들을 묘사한다.

[0028] 도 7: 14-3-3ζ는 뉴런 발생을 조절하기 위해 DISC1 과 상호작용한다. (a-b).

P7 마우스 뇌로부터 동일한 양의 용해물이 항-DISC1 항체 또는 항-14-3-3 항체들로 면역침전되고 14-3-3ζ를 검출하기 위해 DISC1 (a) 또는 EB1-정제된 항혈청 (b)으로 면역블랏팅하였다. 또한, 공동-면역침전에 이용된 5%의 총 세포 용해물로부터 DISC1 이소형들과 14-3-3ζ의 상대적인 발현 수준이 직접적인 면역블랏팅에 의해 결정되었다. 화살표는 DISC1의 주요 100 kDa 및 75 kDa 밴드들(a) 및 14-3-3ζ를 나타내는 27 kDa 밴드(b)를 나타낸다. 별표는 면역침전으로부터 얻어진 백그라운드 IgG 밴드들을 나타낸다. (c) 신경 이동 및 축색돌기 성장에서 14-3-3ζ의 기능에 대한 개략적인 묘사. (i) 14-3-3ζ는 CDK5-인산화된 Ndel1에 결합하여 LIS1과의 상호작용을 촉진시킴으로써 신경 이동을 증가시킨다. (ii) 또한, 14-3-3ζ는 축색돌기 성장 동력학을 조절하는 LIS1/Ndel1/DISC1 복합체에 존재한다.

[0029] 도 8: 14-3-3ζ 유전자의 유전자 트랩 돌연변이.

(a) 마우스 라인 14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST062 ^)Lex에 대한 삽입 위치를 보여주는 도식이고 (b) 마우스 라인 14-3-3ζ^Gt( ^OST390 ^)Lex에 대한 삽입 위치를 보여주는 도식이다. 유전자 트랩 벡터는 선택가능한 마커 유전자 (0 갈락토시다제/네오마이신 포스포트랜스퍼라제 융합 유전자의 경우 BGEO)에 융합된 스플라이싱 억셉터 서열 (splice acceptor sequence, SA)을 포함하고, 이로 인해 내인성 14-3-3ζ 프로모터 하에서 발현된다. 14-3-3ζ의 업스트림 엑손으로의 통합되는 경우, BGEO는 mRNA 전사를 방해하는 융합 전사체를 생산한다. 또한, 상기 벡터는 PGK 프로모터 및 이에 이은 스플라이싱 수여 시그널 (splice donor (SD) signal)의 업스트림에 BTK (Bruton's Tyrosine Kinase gene)의 첫 번째 엑손을 포함한다. BTK는 다운스트림 융합 전사체들의 해독을 예방하기 위해 모든 판독 프레임 (reading frames)에 대한 종결 코돈들을 포함한다. 상기 유전자 트랩 벡터는 2개의 긴 말단 반복들 (LTR) 사이의 레트로바이러스 형태에서 묘사되고 있다. 양쪽 그림들에서, 화살표들은 유전자형 분석을 위해 이용된 프라이머들을 지시한다. 빨간색 박스들은 비-코딩 비해독된 서열을 나타내고 녹색 박스들은 코딩 서열을 지시한다.

[0030] 도 9: 웨스턴 블랏 분석은 14-3-3ζ 발현이 돌연변이 마우스의 모든 조직들에서 감소된다는 것을 보여준다.

조직들은 수컷 및 암컷 14-3-3ζ^062-/-마우스 모두에서 수거되었으며, 동일 주령의 수컷 및 암컷 14-3-3ζ^062+/+마우스 모두에서 수득되었고 (b) 수컷 및 암컷 14-3-3ζ^390-/-마우스 모두에서 수거되었으며, 동일 주령의 수컷 및 암컷 14-3-3ζ^390+/+마우스 모두에서 수득되었다. 실험재료 및 실험방법에 기재된 바와 같이, 모든 시료들은 프로테아제 억제제들을 포함하는 NP40 용해 완충액에서 균질화시켰다. 단백질 농도는 피어스 BCA 단백질 어세이 키트를 이용하여 결정되었고, 10 ㎍의 단백질이 레인 당 로딩되었다. 블랏들은 14-3-3ζ을 검출하기 위한 EB-1 항체로 프로빙되었으며, 항-β-액틴 (1:5000)이 로딩 대조군으로 이용되었다. 결합된 항체들은 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 (1:20,000; Pierce-Thermo Scientific)로 검출되었다. 면역반응성 단백질들은 ECL을 통해 시각화되었다. EB-1 항체는 14-3-3ζ 이외에 14-3-3 이소형들도 검출할 수 있다는 것에 주목.

[0031] 도 10: 14-3-3 이소형들의 mRNA 수준은 14-3-3ζ-손상된 마우스 뇌에서 일정하게 유지된다.

14-3-3ζ^062-/-마우스로부터 유래된 뇌 조직에서 14-3-3ζ 이소형의 결실에 대한 반응에서 모든 14-3-3 이소형들의 전사체 수준이 변화되지 않는다. RNA는 3마리의 14-3-3ζ^062-/-마우스 및 3마리의 동일 주령의 14-3-3ζ^062+/+마우스 대조군의 전체 뇌로부터 분리되었다. 상보적인 DNA (cDNA)가 퀀티텍트 키트 (Quantitect kit; Qiagen)를 이용하여 1 ㎍ RNA로부터 제조되었다. 사이버 그린 (Sybr Green; Qiagen) 및 로터 유전자 기계 (Corbett)를 이용한 실시간 PCR은 14-3-3의 모든 이소형들에 대한 시료들에서 GAPDH와 비교하여 mRNA의 수준을 결정하는 데 이용하였다. 상세한 프라이머의 상세 내용들은 표 1을 참조.

[0032] 도 11: 14-3-3ζ-손상된 마우스는 학습 및 기억에서 인지 기능이상 (cognitive dysfunction )을 나타낸다.

14-3-3ζ^062-/-마우스 (개방된 원; n = 12)는 교차 미로 탈출 업무 테스트에서 공간 학습 (제1일-제6일) 및 기억(M1 및 M2) 모두에 대해 14-3-3ζ^062+/+마우스 (채워진 원; n = 12)보다 더 낮은 능력을 가진다. 14-3-3ζ^062-/-마우스는 연습 기간 및 기억 테스트 기간 (M1 및 M2) 동안 탈출 플랫폼에 도달하는 데 걸리는 시간이 더 길다. 수컷 마우스 및 암컷 마우스로부터 얻어진 데이터가 수집된다. 오차 막대는 평균값 ± SEM으로 제시된다. *, p< 0.05; **, p < 0.01; ***, p< 0.001.

[0033] 도 12: 14-3-3ζ-손상된 마우스는 감소된 놀람 반사 ( startle reflex)를 나타낸다.

14-3-3ζ^062-/-마우스의 놀람 진폭 (개방된 막대; n = 13)은 115 dB의 4개의 맥박-단독 블락들에서 14-3-3ζ^062+/+마우스 (채워진 막대; n = 14)보다 더 낮았다. 모든 블락들로부터 얻어진 데이터의 평균 (Avg)도 제시된다. **, p< 0.05.

[0034] 도 13: 14-3-3ζ 발현은 해마 뉴런들에서 유지된다.

X-gal 염색은 P0 및 P7 14-3-3ζ^062+/-마우스 해마 및 소뇌에서 14-3-3ζ의 내인성 발현을 보여준다. 해마에서 높은 수준의 14-3-3ζ-lacZ 발현은 암몬각의 피라미드형 뉴런들 및 성숙한 치상 뉴런들 (dentate neurons) 모두에서 명백하지만, 생후 소뇌에서는 명확하지 않다. 축척 막대 = 25 ㎛.

[0035] 도 14. 14-3-3ζ-손상된 마우스에서의 해마 층상배열 결손.

Niss1 염색은 14.5 dpc부터 생후 (P0)까지의 WT (i, iii, v) 및 14-3-3ζ^062-/-(ii, iv, vi) 마우스의 해마 발달을 보여준다. 해마세포들은 14-3-3ζ^062-/-의 피라미드층 (sp)에서 사라진다. 화살표 머리는 방사층 (sr) 내 해마 피라미드형 뉴런들의 이중 층을 강조한다. 별표는 지향층 (so) 내 이상적으로 (ectopically) 위치된 피라미드 세포들을 강조한다. 축척 막대 = 25 ㎛.

[0036] 도 15: 14-3-3ζ-손상된 마우스에서 잘못 위치된 뉴런들은 성체기까지 생존한다.

해마원기 (a-f) 및 성숙한 해마 (g-h)에서의 세포자멸사적 (apoptotic) 세포들. 단편화된 세포자멸사적 세포 핵들 (aii 및 bii에서 녹색 TUNEL 양성 세포들이 보여지는 것처럼)의 어떠한 증가도 14-3-3ζ^062-/-의 해마에서 검출되지 않았다. 축척 막대 = 100 ㎛.

[0037] 도 16:

말초 신경계의 발생 중에, Nrp1-양성 신경능 줄기 세포들은 교감 신경계의 크롬친화세포 (c), 뉴런 (n) 및 교세포 (g)와 부신을 형성한다. 반대로, Nrp2-양성 신경능 세포들은 감각 신경계의 뉴런 및 교세포를 형성한다. Nrp1 프로모터로부터 Cre 및 적색 형광단백질들을 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델 (Nrp1:Cre/RFP)을 제조 또는 Nrp2 프로모터로부터 Cre 및 녹색 형광단백질들을 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델 (Nrp2:Cre/GFP)을 제조하였다. 이들 마우스들은 각 하위군을 정제하는 데 사용될 수 있는 Nrp1 및 Nrp2 양성 신경 줄기 세포들의 스펙트럼 분리를 용이하게 한다.

[0038] 도 17:

(A) 베타 갈락토시다제에 대하여 염색된 Nrp2:Cre/GFP 마우스로부터의 P0 마우스 뇌의 두정 섹션 (coronal section). (B) (A)의 박스 영역을 고배율 적용하면, 해마 (h)의 암몬각 (CA1-3) 피라미드 뉴런 및 치아 이랑 (DG) 과립형 뉴런이 Nrp2 발현 신경 줄기 세포들로부터 유래한다는 것이 입증된다. Nrp2는 심실 영역 (VZ)의 신경 줄기 세포들에서도 발현된다.

발명의 상세한 설명

[0039] 본 발명은 단백질 14-3-3ζ의 절대적 수준 또는 단백질 14-3-3ζ/DISC1 복합체 형성 수준의 맥락에서와 같은 단백질 14-3-3ζ의 기능적 수준의 감소가 정신분열증 또는 관련 질병과 같은 신경정신병적 상태의 개시 또는 개시로의 소인을 나타낸다는 결정에 부분적으로 근거를 둔다. 그러나, 이것이 해마의 퇴행을 이끌어낸다는 추가적인 판단이 해마 결손을 나타내는 사람들, 예컨대 정신분열증 환자들에 대한 치료적 처리를 계발하기 위한 기초를 제공하여 왔다. 신경능 줄기 세포들의 하위군이 선택적으로 해마의 뉴런으로 분화되고 해마의 재생에 작용하기 위하여 뇌로 이식될 수 있다는 또 다른 추가적인 판단은, 이러한 발견들과의 조합에 힘입어 현재 정신분열증과 같은 질환에 대한 치료 요법으로의 계발을 이끌었다.

[0040] 따라서, 본 발명의 한 가지 측면은 해마 결손으로 특징지워지는 질환을 앓는 포유류를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 일정 시간 동안 그리고 해마의 재생에 작용하기에 충분한 조건 하에서 유효한 숫자의 Nrp2⁺ 신경능 세포 또는 그 돌연변이 또는 변이체를 상기 포유류에 투여하는 것을 포함한다.

[0041] "해마"에 대한 언급은 뇌의 해마 영역을 말하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 어느 하나의 이론이나 작용 모드로 제한함이 없이 해마는 인간과 다른 포유류의 뇌 중 주요 구성 요소이다. 이는 변연계 (limbic system)에 속하고 단기 기억으로부터 장기 기억으로의 정보의 통합 및 공간 탐색에 있어서 중요한 역할을 한다. 그와 밀접히 연관된 대뇌 피질과 마찬가지로, 해마도 뇌의 좌측 및 우측에 거울상 반쪽을 갖는 짝 구조이다. 인간 및 다른 영장류에서, 해마는 대뇌 피질의 표면 아래, 중간 측두엽 안쪽에 위치한다. 이는 두 주요 연동부: 암몬각 및 치아 이랑을 포함한다.

[0042] 해부학적으로, 해마는 대뇌 피질 가장자리의 정교부이다 (Amaral and Lavenex (2006). "Ch 3. Hippocampal Neuroanatomy". The Hippocampus Book. Oxford University Press). 피질의 가장자리를 따라가는 구조는 소위 변연계 (라틴어 limbus = 가장자리)를 구성하며: 이는 해마, 대상 피질, 후각 피질 및 편도체를 포함한다. 해마는 해부학적으로는 정서적 행동과 연루된 뇌의 부위들 - 시상의 격막, 시상하부 유두체 및 전면 핵 복합체와 연결되어 있다.

[0043] 해마는 전체적으로 휘어진 튜브의 형태를 갖는데, 해마 (seahorse), 숫양의 뿔 (암몬각, 그러므로 CA1 내지 CA4로 세분) 또는 바나나와 다양하게 유추 설명되어 왔다 (전술한 Amaral and Lavenex). 이는 좁은 U 형태로 말리는 단단히 패킹되는 피라미드 뉴런들의 단일층으로 피질이 좁혀지는 구역으로 구분될 수 있는데; "U"의 한 가장자리인 필드 CA4는, 강하게 구부려진 V-형 피질인 치아 이랑과 대면하며 뒤로 포함된다. 이는, 양자 모두 유사한 조성을 공유하지만 서로 다른 신경 회로의 일부인 배쪽 및 등쪽 부분을 구성한다 (Moser and Moser (1998) Hippocampus 8(6): 608-19). 이러한 일반적인 배열구조는 포유류 종 전범위에 걸쳐 보유되는 것이다.

[0044] 해마방회 (parahippocampal gyrus)에 위치하는 내후각 피질 (entorhinal cortex, EC)는 그 해부학적 연결점들로 인하여 해마 영역의 일부로 여겨진다. 이러한 EC는 대뇌 피질의 많은 다른 부분들과 강하고 상호적으로 연결된다. 또한, 시상의 내측 중격핵, 전면 핵 복합체 및 재결합핵 (nucleus reuniens)과 시상 하부의 상유두 핵 뿐만 아니라 뇌간의 봉선핵 및 청반은 EC로 축색돌기를 보낸다. EC 축색돌기의 주요 출력 경로 (관통 경로, perforant path)는 해마이행부를 "관통"하는 층II의 큰 성상 피라미드 세포들로부터 발생하여 치아 이랑의 과립 세포들로 밀도있게 전사, CA3의 꼭대기 수지상 돌기는 보다 약한 전사를 받고, CA1의 꼭대기 수지상 돌기는 저밀도의 전사를 받는다. 따라서, 상기 관통 경로는 EC를 해마와 대뇌 피질의 다른 부분들 간의 주요 "계면"으로 삼는다. 치아 과립 세포 축색돌기 (이끼 섬유라고도 불림)은 CA3 피라미드 세포의 인접 꼭대기 수지상 돌기로부터 나온 가시형 척추 상에 EC로부터의 정보를 전달한다. 그 후, CA3 축색돌기는 세포체의 심부로부터 나와, 상기 꼭대기 수지상 돌기가 위치하는 영역 내로 루프 업한 후, 내후각 피질의 심층 내로 확장 회귀한다 - 상호 회로를 완성하는 샤퍼 콜래트럴 (Shaffer collaterals); 필드 CA1 역시 축색돌기를 EC로 돌려보내지만 이들은 CA3 전사보다 훨씬 밀도가 낮다. 해마 내에서, EC로부터의 정보 흐름은 매우 단방향성인데, 첫번째로 치아 이랑으로, 그 후 CA3 층으로, 그 후 CA1 층으로, 그 다음 해마이행부로, 그 후 해마로부터 나와 EC로, 조밀하게 패킹된 일련의 세포층들을 통한 신호 전달이며, 이는 주로 CA3 축색돌기가 담보한다는 점에서 기인한다. 이들 각각의 층은 또한 복잡한 내재성 회로와 광범위한 종방향 연결을 포함한다 (전술한 Amaral and Lavenex 2006).

[0045] 기타 몇 가지 연결들이 해마의 기능에 있어서 중요한 역할을 한다 (전술한 Amaral and Lavenex 2006). EC의 출력 외에도, 추가적인 출력 경로들이 전두엽 피질을 비롯한 다른 피질 영역들로 이동한다. 매우 중요한 큰 출력은 횡방향 중격 부위로 이동하여 시상하부의 유두체로 간다. 해마는 시상의 재결합핵으로부터 필드 CA1으로, 세로토닌, 노르에프네프린 및 도파민 시스템으로부터 모듈성 입력을 수신한다. 가장 중요한 전사 (projection)는 중간 중격 부위로부터 오는데, 이는 콜린성 및 GABA성 섬유들을 해마의 모든 부분으로 보낸다. 상기 중격 부위로부터의 입력은 해마의 생리학적 상태 제어에 있어서 중요한 역할을 한다: 상기 중격 부위의 파괴는 해마의 세타 리듬을 몰각시키고 특정 유형의 기억을 심각하게 손상시킨다 (Winson (1978), Science 201(4351):160-63).

[0046] 해마와 인접한 대뇌 피질의 영역은 해마방회 (또는 주위해마 (parahippocampus))로 통칭된다 (Eichenbaum et al. (2007), Annu Rev Neurosci 30:123-52). 이는 EC 및 그 이름의 유래가 후각 뇌고랑 옆에 놓여 있다는 데서 유래하는 비주위 피질도 포함한다. 비주위 피질은 복잡한 객체의 시각적 인식에 중요한 역할을 하지만, 그것이 해마의 기여와는 구분될 수 있는 기억에 관한 기여를 제공하고, 해마와 주위해마 양자 모두가 손상되는 경우에만 완전한 기억 상실이 발생한다는 실질적인 증거 또한 존재한다 (Eichenbaum et al. (2007), Annu Rev Neurosci 30:123?52).

[0047] "손상된" 해마에 대한 언급은 그 구조 또는 기능의 전부 또는 일부가 정상적이지 않은 해마에 대한 언급이라고 이해되어야 한다. 이에 대하여, 그 손상은 선천적인 것일 수도 후천적인 것일 수도 있다. 예컨대, 해마의 해부학적 형성기형은 날 때부터 존재할 수 있다. 그러나, 다수의 신경정신병적 및 신경퇴행성 질환들의 개시와 관련한 해마의 손상은 종종 출생 후에 일어나고 부상 (예컨대, 두부 외상 또는 질식)의 결과, 환경적 요인들에의 노출, 마약 복용 등등의 결과이다. 다른 상황에서는, 유전적 결함이 선천적으로 존재하지만 훨씬 나중에까지, 때로 성인이 될 때까지 드러나지 않는다. 상세히 전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 해마 조직의 재생 수단을 제공하는데, 그럼으로써 구조적으로 및 기능적으로 정상인 조직을 적어도 부분적으로 복구한다. 이러한 문맥상, "재생"에 대한 언급은 뇌의 해마 영역 내에 적어도 일부의 정상적인 해마 조직의 생성을 언급하는 것이다. 상기 해마가 전체적으로 교체된다거나 심지어 손상된 조직의 전부가 교체된다는 것을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 방법이 본 발명의 방법의 적용 이전에 대상체에 존재하고 있던 비율과 비교하여 정상 해마 조직의 비율을 증가시킨다는 사실을 언급하는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 병에 걸린 모든 해마 조직의 완전한 정상화라는 맥락상의 적용에 한정되는 것이 아니다. 오히려, 그 손상된 조직의 전부 또는 오로지 일부의 부분적인 정상화에 이른다고 이해되어야 할 것이다.

[0048] 본 명세서에서 사용되는 용어 "포유류"는 인간, 영장류, 가축 동물들 (예컨대, 말, 소, 양, 돼지, 당나귀), 실험실 테스트 동물들 (예컨대, 마우스, 쥐, 기니피그), 반려 동물들( 예컨대, 개, 고양이) 및 포회된 야생 동물 (예컨대, 캥거루, 사슴, 여우)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간 또는 실험실 테스트 동물이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.

[0049] 이러한 구현예에 따라, 손상된 해마로 특징지워지는 질환을 앓는 인간을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 일정 시간 동안 그리고 상기 해마의 재생을 유효하게 하기 위하여 충분한 조건하에서 상기 포유류에게 유효한 숫자의 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그 돌연변이체 또는 변이체를 투여하는 것을 포함한다.

[0050] 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포를 해마가 손상된 포유류의 뇌로 투여하는 것이 단순히 그 세포들의 조직으로의 생착이 아니라 해마 형태성 및 기능성의 보수 및 회복이라는 결과를 낳는다는 판단에 입각하고 있다. "줄기 세포"라는 용어에 의하여 그 세포는 완전히 분화된 것이 아니라 성숙에 이르기 위하여 추가적인 분화를 필요로 한다는 것을 의미하게 된다. 이러한 세포들을 때로 "전구" 세포, "간"세포, "다능성" 세포 또는 "만능성" 세포라고 부른다.

[0051] 본 발명을 어떤 하나의 이론이나 작용 모드로 제한함이 없이, 신경능 세포는 척추 동물에 고유한 일시적, 다능성, 이동성 세포군으로서, 멜라닌 세포, 두부 안면 연골 및 뼈, 평활근, 말초 및 장내 뉴런 및 교세포 등 다양한 세포 계보를 일으킨다. 낭배기 후, 신경능 세포들은 신경판과 비신경 외배엽의 경계에 지정된다. 신경화 (neuralation) 중에, 신경 폴드로도 알려져 있는 신경판의 경계는 배측 (dorsal) 중심선에 수렴하여 신경 튜브를 형성한다. 그 후, 신경 튜브의 지붕판으로부터의 신경능 세포는 신경상피로부터 탈락되어 그들이 다양한 형태의 세포로 분화되는 주변부를 통하여 이동하면서 상피로부터 중간엽으로의 전환을 경험한다. 상기 신경 능선의 발생 근간은 다능성 및 이동성 능력과 같은 세포 특성들을 부여하는 일련의 상호작용적 신호들, 전사 인자들, 및 하류 효과자 유전자들로 설명되는 유전자 조절 네트워크이다.

[0052] 그러므로 "신경능 줄기 세포"에 대한 언급은 신경능 줄기 세포의 기능적 또는 표현형적 특징을 하나 이상 나타내는 임의의 세포 또는 신경능 줄기 세포가 분화할 수 있는 세포형 중 임의의 것으로의 분화 잠재성을 나타내는 임의의 세포를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 대상 신경능 줄기 세포는 다능성을 나타내는 것일 수 있는데, 예컨대 하나 이상의 임의의 다수 주변 구조, 예컨대 두개 골격, 치아의 상아질, 멜라닌 세포, 말초 뉴런, 부신수질 크로마핀 세포 및 모낭 내 특정 세포를 제공하도록 분화시키기 위하여 도입될 수 있는 간세포이거나, 이는 이들 계통의 하위그룹으로 이미 정해진 것일 수 있다. 그러나, 이러한 초기 수준의 확정에도 불구하고, 대상 세포는 여전히 그것이 완전히 분화되지는 않은 것이라는 것에 기초하여 "줄기 세포"이다. "줄기 세포"라는 용어의 사용은 "전구 세포", "다능성 세포", "만능성 세포" 또는 기타 이러한 용어의 사용으로 암시될 수 있는 것과 비교하여 대상 세포의 성숙/미성숙 여부를 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

[0053] 신경능 줄기 세포의 "기능적" 특징을 나타내는 세포에 관한 언급은, 예컨대 상술한 것들과 같은 임의의 하나 이상의 신경능 세포 유래 계통들을 따라 분화되는 것에 한정되는 세포를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. "표현형적" 특징에 대한 언급은 신경능 줄기 세포의 특징인 하나 이상의 단백질 또는 비단백질 분자들의 세포 표면 또는 세포 내 발현 프로파일에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 이를 위하여, 본 발명의 방법에 따르면, 선택적으로 해마의 기능적 뉴런을 ㅈ제공하는 Nrp2 (뉴로필린 2)을 발현하고, 그에 따라 해마의 재생을 위한 세포원인 것은 신경능 줄기 세포임이 이제는 판명되었다. 그러므로, "Nrp2⁺"라는 언급은 Nrp2의 세포 표면 발현으로 특징지워지는 신경능 줄기 세포에 대한 언급으로 이해되어야 한다.

[0054] 여전히 어떤 방식으로든 본 발명을 제한함이 없이, 신경능 줄기 세포는 배아원 또는 보다 편리하게는 성인 제공원 둘 중 하나로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 성인 신경능 줄기 세포는 치아의 상아질 및 모낭 덩이로부터 쉽고 일상적으로 단리될 수 있고, 중추 신경계의 뉴런 및 교세포에 대한 동일한 전구 세포 제공원을 제공할 수 있다. 이식시, 이들 세포들은 GABA성 뉴런 및 올리고덴드로사이트로 분화한다. 따라서, 성인 제공원 또는 배아 제공원 둘 중 어느 것도 본 발명의 방법의 문맥상 사용될 수 있다. 한 가지 구현예에 있어서, 대상 줄기 세포는 성인 줄기 세포이다.

[0055] 그러므로, 이러한 구현예에 따르면, 해마의 손상으로 특징지워지는 질환을 앓는 포유류를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 일정 시간 동안 상기 해마를 유효하게 재생시키기에 충분한 조건하에서 유효한 숫자의 성인 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포를 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함한다.

[0056] 또 다른 구현예에 있어서, 상기 성인 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 상아질 또는 모낭으로부터 단리된다.

[0057] 대상 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군은 단일한 세포 현탁물 또는 세포 집단, 예컨대 조직일 수 있고, 이것은 개체 (예컨대, 치료 대상일 수 있는 개체)로부터 갓 단리되거나, 갓 제공되는 것은 아닌 제공원, 예컨대 배양물 (예컨대, 이때 세포 수는 증대되고 및/또는 세포는 분화 신호에 반응할 수 있도록 배양됨)로부터 제공된 것이거나 세포들로 이루어진 동결 스톡 (예컨대, 확립된 세포주)일 수 있으며, 이는 개체 또는 다른 제공원 중 어느 하나로부터 다소 이른 시점에 단리되었던 것이다. 상기 대상 세포들이 어떠한 다른 형태의 처리 또는 조작, 예컨대 강화 또는 정제, 세포 주기 상태의 변경, 분자 형질 전환 또는 세포주의 형성을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아닌 그러한 처리 또는 조작을 이미 겪었을 수 있다는 것 역시 이해되어야 한다. 따라서, 상기 대상 세포는 1차 세포 또는 2차 세포일 수 있다. 1차 세포는 개체로부터 갓 단리된 것이다. 2차 세포는 그 단리 이후, 세포주의 제조와 같은 어떠한 형태의 실험실 내 (in vitro) 조작을 겪은 것이다.

[0058] 대상 세포군의 "돌연변이체 또는 변이체"에 대한 언급은 상기 세포군으로부터 유래하지만 표현형적 수준 또는 기능적 수준에서 하나 이상의 차이를 나타내는 세포에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 예컨대, 돌연변이체 또는 변이체는 최초 단리 이후에 그 전체적인 또는 일부 기능성이라는 측면으로서 그 세포 표면 마커의 발현이 변경될 수 있다. 이러한 변화는 자발적으로 (예시되건대, 실험실 내 배양 또는 자발적 형질 전환에 뒤이어 일어날 수 있는 세포 표면 마커의 자발적 상승조절 또는 하강조절에 의하여) 또는 예컨대, 세포가 의도적으로 형질 전환 (예컨대, 세포주를 유효하게 생성하기 위하여) 또는 트랜스펙션 (예컨대, 특정 유전자 또는 마커의 발현을 유효하게 하기 위하여)된다면 일어날 지시된 조작의 결과로서 발생할 수 있다.

[0059] 본 발명의 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군은 단일한 표현형적 프로파일 내에서 분화 상태에 있어서 약간의 변이를 나타낼 수 있음을 이해하여야 한다. 즉, 단일한 표현형적 프로파일 내에서, 그 프로파일을 포함하는 세포가 실질적으로 유사한 표현형 및/또는 기능적 특성을 나타낸다고 할지라도, 그럼에도 불구하고 약간의 차이점을 나타낼 수 있다. 이것은, 예컨대 관심사인 표현형적 프로파일을 포함하는 세포들의 전사체 프로파일 또는 세포 표면 마커 발현 (본 명세서에서 정의되는 마커 이외의 것)과 관련한 차이점이라는 관점에서 명백한 것일 수 있다. 예컨대, Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 고도로 특이적이로 별개인 단계를 나타내는 것이 아닐 수 있고, 누군가 이 단계로 분화한 세포들과 그 단계 밖의 성숙하는 마지막의 세포들을 비교하려 한다면 전이 또는 위상을 반영하는 다수의 개별적인 세포 하위군들로 특징지워질 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일 표현형적 프로파일 내 세포 하위군의 존재가 포함된다.

[0060] 실험실 내에서 인간 배아 줄기 세포를 단리하고 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포로 분화시키고자 할 수 있다는 점에서, 이들 세포는 포배기 인간 배아의 내부 세포 매쓰로부터 유래할 수 있고, 또는 확립된 세포주가 사용될 수도 있다 (예컨대, Thomson 및 Odorico에 의하여 개발된 것과 같은 이름하여 H1, H7, H9.1, H9.2, H13 또는 H14 [Trends Biotechnol., 18:53-57 (2002)]). 인간 배아 줄기 세포 배양체를 신생 (de novo) 생성시키기 위하여, 상기 내부 세포 매쓰로부터의 세포들을 미세절제 또는 면역절제 (영양외배엽을 파괴하기 위하여 항체를 사용)하여 주변 영양외배엽으로부터 분리하고 페탈 보바인 세럼으로 보충된 성장 배지 (혹은, 염기성 FGF 함유 녹아웃 Dulbecco 변형 최소 필수 배지가 Serum Replacer (Life Technologies)로 보충되어 세럼 없이 사용될 수 있음)를 함유하는 배양 접시에 도말하는데, 보통은 복제를 방지하기 위하여 유사분열 비활성화시킨 마우스 배아 섬유아세포 피더 레이어 (feeder layer) 상에서 이루어진다. 또는, 피더-불포함 배양 시스템이 사용될 수 있는데, 예컨대 Chunhui Xu, Melissa Carpenter와 그 동료들에 의하여 보고된, 마트리젤 또는 라미닌을 기질로 사용하고, 염기성 FGF, 및 ㅁ마우스 배아 섬유아세포 배앙체로부터의 조절 배지를 사용하는 것이다 (Xu, et al., Nat Biotechnol. 2001 Oct; 19(10):971-4). 그 후, Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군은 이러한 개시 만능성 줄기 세포군으로부터 분화된다.

[0061] 본 발명은 포유류의 뇌로 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군의 집적 (localization)을 촉진하기 위하여 상기 포유류에게 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군을 투여하는 것에 기반을 두고 있다. "집적"은 환자에게 도입되는 상기 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군의 적어도 일부가 뇌를 표적으로 한다는 것을 의미한다. 그러나, 치료라는 임의의 사건의 관점에서, 상기 투여된 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 중 일부는 뇌를 표적하지 않을 수 있고, 제거되거나 뇌 이외의 조직에 위치하게 될 수 있다.

[0062] 본 발명의 문맥상 투여되는 세포들은 단리되어 그들이 최초로 수확된 개체로 회귀 이식되는 자가 (autologous) 세포인 것이 좋다 (예컨대, 상아질 유래 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포). 그러나, 그럼에도 불구하고 본 발명이, 그 대상 세포들이 치료 대상인 개체와 동일한 주요 조직 적합성 (histocompatability) 프로파일을 보여주는 임의의 다른 적합한 제공원으로부터 유래된 세포들을 사용하는 것에 이른다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 이러한 세포들은, 통상 외래의 MHC 프로파일을 나타내는 세포들을 이식하는 것과 관련된 조직 적합성 문제를 유발하지 않을 것이라는 점에서 자가 효과적이다. 이러한 세포들은 "자가"의 정의 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 특정 환경 하에서는 대상 세포들이 유전적으로 동일한 쌍둥이로부터 단리되거나, 대상 개체로부터 유래하는 배우자를 이용하여 생성된 또는 그 대상 개체로부터 클로닝된 배아의 줄기 세포들로부터 분화되는 것이 바람직하거나, 필요하거나 실시상 중요할 수 있다. 상기 세포들은 또한 조작되어 원하는 주요 조직 적합성 프로파일을 나타낼 수 있다. 이러한 세포들을 사용하는 것은 조직 및 기관 이식의 맥락상 본질적으로 맞닥뜨릴 수 있는 어려움을 극복하게 한다.

[0063] 그러나, 자가 세포를 단리 또는 생성하기 불가능하거나 실현이 어려운 경우, 동종이계 (allogeneic) 세포를 이용하는 것이 필요할 수 있다. "동종이계" 세포는 치료될 대상체와 동일한 종으로부터 단리되지만 상이한 MHC 프로파일을 나타내는 것들이다. 치료 맥락상 이러한 세포들을 사용하는 것이 동종이계 계열 면역 반응을 개시시키는 결과를 낳을 수 있으나, 이러한 문제는 치료될 대상체의 그것과 유사성을 나타내는 MHC 프로파일을 보이는 세포들, 예컨대 형제자매, 부모 또는 자식과 같은 친척들로부터 단리/생성된 세포군 등을 이용함으로써 최소화될 수 있다. 종종 동종이계 세포들의 사용시 특징인 면역학적 조직 거부는 또한 면역억제제 약물을 사용함으로써 최소화될 수 있다. 그러나, 이러한 약물들을 사용하느냐 마느냐가 필요해 보이는가는 각 경우의 특정 환경에 달려있다. 본 명세서에서 또한 고려되는 것은 확립된 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포주의 사용이다. 본 발명은 또한 이종의 (xenogeneic) 이식에 이르는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 환자에게 도입되는 세포는 치료될 대상체의 종과는 다른 종으로부터 단리된다.

[0064] "유효한 숫자"에 대한 언급은 적어도 부분적으로 원하는 효과를 달성하거나, 치료될 특정 질환의 개시를 지연, 그의 진행을 억제 또는 그의 개시 또는 진행을 함께 중단시키는 데 필요한 세포들의 수를 의미한다. 물론, 이러한 양은 치료될 특정 질환, 그 질환의 경증도 및 개개인 환자의 파라미터, 예컨대 연령, 신체적 조건, 신장, 체중, 생리학적 상태, 동시 치료, 병력 및 관심 대상 장애와 관련한 파라미터들에 의존적이다. 이 기술 분야의 숙련자는 과도한 실험 없이도 유효한 투여량을 구성할 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포의 수 및 그의 최적 투여 모드를 결정할 수 있을 것이고, 후자는 이하 더 다루게 된다. 이들 인자들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 일상적인 실험만으로 설명될 수 있다. 일반적으로, 최대 세포수, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 최고 안전한 숫자가 사용되는 것이 좋다. 그러나, 의학적 이유, 생리학적 이유 또는 기타 다른 이유로 최저 세포수가 투여될 수 있다는 것을 이 기술 분야의 숙련자는 이해할 것이다.

[0065] 또한, 본 발명의 발명에 따라 투여되는 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포의 모두가 반드시 본 발명에서 언급되는 치료법에 기여하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 예컨대, 일부 세포들은 뇌가 아닌 조직으로 집적할 수 있고, 나머지는 생존하지 못하거나 기능하지 못할 수 있다. 또 다른 예로, Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군이 이종의 세포군 (예컨대 모낭 시료)로부터 정제된 경우, 그 정제된 군은 100% 순도가 얻어지지 않은 비-Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포군을 일부 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 환자에게 도입되는 세포들의 상대적 비율이 전술한 바와 같이 "유효한 숫자"를 구성한다면 달성된다.

[0066] 본 발명의 이러한 측면상, 대상 세포들은 대상 개체로의 도입을 필요로 한다. 이를 위하여, 상기 세포들은 임의의 적절한 방법으로 도입될 수 있다. 예컨대, 세포 현탁물이 직접 주입을 통하여 조직 또는 혈전 내로 도입, 그로써 세포들이 혈전 내에 고정화되어 이식을 용이하게 할 수 있다. 또한, 세포는 이식 이전에 캡슐화될 수 있다. 캡슐화는 증식 (즉, 불멸 특성을 나타내는)이 계속될 수 있는 세포의 전파를 방지하는 데 유용한 기술이다. 또한, 세포는 집적화, 정맥 내 또는 전신 경로로 도입될 수 있다.

[0067] 또한, 세포는 외과적 이식 (그라프팅)에 의하여도 도입될 수 있다. 이는, 예컨대 세포가 조직 그라프트의 형태로 존재하거나, 이식 전 캡슐화된다면 필요할 수 있다. 본 발명을 임의의 이론이나 작용 모드로 제한함이 없이, 세포가 캡슐화된 세포 현탁물로서 투여된다면 세포는 매쓰로 합하여질 것이다.

[0068] 환자에게 투여되는 세포는 임의의 적절한 경로로 단일 투여 또는 복수 투여로서 투여될 수 있다. 좋기로는, 그리고 가능하다면, 단일 투여가 이용되는데, 특히 뇌로의 외과적 이식이 이용되는 방법이다. 주입을 통한 투여는 요구되는 치료의 유형에 따라 다양한 영역의 조직 또는 기관을 향할 수 있다.

[0069] 본 발명의 방법에 따라, 다른 단백질 또는 비단백질 분자들, 예컨대 항생제 또는 분화 유도 사이토카인들이 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포들의 도입과 함께 또는 그 이식된 세포들의 분화 및 증식기 도중에 공투여될 수 있다. "공투여"는 동일하거나 상이한 경로를 통한 동일한 제형 또는 상이한 제형으로 동시 투여, 또는 동일하거나 상이한 경로를 통한 순차적 투여를 의미한다. "순차적" 투여는 이들 세포들의 이식과 상기 단백질 또는 비단백질 분자들의 투여 사이의 초, 분, 시 또는 일에 해당하는 시간차를 의미한다. 예컨대, 상기 대상 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포의 집적화 또는 지시되는 분화를 용이하게 할 공투여 분자가 바람직할 수 있다. 공투여가 필요할 수 있는 다른 예시적 상황을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

[0070] 비동일유전자적 (non-syngeneic) 세포 또는 조직을 대상체에게 투여할 경우, 보통 그 대상체에 의하여 이러한 세포나 조직에 대한 면역 거부가 발생한다. 이 상황에서, 이러한 거부를 최소화하기 위하여, 그 환자를 면역 억제 요법으로서, 좋기로는 이러한 투여 이전에 시작하여 면역 억제 요법으로서 치료할 필요 역시 있을 것이다. 동종이계 그라프트 거부를 억제하기 위한 면역억제 프로토콜, 예컨대 시클로포린 A, 면역억제 항체 등등의 투여를 통하는 등이 널리 알려진 표준 방법이다.

[0071] 치료될 질환의 본질에 의거, 이식된 세포들이 통합되어 완전히 기능하게 될 때까지의 그러한 시기까지 질환의 증상을 경감시키기 위한 일련의 약물 처리를 유지하는 것이 필요할 수 있다 (예컨대, 정신분열증을 치료하기 위한 항정신병 약물의 투여). 또는, 그 질환이 치료되는 시점에, 그 손상의 재발을 방지하기 위하여 약물의 장기 사용을 개시할 필요가 있을 수도 있다. 예컨대, 대상 손상이 자가면역 질환에 의하여 야기되는 경우, 동일유전자적 세포들이 사용되는 경우에도 면역억제 약물의 계속적인 사용이 요구될 수 있다.

[0072] 또한, 본 발명의 방법이 관심 대상의 질환을 치료하기 위하여 단독으로 수행될 수 있고 또는 그것이 대상 치료를 용이하게 하거나 효과를 증진시키기 위하여 설계된 하나 이상의 추가적인 기법들과 함께 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이들 추가적인 기법들은 앞서 자세히 상술한 바와 같이 다른 단백질 또는 비단백질 분자들의 공투여의 형태를 취할 수 있다.

[0073] "해마 손상으로 특징지워지는 질환"이라는 언급은 그 증상 또는 원인이 해마 변성 또는 손상인 임의의 질환을 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 질환들의 예로는 뇌의 선천적 해부학적 이상, 예컨대 두부 외상 또는 질식을 통한 후천성 부상, 장기의 강압 후 제대한 군 장교들에게서 보여지는 것과 같은 위축 및 저형성 또는 기능적 단백질 14-3-3ζ의 수준 또는 단백질 14-3-3ζ/DISC1 복합체 형성의 저하로 특징지워지는 질환들, 예컨대 신경정신병적 질환을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

[0074] "신경정신병적 질환 (neuropsychiatric condition)"에 대한 언급은 신경학적으로 기반된 인지적, 감정적 및 행동적 혼란들에 의해 특징화되는 상태에 대한 언급으로서 이해될 것이다. 그러한 상태에 대한 예들은 하나 이상의 정신분열증 증상들에 의해 특징화되는 상태를 포함하고, 그 중에서도 정신분열증, 분열성 성격장애 (schizotypal personality disorder), 정신병 (psychosis), 양극성 장애 (bipolar disorder), 조울증 (manic depression), 정동장애 (affective disorder), 또는 정신분열형 장애 (schizophreniform) 또는 분열정동성 장애 (schizoaffective disorders), 정신병적 우울증, 자폐증, 약물 유도된 정신병, 섬망 (delirium), 알코올금단증후군 (alcohol withdrawal syndrome) 또는 치매 유도된 정신병을 포함한다.

[0075] 한 가지 구현예에서, 상기 신경정신병적 질환은 하나 이상의 정신분열증 증상들에 의해 특징화되는 질환이다.

[0076] 이러한 구현예에 따르면, 신경정신병적 질환을 앓고 있는 포유류를 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 일정 시간 동안 그리고 해마를 유효하게 재생시키는데 충분한 조건 하에서 유효한 숫자의 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체를 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함한다.

[0077] 한 가지 구현예에 있어서, 상기 포유류는 인간이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 성인 유래 줄기 세포이다.

[0078] 또 다른 구현예에 있어서, 상기 신경정신병적 질환은 하나 이상의 정신분열증 증상들에 의해 특징화되는 질환이다.

[0079] 또 다른 구현예에 있어서, 상기 질환은 정신분열증이다.

[0080] "정신분열증 특유의 증상들 (symptoms characteristic of schizophrenia)"에 대한 언급은 정신분열증으로 고통받는 개인에게서 발생할 수 있는 어떠한 하나 이상의 증상들에 대한 언급으로 이해될 것이다. 상술한 증상들은 질병 과정 전반에 걸쳐 명확할 수 있거나, 또는 단지 일시적으로 또는 주기적으로만 명확할 수 있다. 예를 들어, 정신분열증과 연관된 환각 (hallucinations)은 항상 주기적인 에피소드들로 일어나는 반면에, 특유의 사회적 회피는 진행중인 징후 (manifestation)를 나타낼 수 있다. 또한, 발생된 증상들이 반드시 정신분열증으로 고통받는 모든 개인들에 의해 보여질 필요는 없을 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 개인들은 청각적 환각들로만 고통받을 수 있는 반면에 다른 이들은 시각적 환각들로만 고통받을 수 있다. 하지만, 본 발명의 목적을 위해, 얼마나 많은 정신분열증 환자들 또는 얼마나 극소수의 정신분열증 환자들이 실제로 주어진 증상을 얼마나 나타내는 지와는 상관없이 어떠한 그런 증상들이 이러한 정의에 의해 포괄된다. 본 발명을 어느 하나의 이론 또는 활성 모드에 제한하지 않고, 상기 질병과 가장 일반적으로 연관된 상기 증상들이 양성 증상들 (극도로 비정상적인 행동의 존재를 지시함), 사고장애 및 음성 증상들로 명명되고 있다. 사고장애 및 양성 증상들은 따라가기 어려운 이야기 또는 어떠한 논리적 연결 없이 하나의 주제로부터 다른 주제로 건너뛰기, 망상 (학대, 죄책감, 고상함 또는 조절을 벗어난 존재에 대한 잘못된 믿음) 및 환각 (시각적 또는 청각적)을 포함한다. 사고장애는 명확하고 논리적으로 생각하는 능력이 감소된 것이다. 종종, 사고장애는 정신분열증을 가진 사람을 대화에 참여할 수 없게 만드는 단절되고 무의미한 언어에 의해 명확하게 드러남에 따라 가족, 친구들 및 사회로부터 상기 사람의 소외를 초래한다. 망상은 정신분열증을 가지는 개인들에서 공통적이다. 발병된 사람은 그 또는 그녀가 어떠한 음모를 꾸미고 있다 ("편집광의 망상"으로 불림)고 믿을 수 있다. "사고전파"는 망상의 한 타입으로, 이 질병을 가지는 개인은 그의 생각이 다른 이들에게 들려질 수 있다고 믿는다. 환각은 들려지거나 또는 보여지거나 또는 심지어 느껴질 수 있다. 가장 빈번하게는, 환각은 오직 고통받는 사람에 의해서만 들려지는 목소리 형태를 가진다. 그러한 목소리들은 사람의 행태를 묘사하거나, 그에게 위험을 경고하거나, 또는 그에게 해야할 일을 얘기할 수도 있다. 때때로, 개인은 대화를 수반하는 여러 목소리들을 들을 수 있다. 정상 행동의 부재를 나타내는 결핍 (deficit) 또는 음성 증상들도 상술한 "양성 증상들" 및 "사고장애"보다 덜 명확하지만 동일하게 심각하다. 상술한 결핍 또는 음성 증상들은 강직된 또는 둔마된 정동 (즉, 감정적 표현의 부재), 무관심, 사회적 회피 및 통찰력의 결여를 포함한다. 상기 양성 증상들 및 음성 증상들 모두는 "정신분열증 특유의 증상들"의 정의 안에 포함되는 것으로 이해될 것이다.

[0081] 정신분열증 환자들이 나타내는 증상들의 측면에서 상기 환자들 간에 유의한 변이성 (variation)이 존재할 수 있다는 사실 외에도, 하나 이상의 상술한 증상들에 의해 특징화되는 다른 신경정신병적 질환들이 존재한다는 것도 이해될 것이다. 예를 들어, 환각은 양극성 장애, 정신병적 우울증, 섬망 및 치매 유도된 정신병 같은 질환을 가진 환자들에서도 공통적으로 관찰된다. 따라서, 정신분열증 특유의 하나 이상의 증상들에 의해 특징화되는 질환에 대한 언급은 하나 이상의 상술한 증상들의 존재에 의해 특징화되는 어떠한 신경정신병적 질환에 대한 언급으로서 이해될 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 질환은 정신분열증이다.

[0082] 본 발명의 측면과 관련하여, 치료를 받는 대상체는 치료적 처리 또는 예방적 처리를 받는 것일 수 있고, 치료적 처리 또는 예방적 처리를 필요로 하는 임의의 인간 또는 동물일 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서의 "치료 (처리)" 및 "예방"이라는 언급은 그 가장 넓은 문맥으로 고려된다. "치료"라는 용어는 반드시 포유류가 완전히 회복될 때까지 치료되는 것을 의미하는 것이 아니다. 마찬가지로, "예방"은 반드시 대상체가 결국 질병에 걸리지 않는 것을 의미하는 것은 아니다. 따라서, 치료 및 예방은 특정 질환의 증상 경감 또는 특정 질환을 예방하는 것 또는 달리는 그 질환의 발명 위험을 감소시키는 것을 포함한다. "예방"이라는 용어는 특정 질환의 개시의 중증도의 감소로서 고려될 수 있다. "치료"는 또한 기존재하는 질환의 중증도를 감소시킬 수 있다.

[0083] 본 발명의 또 다른 측면은 해마 손상으로 특징지워지는 포유류의 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그 돌연변이체 또는 변이체의 용도에 관한 것으로, 상기 줄기 세포는 해마를 재생한다.

[0084] 한 가지 구현예에 있어서, 상기 포유류는 인간이다.

[0085] 또 다른 구현예에 있어서, 상기 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 성인 줄기 세포이고, 더욱 특히 상아질 또는 모낭 유래 줄기 세포이다.

[0086] 또 다른 구현예에 있어서, 상기 질환은 뇌의 선천적 해부학적 이상, 예컨대 두부 외상 또는 질식을 통한 후천성 부상, 또는 기능적 단백질 14-3-3ζ의 수준 또는 단백질 14-3-3ζ/DISC1 복합체 형성의 저하로 특징지워지는 질환이다.

[0087] 또 다른 구현예에 있어서, 상기 질환은 신경정신병적 질환, 더욱 특히 정신분열증, 정신분열형 성격 장애, 정신병, 양극성 장애, 조울증, 정서 장애 또는 정신분열병 또는 정신분열 정동 장애, 정신병적 우울증, 자폐증, 약물 유도 정신병, 정신착란, 알코올 금단증상 또는 치매 유도 정신병 중 하나 이상의 증상으로 특징지워지는 질환이다.

[0088] 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포를 포함하는 단리된 세포군에 관한 것이다.

[0089] 본 발명을 하기 비제한적 실시예에 대한 언급을 통하여 추가로 설명한다.

실시예 1

[0090] 실험재료 및 실험방법

마우스. Geo 리포터 유전자를 포함하는 유전자 트랩 컨스트럭트를 운반하고 14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST062 ^)Lex 및 14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST390 ^)Lex 돌연변이 마우스들은 각각 렉시콘 유전학 (Lexicon Genetics) ES 세포주들인 OST062 및 OST390으로부터 유래되었다. 14-3-3ζ^Gt( ^OST062 ^)Lex 마우스들에서 유전자 트랩 벡터는 14-3-3ζ의 첫 번째 인트론에 삽입된 반면에 14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST390 ^)Lex 마우스들에서 유전자 트랩 벡터는 14-3-3ζ의 두 번째 인트론에 삽입되었다. ES 세포주들은 증폭되어 SV129 배반포들에 주입되었다. 결과적인 생식선 전이 수컷들은 SV129 백그라운드에서 유지되거나, 또는 6세대 이상 C57/B16 및 BA1, BC 백그라운드로 역교배되었다. 전체 조직 시료들을 이용한 qRT-PCR 및 웨스턴 블랏이 상술한 마우스 스트레인들에서 상기 유전자의 완전한 KO를 확인하기 위해 이용되었다. 14-3-3C 유전자형은 하기 표 1에 상세하게 기재된 프라이머들을 이용하여 게놈 꼬리 DNA의 PCR 증폭에 의해 확인되었다. 상기 WT 대립형질은 288 bp(14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST062 ^)Lex) 또는 445 bp(14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST390 ^)Lex)의 밴드로 증폭되었으며, 상기 돌연변이 유전자-트랩된 대립형질은 165 bp(14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST062 ^)Lex) 또는 203 bp(14-3-3ζ^Gt ⁽ ^OST390 ^)Lex)의 밴드로 증폭되었다. 마우스들은 표현형적으로 WT 한배새끼들과 구별할 수 없는 이형 육종 쌍들 (heterozygous breeding pairs)로서 유지되었다. 동물 실험들은 의대 및 수의대 대학의 동물윤리위원회 및 애들레이드 대학의 지침에 따라 실시되었다.

[0091] 행동 어세이들 . 모든 과정들은 오전 8시와 오후 12시 사이에 정상적인 광 조건 하에서 실시되었다. 행동 표현형 분석 (behavioural phenotyping)은 이전에 기재된 바와 같이 실시되었다 (Coyle et al . Behav Brain Res 2009, 197(1): 210-218; Summers et al . Pediatr Res 2006; 59(1): 66-71; van den Buuse et al . Int J Neuropsychopharmacol 2009; 12(10):1383-1393). 일군의 동년배 마우스들이 5-주령, 10-주령, 20-주령 및 40-주령 시기에 OFT (open field test)를 위해 이용되었다. 일군의 동년배 마우스들이 12-주령 시기에 공간 작업 기억 (spatial working memory)을 위해 이용된 후, 고가 플러스 미로 및 물체 인식 업무들 (tasks)에 이용되었다. 다른 동년배 마우스들이 12-주령 시기에 PPI를 위해 이용되었다.

[0092] 이행 기능 ( locomotor function ) 테스트. 마우스들의 탐사 활성 및 불안 수준이 15개의 정사각형들 (9 cm × 10 cm)로 분할된 바닥을 포함하는 박스 (50 cm × 27 cm)로 제작된 개방 필드 (open field)에서 측정되었다. 각 마우스는 맨 위 오른쪽 코너에 위치한 박스의 동일한 위치로 진입되었다. 상기 마우스의 행동은 3분 동안 관찰되었으며, 이행 활성은 선 횡단수 (line crossings; 즉, 마우스가 4개의 모든 발들을 하나의 정사각형에서 다른 정사각형으로 이동한 경우)의 측정으로써 스코어링되었다. 마우스가 바닥으로부터 양 앞발을 모두 들어올린 경우에 일어선 (rears up) 숫자로 스코어링되었다. 소변 및 대변 물질은 세션 (session) 사이에 제거되었으며, 오래 남아있는 어떠한 향기를 제거하기 위해 상기 박스를 80% 에탄올로 세심하게 청소하였다.

[0093] 물체 인식 테스트. 물체 인식 업무는 새로움에 대한 마우스들의 자연적인 친밀감 (affinity)을 이용한다: 이전에 본 적이 있는 (익숙한) 물체를 인식한 마우스들은 새로운 물체들을 탐구하는 데 더 많은 시간을 보낼 것이다 (Dere et al . Neurosci Biobehav Rev 2006; 30(8):1206-1224; Sik et al . Behav Brain Res 2003; 147(1-2):49-54). 간략하게는, 장치는 베딩 (bedding)으로 채워진 플라스틱 아레나 (arena)(길이; 50 cm, 폭; 35 cm, 깊이; 20 cm)로 구성되었다. 두 개의 다른 세트의 물체들이 이용되었다: 노란색-캡핑된 플라스틱 항아리 (높이, 6 cm; 바닥 직경, 4.3 cm) 및 빨간색 플라스틱 전구 (길이: 8 cm, 폭: 4 cm). 상술한 물체들 모두가 제시된 경우에 마우스들은 상기 아레나에 어느 위치에 놓여 지더라도 동일한 양의 시간을 소모하였다 (데이터를 보이지 않음). 공간 학습 및 기억을 위해 테스트된 동일한 동년배 마우스들이 12-주령 시기에 물체 인식 기억을 위해 평가되었다. 테스트 아레나에 길들이기 위해 각 마우스는 제시된 어떠한 물체들도 없는 테스트 박스를 탐구하는 데 5분의 시간이 주어졌다. 마우스들은 2번의 시험 (trial)으로 구성된 테스팅 세션을 거쳤다. 각 시험의 지속 기간은 3분이었다. 첫 번째 시험 (샘플 단계 (sample phase)) 동안, 상기 박스는 2개의 동일한 물체들 (a, 샘플들)을 포함하였는데, 상기 물체들은 상기 박스의 북-서쪽 (왼쪽) 및 북동쪽 (오른쪽) 코너 (벽으로부터 5 cm 떨어짐)에 위치하였다. 마우스는 장치에서 항상 남쪽 벽을 향하도록 위치되었다. 첫 번째 탐사 기간 후, 마우스들은 자신들의 우리 (homecage)에 다시 위치시켰다. 15분의 지체 간격 (retention time) 후, 상기 마우스가 두 번째 시험 (선택 단계)을 위해 상기 장치에 위치시켰지만, 이제 상기 장치에는 하나의 익숙한 물체 (a, 샘플)와 신규한 물체 (b)가 존재하였다. 상기 물체들은 오래 남아있는 어떤 향기를 제거하기 위해 세션 사이에 알코올로 세심하게 청소되었다. 시험 1 및 시험 2 동안 각 물체를 탐구하는 데 소모된 시간이 기록되었다. 탐사는 코로 물체를 터치하거나 또는 상기 물체 주위의 2 cm 내에 위치하는 것으로서 정의되었다. 상기 물체 인식 업무에서의 기본적인 측정치들 (measures)은 시험 1 및 시험 2 동안 물체를 탐사하는 데 소모된 시간들이다. 여러 가지 변수들 (variables)이 상기 테스트 동안 측정되었다: e1 (a + a) 및 e2 (a + b)는 각각 시험 1 및 시험 2 동안 양 물체들의 총 탐사 시간에 대한 측정치들이다. h1은 시험 1과 시험 2의 총 탐구 시간에서의 차이 (e1-e2)로 측정된 거주 지수 (index of habituation)이다. d1 (b - a) 및 d2 (d1 / e2)는 신규한 물체와 익숙한 물체 간의 구별 (discrimination)에 대한 지수 측정치들로써 고려되었다. 따라서, d2는 탐사 활동 (e2)에 대해 d1을 정정하는 구별에 대한 상대적인 측정치이다. 제로 (0) 이상의 구별 지수 (discrimination index)는 익숙한 물체보다 새로운 물체를 더 많이 탐사하는 동물들을 표시한다. 어느 하나의 물체에 대한 선호도 (preference)가 없는 동물은 0 근처의 지수를 가질 것이다. 샘플 단계 또는 선택 단계의 시험들 동안 7초 미만의 총 탐사 시간을 나타낸 마우스들은 상기 분석들에서 배제되었는 데, 이는 탐사 시간의 측정이 이러한 역치 밑에서는 신뢰할 수 없는 것으로 밝혀졌기 때문이다 (앞에서 인용된 van den Buuse et al .; de Bruin et al . Pharmacol Biochem Behav 2006; 85(1):253-260).

[0094] 고가 크로스바 ( elevated cross bar ) 테스트. 개방되고 높은 지역에 대한 마우스들의 자연적인 혐오에 기반된 마우스들의 불안 행동은 이전에 기재된 바와 같이 고가 플러스-미로 (elevated plus-maze)를 이용하여 평가되었다 (Komada et al . J Vis Exp 2008; (22); Walf et al . Nat Protoc 2007; 2(2):322-328). 간략하게는, 장치는 검은색 플렉시글라스 (plexiglass)로 이루어진 교차 형태로 제조되었으며, 서로를 중간에서 수직으로 교차하는 2개의 개방된 팔들 (arms; 25 cm × 5 cm)과 2개의 닫힌 팔들 (25 cm × 5 cm × 16 cm)로 구성되었다. 상기 2개의 팔들의 중간에 중앙 플랫폼 (5 cm × 5 cm)이 존재하였다. 교차 미로는 땅으로부터 1 m 위에 올려졌다. 개개의 마우스들은 실험자 반대편에 위치한 개방된 팔을 마주보는 장치의 중앙으로 도입되었고 5분 동안 비디오 녹화를 통해 관찰되었다. 개방된 팔들 및 닫힌 팔들로의 진입 숫자와 양 타입의 팔을 탐사하는 시간이 스코어링되었다. 구멍을 엿보는 행동 (head dipping)의 수, 뒷다리로 서기 (rearing)의 수 및 스트레치 동반된 자세들의 수 같은 마우스의 자연적 행동이 기록되었다. 각 시험 후, 모든 팔들과 중앙 지역이 오래 남아 있는 어떤 향기들을 제거하기 위해 알코올로 세심하게 청소되었다.

[0095] 물 미로 탈출 ( Escape water maze ) 테스트. 공간 학습 및 기억은 이전에 기재된 바와 같이 교차-미로 탈출 업무를 이용하여 평가되었다 (앞에서 인용된 Coyle et al . 2009). 상기 교차 미로는 투명한 플라스틱 (길이, 72 cm; 팔의 치수들, 길이 26 cm × 폭 20 cm)으로 구성되었으며, 23℃로 유지된 원형 풀의 물 (1 m 직경)에 위치하였다. 미로의 북쪽 팔의 말단에 위치된 숨겨진 (물 표면 0.5 cm 아래) 탈출 플랫폼을 감추기 위해 밀크 파우더가 물에 혼합되었다. 상기 풀은 검은색 플라스틱 벽 (높이, 90 cm)으로 둘러 쌓여졌다. 일관된 공간 단서들이 훈련 및 테스팅 과정 동안 항상 남쪽 말단에 서 있는 실험자들에 의해 미로의 각 팔에 배열되었다. 12-주령 마우스들은 탈출 플랫폼 없는 미로를 풀에 위치시키고 60초 동안 헤엄치게 함으로써 상기 미로 환경에 익숙하게 만들었다. 학습 시험들은 6-일의 훈련 기간 동안 행해졌는데, 이 기간 동안 마우스들은 탈출 플랫폼을 포함하지 않은 3개 (동쪽, 남쪽, 서쪽)의 다른 팔들로부터 숨겨진 탈출 플랫폼의 위치를 학습하도록 요구되었다. 각 마우스는 매일 6번의 시험들 (30분의 지체 간격으로 분리된 3번의 시험들로 이루어진 2개의 블락들)에 처해졌고, 상기 시험들에서 3개의 팔들 각각이 임의적인 패턴(매일 2번)의 출발 지점으로 선택되었다. 각 시험에 있어서, 상기 마우스는 벽을 마주보는 팔의 말단 부위에 위치되고 10초 동안 남겨진 경우 탈출 플랫폼에 도달하기 위해 60초를 허용하였다. 주어진 시간 내에 탈출 플랫폼을 기어오르지 못 했던 마우스들은 10초 동안 플랫폼에 위치시켰다. 이후, 상기 마우스는 10초 동안 우리에 가둬놓은 후, 이후 시험들을 지속하였다. 마우스들은 학습 기간 동안 동일한 위치에 놓여졌던 탈출 플랫폼 위치의 장-기간 기억력 (long-term retention)에 대해 평가되었다. 기억은 최종일의 학습 후 14일 (M1) 및 28일 (M2)에 테스트되었으며, 학습 기간 동안 기재된 바와 같이 하루에 6번의 시험들로 구성되었다. 데이터는 각 시험의 마우스에서 각각 탈출잠복기 (즉, 플랫폼으로 헤엄치는 데 걸린 시간(들)), 올바른 시험들 (즉, 첫 번째 팔 진입에서 상기 플랫폼을 발견한 쥐)의 수 및 틀린 진입들/재진입들의 수 (즉, 마우스가 탈출 플랫폼을 포함하지 않았던 팔로 진입한 횟수)에 대해 기록되었다.

[0096] PPI 테스트. 놀람, 놀람 습관화 (habituation) 및 놀람의 PPI가 8개의 유니트 자동화된 시스템 (SR-LAB, San Diego Instruments, USA)을 이용하여 이전에 기재된 바 (앞에서 인용된 van den Buuse et al . 2009)와 같이 평가되었다. 간략하게는, 마우스들은 어느 한 쪽의 사이드가 막혀있는 투명한 플렉시글라스 실린더에 위치되었고, 청각 자극들이 박스의 천장에 있는 스피커를 통해 70-dB 백그라운드 소음 이상으로 전달되었다. 각 테스팅 세션은 평균 25초 사이의 시험-간 간격 (inter-trial interval)으로 104번의 시험들로 구성되었다. 첫 번째 8개의 시험들 및 마지막 8개의 시험들은 한 번의 40-ms 115-dB 펄스 단독의 놀람 자극으로 구성되었다. 중간의 88개의 시험들은 115-dB 펄스-단독 자극의 16개의 시험들, 어떠한 자극도 운반되지 않았던 8개의 시험들 및 64개의 PP (prepulse) 시험들로 이루어진 가짜-임의적으로 배열된 운반 (pseudo-randomised delivery)으로 구성되었다. 총 32개의 115-dB 펄스 단독 시험들은 8개로 구성된 4개의 블락들로서 표현되었으며, 놀람 습관화를 결정하는 데 이용되었다. PP 시험들은 70-dB의 기준선보다 2, 4, 8 및 16 dB 높은 20-ms 비-놀람 자극과 함께 30-ms 또는 100-ms의 자극 간 간격 (inter-stimulus interval)에 의해 선행된 단일 115-dB 펄스로 구성되었다. 몸-전체 (whole-body) 놀람 반응들은 플랫폼의 아래에 부착된 압전식 가속도계 유니트 (piezo-electric accelerometer unit)에 의해 정량적인 값들로 변환되었다. PPI 백분율 (percentage prepulse inhibition, %PPI)은 (펄스-단독 놀람 반응 ― (PP + 펄스 놀람 반응))/펄스-단독 놀람 반응×100.

[0097] 통계적 분석. 모든 통계적 계산은 평균값 ± SEM으로 제시되고 SAS Version 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 실시되었다. 개방 필드 데이터에 있어서, 선 횡단의 수는 선형혼합효과모델 (linear mixed effects model)을 이용하여 WT 및 돌연변이 그룹들을 모두 포함하여 비교되었다. 임의적 마우스 효과는 동일한 마우스로부터 반복된 관찰들에서 의존성을 설명하기 위한 모델에 포함되었다. 고가 크로스바 테스트로부터 얻어진 데이터는 독립적인 샘플의 t-검정을 이용하여 WT과 돌연변이체들 간에 비교되었다. 물 교차-미로 테스트에 있어서, 탈출잠복기는 Cox 비례위험모형 (Cox proportional hazards model)을 이용하여 2개의 처리 그룹들 및 시간 초과 (over time)에 대해 비교되었다. 분산추정 (robust variance estimation)은 동일한 마우스에서의 반복된 측정으로 인한 결과들에서의 신뢰도 (dependence)를 조정하기 위한 모델에서 이용되었다. 모델 그룹 (WT 또는 KO)에서, 시간 (1 내지 6일) 및 그룹과 시간 간의 상호작용이 예측 변수들 (predictor variables)로 입력되었다. 탈출잠복기는 마우스가 탈출구를 여전히 찾아야만 하는 경우 30초를 올바르게 검열된 (right censored) 것으로 고려되었다. 본 연구에서, 정상적으로 분포되어 있는 것 같이 결과를 처리할 수 있는 30초에 검열된 탈출잠복기를 가진 너무 많은 동물들이 있었다. 따라서, 선형혼합효과모델을 이용하는 것이 용이하지 않았다. 잘못된 진입들이 음이항회귀모델 (negative binomial regression model)을 이용하여 WT 및 돌연변이 그룹들 간에 및 시간 초과에 대해 비교되었다. 상기 모델 그룹 (WT 또는 KO)에서, 시간 (1 내지 6일) 및 그룹과 시간 간의 상호작용이 예측 변수들로 입력되었다. 일반화추정방정식 (generalised estimating equation)이 동일한 마우스에서의 반복된 측정으로 인한 결과들에서의 신뢰도 (dependence)를 조정하기 위해 사용되었다. PPI 테스트들로부터 얻어진 데이터는 반복된 측정치들 (Systat, version 9.0, SPSS software; SPSS Inc., USA)을 이용한 이원분산분석 (two-way analysis of variance(ANOVA))을 통해 비교되었다. 상기 분석에 있어서, 그룹-간 요인 (between-group factor)은 유전자형이었고 그룹 내 반복-측정치 요인들은 PP 강도 및 놀람 블락이었다. 모든 연구들에서, <0.05의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

[0098] 면역조직화학. 절편들은 PBST (0.1 M PBS, 0.3% Triton X-100, 1% BSA)에 녹여진 10% 비-면역 말 혈청에서 1시간 동안 상온 (RT)에서 블랏킹된 후, 상온에서 1차 항체들과 하룻밤 동안 반응되었다. 1차 항체들 및 희석: 14-3-3ζ에 대한 래빗 다중클론항체 (1:200)(Guthridge et al . Blood 2004; 103(3):820-827), 0-튜블린에 대한 래빗 다중클론항체 (1:250, Sigma), 칼빈딘 (calbindin)-D28K에 대한 래빗 다중클론항체 (1:1000, Chemicon), NeuN에 대한 마우스 단일클론항체 (1:500, Chemicon), 시냅토피신 (synaptophysin)에 대한 래빗 다중클론항체 (1:100, Cell Signaling). 다음 날에, 절편들은 2차 항체들과 1시간 동안 상온에서 반응되었다. 0.1 M PBS로 3번에 걸쳐서 세척한 후, 상기 절편들은 DAPI (Molecular Probes)와 함께 프로롱 골드 안티페드 시약 (Prolong® Gold antifade reagent)에 마운팅되었다.

[0099] BrdU -펄스- 체이스 분석 및 TUNEL 표지 ( labelling ). 임신된 마우스들의 몸무게 g 당 BrdU 100 ㎍이 14.5 dpc 또는 16.5 dpc에 주입되었고, 새끼들이 생후 7일째에 안락사되었다. 이 시기에 생성된 증식하는 해마 뉴런들의 최종 목적이 동결된 뇌 절편들에 대한 BrdU 면역조직화학을 통해 규명되었다. 조직이 2 M HCl로 20분 동안 37℃에서 변성되고 0.1 M 보레이트 완충액 (pH 8.5)로 10분 동안 중화되었으며, PBST에 녹여진 10% 말 혈청으로 블락킹된 후, 래빗 단일클론 항-BrdU (1:250; Abcam) 및 마우스 단일클론 항-NeuN (1:500; Chemicon) 항체들로 하룻밤 동안 4℃에서 프로빙되었다. 세포 아팝토시스는 제조자의 지시에 따라 인 시튜 세포 사멸 검출 키트 (In Situ Cell Death Detection Kit; TMR Red; Roche Applied Science)를 이용한 TUNEL 어세이를 실시하고 이후 DAPI (Molecular Probes)로 카운터염색함으로써 확인되었다.

[00100] 면역침전. 모든 단백질 추출물은 150 mM NaCl, 10 mM Tris -HCl (pH 7.4), 10% 글리세롤, 1% Nonidet P-40, 그리고 프로테아제 및 포스파타제 억제제들 (ml 당 10 mg의 아프로티닌, ml 당 10 mg의 류펩틴, 2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 2 mM 나트륨 바나데이트)으로 구성된 NP40 용해 완충액에서 용해시켜 제조되었다. 시료들은 60분 동안 4℃에서 용해된 후, 10,000 g에서 15분 동안 원심분리되었다. 상층액은 30분 동안 4℃에서 마우스 Ig-커플링된 세파로오스 비드로 불필요한 것들을 미리-제거하였다 (precleared). 상기 미리-제거된 용해물은 단백질 A-세파로오스 (Amersham Biosciences)에 흡착되는 2 ㎍/ml의 항-DISC1 항체 (C-부분)(Invitrogen) 또는 항-14-3-3 항체 (3F7 Abcam)와 2시간 동안 4℃에서 반응되었다. 상기 세파로오스 비드를 3번에 걸쳐서 용해 완충액으로 세척한 후, SDS-PAGE 샘플 완충액에서 5분 동안 끓였다. 상기 면역침전된 단백질 및 용해물이 SDA-PAGE에 의해 분리되고 니트로셀룰로오스 막으로 전기영동적으로 옮겨진 후 면역블랏팅으로 분석되었다.

[00101] 면역블랏팅 ( immunoblotting ). 상기 막들은 1:1000으로 희석된 항-14-3-3ζ EB1 pAb (1:1000; 앞에서 인용된 Guthridge et al . 2004) 또는 1 ㎍/ml의 항 DISC1 (C-부분)(Invitrogen)으로 프로빙되었다. 뇌 조직에서 14-3-3ζ의 분석을 위해, β-액틴에 대한 래빗 다중클론 항체 (1:5000, Millipore)가 로딩 대조군으로 이용되었다. 결합된 항체들은 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 (1:20,000, Pierce-Thermo Scientific)로 검출되었다. 면역반응성 단백질들은 ECL (Luminescent Image Analyzer LAS-4000, Fujifilm, Japan)로 시각화되었다. 이미지들은 Multi Gauge Ver3.0 (Fujifilm, Japan)로 분석되었다.

[00102] 뉴런 세포 배양. P7 해마 뉴론-교세포 공동배양들은 이전에 기재된 바와 같이 준비되었다 (Kaech et al . Nat Protoc 2006, 1(5):2406-2415). 질산-처리된 커버슬립 (직경 13 mm)이 보레이트 완충액에 녹여진 100 ㎍/ml 폴리-L-리신/PLL (Sigma)으로 하룻밤 동안 37℃에서 코팅된 후, 멸균 물로 1시간 동안 3번에 걸쳐서 세척하였다. 치아이랑 및 CA 시료들이 해부되고 HBSS (Hank’s balanced salt solution)에서 분리되었으며, 뉴런들이 배양 디쉬 (4 PLL-코팅된 커버슬립을 가짐) 당 1 × 10⁵ 세포의 밀도로 플레이팅되었다. 배양은 신경돌기 과성장 어세이 (neurite outgrowth assay)를 위해 인 비트로에서 7일 및 14일 동안 배양되었다. PBST (0.1 M PBS, 0.1% Triton X-100, 1% BSA)에 녹여진 말 혈청으로 1시간 동안 상온에서 전처리된 세포들은 4% PFA에서 1시간 동안 고정되었고, 마우스 단일클론 MAP2 (1:200, Millipore) 및 14-3-3ζ(1:1000)에 대한 1차 항체들과 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켰다. 이후, 상기 커버슬립들은 상응하는 2차 항체들과 1시간 동안 상온에서 반응되었다. 커버슬립들은 안티-페드 (anti-fade) DAPI (Molecular Probes)로 마운팅되었다.

실험결과

[00103] 14-3-3ζ, 돌연변이 마우스들은 행동 및 인지 결점들을 나타낸다

14-3-3 단백질들은 발생하는 뇌 및 성체 뇌에서 풍부하게 발현된다 (Berg et al. Nat Rev Neurosci 2003; 4(9):752-762; Baxter et al . Neuroscience 2002; 109(1):5-14). 신경발달 (neurodevelopment) 및 발생된 뇌 기능에서 14-3-3ζ의 역할을 확인하기 위해, 각각 14-3-3 및 14-3-3ζ^Gt( ^OST390 ^)Lex로 명명된 2개의 넉아웃 마우스 라인들이 인트론 1 또는 2에 레트로바이러스 유전자-트랩 삽입을 포함하는 배아줄기세포 클론들로부터 제조되었다 (도 8; Lexicon Genetics). 이종 교배체들 (heteozygous intercrosses)로부터 얻어진 배아 뇌 조직 및 성체 뇌 조직에 대한 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 블랏팅 결과는 상기 유전자 트랩 벡터들이 유전자 전사를 파괴시켜 무효대립유전자 (null allele)를 창출한다는 것을 확인시켜 주었다 (도 9). 상술한 돌연변이 라인들은 14-3-3ζ^062+/- 및 14-3-3ζ^390+/-로 언급된다. 다른 14-3-3 이소형들의 결실들 (Su et al . Proc Natl Acad Sci U SA 2011; 108(4):1555-1560)과 다르게, 발현 분석은 14-3-3C의 제거가 돌연변이 마우스들에서 다른 14-3-3 패밀리 멤버들의 증가된 발현에 의해 보상되지 않는다는 것을 추가적으로 확인시켜 주었다 (도 10). 상술한 돌연변이 라인들 모두에서 유래된 14-3-3ζ 이형 마우스들의 이종 교배체들은 예상된 멘델 비 (WT 23%, 이형 56%, 돌연변이 21%; n = 494, p<0.001)로 동종 돌연변이체들을 발생시켰는데, 이는 상기 유전자의 제거가 배아 수준에서 치명적 (embryonic lethal)이지 않다는 것을 의미한다. 돌연변이 배아들 및 신생 마우스들의 초기 검사를 통해, 이들이 한배 새끼들과 형태학적으로 구별되지 않기 때문에 발생이 정상적으로 진행된다는 것을 확인하였다. 하지만, 양 라인들로부터 유래된 돌연변이 마우스들은 P14 시기까지 성장 지체가 나타났고 약 20%의 돌연변이 마우스들이 P21 시기까지 죽었다 (WT 29%, 이형 54%, 돌연변이 17%; n=1619). 생존한 (remaining) 돌연변이 마우스들은 WT 한배 새끼들보다 더 작았지만, 유사한 기대 수명 (life expentancy)을 가졌다 (P100; WT 24.55 ± 1.7 g, 돌연변이 19.73g ± 2.5 g). 돌연변이 마우스들은 외적으로는 후각 테스트, 시각 테스트 및 철사-매달리기 (wire-hang) 테스트에서 어떠한 차이도 없이 정상적이고 건강한 것처럼 보였다.

[00104] 신경학적 질환들 및 뇌 기능들과 14-3-3ζ 간의 연관성을 확실하게 분석하기 위해, 돌연변이 및 대조군 마우스들에 대한 일련의 행동 테스트들이 실시되었다. 개방 필드 환경에 대한 14-3-3ζ^062-/- 마우스들의 반응이 먼저 평가되었다. 돌연변이들은 모든 테스팅 수령 (5, 10, 20 및 30-주령) 전반에 걸쳐서 유지된 테스트 기간 동안 이동한 거리에서의 유의한 증가를 보였는데, 이는 돌연변이 마우스들이 과다활동적이라는 것을 의미한다 (도 1a). 이러한 효과는 성에 대한 편견 없이 수컷 및 암컷 모두에서 유사하였다 (p>0.05).

[00105] 익숙한 물체들보다 오히려 새로운 물체들에 대한 상기 마우스의 자연적인 탐사 선호도가 인식 기억을 테스트하기 위해 조사되었다. 내측엽 (medial lobe) 내 후각주위피질 (perirhinal cortex)의 올바른 기능 (functioning)이 상기 과제에 필수적이다 (앞에서 인용된 Dere et al . 2006; 앞에서 인용된 Sik et al . 2003; Forwood et al . Hippocampus 2005; 15(3):347-355; Winters et al . J Neurosci 2005; 25(17):4243-4251). 샘플 단계에서, 마우스들은 각각 동일한 물체를 탐사하는데 동일한 시간을 보냈다 (14-3-3ζ^062+/+, 50.82±1.2%; 14-3-3ζ^062-/-, 49.18±1.2%). 친숙한 물체 및 신규 물체가 제시되는 경우, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 테스트 기간 내내 대조군과 비교하여 현저하게 손상된 새로운 물체 인식을 나타냈다. 익숙한 물체들과 신규한 물체들 간의 선호도의 부족과 일치하게도, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 감소된 구별 지수 (discrimination index; 신규한 물체를 탐사하는 시간 - 익숙한 물체를 탐사하는 시간/신규한 물체를 탐사하는 시간 + 익숙한 물체를 탐사하는 시간)를 나타냈는데, 이는 그들이 새로운 정보를 유지하는 것 (14-3-3ζ^062+/+, 0.1667±0.086초; 14-3-3ζ^062-/-, -0.0569±0.047초; p<0.05)에 실패했다는 것을 의미한다. 다시 한번 말하면, 어떠한 테스팅 단계에서 성 차이가 전혀 없었다 (p>0.5). 놀랍게도, 14-3-3ζ^062-/- 돌연변이체들도 상기 시험의 양 단계들에서 모두 더 긴 탐사 횟수와 함께 물체 인식 테스트에서 과다활동성 (hyperactivity)을 확증하였다 (샘플 단계, 14-3-3ζ^062+/+, 27.33±2.7초; 14-3-3ζ^062-/-, 38.62±4.1초; p<0.05: 테스트 단계, 14-3-3ζ^062+/+, 24.58±3.1초; 14-3-3ζ^062-/-, 50.77±4.7초; p<0.0001).

[00106] 고가 플러스-미로는 설치류의 불안 행동을 테스트하기 위해 널리 이용되고 있다 (앞에서 인용된 Komada et al . 2008; 앞에서 인용된 Walf et al . 2007; Lister RG, Psychopharmacology ( Berl ) 1987; 92(2):180-185). 그러한 테스트에 처해지는 경우에도, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 야생형 대조군들과 비교하여 증가된 활동성을 나타냈다. 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 5분 테스트 기간 동안 교차 팔들 사이로 25.23 ± 1.76의 이행 (transitions)을 나타낸 반면에, 14-3-3ζ^062+/+ 마우스들은 12.29 ± 1.21의 이행을 나타냈다 (p<0.0001). 또한, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 14-3-3ζ^062+/+ 마우스들 (31.4 ± 6.0초)과 비교하여 개방된 팔들에서 유의하게 더 많은 시간 (Fig. 1b: 114.8 ± 11.5초)을 보냈으며 (p<0.0001), 보다 빈번하게 개방된 팔들로 진입하였고 (14-3-3ζ^062+/+, 4.6 ± 0,6; 14-3-3ζ^062-/-, 15.5 ± 1.7, p<0.0001), 더 많은 구멍을 엿보는 행동 (14-3-3ζ^062+/+, 19.6 ± 1.5; 14-3-3ζ^062-/-, 33.4 ± 2.4, p = 0.0041)을 하였는데, 이는 그들이 더 낮은 수준의 불안을 나타냈다는 것을 의미한다.

[00107] 공간 작업 기억-의존적 학습은 교차 미로 탈출 과제를 이용하여 조사되었다 (앞에서 인용된 Summers et al . 2006). 해마와 전전두엽 피질 (prefrontal cortex) 간의 적절한 시그널링은 이러한 과제의 획득을 위한 전제조건이다. 마우스들은 숨겨진 탈출 플랫폼을 포함하는 교차 미로 중 올바른 팔을 확인하기 위해 6일 내내 훈련되었다. 상기 교차 미로의 각 팔은 실험 전반에 걸쳐서 새로운 시각적 단서에 의해 표시되었다. 비록 일부 14-3-3ζ^062-/- 마우스들이 올바른 팔을 확인하도록 학습되었을 지라도, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 습득 기간의 과정 내내 상기 플랫폼에 도달함에 있어 증가된 잠복기를 보였고 (도 11; χ²(5) = 29.8808; p< 0.0001), 유의하게 감소된 팔 선택 정확도 (도 1c: IRR = 0.52; p< 0.0001)를 나타냈다. 이후, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들의 올바른 교차-팔을 기억하는 능력이 습득 후 14일 또는 28일 동안 휴지시킨 후 상기 탈출 플랫폼 물 미로에서 재-테스팅 (각각 M1 및 M2)시킴으로써 조사되었다. 학습 단계와 대조적으로, 14-3-3ζ^062+/+ 마우스들은 탈출잠복기 (HR = 1.18, p = 0.383)에서 어떠한 변화도 나타내지 않았지만, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 유의하게 증가된 탈출잠복기 (HR = 2.98, p < 0.0001)를 나타냈다. 해마-의존적 기억에서의 기능이상과 일치하게도, 돌연변이 마우스들은 팔 선택 정확도에서도 유의한 감소를 보였다 (도 1c; IRR = 0.231; p< 0.0001). 모든 인지 결손들이 성에 무관하였다.

[00108] 감각운동 게이팅 (sensorimotor gating)에서의 결함들은 정신분열증 및 연관된 질환들 같은 신경정신병적 질환들의 내적표현형 (endophenotype)이다. 해마 및 다른 뇌 부위들에서의 적절한 시그널링이 이러한 여과 기작 (filtering mechanism)에서 중요하다. 14-3-3ζ 돌연변이 마우스들이 비정상적인 감각운동 게이팅을 가지는 지를 결정하기 위해, 청각 놀람 반사 (acoustic startle reflex)의 PPI (prepulse inhibition)가 평가되었다. 14-3-3ζ^062-/- 마우스들은 14-3-3ζ^062+/+ 마우스들과 비교하여 유의하게 더 낮은 PPI (도 1d: 유전형 F (1,20)의 주요 효과 = 5.89, p = 0.025)와 놀람(도 12: F(1,20) = 5.87, p = 0.023)을 나타냈다. 증가하는 수준의 프리펄스 강도는 WT 및 돌연변이 마우스들에서 PPI에서의 유사한 증가를 야기하였다 (도 1d). 전체적으로, 놀람 진폭은 돌연변이 마우스들에서 감소되었지만, 놀람 습관화는 정상이었다 (도 12).

[00109] 14-3-3ζ는, 층상배열을 조절하기 위해 해마 뉴런들에서 발현된다

인지 및 행동 결점들이 해마의 신경발달적 결함으로부터 야기되는 지를 결정하기 위해, 뉴런 발달에서 14-3-3ζ의 역할이 분석되었다. 해마 뉴런들은 뇌실대 (NEv) 따라 존재하는 신경상피 및 해마술(NEf)에 인접한 신경상피의 제한된 영역으로부터 유래되었다 (Nakahira et al . J Comp Neurol 2005; 483(3):329-340)(도 2a). 14.5 dpc 시기에 14-3-3ζ 면역염색은 중간대 내 이동하는 해마 뉴런들에서 검출되었지만, 이들의 신경상피 전구체들에서는 검출되지 않았다 (도 2bi). 또한, P0 시기에 14-3-3ζ 면역염색은 해마자체 (hippocampal proper)/암몬각 (CA)의 피라미드세포들에서도 검출되었다 (도 2biii). 14-3-3ζ 마우스 라인들의 유전자 트랩 벡터들 내에 존재하는 베타-geo 트랜스유전자를 이용한 14-3-3ζ의 내인성 발현이 B-갈락토시다제 염색과 함께 이형 마우스들에서 모니터링되었다 (도 2c). 면역염색과 일치하게도, 이동하는 CA 뉴런들 내 전사체 수준에서 14-3-3ζ의 발현이 확인되었다. 또한, CA 및 DG 뉴런들 내 발현도 후기 성체기에서 검출되었다 (도 2c). 하지만, 예상 밖으로 14-3-3ζ는 생후 초기 단계들 후에는 소뇌 같은 뇌의 다른 부위들에서 검출할 수 없었다 (도 13). CA 및 DG 뉴런들 내 발현은 미세해부된 성체 해마들로부터 추출된 단백질에 대한 웨스턴 블랏에 의해 확인되었다 (도 2d). 또한, 웨스턴 블랏 분석은 14-3-3ζ^062-/- 마우스들의 상술한 뇌 부위들에서 상기 단백질의 완전한 제거를 확인시켜 주었다. 마지막으로, 인 비트로 10일 (10 DIV) 후 해마 MAP2 양성 뉴런 배양도 세포체 및 축색돌기/수상돌기 내 14-3-3ζ에 대한 반점이 있는 면역세포염색을 나타냈다 (도 2e).

[00110] 14-3-3ζ가 해마 뉴런들에서 발현되기 때문에, 다음으로 본 발명자들은 CA 및 DG 뉴런들이 성체 및 배아 돌연변이들에서 올바르게 위치되는 지를 결정을 하기 위해 CA 및 DG 뉴런들을 조사하였다. 14-3-3ζ^062-/- 마우스들에서의 Nissl-염색은 해마 성숙 전에 두드러지게 눈에 띄는 발달 장애 (development defects)를 나타냈다 (P0 시기에 5/5, P7 시기에 4/4, P28 시기에 2/2 및 P56 시기에 2/2; 도 3a 및 도 14). 특이적으로, 피라미드형 뉴런들은 항상 휴면 중인 장소인 피라미드층 외에도 방사층 및 지향층에서 이상적으로 (ectopically) 위치되었다. 피라미드형 뉴런들은 CA3 소구역들 (subfields) 내에서 단일 세포층을 이루는 대신에 이판층 (bilaminar stratum)으로 갈라졌다. 수상돌기 과립형 뉴런들도 14-3-3ζ^062-/- 한배 새끼들과 비교하여 14-3-3ζ^062-/- 마우스들에서 산만하게 패킹되었다. Niss1 염색과 일치하게도, thy1-YFP 마우스들 내 해마 구조 (organization)에 대한 분석도 파괴된 라미나 조직 (laminar organization)을 나타냈다 (도 3b).

[00111] 이후, 고찰은 이상 위치화된 피라미드세포들이 성숙한 뉴런들로 발달되는 지 여부에 대한 것이었다. 모든 14-3-3ζ^062-/- 해마들 (4/4 새끼들)에서, 이상 위치의 세포들은 뉴런 마커인 NeuN에 대해 양성이었다 (도 3c). 또한 깊은 분자층 (deep molecular layer) 내 뉴런들을 위치화시키는 것보다는 오히려 뉴런들도 CA3의 표재성 층 (superficial layer)에서 성숙하였다. 종합해보면, 이러한 데이터는 해마에서 잘못 위치된 세포들이 기능적 피라미드형 뉴런들 및 과립형 뉴런들을 형성한다는 것을 의미한다. 또한, 배아, 생후 초기 및 성체 마우스들로부터 유래된 해마들에 대한 TUNEL 염색은 유전형들 간에 명확한 차이들을 나타내지 않았는데 (도 15), 이는 14-3-3ζ의 결핍이 뉴런의 생존에 영향을 끼치지 않는다는 것을 의미한다.

[00112] 14-3-3ζ-손상된 마우스들은 해마 뉴런 이동 결점을 나타낸다

14.5 dpc 시기에 중간대 내 14-3-3ζ의 발현 및 P0 시기에 표재성 층 내 성숙한 뉴런들의 존재는 이상한 라미나 구조가 잘못된 이동 (erroneous migration)으로부터 야기될 수 있다는 가능성을 제기하였다. 해마 뉴런 이동을 시각화시키기 위해, 14.5 dpc 및 16.5 dpc 시기에 이형 14-3-3ζ⁰⁶²교배체들로부터 임신한 어미에게 BrdU를 주입함으로써 BrdU 생년월일 기록 (birthdating)을 완료하였다. 14-3-3ζ^062+/+ 새끼들 및 14-3-3ζ^062-/- 새끼들이 P7 시기에 수집되었으며, BrdU-보유 세포들이 관상 절편들에서 동정되었다. 절편들은 DAPI로 카운터염색되어 해마의 개별 층들을 조사하였다. BrdU-보유 세포들은 각 유전자형에서 5마리 마우스들을 이용하여 10 ㎛ 절편들로부터 카운팅되었고, 각 층에서의 상대적인 백분율이 정량화되었다. 주입 시점들 모두는 14.5 dpc 및 16.5 dpc 시기에 중간대에서 생성된 거의 모든 뉴런들이 대조군 마우스들에서 CA의 피라미드층으로 이동한다는 것을 보인다 (도 4). 하지만, 놀랍게도 14-3-3ζ^062-/- 마우스들에서 유의한 백분율의 BrdU-보유 세포들이 피라미드층 밖에서도 확인되었다. 따라서, 뉴런들이 태어난 곳으로부터 이동하는 것을 실패하거나 또는 올바른 층에서 멈추지 못하는 것은 14-3-3ζ^062-/- 해마에서 이중의 피라미드층 (duplicated stratum pyramidale)을 발생시킨다.

14-3-3ζ-손상된 마우스들의 피라미드세포에서 기능적인 파괴된 이끼 섬유 회로 및 정상이 아닌 시냅스 말단들

[00113] CA3 피라미드형 뉴런들과 DG 과립형 세포들 간의 상호소통은 정밀한 축색돌기 항행 (navigation) 및 시냅스 타겟팅을 통해 이루어진다. 잘못 정렬된 피라미드형 뉴런들이 해마 회로에 영향을 미치는 지에 대한 사안이 P0, P7 및 P56 해마들에서 항-칼빈딘 (calbindin)을 이용한 면역조직화학적 염색을 통해 평가되었다. 대조군 마우스들에서, 이끼 섬유들은 과립형 세포들의 세포체로부터 자라나 CA3의 피라미드층으로 이어지는 피라미드 아래 이끼 섬유 (infrapyramidal mossy fibre, IPMF) 및 피라미드 위 이끼 섬유 (suprapyramidal mossy fibre, SPMF) 트랙들 (tracts)로 두 갈래로 나누어졌다 (도 5). 하지만, 14-3-3ζ^062-/- 마우스들에서는 IPMF 트랙은 CA3 피라미드형 뉴런들의 정단 표면을 따라 항해하였고, SPMF 트랙은 CA3 뉴런들 사이에 존재하는 잘못된 경로를 나타냈다.

[00114] DG 과립형 세포들이 이들의 CA 타겟 세포들 위에 시냅스되는 지를 결정하기 위해, 항-시냅토피신을 이용하여 대조군 동물들 내 CA 소구역의 IPMF 및 SPMF 모두에서 전시냅스들 (presynapses)을 확인하였다. 14-3-3ζ^062-/- 마우스들에서도, 잘못 경로된 축색돌기들이 피라미드층 내에서 이상하게 위치하는 시냅스들을 형성하였다 (도 6). 골지 염색을 통한 시냅스 말단의 시각화는 CA3에서의 시냅스 형성에서 주목할만한 차이들을 추가적으로 드러냈다. 대조군 동물들에서, 정단 수상돌기의 중심 부위에 커다란 가지 이상 성장물들 (spine excrescences)이 존재하였고, 이어서 가느다란-구경의 (fine-calibre) 수상돌기 가지들이 붙어있었다. 14-3-3ζ^062-/- 마우스들의 피라미드형 뉴런들에서는 수상돌기 트리가 유사한 숫자의 가지 점들을 가지는 것으로 보이지만 조사된 모든 마우스들의 중심 및 원거리 선단수상돌기들 모두에 잘못 경로된 이끼 섬유 트랙들로부터 가시 모양의 이상 성장물들을 가졌다.

[00115] 뉴런 이동 및 축색돌기 인도를 조정함에 있어 14-3-3ζ에 의해 이용되는 분자적 경로들을 확인하기 위해, 공동-면역침전 실험들이 P7 마우스들로부터 유래된 총 뇌 추출물들에서 실시되었다. 14-3-3ζ는 DISC1의 C-말단을 이용하여 제조된 항체와 공공-침전될 수 있었다. 그 반대로, DISC1이 14-3-3ζ을 인식하는 항체로 공동-면역침전될 수 있다는 것도 확인되었다 (도 7). 놀랍게도, 상기 데이터는 14-3-3ζ이 100 kDa의 전장 단백질보다는 오히려 DISC1의 75 kDa 형태와 특이적으로 상호작용한다는 것을 나타내는데, 이는 DISC1이 신경 발달 과정에서 이소형-특이적으로 기능한다는 것을 의미한다.

실시예 2

NRP2 양성 뉴런 전구체들이 해마를 생성한다는 입증

[00116] Nrp1 또는 Nrp2를 발현하는 뉴런 전구체들로부터 유래하는 성숙 뉴런을 결정하기 위하여, Nrp1 및 Nrp2 혈통 추적 마우스를 생성시켰다. 이를 위하여, Cre/RFP 또는 Cre/GFP가 Nrp1 또는 Nrp2 프로모터들의 발현 하에 위치되었다 (도 16). 이들 마우스들을 이용한 연구 (n=2 실험 도 17)는 최초로 해마의 뉴런이 Nrp2 발현 신경 줄기 세포로부터 유래한다는 것을 보여준다.

[00117] 당업자는 본 명세서에 기재된 발명이 특이적으로 기재된 것들 이외에 변이들 및 변형들도 허용할 수 있다는 것을 인정할 것이다. 본 발명이 모든 그러한 변이들 및 변형들을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 언급되거나 또는 지시된 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들 모두를 개별적으로 또는 총괄적으로 포함하고, 상기 단계들 또는 특징들 중 어느 두 개 또는 이상의 어느 조합 및 모든 조합을 포함한다.

[00118] 참고목록

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Claims

해마 손상으로 특징지워지는 질환을 앓는 포유류를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 일정 시간 동안 및 상기 해마를 유효하게 재생하는데 충분한 조건 하에서 유효한 숫자의 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 (Nrp2⁺ neural crest stem cells) 또는 그 돌연변이체 또는 변이체를 상기 포유류에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
포유류에서 해마 손상으로 특징지워지는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체의 용도로서,
상기 줄기 세포는 해마를 재생시키는 것인 용도.
상기 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 성인 줄기 세포인 것인 제1항에 기재된 방법 또는 제2항에 기재된 용도.
제3항에 있어서, 상기 성인 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 치아의 상아질 또는 모낭으로부터 단리되는 것인 방법 또는 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질환은 뇌의 선천적 해부학적 이상, 후천성 뇌 부상인 것인 방법 또는 용도.
제5항에 있어서, 상기 후천성 뇌 부상은 두부 외상, 질식, 위축증 또는 저형성증의 결과인 것인 방법 또는 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질환은 기능적 단백질 14-3-3ζ의 수준 감소 또는 14-3-3ζ/DISC1 복합체 형성의 감소로 특징지워지는 것인 방법 또는 용도.
제7항에 있어서, 상기 질환은 신경정신병적 질환인 것인 방법 또는 용도.
제8항에 있어서, 상기 신경정신병적 질환은 정신분열증, 정신분열증, 정신분열형 성격 장애, 정신병 (psychosis), 양극성 장애, 조울증, 정서 장애 또는 정신분열병 (schizophreniform) 또는 정신분열 정동 장애, 정신병적 우울증, 자폐증, 약물 유도성 정신병, 정신착란, 알코올 금단증상 또는 치매 유도성 정신병 중 하나 이상의 증상으로 특징지워지는 것인 방법 또는 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 것인 방법 또는 용도.
제1항에 기재된 방법에 사용하기 위한, Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포를 포함하는 단리된 세포군 (cellular population).
제11항에 있어서, 상기 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 성인 줄기 세포인 것인 단리된 세포군.
제12항에 있어서, 상기 Nrp2⁺ 신경능 줄기 세포는 치아의 상아질 또는 모낭으로부터 단리된 것인, 단리된 세포군.