KR20140116053A

KR20140116053A - 렌티바이러스 패키징을 위한 비-서브타입 b gag 단백질의 용도

Info

Publication number: KR20140116053A
Application number: KR1020147009812A
Authority: KR
Inventors: 티-란 트랜; 피에르 샤르노; 세실 보슈
Original assignee: 떼라벡띠스; 앵스티띠 파스퇴르
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2012-09-25
Publication date: 2014-10-01
Also published as: CN107858375A; ZA201401780B; ES2683820T3; US20140234908A1; CA2849652A1; KR101811736B1; IL231666A0; CA2959867A1; CA2849652C; CN104039968B; BR112014007027A2; JP2018183165A; AU2012313960B2; US20170362607A1; HK1200870A1; JP2014530000A; CA2959867C; CN104039968A; JP6495653B2; WO2013046034A3

Abstract

본 발명은 비-서브타입 B gag-pol 서열, 특히 서브타입 D gag-pol 서열을 포함하는 렌티바이러스 패키징 벡터를 포괄한다. 본 발명은 이러한 벡터들을 제조하고 사용하는 방법들을 포괄한다. 본 발명은 HIV-1 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자들을 포괄한다.

Description

렌티바이러스 패키징을 위한 비-서브타입 B GAG 단백질의 용도{USE OF NON-SUBTYPE B GAG PROTEINS FOR LENTIVIRAL PACKAGING}

본 발명은 렌티바이러스 패키징을 위한 비-서브타입 B GAG 단백질의 용도에 관한 것이다.

재조합 백신들은 재조합 DNA 기술의 진보에 따라 발전되어 왔으며, 이는 바이러스 게놈의 변형에 의해 변형 바이러스들의 생산을 가능케하였다. 이러한 방법에 의해, 유전 서열들을 비-병원성 바이러스 내부로 도입하여, 이들의 호스트 내에서 특정 면역 반응을 발생시키기 위해 이들이 면역 단백질을 인코딩하여 감염된 타겟(target) 세포들에서 발현하는 것이 가능해졌다.

이러한 백신들은 백신 기술에 있어서 주요한 진보를 구성한다(Kutzler et al., Nat Rev Genet, 9(10) : 776-788, 2008). 특히, 이들은 생바이러스(약독화된)를 회피하고 불활성 백신들의 제조와 연관된 위험을 제거하는, 종래의 백신에 비해 이점을 갖는다.

변형된(modified) 레트로바이러스(레트로바이러스 벡터)를 사용한 유전자 전달은 1980년대 초 Mann et al.(Cell, 33(1):153-9, 1983)에 의해 소개되었다. 가장 흔하게 사용되는 종양원성(oncogenic) 레트로바이러스 벡터들은 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus: MLV)에 기반한다. 이들은 폴리단백질 Gag, Pol 및 Env가 형성되는 단순한 게놈을 가지며 바이러스 복제를 위해 트랜스 형태로 요구된다(Breckpot et al., 2007, Gene Ther, 14(11):847-62; He et al. 2007, Expert Rev vaccines, 6(6):913-24). 일반적으로 시스 형태로 요구되는 서열들은 긴 말단 반복순서(long terminal repeats: LTRs) 및 이들의 인접부이다: 병합을 위해 요구되는 역반복 순서(inverted repeats(IR) 또는 att 사이트들), 패키징 서열 Ψ, 수송 RNA-바인딩(transport RNA-binding) 사이트(프라이머 바인딩 사이트: PBS), 및 역전사와 연관된 일부 추가적 서열들(플러스 가닥 개시에 필요한 LTRs 내 반복순서 R, 및 폴리퓨린관(polypurine tracts, PPT)). 복제-결함 레트로바이러스 벡터들을 발생시키기 위해 gag, pol, 및 env 유전자들이 일반적으로 전체적으로 결실되며 발현 카세트로 치환된다.

렌티바이러스(lentivirus) 게놈(즉, 렌티바이러스 벡터)으로부터 유래된 레트로바이러스 벡터들은 다른 바이러스 시스템들에 비해 일부 이점들을 보유하므로, 유전자 치료 및 면역치료 목적을 위한 각광받는 도구로 출현하였다. 특히, 렌티바이러스 벡터들은 다른 레트로바이러스들과 달리 그 자체로 비독성이며, 특히 수지상 세포들에 있어서 비-분할 세포들을 형질도입할 수 있으며(He et al. 2007, Expert Rev vaccines, 6(6):913-24), 내생 경로를 통해 항원표출이 가능하다.

렌티바이러스들은 레트로바이러스과 패밀리(Retroviridae family)의 느린 바이러스들의 속에 해당하며, 이는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency viruses: HIV), 원숭이 면역결핍 버이러스(simian immunodeficiency virus: SIV), 말 전염 뇌염 바이러스(equine infectious encephalitis virus: EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(caprine arthritis encephalitis virus: CAEV), 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus: BIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV)를 포함한다. 렌티바이러스는 이들의 호스트에서 영구적으로 존속할 수 있으며, 일생의 감염과정 동안 다양한 속도로 지속적으로 복제할 수 있다. 호스트 내에서의 상기 바이러스의 지속적 복제는 호스트 방어를 회피하는 이들의 능력에 의존한다.

재조합 렌티바이러스 벡터의 디자인은 렌티바이러스의 시스- 및 트랜스-작용 서열들의 분리에 기반한다. 비-분할 세포들의 효율적인 통합 및 복제는 렌티바이러스 게놈에서의 2개의 시스-작용 서열들, 중앙 폴리퓨린관(cPPT) 및 중앙 말단 서열(central terminal sequence: CTS)의 존재를 요구한다. 이들은 중앙 DNA "플랩(flap)"으로 불리는 3중-가닥 DNA 구조의 형성을 유도하며, 이는 수지상 세포들(dendritic cells: DCs)을 포함하는 비-분할 세포들의 핵 내부로 유전자 수송의 효율을 극대화시킨다(Zennou et al., 2000, Cell, 101(2) 173-85; Arhel et al., 2007, EMBO J, 26(12):3025-37).

HIV-1 렌티바이러스 벡터들은 패키징 구조체로부터 인 트랜스(in trans) 벡터들을 패키징하기 위한 서브타입 B Gag, Pol, Tat 및 Rev 단백질들의 제공에 기반하여 발생되어왔다(Naldini et al, PNAS 15: 11382-8 (1996); Zufferey et al, Nature Biotechnology 15:871-875, (1997); Dull et al, Journal of Virology (1997)). 이러한 연구들은 서브타입 B Gag 및 Pol 단백질들로 수행되었다. HIV-1 패키징 구조체 내의 비-서브타입 B gag 및 pol 서열들의 효과는 평가되지 않았다.

서브타입 B외에 HIV-1의 다양한 서브타입들이 존재한다. C, E 및 A와 같은 일부 HIV-1의 서브타입들은 미국 및 유럽에서의 주된 서브타입인 HIV-1 서브타입 B보다 효율적으로 전달되는 것으로 보여진다(Essex et al., Adv Virus Res. 1999; 53:71-88). 선진 서방국에서 발견되는 우세한 HIV-1 서브타입인, 클레이드(clade) B는 대부분의 HIV-감염자들의 거주지인 아프리카 및 아시아에 존재하는 서브타입들 및 재조합들과 상당히 상이하다(Spira et al., J. Antimicrobial Chemotherapy (2003) 51, 229-240.). 따라서, 북아메리카 및 유럽에서 발견되는 서브타입 B 레트로바이러스, 및 전세계 스케일에서 인간을 감염시키는 바이러스 서브타입들 사이의 심각한 불일치가 존재할 수 있다. 마찬가지로, 서브타입의 다양성은 HIV 전염 모드에 영향을 미칠 수 있다. 동성애 및 비경구 약물 남용이 유럽 및 아메리카에서 클레이드 B 균주에 대해 관찰되는 전염의 주된 모드이다. 반면, 양성간 전염이 우세한 아프리카 및 아시아에서는 클레이드 A, C, D 및 E가 지배적이다. 추가적으로, 일부 연구들은 AIDS의 진행이 전염 서브타입의 기능에 따라 달라진다고 제안하고 있다. 따라서, HIV-1 서브타입 B는 다른 HIV-1 서브타입들과 매우 상이하다.

HIV의 계통적 분류는 통상적으로 동일한 분리물의 다중 서브 게놈 영역들(gag, pol 및 env)로부터 유래한 뉴클레오티드 서열들 또는 전체길이(full-length)의 게놈 서열 분석에 기반한다. HIV-1 전체길이에 근접한 서열의 계통 분석에 따르면, HIV-1 서브타입 B는 HIV 서브타입 D와 유전적으로 가장 밀접하게 연관되었다(도 1 참조). HIV-1 Gag 및 Pol 단백질 서열들의 계통 분석 또한 HIV-1 서브타입 B가 HIV 서브타입 D와 유전적으로 가장 밀접하게 연관되었음을 보여주었다(도 2 참조).

그러나, HIV-1-NDK, 서브타입 D 바이러스는 HIV-1-BRU 프로토타입, 서브타입 B 바이러스보다 CD4+ 림프구에 대해 상당히 세포변형성을 갖는다. 이는 서브타입 D 바이러스의 강화된 융합생성 및 전염성이 기인할 수 있다(De Mareuil et al., J. Virol. 66: 6797 (1992)). 재조합 바이러스의 표현형 분석은 HIV-1-NDK 외피 글리코단백질(envelope glycoprotein)과 함께, HIV-1-NDK 매트릭스(MA) 단백질의 N-말단 부분으로부터의 75개의 아미노산들이 CD4+ 림프구에서의 HIV-1-NDK의 강화된 융합생성 뿐만 아니라 일부 CD4-세포주들에서의 HIV-1-NDK의 강화된 전염성을 유발함을 보여주었다.

본 기술분야에서, 주사 부피를 줄이고, 투약량을 증가시키고, 백신 비용을 감소시키고, 일 배치(batch)로 치료될 수 있는 환자수를 증가시키기 위해 패키지된 렌티바이러스 벡터의 높은 역가(titer)를 제공하는 렌티바이러스 패키징 구조체(packaging construct)의 요구가 상존한다.

렌티바이러스 패키징 플라스미드(구조체 p8.74) 내의 HIV-1 서브타입 B의 gag-pol 유전자는 서브타입 D HIV-1의 gag-pol 유전자에 의해 치환되어 구조체 pThV-GP-N을 생성하였다. 상기 구조체는 렌티바이러스 벡터 생성을 위해 사용되었다. 구조체 p8.74에 비해 pThV-GP-N 플라스미드를 사용하여 대략 2배 높은 역가가 수득되었다. 따라서, 서브타입 D 바이러스의 Gag-Pol은 서브타입 B 바이러스의 Gag-Pol 보다 상대적으로 렌티바이러스 벡터 입자들의 역가를 증가시킨다.

본 발명은 특히, HIV-1 NDK로부터의 서브타입 D gag-pol 서열을 포함하는 렌티바이러스 패키징 벡터를 포괄한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 벡터는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 페키징 벡터는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 인코딩한다.

SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.

SEQ ID NO 2의 아미노산 서열은 다음과 같다.

본 발명은 특히, HIV-1 NDK로부터의 서브타입 D MA 서열을 포함하는 렌티바이러스 패키징 벡터를 포괄한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 벡터는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 MA 단백질을 인코딩한다.

SEQ ID NO:3의 아미노산 서열은 다음과 같다.

바람직하게는, 예를 들면, p8.74와 같이 HIV-1 BRU의 HIV Gag MA 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 패키징 벡터와 비교할 때, HIV Gag MA 단백질을 인코딩하는 상기 렌티바이러스 패키징 벡터는 패키지된 렌티바이러스 벡터의 역가에 있어서, 적어도 1.5 배 혹은 적어도 2 배의 증가를 발생시킨다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 패키징 벡터는 복제-결함 및 Ψ 사이트가 결여된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 벡터는 글루탐산(glutamic acid)이 아닌 12 위치의 아미노산 및 아르기닌(arginine)이 아닌 15 위치의 아미노산을 갖는 HIV Gag MA 단백질을 인코딩한다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 패키징 벡터는 46 위치에 발린(valine) 및 61 위치의 루신(leucine)을 모두 갖지 않는다.

바람직한 실시예에 있어서, MA 단백질의 12 위치의 아미노산은 리신(lysine)이다. 바람직한 실시예에 있어서, 15 위치의 아미노산은 트레오닌(threonine)이다. 바람직한 실시예에 있어서, 15 위치의 아미노산은 알라닌(alanine)이다. 바람직한 실시예에 있어서, 46 위치의 아미노산은 루신이다. 바람직한 실시예에 있어서, 61 위치의 아미노산은 이소루신이다. 바람직한 실시예에 있어서, 61 위치의 아미노산은 메티오닌(methionine)이다.

일 실시예에 있어서, 상기 벡터는 기능성 Env 단백질을 인코딩하지 않는다.

본 발명은 또한 상술한 렌티바이러스 패키징 벡터들을 제조하는 방법 및 상기 렌티바이러스 패키징 벡터들을 사용하는 방법들을 포괄한다.

본 발명은 첨부한 도면들을 통해 보다 충분히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 HIV 바이러스의 계통도를 도시하고 있다.
도 2a 및 도 2b는 각각 HIV GAG 및 HIV POL 단백질의 계통도를 도시하고 있다.
GAG 및 POL 단백질의 서열들은 http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/NEWALIGN/align.html로부터 수득되었다. 공지된 각 HIV 클레이드에 대해, 1명의 환자(클레이드 B) 또는 2명의 환자들의 바이러스 서열들이 랜덤하게 선택되었고, GAG 및 POL 단백질 서열들이 참조 클레이드 B 단백질(B.FR.83.HXB2_LAI_IIIB_BRU.KO3455)과 비교되었다. Vector NTI advance 11(Invitrogen)을 사용하여 정렬을 수행하였다.
도 3은 벡터 생성을 위해 p8.74 및 the pThV-GP-N 플라스미드를 사용하여 수득된 역가(titre)들을 도시하고 있다. 렌티바이러스 입자들은 프로바이러스(proviral) 플라스미드(pFLAP-CMV-GFP), 위형(pseudotyping) 플라스미드(pTHV-VSV.G), 및 상용되는 패키징 플라스미드(BRU 균주로부터 유래된, p8.74) 혹은 NDK-유래 패키징 플라스미드(pTHV-GP-N) 중 어느 하나를 사용하여 생성되었다. 각 패키징 플라스미드를 사용하여, 18개의 독립적 트랜스펙션들(transfections)이 수행되었으며 입자 역가들이 FACS 분석을 통해 측정되었다. 또한, 유사한 결과들이 HIV 항원 발현을 유도하는 β2 마이크로글로불린 프로모터를 함유한 프로바이러스 플라스미드를 채용한 벡터를 사용하여 수득되었다.
도 4a 및 도 4b는 야생형 BRU 및 NDK 바이러스들의 생산 및 이들 각각의 초기 상(phase) 효율의 평가를 도시하고 있다. 293T 세포들이 야생형 BRU(pBRU) 또는 NDK(pNDK-N) 바이러스 인코딩을 위한 플라스미드를 사용하여 도입되었다. 바이러스 상청액(supernatant)이 48시간 후에 수집되었고, 희석되어 P4-CCR5 세포들(HIV LTR에 의해 발현이 유도되는 안정한 루시퍼라아제(luciferase) 리포팅 유전자를 포괄)을 감염시켜 TAT 단백질(바이러스에 의해 발생)의 존재 하에 루시퍼라아제가 생성되었다. BRU 또는 NDK 바이러스의 일련의 희석물들이 P4-CCR5 세포를 감염시키는데 사용되었으며, 루시퍼라아제 발현(도 4a) 또는 루시퍼라아제/P24 비율(도 4b)이 측정되었다.
도 5는 패키징 플라스미드로부터 유래된 BRU(p8,74) 및 NDK(pThV GP-N)의 상이한 비율을 사용한 벡터 생산을 도시하고 있다. 각 조건들(0μg NDK + 10μg BRU에서부터 10μg NDK + 0μg BRU 까지)에 대해, 역가(회색 막대) 및 P24 레벨(검은색 사각형)이 측정되었다.
도 6은 패키징 플라스미드로부터 유래된 BRU(8,74) 또는 NDK(pThVGP-N)을 사용하여 생산된 벡터 상청액의 웨스턴 블롯(Western blot)을 도시하고 있다. P24 단백질 및 전구체 검출이 NIH 항-P24 MAB(183-H12-5C)을 사용하여 수행되었다.
도 7은 클레이드 B 바이러스(BRU; SEQ ID NO:3)의 N-말단 MA 서열들의 클레이드 D 바이러스(NDK; SEQ ID NO:4)와의 서열 정렬을 도시하고 있다.
도 8은 클레이드 B 바이러스의 N-말단 MA 서열들의 서열 정렬을 도시하고 있다.
도 9는 클레이드 D 바이러스의 N-말단 MA 서열들의 서열 정렬을 도시하고 있다.
도 10은 클레이드 B 바이러스(BRU)의 N-말단 MA 서열들의 다른 클레이드 바이러스들과의 서열 정렬을 도시하고 있다.

서브타입 B HIV-1 바이러스들은 전달 효율성이 떨어지고, 상이한 전달 모드를 갖는다는 점에서 다른 HIV-1 서브타입들과 다르다. 그러나, 서브타입 B 바이러스는 HIV-1 렌티바이러스 벡터 및 렌티바이러스 패키징 벡터들의 생성에 광범위하게 사용되어왔다. 비-서브타입 B 바이러스의 Gag 및 Pol 단백질들이 렌티바이러스 패키징 벡터(구조체 p8.74) 생성에 사용될 수 있는지 결정하기 위해, 렌티바이러스 패키징 플라스미드(구조체 p8.74) 내의 HIV-1 서브타입 B의 gag-pol 유전자가 서브타입 D HIV-1의 gag-pol 유전자로 치환되어 구조체 pThV-GP-N을 생성하였다. 상기 구조체는 렌티바이러스 벡터 생산에 사용되었다. 약 2배 높은 역가들이 구조체 p8.74와 비교하여 pThV-GP-N 플라스미드를 사용하여 수득되었다(도 3 참조). 따라서, 패키징 벡터 내의 서브타입 D HIV-1 Gag-Pol은 서브타입 B HIV-1 Gag-Pol로 관찰되는 역가를 초과하여, 렌티바이러스 벡터 역가를 증가시켰다.

렌티바이러스 벡터의 증가된 역가는 렌티바이러스 벡터의 주어진 도오즈(dose) 내의 오염물들의 감소를 가능케 하는 점에서 유리하다. 이는 주사 볼륨의 감소 및 가능한 도오즈량의 증가를 촉진할 수 있다. 또한, 특정 도오즈를 획득하기 위한 물질 및 노동의 양을 감소시킴으로써, 그리고 렌티바이러스 벡터의 싱글 배치로 치료될 수 있는 환자의 수를 증가시킴으로써 백신 비용 감소를 촉진할 수 있다.

HIV-1 BRU 및 HIV-1 NDK 바이러스의 연속적 희석은 HIV-1 NDK 바이러스가 바이러스 생명 주기의 초기 상에 있어서 보다 효율적임을 제시하였다(도 4 참조). 서브타입 B 및 서브타입 D 패키징 벡터들의 서로 다른 양을 혼합함으로써, 서브타입 D 패키징 벡터가 렌티바이러스 벡터 제조물 내의 p24의 역가 및 레벨을 상승시키는 것으로 밝혀졌다(도 5 참조). 서브타입 D 패키징 벡터를 사용한 렌티바이러스 벡터 제조물 내의 p24는 또한 보다 완전하지 않게 가공되며 p24 전구체의 보다 높은 레벨을 보이는 것으로 관찰되었다(도 6 참조). 따라서, 서브타입 D 패키징 벡터 내의 Gag 단백질은 서브타입 B 패키징 벡터와는 다른 다양한 특성을 보였다.

HIV-1 Env와 함께, HIV-1-NDK 매트릭스(MA) 단백질의 N-말단 부분으로부터의 75개의 아미노산들은 CD4+ 림프구들 내의 HIV-1-NDK의 강화된 융합생성 뿐만 아니라 일부 CD4- 세포주들에서의 HIV-1-NDK의 강화된 전염성에 관여된다(De Mareuil et al., J. Virol. 66: 6797 (1992)). 서브타입 B 및 서브타입 D 패키징 벡터들과 함께 렌티바이러스 벡터들의 생성에 사용되는 Env 단백질은 동일하므로(즉, VSV), HIV-1 MA에서의 유일한 차이점들은 서브타입 B 및 서브타입 D 패키징 벡터들에 존재한다.

HIV-1 바이러스들의 다양한 클레이드들로부터의 M의 N-말단 75 아미노산들 내의 아미노산의 보존 및 분화에 대해 시험하였다. HIV-1-NDK는 HIV-1 BRU와 아미노산에 있어서 10개의 차이점을 보였다(도 7 참조). 그러나, 이러한 차이점들 중 단지 8개는 HIV-1 NDK가 20개의 상이한 HIV-1 서브타입 B 바이러스들의 조합과 비교될 때 관찰되었다(도 8 참조). 다른 서브타입 D 바이러스들이 비교대상에 포함될 때, 이러한 차이점들 중 단지 4개가 남았다(도 9 참조). 이러한 차이점들은 서브타입 D 바이러스들에서 아미노산 12 위치에서의 글루탐산의 부존재, 아미노산 15 위치에서의 아르기닌의 부존재, 아미노산 46 위치에서의 발린의 부존재 및 아미노산 61 위치에서의 루신의 부존재이다.

다른 서브타입 바이러스들이 비교에 포함되었을 때, 상기 다른 서브타입들은 이러한 거의 모든 차이점들을 보존하며, 서브타입 D와 정렬되는 것으로 관찰되었다(도 10 참조). 거의 모든 비-서브타입 B 바이러스들은 12 위치에서 리신을 보유하였다. 많은 비-서브타입 B 바이러스들은 15 위치에서 알라닌을 보유하였다. 거의 모든 비-서브타입 B 바이러스들은 46 위치에서 루신을 보유하였다. 거의 모든 비-서브타입 B 바이러스들은 61 위치에서 메티오닌 또는 이소루신을 보유하였다. 비-서브타입 B 바이러스들은 공통으로 12 위치에서 리신, 15 위치에서 아르기닌 외의 아미노산, 46 위치에서 루신, 및 61 위치에서 이소루신 혹은 메티오닌을 보유하였다.

본 발명은 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 인코딩하는 패키징 벡터들 및 이러한 벡터들을 포함하는 호스트 세포들을 포괄한다. 또한, 본 발명은 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 인코딩하는 패키징 벡터를 제조하는 방법을 포괄한다. 또한, 본 발명은 이러한 패키징 벡터들을 활용하여 렌티바이러스 벡터들을 생성하는 방법 및 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 포함하는 렌티바이러스 벡터들을 포괄한다.

패키징 벡터(Packaging Vectors)

본 발명은 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 인코딩하는 패키징 벡터들을 포괄한다. 본 출원에서, 렌티바이러스 "패키징 벡터"는 기능성 HIV-1 Env를 인코딩하지 않고 Ψ 사이트가 없지만, 패키징을 위한 적절한 렌티바이러스 시스-작용 신호를 함유하는 벡터와 동시주입(cotransfected) 되었을 때 바이러스 입자들과 병합될 수 있는 렌티바이러스 Gag 및/또는 Pol 단백질들을 발현할 수 있는 핵산 서열로 정의된다. 본 발명의 렌티바이러스 패키징 벡터는 자체 패키징에 의한 복제 및 자체 서열의 역전사가 불가능하다.

상기 패키징 벡터는 RNA 또는 DNA 벡터일 수 있다. 비-서브타입 B Gag 및 Pol 단백질들은 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 단백질들 및 이들의 재조합물로부터 선택될 수 있다. 바람직한 패키징 벡터는 SEQ ID NO:1을 포함하거나 SEQ ID NO:2를 인코딩한다.

본 발명은 비-서브타입 B Gag 단백질들을 인코딩하는 패키징 벡터들 및 상기 벡터들을 포함하는 호스트 세포들을 포괄한다. 상기 비-서브타입 B Gag 단백질들은 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 단백질들 및 이들의 재조합물로부터 선택될 수 있다. 바람직한 패키징 벡터는 SEQ ID NO:2의 Gag 단백질 부분을 인코딩한다.

본 발명은 비-서브타입 B MA 단백질들을 인코딩하는 패키징 벡터들 및 이들 벡터를 포함하는 호스트 세포들을 포괄한다. 상기 비-서브타입 B MA 단백질들은 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 단백질들 및 이들의 재조합물로부터 선택될 수 있다. 바람직한 패키징 벡터는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:2의 MA 단백질 부분을 인코딩한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 패키징 벡터는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 패키징 벡터는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, 또는 SEQ ID NO:2 혹은 SEQ ID NO:3과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.

본 출원에 사용되는, 두 핵산 서열들의 퍼센트 동일성은 Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)에서 기술되고 위스콘신 대학 Genetics Computer Group(UWGCG)으로부터 획득가능한 GAP 컴퓨터 프로그램 버전 6.0과 상기 GAP 프로그램에 대한 하기의 디폴트 변수들을 사용하여 결정될 수 있다:

(1) 뉴클레오티드에 대한 단항 비교 매트릭스(동일성에 대한 값 1 및 비-동일성에 대한 값 0 포함), 및 Gribskov 및 Burgess의 가중 비교 매트릭스(Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, as described by Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979); (2) 각 갭(gap)에 3.0의 페널티 및 각 갭의 심볼에 대해 추가적인 0.10의 페널티; 및 (3) 말단 그룹들에는 페널티 없음

다양한 실시예들에 있어서, 상기 벡터는 일 이상의 하기의 특징들을 보유한 HIV-1 MA 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.

12 위치 아미노산에 글루탐산의 부재;

15 위치 아미노산에 아르기닌의 부재;

46 위치 아미노산에 발린의 부재; 및

61 위치 아미노산에 루신의 부재.

12 위치의 아미노산이 리신;

15 위치의 아미노산이 트레오닌;

15 위치의 아미노산이 알라닌;

46 위치의 아미노산이 루신;

61 위치의 아미노산이 이소루신; 및/또는

61 위치의 아미노산이 메티오닌.

상기 패키징 벡터는 바람직하게는 HIV-1 Gag 및 Pol을 인코딩한다. 가장 바람직하게는, 상기 패키징 벡터는 HIV-1 Gag MA 단백질을 인코딩한다.

상기 패키징 벡터는 Gag 및 Pol의 발현을 위한 바이러스 혹은 비-바이러스 서열들을 함유할 수 있다. 상기 패키징 벡터는 HIV-1 LTR 혹은 HIV-1 LTR의 U3 영역을 함유할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 패키징 벡터는 HIV-1 LTR들을 함유하지 않는다. Gag 및 Pol의 발현을 유도하기 위해 임의의 프로모터(promoter)가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 인간 세포들 내의 강한 프로모터일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 패키징 벡터는 예를 들면, gag 및 pol과 같은 인코딩된 유전자들의 발현을 유도하는 거대세포바이러스(Cytomegalovirus: CMV) 프로모터, CMV 초기 인핸서(enhancer)/닭 β 액틴(CAG) 프프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV) 프로모터, 인간 포스포글리세린산 키나아제(phosphoglycerate KINASE: hPGK) 프로모터 또는 LTR 프로모터로부터의 U3(예를 들면, 척수증식성 유종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus: MPSV) U3) 프로모터를 함유할 수 있다.

바람직하게는, 상기 패키징 벡터는 임의의 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 폴리아데닐레이션 신호는 인간 세포들에 있어서 강한 신호이다. 가장 바람직하게는, 폴리아데닐레션 신호는 인간 α2 글로빈 혹은 소 성장 호르몬(Bovine Growth hormone: BGH) 폴리아데닐레이션 신호이다.

바람직하게는, 상기 패키징 벡터는 Rev-응답 요소(Rev-responsive element: RRE)를 함유한다. 바람직한 일 실시에에 있어서, 상기 패키징 벡터는 HIV-1 Rev 단백질을 발현한다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 적어도 하나의 스플라이스 도너(splice donor) 사이트 및 적어도 하나의 스플라이스 억셉터(splice acceptor) 사이트를 함유한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 HIV-1 Tat 단백질을 발현한다.

바람직한 실시예들에 있어서, 상기 패키징 벡터는 HIV-1 Vif, Vpr, Vpu, 및/또는 Nef를 인코딩하는 서열들이 결여되어 있다. 상기 패키징 벡터는 본 출원에 설명된 특징들을 일 이상 갖는 HIV-1 MA 단백질을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 오직 하나의 HIV-1 단백질, Gag를 인코딩한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 오직 2개의 HIV-1 단백질들, Gag 및 Pol을 인코딩한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 Gag, Pol, Rev 및 Tat으로부터 선택된 오직 3개의 HIV-1 단백질들을 인코딩한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 오직 4개의 HIV-1 단백질들, Gag, Pol, Rev 및 Tat를 인코딩한다.

일 실시예에 있어서, 상기 벡터는 (5'에서 3'으로)CMV 프로모터, HIV-1 Gag-Pol을 인코딩하는 핵산 서열, Tat 및 Rev의 엑손 인코딩 부분, 스플라이스 도너 사이트, RRE를 함유한 인트론, 스플라이스 억셉터 사이트, Tat 및 Rev의 엑손 인코딩 부분, 및 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다. 바람직하게는, HIV-1 Gag-Pol은 서브타입 D HIV-1 Gag-Pol이다.

상기 패키징 벡터는 박테리아 또는 진핵 세포에서의 복제 원점(origin)을 더 함유할 수 있다. 상기 패키징 벡터는 박테리아 또는 진핵 세포에서의 선택을 위한 선택가능한 마커(marker) 유전자를 함유할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 패키징 벡터들을 포함하는 호스트 세포들을 포괄한다. 상기 호스트 세포들은 본 발명의 상기 패키징 벡터들로 일시적으로 감염될 수 있다. 상기 호스트 세포들은 상기 호스트 세포의 게놈 내부로 병합된 본 발명의 패키징 벡터들을 갖는 세포주(cell line)일 수 있다. 많은 다양한 세포들이 적절한 호스트 세포들로 사용된다. 바람직하게는, 상기 세포들은 인간 세포들이며, 가장 바람직하게는 불멸화된 인간 세포주이다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포들은 HEK 293T 세포들이다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포들은 HeLA, HT1080 또는 PER C6 세포들이다(Delendaet al, Cells for Gene Therapy and vector Production, Methods in Biotechnology, Vol 24 : Animal Cell Biotechnology : Methods and Protocols, 2^nd Ed. Edited by R.Pㆆrtner, Humana Press Inc., Totowa, NJ).

패키징 시스템

본 발명은 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 발현하는 세포들을 포함하는 렌티바이러스 패키징 시스템을 포괄한다. 본 출원에서 렌티바이러스 "패키징 시스템"은 Ψ 사이트의 부존재 하에서 적어도 렌티바이러스 Gag 및 Pol 단백질들을 발현하며, Ψ 사이트를 함유하는 외생 핵산의 패키징 및 역전사가 가능한 세포들을 포함하는 세포-기반 시스템으로 정의된다. 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 또한 다른 바이러스 단백질들을 발현할 수 있다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템은 외피(envelope) 단백질을 발현한다. 상기 외피 단백질은 렌티바이러스(예를 들면, HIV-1 Env) 또는 비-렌티바이러스(예를 들면, VSV, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 광견병(Rabies) 바이러스) 외피 단백질일 수 있다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템은 HIV-1 Tat 및/또는 Rev 단백질을 발현한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 이들의 게놈 내부로 안정적으로 병합된 HIV-1 Gag 및/또는 Pol을 인코딩하는 서열들을 함유한다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 이들의 게놈 내부로 안정적으로 병합된 외피 단백질을 인코딩하는 서열들을 함유한다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 이들의 게놈 내부로 안정적으로 병합된 HIV-1 Tat 및/또는 Rev를 인코딩하는 서열들을 함유한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템은 HIV-1 Gag 및/또는 Pol 단백질들을 일시적으로 발현한다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 외피 단백질을 일시적으로 발현한다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 HIV-1 Tat 및/또는 Rev 단백질들을 일시적으로 발현한다.

상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 단백질들 및 이들의 재조합물로부터 선택된 비-서브타입 B Gag 및 Pol 단백질들을 발현할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 SEQ ID NO:1을 포함하거나 SEQ ID NO:2를 발현한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 비-서브타입 B Gag 단백질들을 발현한다. 상기 비-서브타입 B Gag 단백질들은 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 단백질들 및 이들의 재조합물로부터 선택될 수 있다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 비-서브타입 B MA 단백질들을 발현한다. 상기 비-서브타입 B MA 단백질들은 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 단백질들 및 이들의 재조합물로부터 선택될 수 있다. 바람직한 패키징 벡터는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:2의 MA 단백질 부분을 인코딩한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 본 발명의 렌티바이러스 벡터들 중 임의의 벡터를 함유할 수 있다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열을 함유한다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스템의 세포들은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현한다.

패키징 벡터들의 생성 방법

본 발명은 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 인코딩하는 패키징 벡터들의 제조 방법들을 포괄한다. 상기 패키징 벡터는 본 출원에서 논의된 임의의 특징들을 보유할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 비-서브타입 B HIV-1 바이러스로부터 Gag 및/또는 Pol 서열을 비-HIV 프로모터(예를 들면, CMV 프로모터)의 조절 하에 플라스미드로 삽입하여 패키징 벡터를 생성하는 것을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 오직 1종의 HIV-1 단백질을 인코딩한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 오직 2종의 HIV-1 단백질들을 인코딩한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 Gag, Pol, Rev 및 Tat으로부터 선택된 오직 3종의 HIV-1 단백질들을 인코딩한다. 일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터는 오직 4종의 HIV-1 단백질들, Gag, Pol, Rev, 및 Tat을 인코딩한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 플라스미드는 일 이상의 CMV 프로모터, Tat 및 Rev의 엑손 인코딩 부분, 스플라이스 도너 사이트, RRE를 함유한 인트론, 스플라이스 억셉터 사이트, Tat 및 Rev의 엑손 인코딩 부분, 및 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 패키징 벡터는 CMV 프로모터, Tat 및 Rev의 엑손 인코딩 부분, 스플라이스 도너 사이트, RRE를 함유한 인트론, 스플라이스 억셉터 사이트, Tat 및 Rev의 엑손 인코딩 부분, 및 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다.

비-서브타입 B HIV-1 바이러스는 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 바이러스들 및 이들의 재조합물로부터 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 HIV-1 서브타입 B 바이러스의 Gag 서열을 포함하는 패키징 벡터를 제공하는 단계 및 상기 벡터 내의 Gag 서열들을 HIV-1 비-서브타입 B 바이러스로부터의 서열들로 치환하는 단계를 포함한다.

상기 비-서브타입 B HIV-1 바이러스는 서브타입 A, 서브타입 C, 서브타입 D, 서브타입 E, 서브타입 F1, 서브타입 F2, 서브타입 G, 서브타입 H 및 서브타입 J 바이러스들 및 이들의 재조합물로부터 선택될 수 있다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 비-서브타입 B HIV-1 바이러스는 HIV-1 NDK이다.

렌티바이러스 벡터들의 생성 방법

본 발명은 또한 HIV-1 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 인코딩하는 패키징 벡터들을 사용하여 렌티바이러스 벡터들을 생성하는 방법들을 포괄한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 HIV-1 비-서브타입 B Gag 또는 Pol 단백질을 인코딩하는 패키징 벡터를 렌티바이러스 벡터를 갖는 세포에 투여하는 것을 포괄한다. 상기 패키징 벡터는 본 출원에서 논의된 임의의 특징들을 포함할 수 있다.

상기 렌티바이러스 벡터는 Ψ 사이트 및 프라이머 결합 사이트를 포함하는, 패키징 및 역전사 시스-작용 서열들을 포함한다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터는 두 HIV-1 LTR 서열들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, LTR들 중 하나는 U3 및 R 서열들을 위해 제거된다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터는 중앙 폴리퓨린관(cPPT) 및 중앙 말단 서열(central terminal sequence: CTS)을 포함한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 바람직하게는 선택가능 마커 또는 종양 항원과 같은 렌티바이러스 또는 비-렌티바이러스 단백질을 인코딩한다.

일 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 일 이상의 HIV 항원, 바람직하게는 HIV-1 항원을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 항원은 Gag, Pol, Env, Vif, Vpr, Vpu, Nef, Tat 또는 Rev 항원이다. 상기 항원은 단일 항원, 항원들의 혼합체, 항원성 폴리펩티드, 또는 이러한 단백질들로부터의 항원성 폴리펩티드들의 혼합체일 수 있다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 p24 Gag 항원을 포함한다.

일 실시예에 있어서, 본 발명은 NIS-함유 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다. "NIS-함유 프로모터"는 NF-Kb 결합 사이트, 인터페론 자극 반응 요소(interferon stimulated response element: ISRE), 및 SXY 모듈(SXY)를 포함한다. 자연 발생 NIS-함유 프로모터들의 예들은 β2m 프로모터 및 MHC 클래스 I 유전자 프로모터이다. 이러한 자연 발생 NIS-함유 프로모터들은 일반적으로 단백질 β2m 또는 MHC 클래스 I 단백질을 인코딩하는, 또는 게놈 데이터베이스(예: NCBI 폴리뉴클레오티드 데이터베이스, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna) 내에서 이러한 단백질들을 인코딩하는 것으로 여겨지는 유전자의 프로모터 영역으로부터 복제 또는 재생된다. β2m 및 클래스 I MHC 단백질들 모두 주 조직적합성 콤플렉스(Major Histocompatibility Complex: MHC)에 들어간다. β2m 및 클래스 I MHC 프로모터 서열들은 또한 통상적으로 게놈 데이터베이스들과 같이 언급된다-즉, β2m 및 클래스 I MHC 프로모터 서열인 것으로 주석처리된다.

MHC 클래스 I 및 β2-마이크로글로불린 프로모터들은 NIS-함유 프로모터들의 공유된 구조적 상동성을 보유한다. 이러한 프로모터들은 또한 수지상 세포들에서 강하게 활성화되는 능력뿐만 아니라 보다 낮은 강도로 다른 인간 신체 조직의 대부분에서 활성화되는 능력을 공유한다.

일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터 및 상기 렌티바이러스 벡터는 세포 내로 함께 도입되어 상기 패키징 벡터에 의해 생성된 Gag 단백질 및 상기 렌티 바이러스 벡터에 의해 생성된 핵산을 함유하는 렌티바이러스 벡터 입자들의 형성을 가능케한다. 바람직하게는, 이는 상기 패키징 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 세포들의 동시주입에 의해 달성된다. 상기 세포들은 또한 Env 단백질, 바람직하게는 VSV 글리코단백질 G를 인코딩하는 핵산으로 감염될 수 있다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터 입자들은 진입(entry), 역전사, 및 적절한 호스트 세포 내에서 발현이 가능하다.

일 실시예에 있어서, 상기 패키징 벡터 또는 상기 렌티바이러스 벡터는 안정적으로 세포들 내부로 병합되고, 비-병합된 벡터는 상기 세포들 내부로 주입되어 렌티바이러스 벡터 입자들의 형성을 가능케한다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 세포들에 의해 생성된 상기 렌티바이러스 벡터를 수집하는 단계를 더 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 서브타입 B Gag 또는 Pol 단백질을 인코딩하는 동일한 패키징 벡터보다 더 높은 역가의 렌티바이러스 벡터를 패키징하는 패키징 벡터의 선택을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 역가는 서브타입 B Gag 또는 Pol 단백질을 인코딩하는 패키징 벡터에 상대적으로 적어도 1.5 또는 2배 증가된다.

렌티바이러스 벡터 입자들

본 발명은 또한 HIV-1 비-서브타입 B Gag 및/또는 Pol 단백질들을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자들을 포괄한다. 상기 비-서브타입 B Gag 및 Pol 단백질들은 본 출원에서 논의된 임의의 특징들을 포함할 수 있다.

상기 렌티바이러스 벡터 입자는 Gag, Pol 및 Env 단백질들과 연관된 Ψ 사이트 및 프라이머 결합 사이트를 포함하는 패키징 및 역전사를 위한 시스-작용 서열들을 포함하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 핵산은 두 HIV-1 LTR 서열들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 LTR들 중 하나는 U3 및 R 서열들을 위해 제거된다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터 입자의 핵산은 중앙 폴리퓨린관(cPPT) 및 중앙 말단 서열(CTS)을 포함한다. 상기 핵산은 바람직하게는 선택가능 마커 또는 종양 항원과 같은 렌티바이러스 또는 비-렌티바이러스 단백질을 인코딩한다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 VSV 글리코단백질을 포함한다.

바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터는 NIS-함유 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 프로모터는 β2m 프로모터이다.

일 실시예에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 일 이상의 HIV 항원, 바람직하게는 HIV-1 항원을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 항원은 Gag, Pol, Env, Vif, Vpr, Vpu, Nef, Tat 또는 Rev 항원이다.

본 발명의 렌티바이러스 벡터들은 인간 호스트를 포함하는 호스트 세포에 투여될 수 있다.

상기 렌티바이러스 벡터 입자는 특정 세포 타입들에 대한 타겟팅(targeting) 메커니즘을 보유할 수 있다(예를 들면, 본 출원에 참조로 병합되는 Yang et al., Targeting lentiviral vectors to specific cell types in vivo, PNAS 113(31): 11479-11484 (2006) 참조). 타겟팅은 세포 상의 세포 표면 단백질에 결합하는 항체를 통해 달성될 수 있다. 타겟팅된 세포 타입은 바람직하게는 수지상 세포, T 세포, B 세포이다. 수지상 세포 타입에의 타겟팅이 바람직하며, DC 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 외피 단백질을 통해 달성될 수 있다(예를 들면, 본 출원에 참조로 병합되는 Yang et al., Engineered Lentivector Targeting of Dendritic Cells for In Vivo, Nat Biotechnol. 2008 March ; 26(3): 326??334 참조).

본 발명은 에피토프(epitope)에 대항하는 면역 반응의 발생 또는 향상을 유유도하거나 이에 기여할 수 있는 치료적 조성물 혹은 백신 제조를 위한, 특히 렌티바이러스 벡터 입자들의 형태로 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터들의 사용과 연관되며, 보다 상세하게는 상기 벡터들 내에 존재하는 전이유전자(transgene)에 의해 인코딩되는 것들과 연관된다.

실시예

실시예 1: 플라스미드 설계

gag-pol 유전자가 두 프라이머들 및 pNDK-N, HIV-1 NDK의 클론을 주형으로 사용하여 PCR을 통해 증폭되었다. pThV-GP-N 플라스미드를 수득하기 위해, PCR 생성물이 EagI/SalI로 소화되었고, 패키징 구조체 p8.74 내에 삽입되고, 또한 EagI /SalI에 의해 소화되었다.

실시예 2: 감염(transfection)에 의한 렌티바이러스 벡터의 생성

pFLAP CMV GFP bis 및 pTHV-VSV.G (INDI-CO)bis과 p8.74 또는 pThV-GP-N를 조합하여 사용함으로써 렌티바이러스 벡터 스톡(stock)이 생성되었다. 36개의 트랜스펙션들이 수행되었으며, 18개는 p8.74로, 18개는 pThV-GP-N으로 수행되었다. 모든 상청액들은 -80^oC에서 저장되었다.

플라스미드 plasmid pFLAP-CMV GFP bis는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescence protein: GFP)을 위해 인코딩되었고, 이의 발현은 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 검출가능하다.

실시예 3: 렌티바이러스 벡터 생산의 역가

293T 세포들 내의 GFP 발현의 빈도에 의해 벡터 역가가 결정되었다. 세포들은 웰(well) 당 1×10⁵ 세포들의 밀도에 도달할 때까지 10% FBS를 함유하는 DMEM 내에서 24-웰 플레이트에서 배양되었다. 이후, 세포들은 최종 부피 300μL에서 서로 다른 벡터 상청액 부피가 도입되었다. 2시간 후, 10% FBS를 함유하는 700μl의 신선한 배지가 각 웰에 첨가되었다. 도입 후 72시간에서, 상기 배지는 제거되었으며 세포들은 Dulbecco 인산-버퍼 염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline: DPBS; Gibco)에서 세척되었다. 세포들은 0.05% 트립신(Trypsin)-EDTA(Gibco)로 제거되었다. 트립신화(trypsinization)는 300μl의 종결 DMEM의 첨가에 의해 중단되었으며, 세포들은 FACS 튜브로 이송되었고, 이후 GFP-발현 세포들의 수를 509nm 여기 파장을 사용하는 FACSCalibur(BD Biosciences)로 측정하였다. 30% 아래의 GFP 양성 세포들의 비율만이 고려되었다.

도 3에 그 결과들이 도시되었다. pThV-GP-N 및 p8.74 벡터 생산 사이에서 상당한 차이가 관찰되었으며, pThV-GP-N 플라스미드를 사용하여 더 높은 역가가 수득되었다. 실제로, 패키징 플라스미드 pThV-GP-N으로 수득된 벡터 역가는 기존 사용되는 플라스미드 p8.74로 수득된 벡터 역가보다 2배 더 높았다(Student 테스트에 따르면, p<0.001)

실시예 4: pThV-GP-N으로 증가된 렌티바이러스 벡터의 역가

HIV-1 BRU 및 HIV-1 NDK 바이러스들이 293T 세포들 상에 형성되었으며, P4 CCR5 세포들에 도입되기 위해 사용되었다. 이러한 세포들은 HIV LTR의 조절 하에서 안정한 루시퍼라아제 유전자를 포괄한다: 이들이 TAT 단백질로 도입되는 경우(이들이 WT HIV로 감염되는 케이스), LacZ 유전자가 발현되며, 루시퍼라아제 발현이 측정될 수 있다. HIV-1 Gag p24 및 루시퍼라아제 발현이 측정되었다. 그 결과가 도 4에 도시되었으며, 아생형 NDK 바이러스가 야생형 BRU 보다 높은 도입 속도를 가짐이 확인된다.

실시예 5: pThV-GP-N로 증가된 p24 및 역가

상이한 비율의 p8.74 및 pSD GP NDK 패키징 벡터들이 사용되어 렌티바이러스 벡터 입자들을 생산하였다. 각 비율에 있어서, 역가 및 P24 레벨이 측정되었다. 도 5에 결과가 도시되며, 역가 및 P24 레벨 생산 향상은 NDK 패키징 플라스미드의 존재에 기인함을 알 수 있다.

실시예 6: pThV-GP-N로 감소된 p24 가공

패키징 벡터 p8.74 and pTHV-GP-N들이 렌티바이러스 벡터 입자들을 함유하는 상청액 생산에 사용되었다. 웨스턴 블롯이 NIH 안티-P24 MAB(183-H12-5C)을 사용하여 상기 상청액 상에서 수행되었다. 도 6에 결과가 도시되며, NDK 및 BRU 패키징 플라스미드들 사이의 차이는 P24 단백질 및 전구체의 생산에 의존함이 확인되며, BRU가 단지 바이러스 상청액 내에서 P24만을 보일 때, NDK는 더 높은 P24 합성(바이러스 상청액 내에서 P24 전구체의 존재)을 생성하는 것으로 추정된다.

SEQUENCE LISTING <110> Theravectys Institut Pasteur <120> USE OF NON-SUBTYPE B GAG PROTEINS FOR LENTIVIRAL PACKAGING <130> THERA.11.3 <140> PCT/US2012/ <141> 2012-09-25 <150> 11306222.8 <151> 2011-09-26 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4298 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggaaaattag atacatggga aagaattcgg 60 ttacggccag gaggaaagaa aaaatatgca ctaaaacatt tgatatgggc aagcagggag 120 ctagaacgat ttacacttaa tcctggcctt ttagagacat cagaaggctg taaacaaata 180 ataggacagc tacaaccatc tattcaaaca ggatcagaag aaattagatc attatataat 240 acagtagcaa ccctctattg tgtacatgaa aggatagagg taaaagacac caaagaagct 300 gtagaaaaga tggaggaaga acaaaacaaa agtaagaaaa agacacagca agcagcagct 360 gatagcagcc aggtcagcca aaattaccct atagtgcaga acctacaggg gcaaatggta 420 catcaggcca tatcacctag aactttgaac gcatgggtaa aagtaataga agaaaaggcc 480 ttcagcccgg aagtaatacc catgttttca gcattatcag aaggagccac cccacaagat 540 ttaaacacca tgctaaacac agtgggggga catcaagcag ctatgcaaat gctaaaagag 600 accatcaatg acgaagctgc agaatgggac agattacatc cagtgcatgc agggcctgtt 660 gcaccaggcc aaatgagaga accaagggga agtgatatag caggaactac tagtaccctt 720 caggaacaaa tagcatggat gacaagcaac ccacctatcc cagtaggaga aatctataaa 780 agatggataa tcctgggatt aaataaaata gtaagaatgt atagccctgt cagcattttg 840 gacataagac agggaccaaa ggaacctttt agagactatg tagaccggtt ctataaaact 900 ctaagagccg agcaagcttc acaggatgta aaaaactgga tgacagaaac cttgttggtc 960 caaaatgcaa acccagattg taaaactatc ttaaaagcat tgggaccaca ggctacacta 1020 gaagaaatga tgacagcatg ccagggagtg ggggggcccg gccataaagc aagagttttg 1080 gctgaggcaa tgagccaagt aacaggttca gctactgcag taatgatgca gagaggcaat 1140 tttaagggcc caagaaaaag tattaagtgt ttcaactgtg gcaaggaagg gcacacagca 1200 aaaaattgca gggcccctag aaaaaagggc tgttggaaat gcggaaggga aggacaccaa 1260 atgaaagatt gcactgaaag acaggctaat tttttaggga agatttggcc ttcccacaag 1320 ggaaggccgg ggaattttct tcagagcaga ccagagccaa cagccccacc agcagagagc 1380 ttcgggtttg gggaggagat aaccccctct cagaaacagg agcagaaaga caaggaactg 1440 tatcctttag cttccctcaa atcactcttt ggcaacgacc cctcgtcaca ataaagatag 1500 ggggacagct aaaggaagct ctattagata caggagcaga tgatacagta ttagaagaaa 1560 taaatttgcc aggaaaatgg aagccaaaaa tgataggggg aattggaggt tttatcaaag 1620 taagacagta tgatcaaata ctcatagaaa tctgtggata taaagctatg ggtacagtat 1680 tagtaggacc tacacctgtc aacataattg gaagaaattt gttgacccag attggctgca 1740 ctttaaattt tccaattagt cctattgaaa ctgtaccagt aaaattaaag ccaggaatgg 1800 atggcccaaa agttaaacaa tggccattga cgaagaaaaa ataaaagcat taacagaaat 1860 ttgtacagaa atggaaaagg aaggaaaaat ttcaagaatt gggcctgaaa atccatataa 1920 tactccaata tttgccataa agaaaaaaga cagtaccaag tggagaaaat tagtagattt 1980 cagagaactt aataagagaa ctcaagattt ctgggaggtt caattaggaa taccgcatcc 2040 tgcagggctg aaaaagaaaa aatcagtaac agtactggat gtgggtgatg catatttctc 2100 agttccctta gatgaagatt ttaggaaata taccgcattt accataccta gtataaacaa 2160 tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgctccca cagggatgga aaggatcacc 2220 ggcaatattc caaagtagca tgacaaaaat cttagagccc tttagaaaac 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aagcaggata 3120 tgttactgac agaggaagac agaaagttgt ccctttcact gacacgacaa atcagaagac 3180 tgagttacaa gcaattaatc tagctttaca ggattcggga ttagaagtaa acatagtaac 3240 agattcacaa tatgcactag gaatcattca agcacaacca gataagagtg aatcagagtt 3300 agtcagtcaa ataatagagc agctaataaa aaaggaaaag gtttacctgg catgggtacc 3360 agcacacaaa ggaattggag gaaatgaaca agtagataaa ttagtcagtc agggaatcag 3420 gaaagtacta tttttggatg gaatagataa ggctcaggaa gaacatgaga aatatcacaa 3480 caattggaga gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtggtagcga aagaaatagt 3540 agctagctgt gataaatgtc agctaaaagg agaagccatg catggacaag tagactgtag 3600 tccaggaata tggcaattag attgtacaca tctggaagga aaagttatcc tggtagcagt 3660 tcatgtagcc agtggctata tagaagcaga agttattcca gcagaaacgg ggcaagaaac 3720 agcatacttt ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaagtagtac atacagataa 3780 tggcagcaat ttcaccagtg ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcag ggatcaaaca 3840 ggaatttgga attccctaca atccccaaag tcaaggagta gtagaatcta tgaataaaga 3900 attaaagaaa attataggac aggtaagaga tcaagctgaa catcttaaga cagcagtaca 3960 aatggcagta tttatccaca attttaaaag aaaagggggg attgggggat acagtgcagg 4020 ggaaagaata atagacataa tagcaacaga catacaaact agagaattac aaaaacaaat 4080 cataaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccaa tttggaaagg 4140 accagcaaag cttctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagaca atagtgacat 4200 aaaggtagta ccaagaagaa aagtaaagat cattagggat tatggaaaac agatggcagg 4260 tgatgattgt gtggcaagta gacaggatga ggattaac 4298 <210> 2 <211> 1499 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Ala Leu Lys 20 25 30 His Leu Ile Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Ile Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Ile Gly Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Ile Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80 Thr Ile Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Arg Ile Glu Val Lys Asp 85 90 95 Thr Lys Glu Ala Val Glu Lys Met Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys 100 105 110 Lys Lys Thr Gln Gln Ala Ala Ala Asp Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn 115 120 125 Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile 130 135 140 Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala 165 170 175 Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 180 185 190 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Asp Glu Ala Ala Glu 195 200 205 Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Val Ala Pro Gly Gln 210 215 220 Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu 225 230 235 240 Gln Glu Gln Ile Ala Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly 245 250 255 Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 260 265 270 Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu 275 280 285 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu 290 295 300 Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val 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Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly Ile Ile Gln 1145 1150 1155 Ala Gln Pro Asp Lys Ser Glu Ser Glu Leu Val Ser Gln Ile Ile 1160 1165 1170 Glu Gln Leu Ile Lys Lys Glu Lys Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro 1175 1180 1185 Ala His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val 1190 1195 1200 Ser Gln Gly Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys 1205 1210 1215 Ala Gln Glu Glu His Glu Lys Tyr His Asn Asn Trp Arg Ala Met 1220 1225 1230 Ala Ser Asp Phe Asn Leu Pro Pro Val Val Ala Lys Glu Ile Val 1235 1240 1245 Ala Ser Cys Asp Lys Cys Gln Leu Lys Gly Glu Ala Met His Gly 1250 1255 1260 Gln Val Asp Cys Ser Pro Gly Ile Trp Gln Leu Asp Cys Thr His 1265 1270 1275 Leu Glu Gly Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala Ser Gly 1280 1285 1290 Tyr Ile Glu Ala Glu Val Ile Pro Ala Glu Thr Gly Gln Glu Thr 1295 1300 1305 Ala Tyr Phe Leu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Trp Pro Val Lys Val 1310 1315 1320 Val His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Ser Ala Thr Val Lys 1325 1330 1335 Ala Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile 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Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 75 <210> 7 <211> 73 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 7 Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys 1 5 10 15 Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Ile 20 25 30 Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Thr Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro 50 55 60 Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 <210> 8 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 8 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Gln Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu 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Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Lys Trp Glu Lys 1 5 10 15 Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Ile 20 25 30 Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gln Pro 50 55 60 Ser Leu Pro Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 <210> 12 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 12 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 75 <210> 13 <211> 73 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 13 Ala Arg Ala Ser Ile Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys 1 5 10 15 Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile 20 25 30 Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Ile Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro 50 55 60 Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 <210> 14 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 14 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Val Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Lys Ile Leu Gly Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 75 <210> 15 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 15 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Gln Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Glu Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Ile 65 70 75 <210> 16 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 16 Met Gly Ala Arg Ala Ser Ile Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Gln Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Gly Gly Cys Lys Gln Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 His Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 75 <210> 17 <211> 73 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 17 Ala Arg Ala Ser Ile Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys 1 5 10 15 Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Arg Tyr Arg Leu Lys His Ile 20 25 30 Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Ile Arg Gln Leu Gln Pro 50 55 60 Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 <210> 18 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 18 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Leu Arg Pro Arg Gly Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ser Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Arg Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ala Leu Gln Thr Gly Ser Glu Asp Phe 65 70 75 <210> 19 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 19 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 75 <210> 20 <211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 20 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Ser Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn 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<211> 75 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 23 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Val Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ala Glu Gly Cys Lys Gln Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 His Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 75 <210> 24 <211> 72 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile 1 5 10 15 Arg Xaa Arg Gln Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val 20 25 30 Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu 35 40 45 Glu Thr Xaa Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Glu Gln Leu Gln Pro Ala 50 55 60 Leu Gln Thr Gly Ser Glu 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<212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 32 Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys 1 5 10 15 Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Arg Lys Arg Tyr Arg Leu Lys His Ile 20 25 30 Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Gly Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Ile Ser Gln Leu Gln Pro 50 55 60 Ser Leu Lys Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 <210> 33 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 33 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu 50 55 60 <210> 34 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 34 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Thr Trp 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Ala Leu Lys 20 25 30 His Leu Ile Trp 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(54)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 40 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ser Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Met Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Met Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Asp Leu Leu Glu Thr Xaa Glu Gly Cys Gln Gln Ile Xaa 50 55 60 <210> 41 <211> 59 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 41 Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys 1 5 10 15 Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Ile Lys His Leu 20 25 30 Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Gly Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Ala Glu Gly Cys Gln Gln Ile Met 50 55 <210> 42 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 42 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Arg Tyr 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Leu Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Lys Ile Ile 50 55 60 <210> 59 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 59 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Met Lys 20 25 30 His Leu Ile Trp Ala Gly Arg Glu Leu Asp Arg Phe Ala Leu Asp Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Lys Ile Ile 50 55 60 <210> 60 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 60 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Met Lys 20 25 30 His Leu Ile Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asp Ser 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Thr Glu Gly Cys Arg Lys Ile Ile 50 55 60 <210> 61 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 61 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Arg Lys Lys Tyr Lys Met Lys 20 25 30 His Leu Ile Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asp Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Lys Ile Ile 50 55 60 <210> 62 <211> 38 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 62 Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg 1 5 10 15 Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Thr Glu 20 25 30 Gly Cys Lys Gln Ile Ile 35 <210> 63 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 63 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Arg Lys Lys Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Asp Leu Leu Glu Thr Ala Asp Gly Cys Gln Gln Ile Leu 50 55 60 <210> 64 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 64 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Asp Leu Leu Asp Thr Ala Glu Gly Cys Leu Gln Leu Ile 50 55 60 <210> 65 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 65 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Pro Glu Gly Cys Leu Gln Ile Ile 50 55 60 <210> 66 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 66 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Asp Arg Phe Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Asp Leu Leu Glu Thr Ala Asp Gly Cys Leu Lys Ile Xaa 50 55 60 <210> 67 <211> 61 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 67 Met Gly Ala Arg Ala Ser Ile Leu Ser Gly Gly Lys Leu Asp Asp Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Gln Tyr Arg Ile Lys 20 25 30 His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Asp Arg Phe Ala Leu Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Ser Ala Lys Gly Cys Gln Gln Ile Leu 50 55 60

Claims

Ψ 사이트가 결여되며 HIV-1 Gag MA 단백질을 인코딩하는 복제-결함 렌티바이러스 패키징 벡터에 있어서,
상기 HIV-1 Gag MA 단백질은:
a) 12 위치에 글루탐산이 아닌 아미노산을 가지며,
b) 15 위치에 아르기닌이 아닌 아미노산을 가지며,
c) 46 위치에 발린 및 61 위치에 루신을 모두 갖지 않으며; 그리고
상기 HIV-1 Gag MA 단백질을 인코딩하는 상기 렌티바이러스 패키징 벡터는 HIV-1 BRU의 HIV-1 Gag MA 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 패키징 벡터와 비교할 때 패키지된 렌티바이러스 벡터의 역가에 있어서 적어도 1.5배 증가를 생성하는 렌티바이러스 패키징 벡터.
제 1 항에 있어서, 12 위치의 상기 아미노산은 리신인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 있어서, 12 위치의 상기 아미노산은 아르기닌인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 있어서, 15 위치의 상기 아미노산은 트레오닌인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 있어서, 15 위치의 상기 아미노산은 알라닌인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 있어서, 46 위치의 상기 아미노산은 루신인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 있어서, 61 위치의 상기 아미노산은 이소루신인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항에 있어서, 61 위치의 상기 아미노산은 메티오닌인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 2 항에 있어서, 15 위치의 상기 아미노산은 트레오닌인 것을 특징으로 하는 벡터.
.
제 2 항에 있어서, 46 위치의 상기 아미노산은 루신인 것읕 특징으로 하는 벡터.
제 2 항에 있어서, 61 위치의 상기 아미노산은 이소루신인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 9 항에 있어서, 46 위치의 상기 아미노산은 루신인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 9 항에 있어서, 61 위치의 상기 아미노산은 이소루신인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 13 항에 있어서, 61 위치의 상기 아미노산은 이소루신인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 15 항에 있어서, 상기 HIV-1 Gag MA 단백질은 HIV-1 NDK의 HIV-1 Gag MA 단백질인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 16 항에 있어서, 상기 벡터는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 벡터.
비-서브타입 B HIV-1 바이러스로부터의 Gag 및/또는 Pol 서열을 비-HIV 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 내부로 삽입하여 패키징 벡터를 생성하는 단계를 포함하는 패키징 벡터의 생성 방법.
비-서브타입 B HIV-1 Gag 또는 Pol 단백질을 인코딩하는 패키징 벡터를 렌티바이러스 벡터를 갖는 세포에 투여하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 생성 방법.
제 19 항에 있어서, 서브타입 B HIV-1 Gag 또는 Pol 단백질을 인코딩하는 동일한 패키징 벡터보다 높은 역가의 렌티바이러스 벡터를 패키징하는 패키징 벡터를 선택하는 단계를 더 포함하는 렌티바이러스 벡터의 생성 방법.