CN104540938A - 治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及使哺乳动物中海马区再生的方法及用于该方法的试剂。更具体地，本发明提供通过给予神经嵴干细胞亚群来使哺乳动物中海马区再生的方法。本发明方法可用于治疗以海马区缺陷为特点的病症，例如神经精神疾病。

Description

治疗方法

发明领域

本发明一般涉及使哺乳动物中海马区再生的方法及用于该方法的试剂。更具体地，本发明提供通过给予神经嵴干细胞亚群来使哺乳动物中海马区再生的方法。本发明方法可用于治疗以海马区缺陷为特点的病症，例如神经精神疾病。

发明背景

关于本说明书中作者的发表物详细书目在说明书的结尾按字母顺序集中。

该说明书中对任何现有技术的参考不应认为且不应作为对于该现有技术构成澳大利亚的一般常识的部分的承认或任何形式的提示。

精神分裂症是已知对于人类最致残且造成情绪破坏的疾病之一。不幸的是，因被误解已久，其几乎不受关注且其受害者蒙受侮辱。实际上，精神分裂症是相当常见的疾病。其等同地影响两种性别，并且全世界人群有约1％患有该疾病。另2-3％患有分裂型人格障碍，其为该疾病的轻度形式。因其流行性和严重性，精神分裂症被广泛研究以致力于开发用于诊断该疾病的更好标准。

精神分裂症的特点是具有一群特殊且可预测的症状。与该疾病最常相关联的症状称作正性症状，其指示存在极其异常的行为。这些包括思维障碍(难以理解语言交流或从一个主题跳到另一个主题，没有逻辑连接)、妄想(对于迫害、内疚、宏大或受外界控制的假想)和幻觉(视觉或听觉)。思维障碍是清楚且逻辑性思考能力的减弱。常通过无联系且无意义的语言来显示个人患有精神分裂症，其无法参与谈话，导致其与其家庭、朋友和社会的疏远。妄想在患有精神分裂症的个体中常见。受影响的个人会相信其正遭受阴谋(所谓“受迫害妄想症”)。“广播(broadcasting)”表述一种妄想类型，其中患有该疾病的个体相信其想法能被他人听见。幻觉能被听见、看见或甚至感受到。最常见地，其表现为语音仅被受折磨的人听见。此类语音可能会描述该个人的动作，警告其有危险或告诉其该做什么。有时该个人可能会听见数个语音在进行对话。相较于上述“正性症状”和“思维障碍”不太明显但同样严重的是缺乏或负性症状，其代表正常表现的缺失。这些包括情感贫乏或感情迟钝(即，缺乏感情表达)、冷漠、不合群和自知力缺失。

精神分裂症的发病通常出现于青春期或成人期早期过程中，尽管已知其在年长人群中发展。精神分裂症可能会快速发病，其伴随发展数周的急性症状，或也可能会缓慢发病，其发展数月或甚至数年。尽管精神分裂症会影响处于生命中任何时期的任何人，但其在遗传上倾向于该疾病的那些人中更常见一些，这些人一般在青春期晚期或成人期早期发生首次精神失常。父母双方都不患该疾病，其子女发展精神分裂症的概率是1％。父母双方之一患有该疾病，其子女发展精神分裂症的概率是约13％。父母双方都患有该疾病，其子女发展精神分裂症的概率是约35％。这指示存在遗传联系。

四分之三的精神分裂症患者在16岁和25岁之间发展该疾病。30岁后不常发病，而40岁后罕有发病。在16～25岁年龄组中，精神分裂症对男性的影响多于女性。在25～30岁年龄组中，女性中的该事件发生率高于男性。

一般而言，对于任何疾病的研究都要求应有合适有效的诊断标准。事实上，诊断应基本基于病因(即，基于疾病是否源自遗传缺陷、病毒或细菌感染、毒素或胁迫)。不幸的是，大多数精神疾病的病因是未知的，因此这些疾病仍然根据以下四种主要心智能力哪种受到影响而被归类：

(i)思维与认知障碍

(ii)情感障碍

(iii)社会行为障碍；和

(iv)学习、记忆和智力障碍。

因此，因为对这些病症的生物学病因已知甚少，仍需要阐明这些疾病的诱导和发展机制。

14-3-3蛋白组成一个高度保守的调节性分子家族，其在发育和过程中和成人组织中大量表达。这些蛋白质包含其中不同的同种型(β、ζ、ε、γ、η、τ、σ)，其结合大量功能相异的信号转导分子以控制细胞周期调控、增殖、迁移、分化和凋亡(Berg等.Nat Rev Neurosci 2003；4(9):752-762；Fu等.Annu Rev PharmacolToxicol 2000；40:617-647；Toyo-oka等.Nat Genet 2003Jul；34(3):274-285；Aitken A.,Semin Cancer Biol 2006；16(3):162-172；Rosner等.Amino Acids 2006；30(1):105-109)。

迄今为止，蛋白14-3-3分子家族中任何一者在精神分裂症中的作用仍然令人困惑。已有一些研究做出关注，尽管到目前为止仍未在对于与易患病体质相关联的发展神经精神病症(例如精神分裂症)的单一核多态性的鉴定上得出结论。以研究蛋白14-3-3同种型的水平变化为目的而不考虑那些分子是否变异的研究，已趋于着重在η和θ同种型的水平变化，尽管至今没有任何结论性的证据证明它们是神经精神病症发病的可靠标志物。关于其它蛋白14-3-3同种型，例如β和ζ，Wong等.(2005)发现其在精神分裂症和躁郁症中的表达水平没有变化。Middleton等.(2005)进一步研究并表示这些特定同种型不太可能与发展精神分裂症的遗传风险直接相关并且也不是提供精神分裂症强相关性的标志物。不过，与这些结果相反，在产生本发明的研究工作中，测定出蛋白14-3-3ζ的功能水平降低，尤其是14-3-3ζ/DISC1的形成水平，与神经精神病症的发病和神经精神病症发病的易患病体质(例如以一种或多种神经分裂症症状为特征的病症)相关联。

尽管这些结果确实与预测对于精神分裂症发病的易感性的诊断发展方面高度相关，但本领域技术人员将理解诊断性症状的存在并不必教导可能的治疗，因为可检测的诊断性标志物即便作为标志物是可靠的，其本身对该疾病的实际病因常常是次要的。对关于疾病病症的“病因和作用”没有直接了解，导致实质上没有可能设计有效治疗。为此，对于有效治疗神经精神病症(例如精神分裂症)的方法的发展需求已久。

为此，在导致做出本发明的进一步工作中，已测定14-3-3ζ和14-3-3ζ/DISC1复合物的功能缺失导致异常神经元迁移引起的海马区发育异常。此外，在海马区发育方面，已确定Nrp2⁺神经嵴干细胞(其为神经嵴干细胞亚群)特定分化成海马区的神经元并且能够有效地使海马区再生。因此，现在这促进了对神经精神病症(例如精神分裂症)的治疗性治疗的设计。

发明内容

除非另有说明，在本说明书和所附权利要求书中，术语“包含”以及变化形式如包括摂和含有摂应理解为是指包括所述的整数或步骤或者多个整数或步骤的组，但是不排除任何其它整数或步骤或者多个整数或步骤的组。

本文中所用的术语“源自”应认为是指由指明品种源生的但无需从该指定来源直接获得的特定整体或整体的组。此外，除非另有说明，本文中所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象。

除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。

本发明的一方面涉及治疗患有以海马区缺陷为特征的病症的哺乳动物的方法，所述方法包括在足以使海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

在另一方面，提供治疗患有以海马区缺陷为特征的病症的人的方法，所述方法包括在足以使海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

在另一方面，因此提供治疗患有以海马区缺陷为特征的病症的哺乳动物的方法，所述方法包括在足以使海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的成体Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

本发明的另一个方面涉及Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体在制备治疗哺乳动物病症的药物中的应用，其中所述病症特征为海马区缺陷，所述干细胞使海马区再生。

本发明的另一个方面涉及包含用于本发明方法的Nrp2⁺神经嵴干细胞的分离的细胞群。

附图简要说明

图1：14-3-3ζ-缺陷小鼠显示异常的认知和行为特征。在旷场实验中，14-3-3ζ^062-/-小鼠(空心柱；n＝11)在5-30周龄时比14-3-3ζ^062+/+同窝鼠仔(填充柱；n＝11)具有更强的探究行为。(b)在高架十字迷宫实验中，14-3-3ζ^062-/-小鼠(空心柱；n＝12)比14-3-3ζ^062+/+小鼠(填充柱；n＝12)在开放臂(open arm)中花费更多时间。(c)在十字迷宫逃脱任务测试中，14-3-3ζ^062-/-小鼠(空心圆；n＝12)相比14-3-3ζ^062+/+小鼠(实心方块；n＝12)在空间学习(第1-6天)和记忆(M1和M2)上均具有较低能力。(d)相较于14-3-3ζ^062+/+小鼠(实心柱；n＝11)而言，14-3-3ζ^062-/-小鼠(空心柱；n＝11)具有下降的PPI，其前脉冲(PP)为高出70dB基线2、4、8和16dB，并且刺激间间隔为100毫秒。还显示了来自所有PP强度的数据的平均值(Avg)。所有图中汇集来自雄性小鼠和雌性小鼠的数据。误差线表示为平均值±SEM。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。

图2.14-3-3ζ在阿蒙角(Ammon’s horn)的锥体细胞和齿状回的颗粒神经元中表达。(a)(i)显示穿过14.5dpc胚胎小鼠大脑的冠状切面的示意图，其显示不同海马区区域。V，脑室；IZ，中间区；VZ，脑室带。(ii)显示穿过P0小鼠海马区的冠状切面的示意图。来自海马区原基的神经元起源于脑室神经上皮(浅蓝色)和邻近海马伞(fimbria)的神经上皮(深蓝色)。包含组成阿蒙角及其层(so，起层；sp，锥体细胞层；sl，透明层；sr，辐射层)的海马角(CA1-3)的锥体神经元的三个分区相对于齿状回(DG)中的颗粒神经元的定位显示。(b)(i-ii)检测14.5dpc的发育中海马区的中间区中的14-3-3ζ免疫反应性。(iii-iv)在P0时，14-3-3ζ-阳性神经元位于锥体细胞层中。(v)较高放大倍数观察锥体神经元(星号)显示14-3-3ζ具有点状细胞质定位。(c)X-gal(半乳糖苷)染色显示P0、P7和成年14-3-3ζ^062+/-海马区中的14-3-3ζ的内源性表达。在锥体神经元和颗粒神经元中明显有高水平14-3-3ζ-lacZ表达。(d)海马区神经元培养。(i)14-3-3ζ用EB1染色(红色)。(ii)MAP2阳性(绿色)海马区神经元。(iii)14-3-3ζ和MAP2的重叠突出显示MAP2阳性神经突(箭头)中的共同表达。(e)14-3-3ζ蛋白(27kDa)在野生型小鼠的阿蒙角和齿状回中表达。成年野生型和14-3-3ζ^062-/-小鼠的裂解物经免疫印迹和抗14-3-3ζ抗体(EB1)探测来进行Western印迹。采用抗-(3-肌动蛋白(42kDa)抗体作为上样对照。标尺＝100μm(bi-iv；c；di-iii)，25μm(bv)。

图3：14-3-3-ζ-缺陷小鼠显示海马区的分层缺陷(lamination defect)。

Nissl染色显示从14.5dpc直至出生后56天(P56)的野生型和14-3-3ζ^062-/-小鼠的海马区发育。海马区细胞在14-3-3ζ^062-/-小鼠的锥体细胞层(sp)中分散(iv,vi,viii)。箭头突出显示辐射层(sr)中海马区锥体神经元的重复的层。星号突出显示起层(so)中异位定位的锥体细胞。箭头指示齿状回中松散排列的颗粒神经元。(b)向14-3-3ζ⁰⁶²背景引入Thy1-YFP转基因表达显示14-3-3ζ^062-/-小鼠中海马区锥体神经元的严重组织破坏。蓝色，DAPI；绿色，Thy1表达。(c)从指示基因型的P0(i-iv)和P56(v-vi)小鼠获得的海马区的冠状切面。在野生型海马区中(iii，黄色箭头)，较深的锥体细胞层处于NeuN-阳性锥体细胞之中，形成自CA1至CA3的均一的成熟区。在14-3-3ζ^062-/-海马区中，成熟区较不均一，伴有一些NeuN-阳性成熟锥体细胞异位定位在CA3中的锥体细胞层的较深区(黄色箭头)和浅表区(白色箭头)。在P5614-3-3ζ^062-/-小鼠中，对NeuN的免疫染色突出显示重叠CA3分区中的锥体细胞，指示异位细胞达到成熟(vi)。标尺:100um。

图4：BrdU-脉冲示踪分析指示14-3-3ζ-缺陷小鼠中的神经元迁移缺陷。

在14.5dpc:P7(i-v)和16.5dpc:P7(vi-x)时的BrdU-脉冲示踪分析显示，BrdU-阳性细胞(黑色)位于野生型海马区的CA3分区的锥体细胞层(sp)中(ii和vii)。(v)图表总结14.5dpc:P7时，异位海马区神经元的百分比。14-3-3ζ^062-/-小鼠的BrdU-标记细胞是异位定位的。神经元止于起层(so)中，或迁移越过锥体细胞层并进入透明层(sl)(iv和ix中的箭头)。(x)图表总结16.5dpc:P7时，异位海马区神经元的百分比。标尺：100μm。

图5：14-3-3ζ-缺陷小鼠中的异常苔藓纤维通路。

对14-3-3ζ^062+/+(i、iii、v和vii)和14-3-3ζ^062-/-(ii、iv、vi和viii)小鼠的锥体下(IPMF，黄色箭头)和锥体上(SPMF，白色箭头)的苔藓纤维管道的钙结合蛋白免疫染色。与野生型对照相似，14-3-3ζ^062-/-缺陷神经突在穿过离开齿状回(DG)之后初始分叉成SPMF和IPMF分支。然而，14-3-3ζ^062-/-小鼠的IPMF分支异常地穿过锥体细胞密质部分(sp，白色箭头)。此外，14-3-3ζ^062-/-小鼠的扩散的SPMF分支侵入了CA3中的重复锥体细胞层。标尺＝100μm。

图6：异位CA3锥体细胞和错误取向的苔藓纤维之间的功能突触连接。

(i-iv)用针对突触素(Syp)的抗体染色的P5614-3-3ζ^062+/+小鼠的海马区切面显示在IPMF(白色箭头)和SPMF(黄色箭头)中均有免疫反应。Syp染色位于起层(so)和透明层(sl)中，由CA3的锥体细胞密质部分围绕。(v-viii)对14-3-3ζ^062-/-小鼠的海马区切面Syp染色显示，在CA3的锥体细胞层中异常穿过的苔藓纤维(星号、v、vii)形成功能突触。(ix-xii)异位的成熟CA3锥体细胞(用NeuN染色；以星号表示)与来自错误取向的苔藓纤维的突触蛋白(Syp，绿色)交汇。标尺＝100μm。(b)高尔基染色显示野生型或14-3-3ζ^062-/-成年小鼠(P35)的锥体细胞的树突分支。一组刺状赘生物(指示与错误取向的苔藓纤维突触结的接触点(MFB，斜线))位于野生型神经元中CA3锥体细胞的顶部近端树突上。两组刺状赘生物位于14-3-3ζ^062-/-小鼠中的顶部树突树上，一组位于近端顶部树突处而另一组位于远端树突分支中(*)。(c)显示相较于野生型海马区而言，14-3-3ζ^062-/-小鼠中的错误取向的苔藓纤维管道和苔藓纤维结与异位CA3锥体细胞交汇的异常突触点的示意性图表。图7：14-3-3ζ与DISC1相互作用以控制神经元发育。

(a-b).来自P7小鼠大脑的等量裂解物用抗-DISC1抗体或抗-14-3-3抗体免疫沉淀，并用DISC1(a)或识别14-3-3ζ的EB1纯化的抗血清(b)进行免疫印迹。还通过直接免疫印迹测定来自用于共免疫沉淀的5％总细胞裂解物(输入)的DISC1同种型和14-3-3ζ的相对表达水平。箭头指示100kDa和75kDa的DISC1主要条带(a)和表示14-3-3ζ的27kDa的主要条带(b)。星号表示来自免疫沉淀的背景IgG条带。(c)14-3-3ζ在神经元迁移和轴突生长中的作用的示意图。(i)14-3-3ζ结合CDK5磷酸化的Ndel1以促进与LIS1的相互作用，因而促进神经元迁移。(ii)14-3-3ζ还存在于LIS1/Ndel1/DISC1复合物中以控制轴突生长动力学。

图8：14-3-3ζ基因的基因捕获突变。

示意性显示对于小鼠品系14-3-3ζ^{Gt(OST062)Lex}的插入点和(b)对于小鼠品系14-3-3ζ^{Gt(OST390)Lex}的插入点。基因捕获载体包含融合至可选标志物基因(BGEO对于0半乳糖苷酶/新霉素膦酸转移酶融合基因)的剪接受体序列(SA)，其从而在内源性14-3-3ζ启动子控制下表达。当被整合进入14-3-3ζ的上游外显子时，BGEO产生干扰mRNA转录的融合转录本。所述载体还包含PGK启动子，其后是剪接供体(SD)信号上游的布鲁顿氏(Bruton's)酪氨酸激酶基因(BTK)的第一个外显子。BTK在所有阅读框中包含终止密码子以防止下游融合转录本的翻译。基因捕获载体以逆转录病毒形式存在于两条长末端重复(LTR)之间。两幅图中，箭头表示用于基因型分型的引物。红色方框指示非编码未翻译的序列，而绿色方框表示编码序列。

图9：Western印迹分析证明突变小鼠的所有组织中的14-3-3ζ表达减少：

组织获自(a)雄性和雌性14-3-3ζ^062-/-小鼠和年龄匹配的14-3-3ζ^062+/+小鼠，和(b)雄性和雌性14-3-3ζ^390-/-小鼠和年龄匹配的14-3-3ζ^390+/+小鼠。所有样品在NP40裂解缓冲液中均质化，所述NP40裂解缓冲液包含材料与方法中所述的蛋白酶抑制剂。蛋白质浓度采用皮尔斯(Pierce)BCA蛋白质分析试剂盒并且每条泳道上样10μg蛋白质来测定。印迹用EB-1抗体探测以检测14-3-3ζ，而抗-β-肌动蛋白(1:5000)用作上样对照。用HRP-偶联的二抗(1:20,000,皮尔斯-热科学公司(Pierce-Thermo Scientific)检测结合的抗体。免疫反应性蛋白质通过ECL观察。注意到EB1抗体还可检测14-3-3同种型而非14-3-3ζ。

图10：14-3-3ζ-缺陷小鼠大脑中14-3-3同种型的mRNA水平保持不变：

响应对14-3-3ζ^062-/-小鼠大脑组织中14-3-3ζ同种型的检测，所有14-3-3同种型的转录水平没有变化。RNA分离自三只14-3-3ζ^062-/-小鼠和三只年龄匹配的14-3-3ζ^062+/+对照的完整大脑。互补DNA(cDNA)由1μg RNA采用Quantitect试剂盒(凯杰公司(Qiagen))生成。采用Sybr Green(凯杰公司)和Rotor Gene仪器(考百特公司(Corbett))的实时PCR用于测定所有14-3-3同种型样品中相较于GAPDH的mRNA水平。具体引物参见表1。

图11：14-3-3ζ-缺陷小鼠显示学习和记忆方面的认知功能缺陷。

(c)在十字迷宫逃脱任务测试中，14-3-3ζ^062-/-小鼠(空心圆；n＝12)相比14-3-3ζ^062+/+小鼠(实心方块；n＝12)在空间学习(第1-6天)和记忆上均具有较低能力。整个训练期间和记忆测试期(M1和M2)过程中，14-3-3ζ^062-/-小鼠需要更长时间来到达逃脱平台。汇集来自雄性和雌性小鼠的数据。误差线表示为平均值±SEM。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。

图12：14-3-3ζ-缺陷小鼠显示惊吓反射减弱。在四次115dB的单独脉冲区块(block)中，14-3-3ζ^062-/-小鼠(空心柱；n＝13)的惊吓幅度低于14-3-3ζ^062+/+小鼠(实心柱；n＝14)。显示来自所有区块的平均(Avg)惊吓。**,<0.05。

图13：海马区神经元中的保持14-3-3ζ表达。

(c)X-gal(半乳糖苷)染色显示P0和P714-3-3ζ^062+/-海马区和小脑中的14-3-3ζ的内源性表达。阿蒙角的锥体神经元和成熟齿状神经元中有明显的海马区中14-3-3ζ-lacZ高水平表达，但在出生后的小脑中并非如此。标尺＝25μm。

图14.14-3-3ζ-缺陷小鼠中的海马区分层缺陷。

Nissl染色显示野生型(i、iii、v)和14-3-3ζ^062-/-(ii、iv、vi)小鼠从14.5dpc直至出生(P0)的海马区发育。海马区细胞在14-3-3ζ^062-/-小鼠的锥体细胞层(sp)中分散。箭头突出显示辐射层(sr)中海马区锥体神经元的重复的层。星号突出显示起层(so)中异位定位的锥体细胞。标尺＝25μm。

图15：存活进入成年期的14-3-3ζ-缺陷小鼠中错误定位的神经元。海马区原基(a-f)和成熟海马区(g-h)中的凋亡细胞。14-3-3ζ^-/-海马区中未检测到片段化、凋亡细胞核增加(如aii和bii中绿色TUNEL阳性细胞所示)。标尺＝100μm。

图16：

在周围神经系统发育过程中，Nrp1-阳性神经嵴干细胞形成交感神经系统和肾上腺的嗜铬细胞(c)、神经元(n)和神经胶质(g)。相反，Nrp2阳性神经嵴细胞形成感觉神经系统的神经元和神经胶质。我们生成了表达来自Nrp1启动子的Cre和红色荧光蛋白的转基因小鼠模型(Nrp1:Cre/RFP)或表达来自Nrp2启动子的Cre和绿色荧光蛋白的转基因小鼠模型(Nrp2:Cre/GFP)。这些小鼠促进Nrp1和Nrp2阳性神经干细胞的谱分离，其可用于纯化各亚群。

图17：

来自Nrp2:Cre/GFP小鼠的P0小鼠大脑的冠状切面针对β半乳糖苷酶染色。(B)：(A)中框内区域在较高放大倍数下显示海马区(h)的海马角(CA1-3)锥体神经元和齿状回(DG)颗粒神经元源自表达Nrp2的神经干细胞。Nrp2也在脑室带(VZ)中的神经干细胞中表达。

发明详述

本发明部分基于如下确定：蛋白14-3-3ζ的功能水平降低(例如就蛋白14-3-3ζ的绝对水平或蛋白14-3-3ζ/DISC1复合物形成水平而言)指示神经精神病症(例如精神分裂症或相关病症)的发病或发病倾向。然而，对于这导致海马区退化的进一步确定提供了开发对于显示海马区缺陷的个体(例如精神分裂症患者)的治疗性治疗的基础。对于神经嵴干细胞的亚群选择性地分化成海马区的神经元并能够被移植进入大脑以使海马区再生的更进一步确定，通过将所有这些发现结果组合，目前已导致对于病症(例如精神分裂症)的治疗方案的开发。

因此，本发明的一方面涉及治疗患有以缺陷性海马区为特征的病症的哺乳动物的方法，所述方法包括在足以导致海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

述及“海马区”应理解为述及脑部的海马区域。本发明不受任何理论或作用模式限制，海马区是人和其它哺乳动物的脑的重要组成部分。其属于边缘系统并且在从短期记忆到长期记忆的信息整合及空间导向中起重要作用。比如与其紧密相关联的大脑皮层，是成对结构，在脑的左侧和右侧具有镜像两半部分。在人类和其它灵长类中，海马区位于内侧颞叶内部，皮脂表面下方。其包含两个主要联锁部分：阿蒙角和齿状回。

解剖学上，海马区是大脑皮层边缘的精细部分(elaboration)(Amaral和Lavenex(2006).“Ch 3.Hippocampal Neuroanatomy(第三章.海马区神经解剖学)”.The Hippocampus Book(《海马区书籍》).牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)。形成皮层边缘的结构组成所谓的边缘系统(limbic system)(拉丁文limbus＝边界)：这些包括海马区、扣带皮层、嗅觉皮层和杏仁核。海马区解剖学上连接至涉及情感行为的脑的部分－隔膜、下丘脑乳头体和丘脑中的前核复合体。

海马区整体为弯曲管形，其已被不同地类比成海马、羊角号(CornuAmmonis(海马角)，由此细分部分CA1至CA4)或香蕉(Amaral和Lavenex，同上)。其可被区分为一个区域，其中皮层变窄进入密集布满锥体神经元的单层，其卷曲成紧U形；该“U”形的一个边缘称作CA4，被嵌入面朝后方强烈弯曲的V形皮层，齿状回。其由腹部和背部组成，其腹部和背部均具有类似组成但是不同神经回路的部分(Moser和Moser(1998)Hippocampus 8(6):608-19)。在哺乳动物物种的全面范围保持该一般外形。

位于海马旁回的内嗅皮层(EC)因其解剖连接而被认为是海马区的部分。EC与大脑皮层的多种其它部分强力且相互连接。此外，丘脑的内侧隔核、前核复合体和连接核以及下丘脑的乳头状核，和脑干中的中缝核与蓝斑发出轴突至EC。EC轴突的主要输出通路(穿质通路)来自层II中的大星状锥体细胞，其将脑下脚“穿孔”并密集投射至齿状回中的颗粒细胞，CA3的尖端树突具有较少密集投射，且CA1的尖端树突具有稀疏投射。因此，穿质通路建立EC为海马区和大脑皮质其它部分之间的主要“界面”。齿状颗粒细胞轴突(称作苔藓纤维)传递来自刺棘(thorny spine)上EC的信息，其从CA3锥体细胞的近端尖端树突伸出。然后，CA3轴突从细胞体的深部伸出，并向上成环进入尖端树突所在的区域，然后向后延伸进入内嗅皮层的深层——完成可逆回路的Shaffer侧支；CA1场还向后发出轴突至EC，但这些较CA3投影稀疏。在海马区中，来自EC的信息流大部分是单向性的，伴随信号传递通过一系列紧密排布的细胞层，先到齿状回，然后到CA3层，然后到CA1层，然后到脑下脚，然后离开海马区至EC，这主要归因于CA3轴突的侧支化。这些层各自还包含复杂内部回路和广泛的纵向连接(Amaral和Lavenex 2006,同上)。

若干其它连接在海马区功能中起重要作用(Amaral和Lavenex 2006,同上)。除了向EC输出之外，走向其它皮层区域的额外输出通路包括前额皮质。非常重要的大量输出走向外侧隔区，并且走向下丘脑的乳头体。海马区接受来自血清素、去甲肾上腺素和多巴胺系统的调节性输入，以及来自CA1场丘脑的连接核的调节性输入。非常重要的投影来自内侧隔区，其发出胆碱能纤维和GABA能纤维至所有海马区部分。来自隔区的输入在控制海马区生理学状态中起关键作用：隔区的损坏破坏海马区θ节律，并严重损伤某些记忆类型(Winson(1978),Science 201(4351):160–63)。

公认邻近海马区的皮层区域为海马旁回(或旁海马区)(Eichenbaum等.(2007),Annu Rev Neurosci 30:123–52)。其包括EC和边缘皮层，该名称源于其位于嗅脑沟旁边。边缘皮层在对复杂对象的视觉识别中起重要作用，但也有大量证据证明其对记忆的作用与海马区的作用不同，从而完全失忆仅在海马区与旁海马区同时受损时出现(Eichenbaum等.(2007),Annu Rev Neurosci 30:123–52)。

述及海马区“缺陷”，应理解为述及海马区的全部或部分结构或功能非正常。为此，该缺陷可以是先天的或获得性的。例如，海马区的解剖学畸形可能自出生就存在。然而，与许多神经精神病症和神经退行性病症的发病相关联的海马区缺陷通常是后来获得的，并且是暴露至环境因素、药物使用等的损伤(例如，头部外伤或窒息)的结果。在其它情况中，遗传缺陷先天存在，但直至很晚，有时到成人期才出现。如上文详述，本发明的方法提供使海马区组织再生，从而至少部分恢复组织使其结构或功能正常的方式。在该内容中，述及“再生”是指在脑部海马区区域内产生至少一些正常的海马区组织。其并不意在指海马区被完全替代或甚至指全部缺陷组织被替代。而是，实际上，本发明的方法使正常海马区组织的比例相较于实施本发明方法之前的对象内存在的比例而言有所增加。因此，本发明的方法并不将其应用限于所有受影响的海马区组织完全正常化的内容中。而是，应理解其范围是使全部或仅仅一些缺陷组织部分正常化。

本文所用的术语“哺乳动物”包括人、灵长类、家畜动物(例如，马、牛、羊、猪、驴)、实验室测试动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(例如，狗、猫)和圈养的野生动物(例如，袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，所述动物是人或实验室测试动物。甚至更优选地，所述哺乳动物是人。

根据该实施方式，提供治疗患有以海马区缺陷为特征的病症的人的方法，所述方法包括在足以使海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

如上详述，本发明的方法基于如下确定：向具有海马区缺陷的哺乳动物的脑给予Nrp2⁺神经嵴干细胞不仅导致细胞嫁接进入所述组织，还导致海马区形貌和功能的修复和恢复。“干细胞”指该细胞不完全分化但需要进一步分化以达成熟。此类细胞有时还称为“前体”细胞、“祖”细胞、“多能”细胞或“多能性”细胞。

本发明不受任何理论或作用模式的限制，神经嵴细胞是脊椎动物独有的瞬时、多能、迁移性细胞群，其引起不同细胞系，包括黑素细胞、颅面软骨和骨、平滑肌、周围和肠神经元和神经胶质。原肠胚形成后，神经嵴细胞特定处于神经板和非神经外胚层的边界处。神经胚形成过程中，神经板的边界(也称作神经褶)，会聚在背中线处以形成神经管。随后，来自神经管的顶板的神经嵴细胞经历上皮向间充质的转变，从神经上皮层离，并迁移通过外周，在那里它们分化成不同的细胞类型。基因调控网络是神经嵴发育的基础，其被描述为一组相互作用的信号、转录因子和下游效应子基因，它们赋予细胞特性，例如多能性和迁移能力。

因此，述及“神经嵴干细胞”应理解为述及显示神经嵴干细胞的一种或多种功能或表型特性的任何细胞，或显示分化成神经嵴干细胞能够分化成的任何细胞类型的潜力的任何细胞。对象神经嵴干细胞可以是显示多潜能的细胞，例如，可以是能够被诱导分化产生任何一种或多种多样周围结构(例如颅骨骼、牙的牙质、黑素细胞、周围神经元、肾上腺嗜铬细胞和毛囊中的特定细胞)的祖细胞，或其可已经被指定为这些细胞系的亚组。然而，不受原始定义的约束，所述对象细胞只要未完全分化即任被认为是“干细胞”。术语“干细胞”的使用不应理解为是对关于可能被术语“祖细胞”、“多能细胞”、“多能性细胞”或其它此类术语暗示的细胞而言的对象细胞的成熟/未成熟的限制。

述及细胞显示神经嵴干细胞的“功能”特点，应理解为指受限于随任何一种或多种神经嵴细胞源性细胞系的分化的细胞，例如上文详述那些。述及“表型”特点，应理解是指一种或多种蛋白质或非蛋白质分子的细胞表面或胞内表达谱，其具有神经嵴干细胞特点。为此，根据本发明方法，现确定其为神经嵴干细胞，其表达Nrp2(神经纤毛蛋白2)，其选择性产生海马区的功能神经元并因而是供于海马区再生的细胞的来源。因此，述及“Nrp2⁺”应理解是指以细胞表面表达Nrp2为特征的神经嵴干细胞。

本发明仍然不受任何方式限制，神经嵴干细胞可源自胚胎来源，或更方便地，源自成体来源。具体而言，成人神经嵴干细胞能被容易地且常规地从牙的牙质和毛囊隆起部分分离，并且提供中枢神经系统中神经元和神经胶质的相同前体细胞来源。移植时，这些细胞分化成GABA能神经元和少突细胞。因此，本发明方法内容中可采用成体来源或胚胎来源。在一个实施方式中，所述对象干细胞是成体干细胞。

根据该实施方式，因此提供治疗患有以海马区缺陷为特征的病症的哺乳动物的方法，所述方法包括在足以使海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的成体Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

在另一个实施方式中，所述成体Nrp2⁺神经嵴干细胞分离自牙质或毛囊。

对象Nrp2⁺神经嵴干细胞群可以是单一细胞悬液或细胞聚集体(例如组织)，其已被新鲜分离自个体(例如可能成为治疗对象的个体)，或其已被取自非新鲜来源，例如来自培养物(例如，其中细胞数量经扩增和/或细胞经培养从而使其能接受分化信号)或细胞的冷冻储液(例如，已建立的细胞系)，其已在较早某时间点被分离自个体或其它来源。还应理解，所述对象细胞可已经历一些其他形式的处理或操作，例如但不限于：富集或纯化、细胞周期状态调节、分子转化或细胞系形成。因此，所述对象细胞可以是原代细胞或次生细胞。原代细胞是从个体新鲜分离的细胞。次生细胞是在其分离后经历了一些形式的体外操作(例如制备细胞系)的细胞。

述及对象细胞群的“突变体或变异体”，应理解为是指源自细胞群但在表型或功能水平上显示至少一种差异的细胞。例如，突变体或变异体可在初始分离之后具有细胞表面标志物的表达变化(作为整体或其功能的一些方面)。此类变化可自发产生(例如通过自发上调或下调细胞表面标志物，这可在体外培养自发转化中自发产生)或由直接处理所致，例如细胞若被人为转化(例如，为了使细胞系生成)或转染(例如，使特定基因或标志物表达)则有可能发生。

应理解，本发明的Nrp2⁺神经嵴干细胞群可显示单一表型概况中的分化状态中的一些变异。即，在单一表型概况中，尽管具有此概况的细胞可基本显示相似的表型和/或功能特点，但仍有可能显示一些差异。例如，就含有在研表型概况的细胞的转录组概况或细胞表面标志物(不同于本文定义的标志物)表达中的差异而言可能是明显的。例如，Nrp2⁺神经嵴干细胞可能不处于高度特定且离散阶段，但可由反映某一转变或时期的多种离散细胞亚群来表征(如果将已分化进入这一阶段的细胞与即将成熟离开这一阶段的细胞作比较)。因此，涵盖本发明单一表型概况中的细胞亚群的存在。

在希望人类胚胎干细胞被体外分离和分化的范围内，对于Nrp2⁺神经嵴干细胞，这些细胞可源自胚泡期人类胚胎的内细胞团或源自已建立的可用细胞系(例如由Thomson和Odorico建立的那些,Trends Biotechnol.,18:53-57(2002),称作H1、H7、H9.1、H9.2、H13或H14)。为了产生从头培养的人胚胎干细胞培养物，通过微外科或通过免疫外科法(其采用针对滋养外胚层的抗体来将其分解)来从周围滋养外胚层分离来自内细胞团的细胞，并将其置入含有补充了胎牛血清的生长培养基(或者，包含基础FGF的敲除杜尔贝科氏(KnockOut Dulbecco's)改良最小基础培养基可补充有血清替代物(Serum Replacer)(生命技术公司(LifeTechnologies))并不含血清使用)的培养皿中，通常置于小鼠胚胎成纤维细胞(其已经有丝分裂失活处理以防止复制)饲养层上。或者，可采用不含饲养层的培养系统，例如Chunhui Xu,Melissa Carpenter及其同事报道的那样，采用基质胶或层粘连蛋白作为小鼠胚胎成纤维细胞培养的基质、基础FGF和条件培养基(Xu等,Nat Biotechnol.2001年10月；19(10):971-4)。然后，使Nrp2⁺神经嵴干细胞群从该起始多能干细胞群分化。本发明基于：给予Nrp2⁺神经嵴干细胞群至哺乳动物以促进其定位至所述哺乳动物的脑部。“定位”是指被引入患者的至少一些Nrp2⁺神经嵴干细胞群靶向脑部。然而，应理解，可能出现任何治疗事件，一定比例的给予的Nrp2⁺神经嵴干细胞可能不靶向脑部，而可能被清除或处于非脑部组织。

本发明内容中给予的细胞优选是自体同源细胞，其被分离并重新移植进入其初始来源的个体(例如，牙质源性的Nrp2⁺神经嵴干细胞)。然而，应理解，本发明涉及源自任何其它合适来源的细胞的应用，其中对象细胞显示与治疗对象个体相同的主要组织相容性概况。因此，此类细胞有效地是自体同源的，因为其不会导致与显示外来MHC概况的细胞移植相关联的组织相容性问题。此类细胞应理解为落在“自体同源”的定义内。例如，在某些情况下，对象细胞分离自遗传学相同的双胞胎，或分化自采用源于对象个体的配子生成的胚胎或克隆自所述对象个体的干细胞，是希望的、必需的或具有实际意义的。这些细胞还可能已被工程改造以显示所需主要组织相容性概况。采用此类细胞克服了组织和器官移植中的常见困难。

然而，当分离或生成自体同源细胞没有可能或不可行时，可能必需使用异源细胞。“异源”细胞是分离自与治疗对象相同的物种但显示不同MHC概况的那些细胞。尽管在治疗内容中此类细胞的使用可能会导致基于异源的免疫应答发作，不过该问题可通过采用显示与治疗对象具有相似性的MHC概况的细胞(例如已被分离/产生自亲属(例如同胞、父母或子女)的细胞群)来最小化。通常以采用异源细胞为特征的免疫学组织排斥可通过采用免疫抑制药物来最小化。然而，认为是否必需采用此类药物将取决于各例的具体情况。本文还设想采用已建立的Nrp2⁺神经干细胞系。应理解本发明涉及异种移植。即，引入患者的细胞分离自与治疗对象物种不同的物种。

述及“有效数量”指的是，以至少达到所需效果，或延迟治疗的具体病症的发病，抑制所述病症的进展，或使所述病症的发病或进展同时停止的必需的细胞数量。当然，所述量将取决于，治疗的具体病症，所述病症的严重性，以及个体患者参数，包括年龄、身体状况、体型、体重、生理状态、并行治疗、病史和与在研问题相关的参数。本领域技术人员不必进行过多实验即能确定构成有效剂量的Nrp2⁺神经嵴干细胞的数量及其最优给予模式，后一个问题将在下文中作进一步讨论。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并可以用不超出常规的实验来落实。一般优选采用最大细胞数量，即，根据成熟医学判断出的最高安全数量。然而，本领域普通技术人员应理解，可出于医学原因、心理学原因或出于任何其他原因而给予较低细胞数量。

还应理解，根据本发明方法给予的Nrp2⁺神经嵴干细胞可必然促进本文所述的治疗方案。例如，一些细胞可能位于非脑部组织，而其它可能变为无活力或无功能细胞。在另一个示例中，当Nrp2⁺神经嵴干细胞群已从异质细胞群(例如毛囊样品)纯化时，所述纯化的群可包含一些非Nrp2⁺神经嵴干细胞(不具有100％纯度)。因此，如果引入患者的细胞的相应部分组成上文定义的“有效数量”，则本发明得以实现。

在本发明的这一方面中，所述对象细胞需要引入对象个体。为此，所述细胞可通过任何合适方法引入。例如，细胞悬液可通过直接注射至组织或血块内(从而使所述细胞固定在该血块内以便移植)来引入。还可在移植之前包封所述细胞。包封是有利于防止细胞分散的技术，所述细胞可持续增殖(即，显示不灭特性)。所述细胞还可通过局部、静脉内或全身途径引入。

所述细胞还可通过手术植入(移植)来引入。这在以下情况中可能是必需的，例如，当细胞以组织移植物形式存在时，或当细胞在移植之前被包封时。不使本发明受任何理论或作用模式的限制，当细胞以包封细胞悬液给予时，所述细胞将结合成团。

给予患者的细胞可以单剂量或多剂量通过任何合适途径给予。优选地，或可能时，采用单一给予，特别是在采用手术移植入脑的方法时。通过注射给予可指向不同的组织或器官区域，这取决于所需治疗的类型。

根据本发明方法，可在Nrp2⁺神经嵴干细胞引入时或在移植细胞的分化和增殖期共同给予其它蛋白质或非蛋白质分子例如抗生素或诱导分化的细胞因子。“共同给予”是指在相同制剂或在不同制剂中通过相同或不同途径同时给予或通过相同或不同途径依次给予。“依次”给予是指蛋白质或非蛋白质分子的给予和这些细胞的移植之间相差数秒、数分钟、数小时或数天的时间。例如，可能需要共同给予能够促进对象Nrp2⁺神经嵴干细胞定位或引导对象Nrp2⁺神经嵴干细胞分化的分子。其中可能需要共同给予的情况的其它示例包括但不限于：

当给予非同源细胞或组织至对象时，该对象通常产生对于此类细胞或组织的免疫排斥。在这种情况下，可能需要另用免疫抑制方案治疗该对象(优选在给予前开始该方案)，从而使所述排斥最小化。用于移植异源移植排斥的免疫抑制方案(例如通过给予环孢菌素A、免疫抑制抗体等)已经广泛使用并具有标准实践。

视治疗的病症的性质而定，可能需要将患者保持在药物治疗中，以减轻病症症状，直至移植的细胞变得相容且完全发挥功能时(例如，给予抗精神病药物以治疗精神分裂症)。或者，在治疗病症时，可能需要开始长期使用药物以防止再次出现损伤。例如，在自体免疫病症造成对象损伤时，可能需要持续使用免疫抑制药物，甚至在采用同源细胞时也是如此。

应理解，本发明的方法能够单独地治疗问题病症，或可与设计以促进或加强对象治疗的一种或多种其它技术一起进行。这些其它技术可以是与其它蛋白质或非蛋白质分子共同给予的形式，如上文详述。

述及“以海马区缺陷为特征的病症”应理解是指海马区退化或损伤的任何病症、症状，或以海马区退化或损伤为病因的任何病症、症状。此类病症的示例包括但不限于：先天大脑解剖学异常、获得性损伤，例如经由头部外伤或窒息获得的损伤，萎缩和发育不全，例如在长期强迫后的退役军人(军官)中所见那样，或以功能蛋白14-3-3ζ或蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体形成水平降低为特征的病症，例如神经精神病症。述及“神经精神病症”，应理解是指以基于神经学的认知、情感和行为障碍为特征的病症。此类病症的示例由其包括以如下病症的一种或多种症状为特征的病症：精神分裂症、精神分裂症、分裂型人格障碍、精神病、双向障碍、躁郁症、情感障碍，或精神分裂症样或情感分裂疾病、精神病性抑郁、孤独症、药物诱导的精神病、精神错乱、戒酒综合征或痴呆诱导的精神病。

在一个实施方式中，所述神经精神病症是以一种或多种精神分裂症症状为特征的病症。

根据该实施方式，提供治疗患有神经精神病症的哺乳动物的方法，所述方法包括在足以使海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。在另一个实施方式中，所述Nrp2⁺神经嵴干细胞是成体源性的干细胞。

在另一个实施方式中，所述神经精神病症是以一种或多种精神分裂症症状为特征的病症。

在另一个实施方式中，所述病症是精神分裂症。

述及“以精神分裂症为特征的症状”应理解是指可能在患精神分裂症的个体中出现的任何一种或多种症状。这些症状可能贯穿该病程始终出现，或其可能只是瞬时或阶段性地出现。例如，与精神分裂症相关联的幻想常以周期性事件形式出现，而社会退缩特征可能显示持续表现。应理解，对象症状可能不必由所有患精神分裂症的个体显示。例如，一些个体可能仅患有幻听，而其它对象可能仅患有幻视。然而，出于本发明目的，任何此类症状(不论有或多或少的精神分裂症患者曾经实际显示给定症状)，都被该定义涵盖。本发明不受任何理论或作用模式的限制，与所述疾病最常相关联的症状被称为正性症状(其指示严重异常行为的存在)，思维障碍和负性症状。思维障碍和正性症状包括难以理解语言交流或没有逻辑联系地从一个主题跳至另一个主题、妄想(对于迫害、内疚、宏大或受外界控制的假想)和幻觉(视觉或听觉)。思维障碍是清楚且逻辑性思考能力的减弱。常通过无联系且无意义的语言来显示个人患有精神分裂症，其无法参与谈话，导致其与其家庭、朋友和社会的疏远。妄想在患有精神分裂症的个体中常见。受影响的个人会相信其正遭受阴谋(所谓“受迫害妄想症”)。“广播(broadcasting)”表述一种妄想类型，其中患有该疾病的个体相信其想法能被他人听见。幻觉能被听见、看见或甚至感受到。最常见地，其表现为语音仅被受折磨的人听见。此类语音可能会描述该个人的动作，警告其有危险或告诉其该做什么。有时该个人可能会听见数个语音在进行对话。相较于上述“正性症状”和“思维障碍”不太明显但同样严重的是缺乏或负性症状，其代表正常表现的缺失。这些包括情感贫乏或感情迟钝(即，缺乏感情表达)、冷漠、不合群和自知力缺失。应理解，正性症状和负性症状均落在“以精神分裂症为特点的症状”的定义中。

除了精神病患者在其显示的症状间可能具有显著差异的事实之外，还应理解还有同样以一种或多种这些症状为特征的其他神经精神病症。例如，幻觉也常在例如双向障碍、精神病性抑郁、精神错乱和痴呆诱导的精神病患者中观察到。因此，述及以一种或多种精神分裂症特征症状为特点的病症应理解是指以存在一种或多种这些症状为特点的任何神经精神病症。在一个实施方式中，所述病症是精神分裂症。

在本发明的一个相关方面中，经历治疗的患者可接受治疗性或预防性治疗，并且可以是需要治疗性或预防性治疗的任何人或动物。就这点而言，本文述及“治疗”和“预防”应认为是其最广泛含义。术语“治疗”不必意味着哺乳动物被治疗直至完全恢复。类似地，“预防”不必意味着对象最终不会染上疾病病症。因此，治疗和预防包括特定病症症状的改善，或者预防或其他情况下减小发展特定病症的风险。术语“预防”可被认为是降低特定病症发病的严重性。“治疗”也可降低存在的病症的严重性。

本发明的另一个方面涉及Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体在制备治疗哺乳动物中的病症的药物中的应用，所述病症以海马区缺陷为特征，其中所述干细胞使海马区再生。

在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。

在另一个实施方式中，所述Nrp2⁺神经嵴干细胞是成体干细胞，并且仍更特定地是牙的牙质或毛囊源性的干细胞。

在另一个实施方式中，所述病症是脑的先天性解剖学异常，获得性脑损伤(例如通过头部外伤或窒息获得)或以功能性蛋白14-3-3ζ或蛋白14-3-3ζ/DISC1复合物形成水平降低为特征的病症。

在另一个实施方式中，所述病症是神经精神病症，更具体地是以如下病症的一种或多种症状为特征的病症：精神分裂症、精神分裂症、分裂型人格障碍、精神病、双向障碍、躁郁症、情感障碍，或精神分裂症样或情感分裂疾病、精神病性抑郁、孤独症、药物诱导的精神病、精神错乱、戒酒综合征或痴呆诱导的精神病。

本发明的另一个方面涉及包含用于本发明方法的Nrp2⁺神经嵴干细胞的分离的细胞群。

下面参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例1

材料和方法

小鼠.携带包含Geo报告基因的基因捕获构建体的14-3-3ζ^{Gt(OST062)Lex}和14-3-3ζ^{Gt(OST390)Lex}突变小鼠分别获自雷克西康遗传学公司(Lexicon Genetics)ES细胞系OST062和OST390。14-3-3ζ^{Gt(OST062)Lex}小鼠中的基因捕获载体插入14-3-3ζ的第一内含子，而14-3-3ζ^{Gt(OST390)Lex}小鼠中的基因捕获载体插入14-3-3ζ的第二内含子。将ES细胞系扩增并注射进入SV129囊胚。所得的胚系传递雄性保持在SV129背景或6代内回交进入C57/Bl6和BA1、BC背景。采用来自全组织样品的qRT-PCR和western印迹以证实该基因在这些小鼠品系中的完全KO。14-3-3C基因型采用补充表1中详列的引物，通过PCR扩增基因组尾DNA来测定。野生型等位基因扩增了288bp(14-3-3ζ^{Gt(OST062)Lex})或445bp(14-3-3ζ^{Gt(OST390)Lex})条带，而突变基因捕获等位基因扩增了165bp(14-3-3ζ^{Gt(OST062)Lex})或203bp(14-3-3ζ^{Gt(OST390)Lex})条带。将小鼠保持在杂合繁殖对，其在表型上无法与野生型同窝鼠仔区分。动物实验按照阿德莱德大学的医学与兽医科学学院的动物伦理委员会的规定进行。

行为试验。所有处理在正常光照条件下于上午8.00～12.00进行。行为表型分型如先前所述进行(Coyle等.Behav Brain Res 2009,197(1):210-218；Summers等.Pediatr Res 2006；59(1):66-71；van den Buuse等.Int J Neuropsychopharmacol2009；12(10):1383-1393)。取5-、10-、20-和40-周龄时间点的一组小鼠用于旷场实验。取12周龄的一组小鼠用于空间工作记忆，然后是高空十字迷宫和物体识别任务。取12周龄的另一组小鼠用于PPI。

运动功能测试。在旷场中检测小鼠的探索活动性和焦虑水平，该旷场由箱(50cm x 27cm)制成，将地板分成15个方块(9cm x 10cm)。将各小鼠引入箱的面对右顶角的相同位置。观察小鼠的行为3分钟，并通过检测越线(linecrossing)(即，小鼠将四只爪子都从一个方块移入另一个方块时)来对运动活动力评分。当小鼠的两只前爪都离开地板时记录暴跳(rear up)次数。去除批次之间的尿液和粪便，并用80％乙醇彻底清洁以去除任何余留气味。

物体识别测试。物体识别任务利用小鼠对新事物产生的自然吸引力；识别先前见过的(熟悉的)物体的小鼠将花更多时间探索新物体(Dere等.NeurosciBiobehav Rev 2006；30(8):1206-1224；Sik等.Behav Brain Res 2003；147(1-2):49-54)。简言之，由塑料场地(长：50cm，宽：35cm，深：20cm)组成的装置用基床填充。采用两组不同物体；一个黄盖的塑料坛(高：6cm；底径：4.3cm)和一个红色塑料球(长：8cm，宽：4cm)。当面对这两种物体时，小鼠花费相同时间(不计其在场地中所处的位置)(数据未显示)。评估测试了空间学习和记忆的12周龄的相同组的小鼠的物体识别记忆。给各小鼠5分钟来探索空无一物的测试箱来使其习惯该测试场地。使小鼠经历包含两种考察的测试时间。各考察历时3分钟。在第一考察过程中(采样阶段)，所述箱包含两个相同物体(a，样品)，这两个物体被放在该箱的西北(左)和东北(右)角(距壁5cm)。小鼠总是面对装置中的南壁放置。在第一探索阶段后，将小鼠放回其笼子。在15分钟的记忆间隔之后，将小鼠放进用于第二考察(选择阶段)的装置，但现在该装置有熟悉物(a，样品)和新物体(b)。在考察期之间，所述物体用乙醇彻底清洁以去除任何余留气味。记录考察1和考察2过程中探索各物体所花费的时间。探索定义为用鼻子触碰物体或在距离该物体2cm范围内。所述物体识别任务中的基础检测是在考察1和考察2过程中探索物体所花费的时间。在测试过程中检测若干变化：e1(a+a)和e2(a+b)分别是在考察1和考察2过程中对于两个物体的总探索时间的检测。h1是通过从考察1到考察2(e1–e2)的总探索时间的差异所度量的习惯指数。认为d1(b–a)和d2(d1/e2)是对于新物体和熟悉物之间的辨别力的度量指数。因此，d2是辨别力的相对度量，其基于探索活动性(e2)校正d1。大于零的辨别指数描述动物对新物体的探索多于熟悉物。对任何物体均无倾向的动物的指数接近零。将取样阶段或选择阶段在考察过程中的总探索时间少于7秒的小鼠从分析排除，因为发现在该阈值之下的探索时间度量是不可靠的(vanden Buuse等.同上；de Bruin等.Pharmacol Biochem Behav 2006；85(1):253-260)。

高空十字杆测试。如先前所述，采用高空十字迷宫评估小鼠的焦虑行为，小鼠的该焦虑行为基于其对开放和高空区域的天然憎恶(Komada等.J Vis Exp2008；(22)；Walf等.Nat Protoc 2007；2(2):322-328)。简言之，装置由黑色有机玻璃制成十字形状并由在中间垂直彼此交叉的两个开放臂(25cm x 5cm)和两个闭合臂(25cm x 5cm x 16cm)组成。两臂中间有中央平台(5cm x 5cm)。十字迷宫从地面升高1m。将个体小鼠引至该装置中心，面对与实验员相反位置的开放臂，并通过视频记录观察5分钟。记下进入开放臂和闭合臂的次数和探索两种臂的时间。检测小鼠的自然行为，例如探头次数、暴跳次数和伸展姿势次数。在各考察之后，用乙醇彻底清洁所有臂和中央区域以去除任何余留气味。

逃脱水迷宫测试。采用先前描述的十字迷宫逃避任务来评估空间学习和记忆(Coyle等.2009,同上)。十字迷宫由透明塑料制成(长，72cm；臂尺寸，长26cmx宽20cm)并放在圆形水池(1m直径)中并保持在23C。将奶粉混入水中以隐藏淹没的(水面下0.5cm)逃脱平台(位于迷宫远端北臂中)。该池由黑色塑料壁(高90cm)围住。在迷宫各臂处安排恒定空间提示，并由实验员在训练和测试过程中保持站在南方端。通过将小鼠放入没有逃脱平台的池并允许游泳60秒来使12周龄的小鼠个体习惯该迷宫环境。学习考察在6天训练期间进行，其中要求小鼠了解淹没的逃脱平台相对不包含逃脱平台的其它三个臂(东、南、西)的位置。对各小鼠进行6次每日考察(两批三个考察由30分钟休息间隔)，其中选择三个臂中各一个臂作为随机模式的起始点(每天两次)。就各考察而言，将小鼠放在面壁的臂的远端中，并允许接触逃脱平台60秒，让其在那停留10秒。将给定时间内没有爬上逃脱平台的小鼠在平台上放置10秒。然后，将小鼠放进笼子10秒并继续后续考察。评估小鼠的对逃脱平台位置的长期记忆，所述逃脱平台如学习阶段过程中一样放置在相同位置。在学习最末一天之后14天(M1)和28天(M2)测试记忆，所述学期由关于学习阶段所述的单天6次考察组成。记录各小鼠的对其每次逃脱用时进行考察的数据(即，游至平台所用的时间)、正确考察的数量(即，小鼠发现平台在第一臂入口的情况)和错误进入/再进入的次数(即，小鼠进入不含逃脱平台的臂的次数数量)。

PPI测试。惊吓，如先前描述(van den Buuse等.2009同上)采用8单元自动化系统(SR-LAB,美国的圣迭戈器械公司(San Diego Instruments))评估惊吓适应和惊吓PPI。简言之，将小鼠放进透明Plexiglas圆筒，该圆筒各侧闭合，然后通过该箱顶部的扬声器传送超过70-dB背景噪音的听觉刺激。各测试时间由104个考察组成，平均考察间隔在25秒间。最先和最末八个考察由单一40毫秒115-dB脉冲单独惊吓刺激组成。中间88个考察由假性随机传送16次115-dB脉冲单独惊吓，其中8次考察不传送刺激，和64次前脉冲考察组成。总共32次115-dB脉冲单独考察表示为四批八次，并用于确定惊吓适应。前脉冲考察如下组成：单次115-dB脉冲在刺激间间隔(ISI)提前30毫秒或100毫秒，伴有超过70-dB基线2、4、8或16dB的20毫秒的无惊吓刺激。通过平台下方连接的压-电加速计单元将全体惊吓反应转换成定量值。前脉冲抑制百分比(％PPI)计算为脉冲单独惊吓反应-前脉冲+脉冲惊吓反应/脉冲单独惊吓反应X 100。

统计学分析。所有统计学计算表示为平均值±SEM并且采用SAS 9.2版(美国北卡罗来纳州卡里的SAS研究所有限公司(SAS Institute Inc.))进行。对于旷场数据而言，采用混合效应线性模型比较野生型和突变组与超时之间的越线次数。模型中包括随机小鼠效应以计算来自相同小鼠的重复观察结果中的依赖性。采用独立样品t检验比较野生型和突变小鼠之间的来自高空十字杆的数据。就水十字迷宫测试而言，采用考克斯(Cox)比例危险率模型比较两个处理组和超时之间的逃脱用时。采用该模型中的稳健方差估计来调节结果中因对相同小鼠重复测量所产生的依赖性。在模型组(WT或KO)中，输入时间(第1～6天)和组间与时间的相互作用作为预测变量。₆认为逃脱用时是小鼠找到出口时的右设限30秒。在我们的研究中，有太多动物逃脱用时为右设限30秒，从而能够将结果处理为正态分布。因此，采用混合效应线性模型不具可行性。采用负二项回归模型来比较野生型和突变组以及超时之间的错误进入。在模型组(WT或KO)中，输入时间(第1～6天)和组间与时间的相互作用作为预测变量。₆采用通用估计等式来计算因对相同小鼠重复测量所产生的结果依赖性。采用有重复测量的方差双向分析(ANOVA)(Systat,9.0版,SPSS软件；美国SPSS公司)来比较来自PPI测试的数据。对于该分析，组件因素是基因型，而组内重复测量因素是前脉冲强度和惊吓批次。所有研究中，认为p值<0.05具有统计学显著性。

免疫组化。切片在内含10％非免疫马血清的PBST(0.1M PBS,0.3％曲通X-100,1％BSA)中于室温(RT)下封闭1小时，并后续在室温下用一抗孵育过夜。一抗和稀释度：兔多克隆针对14-3-3ζ(1:200)(Guthridge等.Blood 2004；103(3):820-827)，兔多克隆针对0-微管蛋白(1:250,西格玛公司(Sigma))，兔多克隆针对钙结合蛋白-D28K(1:1000,开米康公司(Chemicon))，小鼠单克隆针对NeuN(1:500,开米康公司)，兔多克隆针对突触素(1:100,细胞信号转导公司(Cell Signaling))。在后一天，切片在室温下用二抗孵育1小时。用0.1M PBS冲洗3次后，切片在金不变色试剂中用DAPI(分子探针公司(MolecularProbes))固定。

BrdU-脉冲追踪分析和TUNEL标记.对14.5dpc或16.5dpc的妊娠小鼠以100μg/g妊娠小鼠体重注射BrdU，并在出生后第7天将对幼仔处以安乐死。通过在冷冻脑切片上的BrdU免疫组化来揭示这些时间点产生的增殖海马区神经元的最后终点。组织用2M HCl在37℃变性20分钟，在0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中中和10分钟，用内含10％马血清的PBST封闭并用大鼠单克隆抗-BrdU(1:250；阿柏堪穆公司(Abcam))和小鼠单克隆抗-NeuN(1:500；开米康公司(Chemicon))抗体在4℃探测过夜。细胞凋亡通过TUNEL试验采用原位细胞死亡检测试剂盒(TMR红；罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))根据生产商说明操作然后用DAPI(分子探针公司)负染来测定。

免疫沉淀。所有蛋白质提取物通过在NP40裂解缓冲液中裂解制备，所述NP40裂解缓冲液组成如下：150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.4)、10％甘油、1％Nonidet(诺乃洗涤剂)P-40以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂(10mg抑肽酶/ml、10mg亮肽素/ml、2mM苯甲基磺酰氟和2mM钒酸钠)。样品在4C裂解60分钟，然后以10,000g离心15分钟。上清液用小鼠Ig-偶联的Sepharose珠在4C预清洗30分钟。预清洗的裂解物在4C用吸收至蛋白A-Sepharose(阿莫山生物科学公司(Amersham Biosciences))的2ug/ml抗-DISC1抗体(C-末端)(英杰公司(Invitrogen))或抗-14-3-3抗体(3F7阿柏堪穆公司(Abcam))孵育2小时。Sepharose珠用裂解缓冲液洗涤3次，然后在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸5分钟。免疫沉淀的蛋白质和裂解物通过SDS-PAGE分离，并电转移至硝化纤维素膜，然后通过免疫印迹分析。

免疫印迹。膜用抗-14-3-3ζEB1pAb以1:1000(Guthridge等.2004同上)或抗DISC1(C-末端)(英杰公司)以1ug/ml探测。为了分析来自脑部组织的14-3-3ζ，采用针对(β-肌动蛋白(1:5000,密理博公司(Millipore))的兔多克隆作为上样对照。用HRP-偶联的二抗(1:20,000,皮尔斯-热科学公司(Pierce-Thermo Scientific)检测结合的抗体。免疫反应性蛋白质通过ECL(日本富士公司的发光图像分析仪LAS-4000)观察。图像用Multi Gauge 3.0版(日本富士公司)分析。

神经元细胞培养。按如下文献所述制备P7海马区神经元-神经胶质共培养物(Kaech等.Nat Protoc 2006,1(5):2406-2415)。硝酸处理的盖玻片(直径13mm)用内含100μg/ml聚-L-溶素/PLL(西格玛公司)的硼酸盐缓冲液在37℃被覆过夜，然后用无菌水冲洗3x 1小时。齿状回和CA样品被切下并在汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中解离，然后将神经元以1x 10⁵个细胞/培养皿的密度放置(用4PLL-被覆的盖玻片)。培养物体外孵育7天和14天供于神经突增生试验。细胞在4％PFA中固定1小时，在内含10％非免疫马血清的PBST(0.1M PBS,0.1％曲通X-100,1％BSA)中于室温下(RT)预孵育1小时并在4℃用针对小鼠单克隆MAP2(1:200,密理博)和14-3-3ζ(1:1000)的一抗孵育过夜。然后，盖玻片用对应二抗在室温下孵育1小时。盖玻片用不变色DAPI(分子探针公司)固定。

结果

14-3-3ζ，突变小鼠显示行为和认知缺陷

14-3-3蛋白在发育和成体脑中大量表达(Berg等.Nat Rev Neurosci 2003；4(9):752-762；Baxter等.Neuroscience 2002；109(1):5-14)。为了确定14-3-3ζ在神经发育和脑功能生成中的作用，从在内含子1或2中包含逆病毒基因捕获插入物的胚胎干细胞克隆产生两种敲除小鼠品系，分别称作14-3-3和14-3-3ζ^{Gt(OST390)Lex}(图8；雷克西康遗传学公司(Lexicon Genetics))。对于来自杂合杂交的胚胎和成体脑组织的定量RT-PCR和western印迹证实基因捕获载体干扰基因转录并产生无效等位基因(图9)。这些突变品系称作14-3-3ζ^062+/-和14-3-3ζ^390+/-。不像其它14-3-3同种型的缺失(Su等.Proc Natl Acad Sci U SA 2011；108(4):1555-1560)，表达分析进一步确定14-3-3C的移除并不能通过增加突变小鼠内其它14-3-3家族成员的表达来平衡(图10)。来自两种种系的14-3-3ζ杂合小鼠的交叉产生预测的孟德尔式比例的杂合突变体(野生型23％、杂合子56％、突变体21％；n＝494，p<0.001)，指示该基因的移除不是胚致死。对于突变体胚胎和新生小鼠的初始研究表明，发育正常进行，因为它们从外表无法与其同窝鼠仔区分。然而，到P14时来自两种品系的突变小鼠显示生长迟缓，而到P21时约由20％的突变小鼠已经死亡(野生型29％、杂合子54％、突变体17％；n＝1619)。剩余的突变小鼠比野生型同窝鼠仔小，但具有相似预期寿命(P100；野生型24.55±1.7g、突变体19.73g±2.5g)。突变小鼠表面上显示为正常且健康，在嗅觉测试、视觉测试和挂线测试(wire-hang test)中无差异。

为了确定地分析14-3-3ζ与神经学疾病和脑功能的关系，对突变小鼠和对照小鼠进行了一系列行为测试。首先评价了14-3-3ζ^062-/-小鼠对旷场环境的反应。突变体在测试过程中显示行进距离显著增加，该结果贯穿全部测试年龄(5、10、20和30周龄)均有保持，指示突变小鼠过度活跃(图1A)。该效果在雄性小鼠和雌性小鼠中类似，没有性别偏差(p>0.05)。

研究小鼠对于新物体而非熟悉物的自然探索偏好以测试识别记忆。内侧叶中的边缘皮层的校正作用是该任务的基础(Dere等.2006同上；Sik等.2003同上；Forwood等.Hippocampus 2005；15(3):347-355；Winters等.J Neurosci 2005；25(17):4243-4251)。在取样阶段，小鼠花费相等时间探索各相同物体(14-3-3ζ^062+/+,50.82±1.2％；14-3-3ζ^062-/-49.18±1.2％)。当面对熟悉物和新物体时，相较于对照而言，14-3-3ζ^062-1-小鼠在测试阶段显示显著削弱的新物体识别力。与缺乏在熟悉物和新物体之间的偏好一致，14-3-3ζ^062-/-小鼠的辨别指数降低(探索新物体的时间–探索熟悉物的时间/探索新物体的时间+探索熟悉物的时间)，指示其无法保留新信息(14-3-3ζ^062+/+,0.1667±0.086s；14-3-3ζ^062-/-,-0.0569±0.047s；p<0.05)。同样，测试阶段也没有性别差异(p>0.5)。特别是，14-3-3ζ^062-/-突变体还显示在物体识别测试中过度活跃，在两个考察阶段花费较长的探索时间(取样阶段，14-3-3ζ^062+/+,27.33±2.7s；14-3-3ζ^062-/-,38.62±4.1s；p<0.05:测试阶段,14-3-3ζ^062+/+,24.58±3.1s；14-3-3ζ^062-/-,50.77±4.7s；p<0.0001)。

高空十字迷宫广泛用于测试啮齿类动物的焦虑行为(Komada等.2008同上；Walf等.2007同上；Lister RG,Psychopharmacology(Berl)1987；92(2):180-185)。当处于该测试中时，14-3-3ζ^062-/-小鼠还显示相对于野生型对照而言活性增加。14-3-3ζ^062-/-小鼠在5分钟测试期间于交叉臂之间有25.23±1.76次跃迁，而14-3-3ζ^062+/+具有12.29±1.21次(p<0.0001)。此外，14-3-3ζ^062-/-小鼠相比14-3-3ζ^062+/+小鼠(31.4±6.0s,p<0.0001)花费显著更多的时间在开放臂中(图1B:114.8±11.5s)，更频繁地进入开放臂(14-3-3ζ^062+/+,4.6±0,6；14-3-3ζ^062-/-,15.5±1.7,p<0.0001)，且更多次地探头(14-3-3ζ^062+/+19.6±1.5；14-3-3ζ^062-/-,33.4±2.4p＝0.0041)，表明其焦虑水平较低。

采用十字迷宫逃脱任务(Summers等.2006同上)来检测空间工作记忆依赖性学习。海马区和前额皮层之间的正确信号转导是该任务探测的前提。小鼠训练6天以识别包含淹没的逃脱平台的十字迷宫的正确的臂。在整个实验过程中，十字迷宫的各臂由新视觉线索指示。尽管一些14-3-3ζ^062-/-小鼠学会辨别正确的臂，其显示到达平添的用时明显增加(超过学习阶段的时程)(图11；χ²(5)＝29.8808；p<0.0001)并且臂选择准确度显著下降(图1C:IRR＝0.52；p<0.0001)。然后，通过使其在学习后14天或28天休息，随后通过在逃脱平台水迷宫中重新测试(分别为M1和M2)来测试其记住正确十字臂的能力。相较于学习阶段，14-3-3ζ^062+/+小鼠显示逃脱用时无变化(HR＝1.18,p＝0.383)，而14-3-3ζ^062-/-显示逃脱用时显著增加(HR＝2.98,p<0.0001)。与海马区依赖性记忆的缺陷一致，突变小鼠在臂选择准确度上也有显著下降(图1C:IRR＝0.231；p<0.0001)。所有认知缺陷均与性别无关。

感觉运动门控的缺陷是神经精神疾病(如精神分裂症和相关疾病)的内表型。海马区和其它脑区域中的合适信号转导是该过滤机制的基础。为了确定14-3-3ζ突变小鼠是否具有异常感觉运动门控，评估听觉惊吓反射的前脉冲抑制(PPI)。发现相较于14-3-3ζ^062+/+小鼠而言，14-3-3^062-/-小鼠具有显著较低的PPI(图1D:基因型主要效应F(1,20)＝5.89,p＝0.025)和惊吓(图12:F(1,20)＝5.87,p＝0.023)。前脉冲强度的水平增加导致野生型和突变体小鼠中PPI的相似增加(图1D)。总体而言，突变小鼠中的惊吓幅度减小，但惊吓适应正常(图12)。

14-3-3ζ,在海马区神经元中表达以控制分层

为了测定海马区的神经发育缺陷是否会引起认知和行为缺陷，分析了14-3-3ζ在神经元发育中的作用。海马区神经元源自沿脑室区的神经上皮(NEv)，并且来自邻近伞的神经上皮(NEf)的限制区(Nakahira等.J Comp Neurol 2005；483(3):329-340)(图2A)。在14.5dpc时，14-3-3ζ免疫染色在中间带中的迁移海马区神经元中检测到，但未在其神经上皮前体中检测到(图2Bi)。至P0时，14-3-3ζ免疫染色也在海马角/阿蒙角(CA)的锥体细胞中被检测到(图2Biii)。利用14-3-3ζ小鼠品系的基因捕获载体中β-geo转基因，用杂合小鼠中的B-半乳糖苷酶染色监测到14-3-3ζ内源性表达。与免疫染色一致，鉴定了迁移CA神经元中的转录水平的14-3-3ζ表达。此外，CA和DG神经元中的表达在晚期成年期被检测到(图2C)。然而，意料之外的是，在出生后早期阶段之后，14-3-3ζ在脑的其它区域(例如小脑)检测不到。通过对提取自微切割成年海马区的蛋白质进行western印迹证实CA和DG神经元中的表达(图2D)。这还证实该蛋白质从14-3-3ζ062-/-小鼠的这些脑区域完全去除。最终，在体外10天之后(DIV)，海马区MAP2阳性神经元培养物还显示对于细胞体和轴突/树突中的14-3-3ζ的点状免疫细胞染色(图2E)。

因为14-3-3ζ在海马区神经元中表达，我们接下来测试是否检测CA和DG神经元来确定其在成年和胚胎突变体中定位正确。14-3-3ζ^062-/-小鼠的Nissl-染色揭示在海马区成熟之前首先被注意到的发育缺陷(5/5在P0时,4/4在P7时,2/2在P28时和2/2在P56时；图3A和图14)。特定地，除其通常所在的锥体细胞层的位置以外，锥体神经元异位定位在辐射层和起层中。在CA3分区中，锥体神经元分离成双层而非单细胞层。相较于14-3-3ζ^062+/+同窝鼠仔，齿状颗粒神经元还松散地排布在14-3-3ζ^062-/-小鼠中。与Nissl染色一致，对thy1-YFP小鼠海马区组织的分析还揭示受干扰的薄层组织(图3B)。

然后，考虑涉及是否异位定位的锥体细胞发育成成熟神经元。在所有14-3-3ζ^062-/-海马区中(4/4幼仔)，异位细胞呈神经元标志物NeuN阳性(图3C)。与其自身在深分子层中的定位不同，神经元还在CA3的浅层成熟。结合该数据推断，海马区中错误定位的细胞形成功能锥体和颗粒神经元。此外，来自胚胎、出生后早期和成年小鼠的海马区的TUNEL染色显示基因型之间没有明显差异(图15)，表明缺失14-3-3ζ不影响神经元活力。

14-3-3ζ-缺陷小鼠显示海马区神经元迁移缺陷

14.5dpc时中间带中的14-3-3ζ的表达和P0时浅层中成熟神经元的存在提高了错误迁移可能导致异常薄层结构的可能性。为了观察海马区神经元迁移，通过将BrdU注射进入来自杂合14-3-3ζ⁰⁶²杂交种的14.5dpc和16.5dpc时的妊娠雌鼠来完成BrdU出生日处理(birthdating)。在P7时收集14-3-3ζ^062+/+和14-3-3ζ^062-/-幼仔，并在冠状切面中鉴定保留BrdU的细胞。切片用DAPI负染以鉴定海马区分离层。采用各基因型5只小鼠，从10μm切片对保留BrdU的细胞计数，并且对各层中的相对百分比定量。两个注射时间点显示，脑室区中产生的接近所有神经元在14.5dpc或16.5dpc时迁移进入对照小鼠中的CA的锥体细胞层(图4)。然而，引人注目的是，在14-3-3ζ^062-/-小鼠中的锥体细胞层之外鉴定出显著百分比的保留BrdU的细胞。因此，神经元无法从其生成位置迁移或停在其正确层之内产生14-3-3ζ^062-/-海马区中重复的锥体细胞层。

14-3-3ζ-缺陷小鼠中锥体细胞内的功能干扰的苔藓纤维回路和异常突触末 端

CA3锥体神经元和DG颗粒细胞之间的联系通过精确轴突路径和突触靶向来实现。通过在P0、P7和P56海马区中用抗钙结合蛋白进行免疫组化染色来评估组织中错误排列的锥体神经元是否影响海马区回路。在对照小鼠中，苔藓纤维从颗粒细胞体发出并分叉成下锥体苔藓纤维(IPMF)和上苔藓纤维(SPMF)管道，跨越CA3的锥体细胞层(图5)。在14-3-3ζ^062-/-小鼠中，IPMF管道沿CA3锥体神经元的顶面行进，但SPMF管道在CA3神经元之间取向错误。

为确定DG颗粒细胞是否触及其CA靶细胞，采用抗突触素来鉴定对照动物中CA3分区的IPMF和SPMF中的突触前(presynapse)。在14-3-3ζ^062-/-小鼠中，取向错误的轴突还在锥体细胞层中形成异常突触(图6)。经高尔基染色的突触结的现象进一步揭示CA3中突触形成中引人注意的差异。在对照动物中，尖端树突的近端区域上的大刺状赘生物(spine excrescence)后跟随细径(fine-calibre)树突分支。在14-3-3ζ^062-/-小鼠的锥体神经元中，所有测试小鼠的树突树看起来具有相似数量的分支点，但在尖端树突的近端和远端上具有来自错误取向的苔藓纤维管道的多刺赘生物。

为了鉴定14-3-3ζ所用以调整神经元迁移和轴突取向的分子通路，对提取自P7小鼠的完整大脑进行共免疫沉淀实验。发现14-3-3ζ能够用针对DISC1的C末端产生的抗体共免疫沉淀。反之亦然，也发现DISC1能够用识别14-3-3ζ的抗体共免疫沉淀(图7)。令人吃惊的是，该数据指示14-3-3ζ特异性地与DISC1的75kDa形式而非100kDa全长蛋白质相互反应，指示DISC1以同种型特异性方式在神经发育中起作用。

实施例2

证明NRP2阳性神经元前体产生海马区

为了确定来自神经元前体并表达Nrp1或Nrp2的成熟神经元，生成Nrp1和Nrp2品系追踪小鼠。为此，已将Cre/RFP或Cre/GFP置入Nrp1或Nrp2启动子表达之下(图16)。采用这些小鼠的研究(来自n＝2实验，图17)第一次显示海马区神经元源自表达Nrp2的神经干细胞。

本领域技术人员会理解，除了特定说明以外，可以对本文所述的发明进行变化和修改。应理解本发明包含所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种的任意和全部组合。

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Claims (13)

1.一种治疗患有以海马区缺陷为特征的病症的哺乳动物的方法，所述方法包括在足以实现海马区再生的条件下给予所述哺乳动物一段时间有效数量的Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体。

2.Nrp2⁺神经嵴干细胞或其突变体或变异体在制备治疗哺乳动物病症的药物中的应用，其中所述病症特征为海马区缺陷，所述干细胞使所述海马区再生。

3.如权利要求1所述的方法或如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Nrp2⁺神经嵴干细胞是成体干细胞。

4.如权利要求3所述的方法或应用，其特征在于，所述成体Nrp2⁺神经嵴干细胞分离自牙的牙质或毛囊。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述病症是脑的先天解剖学异常或获得性脑损伤。

6.如权利要求5所述的方法或应用，其特征在于，所述获得性脑损伤由头部外伤、窒息、萎缩或发育不全所致。

7.如权利要求1～4中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述病症以功能蛋白14-3-3ζ或蛋白14-3-3ζ/DISC1复合物形成的水平降低为特征。

8.如权利要求7所述的方法或应用，其特征在于，所述病症是神经精神病症。

9.如权利要求8所述的方法或应用，其特征在于，所述神经精神病症是以如下病症的一种或多种症状为特征的病症：精神分裂症、精神分裂症、分裂型人格障碍、精神病、双向障碍、躁郁症、情感障碍，或精神分裂症样或情感分裂疾病、精神病性抑郁、孤独症、药物诱导的精神病、精神错乱、戒酒综合征或痴呆诱导的精神病。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述哺乳动物是人。

11.一种分离的细胞群，所述细胞群包含用于权利要求1所述方法的Nrp2⁺神经嵴干细胞。

12.如权利要求11所述的分离的细胞群，其特征在于，所述Nrp2⁺神经嵴干细胞是成体干细胞。

13.如权利要求12所述的分离的细胞群，其特征在于，所述Nrp2⁺神经嵴干细胞分离自牙的牙质或毛囊。