KR20140114268A - 새로운 박테리아 및 상기 박테리아의 추출물들 또한 치료법에서 그들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지하수로부터 분리되어 특성분석된 새로운 박테리아 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 명확하게 염증들의 치료의 맥락에서 박테리아 추출물들 및 그들의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

새로운 박테리아 및 상기 박테리아의 추출물들 또한 치료법에서 그들의 용도 {Novel bacterium and extracts of said bacterium and the use of same in therapy}

본 발명은 지하수로부터 분리되어 특성분석된 새로운 박테리아 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 명확하게 염증들의 치료의 맥락에서 박테리아 추출물들 및 그들의 치료적 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 만성 장의 염증성 장애들 및 치주염들의 치료 및 예방에서 관심 있는 새로운 조성물들에 관한 것이다.

급성 장염, 과민성 대장 증후군, 크론병은 선진국에서 증가하고 있고 대략 1.4백만 명의 미국인들을 괴롭히는 질환들이다 (Arijs, I. et al ., 2009. PLoS ONE.4:e7984; Hill, D.A. and D. Artis. 2010. Annu. Rev. Immunol. 28:623-67; 또한 Kaser, A. et al ., 2010. Annu. Rev. Immunol.　 28:573-621). 크론병, 염증성 장 질환은 소화관의 분절들을 침범하지만, 그의 선호적 부위들은 회장 (소장의 말단 부분) 및 결장이다. 침범된 장벽은 부종이 생긴다. 이의 진행기간 동안, 본 장벽의 부종은 장의 직경에서 감소를 초래할 것이다. 협착 (수축)의 원인이 되는 섬유증으로 진화도 역시 발생할 수 있다.

본 질환은 다소간 넓거나 다소간 깊은 궤양들의 존재를 특징으로 하고, 이는 벽 (열창들)을 통과하여 농양 및 누관 (fistulas)을 유발한다. 본 질환은 둘 다의 성별들이 걸리며, 일반적으로 20세 및 40세 사이에서 출현하고 있다. 일반적인 형태에서, 이것은 느리게 또한 은밀하게 시작된다. 간헐적인 설사와 불분명한 복부 통증은 수 개월 또는 수년 동안의 증상 동반을 요약한다.

본 질환이 굳게 고착되었을 때, 때로 지방성이면서 출혈은 거의 없는 적당한 강도의 설사가 기본적인 증상이 된다. 우측 장골와에서의 고정된 계속적인 통증 또는 발작성의 비전형적 통증도 역시 본 질환과 연관되어 있다. 체중 감소 및 열은 다른 중요한 증상들이다. 징후들은 병변들의 국소해부학에 따라 다양해진다.

본 질환은 강도가 다양하고 종종 자발적으로 회복되는 피부 발적들에 의해 진행된다.

그러나, 합병증들이 빈번하고, 이들은 복수의 수술적 절차들을 요구할 수 있다: 장 폐쇄, 장 누관, 장 천공들, 피부에서 및 복부내 기관들에서의 누관 (천공들), 항문직장 합병증들 (열창들, 농양들).

수술적 절차들 이외에도, 단일클론 항체들로의 치료들 (항-TNF, 항-IL-12/p40 또는 항-IL-23/p40)이 크론병을 완화하도록 존재하지만, 이들은 매우 비용이 많이 드는 단점을 가진다.

본 특허출원의 발명은, 본 맥락에서 본 질환을 앓는 환자들을 위로하는, 차별적이고, 효과적이며, 매우 비용이 적게 드는 방법을 제안하고 있다.

크론병은 다수의 요인들 가지고 또한 복잡미묘하다. 본 질환에서 확인된 요인들의 하나는 당연히 면역학적이다. 최근의 출판물들은 숙주의 면역 체계가 "교란되는" 것을 밝혀주었다: 전염증성 및 염증성 반응들이 불균형되고 악화되는 것으로 증명되었다. 면역 체계의 탈조절이 제시되고 있다: IL-12의 생산과 함께 강화된 Th1 프로파일, IL-23에서의 증가로 강화된 Th17의 프로파일, 장의 자연적 균총의 파괴 및 손상된 내성. 이는 발병 기전 (T 세포들의 활성화, 염증성 사이토카인들, 장내 세균에 대한 항체들)을 유발하는 비정상 장내 균총에 대한 면역 반응들을 유도하는 부적절한 국소적 및 전신적 면역 반응들을 유발한다 (Abraham C. and Cho J.H., N Engl J Med 2009;361: 2066-78).

세낙 등은 프로테아제-활성화 수용체-2 (PAR2)가 동물들에서 급성 장염을 유도하는 것을 발견하였다 (Cenac et al ., Am J Pathol. 2002.161: 1903-1915). PAR2는 위장관에서 과다 발현된다: 내피세포들, 결장 근육세포들, 장내세포들, 장내 뉴런들, 면역 세포들 등. 위장관에 풍부하게 존재하는 프로테아제들 (트립신, 트립타제)는 PAR2를 본 동일한 수용체를 활성화하는 특이적 펩타이드를 노출하는 N-말단에서 절단한다 (자가-활성화의 현상). 결론적으로, 이것은 전염증성 사이토카인들의 생산을 활성화하여 염증을 촉발시킨다 (Vergnolle, N. 2005. Gut. 54: 867-874; 또한 Vergnolle, N. 2009. Pharmacol. Ther. 123: 292-309). 본 현상은 야생 마우스에서 관찰되지만, KO 마우스 (PAR2 결핍)에서는 나타나지 않는다. 항프로테아제 및/또는 PAR2 길항제로의 치료는 본 염증 현상을 피하는 것을 가능하게 한다.

치은염과 유사하게, 치주염은 치주, 예로 치아를 둘러싸면서 지지하는 분화된 조직들: 치은, 시멘트질, 치주 인대 및 치조골의 염증성 질환이다. 이것은 종종 치조 붕괴 (뼈 소실)가 동반된다. 만성 치주염은 모든 연령에서 나타날 수 있지만 성인들에서 더욱 보편적이다. 이것은 다수의 요인들을 가진다 (유전적 및 환경적 요인들). 만성 치주염은 치아 세균막에 의해 개시되고 유지된다.

그러나, 면역 방어 기작들이 이의 발병 기전에 중요한 역할을 한다. 최근의 연구들은 PAR2가 골모세포들, 구강 표피세포들 및 치은 섬유모세포들에서 발현되기 때문에 치주염에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Holzhausen, M. et al ., 2006. Am J Pathol. 168: 1189-1199).

포르파이로모나스 진기발리스 (Porphyromonas gingivalis)(만성 치주염에서 주요한 병원균)에 의해 생산되는 치은통증-R (gingipain-R) 프로테아제가 PAR2를 N-말단의 단백분해 절단에 의해 활성화할 수 있어 본 동일한 수용체를 활성화하는 특이적 펩타이드를 노출시키는 것 (자가-활성화의 현상)으로 보고되어 왔다 (Abraham, L.A. et al ., 2000. Bone. 26: 7-14; 또한 Lourbakos, A. et al ., 2001. Infect. Immun. 69: 5121-5130). 이것은 전염증성 사이토카인들의 생산을 유도하고, 뼈 소실을 유도하는 염증으로 이어진다.

프로테아제 저해를 목표로 하는 치료법 또는 PAR2 길항제의 사용은 치주염과 유사한 염증성 질환과 같은 감염성 기원의 병리학들을 조정하는 가능한 접근법을 구성할 수 있다.

본 맥락에서, 본 발명은 이전에 전혀 기술된 바 없었던 새로운 박테리아의 분리, 특성분석 및 분획화에 의해 이들 염증성 장애들의 치료에 대한 용액을 제공하고 있다.

맨처음으로, 또한 놀라운 방식으로, 본 출원인은 지하수로부터 새로운 박테리아 종에 속하는 균주를 분리하는 데 성공하였고, 상기 새로운 박테리아 균주 (또는 박테리아)는 LMB64라고 명명된다.

본 박테리아 LMB64는 분리되었던 시실에 추가하여 특성분석되었고, 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 목 (class), 네이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과 (subfamily)에 속하고, 아마도 아직까지 정의되지 않은 새로운 속으로서 정의될 것이다. 16S rRNA를 코딩하는 유전자 서열의 분석은 본 박테리아를 크로모박테리움 (Chromobacterium), 팔루디모나스 (Paludimonas), 루텔리아 (Lutelia) 및 글루벤키아나 (Glubenkiana) 속들과 근접하게 두는 것을 가능하게 하였고, 이들과 95% 서열 유사도를 공유하고 있다.

본 비병원성 박테리아는 그램-음성이고, 실시예들에서 보다 자세하게 기술될 것이다. 본 박테리아는 비미세섬유성 (nonfilamentous)이 되는 특징도 역시 가진다. 게다가, 본 박테리아는 물의 유형이라면 모두, 보다 상세하게는 보통의 물을 포함하는 배지 상에서 배양될 수 있는 장점을 가진다. 예로서, 비트레오실라 필리 포르미스 (V. 필리포르미스)와는 대조적으로 본 발명의 박테리아 LMB64의 배양은 특정한 배양 조건들을 요구하지 않고, 보다 상세하게는 적어도 하나의 무황 유형의 미네랄을 포함하는 배지 및/또는 고온 물을 요구하지 않는다 (아토피 피부염의 치료를 위한 V. 필리포르미스의 박테리아 추출물의 용도를 기술하고 있는 유럽 특허 제 EP2018891호 (Gueniche A., 2009) 및 구에니케 등에 의한 문헌 (Gueniche et al. 2006, European Journal of Dermatology, 16, 4, 380-384)의 본 측면에서 언급될 수 있다). 이것은 배양 조건들 및 시설들 둘 다의 견지에서 또한 경제학적 관점으로부터 분명한 장점을 보여준다.

16S rRNA를 코딩하는 유전자는 거의 완전하게 서열결정 되었다 (1487　bp). 박테리아 LMB64는 10,948　bp의 원형 플라스미드를 가진다. 본 플라스미드는 완전하게 서열결정되었고, 본 서열은 서열번호 2의 서열에 나타나 있다.

첫 번째 구현예에 따르면, 본 발명은 16S rRNA를 코딩하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 서열, 또는 상기 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열이라면 모두를 포함하거나 이들로 구성되는, 베타프로테오박테리아 목, 네이세리아시애 아과에 속하는 비병원성 그램-음성 박테리아에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 본 발명은 상기 박테리아의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것을 특징으로 하는, 베타프로테오박테리아 목, 네이세리아시애 아과에 속하는 비병원성 그램-음성 박테리아에 관한 것이다.

본 발명의 맥락에서, 두 개 핵산 서열들 간의 "일치도 백분율 (percentage identity)"은 최고의 정렬 이후에 획득되는 (최적의 정렬) 비교될 두 개 서열들 간의 일치하는 뉴클레오타이드들의 백분율을 말하고, 여기에서 본 백분율은 순수하게 통계학적이고 두 개 서열들 간의 차이들은 무작위로 또한 그들의 전체 길이를 통해 분포된다. 두 개 핵산 서열들 간의 서열들의 비교는 정상적으로 그들을 최적의 방식으로 정렬한 이후에 이들 서열들을 비교하여 이루어지고, 여기에서 상기 비교는 분절 마다 또는 "비교창" 마다 이루어질 수 있다. 비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은 수작업에 추가하여, 스미스 및 워터맨의 로칼 상동성 알고리즘에 의해 [Smith and Waterman (1981), Ad. App. Math. 2: 482], 니들만 및 운쉬의 로칼 상동성 알고리즘에 의해 [Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443], 피어슨 및 립만의 유사도 탐색 방법에 의해 [Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. The USA 85: 2444] 또는 이들 알고리즘들을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지에 있는 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 유전학 그룹 컴퓨터, 575 Science Dr., 매디슨, WI, 또는 BLAST N 또는 BLAST P 비교 소프트웨어)에 의해 수행될 수 있다.

두 개 핵산 서열들 간의 일치도 백분율은 비교될 핵산 서열이 이들 두 개 서열들 간의 최적의 정렬의 경우 기준 서열과 대비하여 첨가들 또는 결실들을 포함 할 수 있는 최적의 방식으로 이들 두 개의 정렬된 서열들을 비교하여 결정된다. 일치도 백분율은 뉴클레오타이드가 두 개 서열들 간에 일치하는 자리들의 수를 결정하는 것에 의해, 본 일치하는 자리들의 수를 비교창에 있는 자리들의 전체 수로 나누는 것에 의해 또한 이들 두 개 서열들 간의 일치도 백분율을 획득하도록 획득된 결과를 100으로 곱하는 것에 의해 계산된다.

예를 들어, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html에서 입수가능한 "BLAST 2 서열들" (Tatusova et al., "Blast 2 서열들 - 단백질 및 뉴클레오타이드 서열들을 비교하는 새로운 도구", FEMS Microbiology Lett. 174: 247-250)이 디폴드 매개변수들로 (상세하게, 매개변수들의 경우 "오픈 갭 감점": 5점, 및 "연장 갭 감점": 2점; 예를 들어 프로그램에 의해 제안된 "BLOSUM 62" 매트릭스가 되는 선택된 매트릭스로), 비교될 두 개 서열들 간의 일치도 백분율이 프로그램에 의해 직접 계산되면서 사용될 수 있다. "ALIGN" 또는 "매그얼라인 (Megalign)" 소프트웨어 (DNASTAR)와 같은 다른 프로그램들을 사용하는 것도 역시 가능하다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 박테리아는 서열번호 2의 서열, 또는 상기 서열번호 2의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 일치도를 가지는 서열이라면 모두를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

바람직한 방식으로, 박테리아 LMB64는 서열번호 2의 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 박테리아 LMB64는 비미세섬유성 (nonfilamentous)인 것을 특징으로 한다.

상기 박테리아 LMB64의 다른 특징들은 하기 실시예들에서 자세하게 기술될 것이다.

또한, 본 발명의 박테리아 LMB64는 본 출원인의 이름으로 파리, 파스퇴르 연구소, 국가 미생물 배양 수집기관 (CNCM)에 2010년 4월 8일자로 기탁번호 제 I-4290호 하에 기탁되었다.

따라서, 본 발명의 한 가지 목적은 CNCM 기관에 2010년 4월 8일자로 기탁번호 제 I-4290호 하에 기탁된 박테리아, 또는 상동체, 자손 또는 기타 다른 돌연변이체라면 모두이다.

용어 "돌연변이체 (mutant)"는 균주 I-4290로부터 직접 나온 박테리아라면 모두를 말하고, 자연적인 돌연변이들 또는 재조합들, 예를 들어 세포 증식, 세포 분열 (박테리아 분열 또는 DNA 복제 동안 발생하는 오류들로 인한 돌연변이) 또는 주어진 화합물에 저항하거나 저항하게 되는 돌연변이체들의 선택과 같은 자연적인 선택 또는 배양 배지에서의 선택의 기작이라면 모두와 관련된 재조합이라면 모두를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이체들 중에는 그들의 게놈 서열 (또는 그들의 플라스미드의 서열)에서, 방사선 조사에 의해, 바이러스에 의해, 트랜스포존들에 의해 또는 변이생성 화합물들에 의해 유발되는 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는 균주 I-4290로부터 나온 박테리아라면 모두가 포함된다.

본 발명의 첫 번째 구현예에 따르면, 박테리아 배양으로부터 나온 생물량 (biomass) 전부는, 예를 들어 여과, 알코올 (에탄올, 이소프로판올, 이소부탄올)로의 응집에 의해, 마찰된 층 (prelayer)을 가진 실린더 상의 건조에 의해서와 같은 다양한 기지의 방법들에 의해 분리된 다음, 동결-건조 또는 열-불활성화된 형태로 사용될 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 일반적인 방식으로 상기 기술된 바와 같은 박테리아, 즉 박테리아 LMB64의 현탁액으로부터 획득된, 박테리아성 분획이라고도 불리는 박테리아 추출물에 관한 것이다.

용어 "박테리아 추출물 (bacterial extract)"은 박테리아성 생물량의 추출물 또는 분획이라면 모두 또는 상기 추출물의 활성을 가진 분획이라면 모두를 말한다. 예를 들어, 이러한 추출물은 제조 방법이 적어도 하나의 박테리아의 용해 단계 또한 원심분리 또는 여과로 구성되는 적어도 하나의 다양한 분획들의 분리 단계를 포함하는, 박테리아 LMB64의 배양액으로부터 획득될 수 있다.

비제한적인 방식으로, 본 발명에 따른 추출물은, 예를 들어 원심분리에 의해 농축되었던 배양 배지로부터 분리된 박테리아 세포들; 또는 세포 외막이 초음파 또는 고압멸균의 작용에 의해서와 같은 당업자들에게 숙지되어 있는 수단이라면 모두에 의해 파쇄되었던 작동을 거쳤던 농축된 박테리아 세포들; 또는 여과에 의해 획득된 상청액으로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 제조 방법의 중요한 단계는, 예를 들어 핵산들 (염색체 DNA, 염색체외 원형 DNA, 플라스미드들), 리보좀들 또한 글리코겐, 전분 및 폴리-β-하이드록시부틸레이트 등과 같은 세포내 저장된 물질들과 같은 다양한 세포내 구성성분들의 제거를 포함한다.

바람직한 방식으로, 본 발명에 따른 박테리아 추출물은 세포내 구성성분들을 제거하는 방식으로 상기 박테리아 현탁액의 처리 이후에 획득된다.

그 결과는 본 발명에 따른 추출물이 주로 막으로부터, 세포질 주변 공간으로부터 및/또는 세포외 공간으로부터 나온 구성성분들을 포함하는 것이다.

보다 상세하게, 상기 세포내 구성성분들은 적어도 핵산들을 포함한다.

세포내 화합물들의 제거에 추가하여, 또한 비제한적인 예로서, 당업자들이라면 박테리아의 용해 및 원심분리 이후에 배양 상청액의 구성성분들 (이하, 분획 S0) 및 펠렛을 구성하는 구성성분들 (이하, E0)을 분리하는 것도 역시 쉽게 가능하다. 예를 들어, S0 및 E0의 성분들 사이에 분리 한계는 분자량 100 kDa 주변인 것으로 제시될 수 있다. 결론적으로, 분획 S0의 성분들은 대부분 100 kDa 이하의 분자량을 가지는 한편, 분획 E0의 성분들은 대부분 100 kDa 이상의 분자량을 가진다.

보다 상세하게, 주로 표면 단백질들을 포함하는 것들로부터 배양 상청액에서 발견되는 생체분자들 (S0) 또한 박테리아의 세포질 주변 공간에 위치하는 단백질들 (E0)을 추출하고 분리하는 것은 따라서 당업자들에게 숙지되어 있는 기법들에 의해 가능하다.

본 발명의 한 가지 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 적어도 막 단백질들, 세포질 주변 단백질들 및 편모로부터 나온 단백질들을 포함하는 분획 E0를 포함한다.

세포질 주변 단백질들은 삼투압 충격에 의해 또는 무질서유발제 또는 계면활성제들을 포함하는 배지에서의 배양에 의해 방출될 수 있는, 그램-음성 박테리아의 세포질 주변 공간에 정착된 단백질들을 포함한다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 3판: Sambrook and Russell. CSHL Press).

편모로부터 나온 단백질들은 편모의 다량체 단백질들 또는 편모의 단편들을 포함한다. 박테리아 편모 전부를 계면활성제들로 분리하고 정제하고 초원심분리가 (CsCl 구배의 존재 시) 이어지는 방법들이 문헌에 기술되고 있다. 본 발명에서, 추출 방법들의 예들은 편모 단편들을 회수하는 것을 가능하게 한다.

막 단백질들은 막에 고정되고 일부가 표면 상에 노출된 단백질들 (외부 막 단백질들, 또는 Omp와 같음), 막의 표면에 부착된 단백질들, 지질단백질들 및 포린들을 포함한다 (Ward JB., Microbial adhesion to surfaces, 1980).

바람직한 방식으로, 상기 막 단백질들은 포린들 (porins), Omp A, 지질다당류들 (lipopolysaccharides) 및/또는 지질단백질들 (lipoproteins)로 구성된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 분획 S0을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명에 따른 박테리아 추출물은 적어도 분비된 펩타이드들 및 단백질들 또한 이차 대사물들을 포함하는 분획 S0를 포함한다.

분비된 펩타이드들 및 단백질들은 박테리아 LMB64에 의해 자연적으로 생산되고 분비되고, 또한 원심분리에 의해 또는 여과에 의해 회수될 수 있는 펩타이드들 및 단백질들을 포함한다.

이차 대사물들은 박테리아 LMB64가 생산하고 배양 배지에 분비하는 작은 분자들을 포함한다.

본 명세서에서 분획 S0 내의 지질다당류들의 존재가 언급되어야 한다. 따라서, 지질다당류들은 주로 분획 E0에서 발견되기는 하더라도, 분획 S0에서 더 적은 양들로 그럼에도 불구하고 역시 발견된다.

유익한 방식으로, 분획들 E0 및 S0는 분획 ES0를 획득하는 방식으로 조합될 수 있고, 예를 들어 배양 배지를 대략 5시간 동안 4℃의 온도에서 배양하고 기본 배지 (pH 9 내지 11)에서 반응하도록 남겨두는 것에 의해, 원심분리에 의해 또한 투명한 ES0 용액을 획득하도록 0.2 μm에서 여과에 의한다.

따라서 박테리아 추출물 ES0는, 무엇보다도 막 단백질들, 지질다당류들, 세포질 주변 단백질들, 편모의 단백질 단편들 또한 박테리아에 의해 생산되는 일차 및 이차 대사물들로 구성된다.

바람직한 방식에서, 추출물 ES0는 SDS-PAGE 기법에 따라:

- 밴드 1: 30　kDa 및 36　kDa, 선호하기로는 34　kDa;

- 밴드 2: 41　kDa 및 45　kDa, 선호하기로는 43　kDa;

- 밴드 3: 47　kDa 및 51　kDa, 선호하기로는 49　kDa; 범위의

분자량들 (대략 바이오래드사 (Bio-Rad)로부터 나온 분자량 표준들과 대비함)에 각각 해당하는 3개의 기본 밴드들을 포함하는 적어도 12개의 밴드들을 포함하는 단백질 프로파일을 가진다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 적어도 분획 E0 및 분획 S0를 포함하는 분획 ES0를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 각각 30 kDa 및 36 kDa, 41 kDa 및 45 kDa, 또한 47 kDa 및 51 kDa 사이 범위의 분자량들에 해당하는 세 개의 기본 밴드들을 포함하는, SDS-PAGE에 의해 획득된 단백질 프로파일을 가진 분획 ES0를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 박테리아 추출물은 각각 34 kDa, 43 kDa 및 49 kDa의 분자량들에 해당하는 세 개의 기본 밴드들을 포함하는, SDS-PAGE에 의해 획득된 단백질 프로파일을 가진 분획 ES0를 포함한다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고; 또한

b) 세포내 구성성분들을 제거하는;

단계들을 포함하는, 박테리아 추출물을 제조하는 방법을 기술하고 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고;

b) 상기 배양액을 원심분리하고; 또한

c) 상청액 S0를 회수하는;

단계들을 포함하는, 박테리아 추출물 S0를 제조하는 방법으로 구성된다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고;

b) 상기 배양액을 원심분리하여 상청액을 제거하고;

c) 세포내 구성성분들을 제거하는 방식으로 단계 b)로부터 나온 생물량을 처리하고; 또한

d) 펠렛 E0를 회수하는;

단계들을 포함하는, 박테리아 추출물 E0를 제조하는 방법으로 구성된다.

바람직한 방식으로, 단계 c)는 단계 b)로부터 나온 생물량의 초음파 파쇄 처리, 다음으로 상기 세포내 구성성분들을 포함하는 펠렛을 제거하는 것을 목표로 하는 초기 원심분리, 다음으로 상청액의 두 번째의 원심분리로 구성된다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은:

a) 박테리아 LMB64를 적합한 배지에서 배양하고;

b) 상기 배양액을 원심분리하여 상청액을 제거하고;

c) 단계 b)로부터 나온 생물량을 초음파 파쇄로 처리하고;

d) 상기 초음파 파쇄로 처리된 생물량을 원심분리하여 획득된 생물량을 제거하고;

e) 단계 d)로부터 나온 상청액을 원심분리하고; 또한

d) 펠렛 E0를 회수하는;

단계들을 포함하는, 박테리아 추출물 E0를 제조하는 방법으로 구성된다.

상기에 기술된 다양한 방법들은 설명을 위해서만 제공되고, 당업자들에게 숙지되어 있는 방법들이라면 모두가 사용될 수 있는 점을 주목해야 한다.

하기 실시예들로부터 자명해질 바와 같이, 본 출원인은 본 유형의 추출물의 경우 기대되는 활성들에 추가하여, 이전에 전혀 기술된 적이 없었던 여러 새로운 활성들을 보여주었다.

본 발명의 첫 번째 유익한 관점은 면역조정과 관련하여 전면역성 사이토카인들의 조정 (modulation) 특성에 있다. 보다 상세하게, 본 발명에 따른 박테리아 및/또는 추출물의 사용은, 크론병과 같이 Th1 또는 Th17 프로파일로 강한 방향성을 가진 반응의 경우에 항상성을 회복시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 장점은, 실시예들로부터 자명하게 될 바와 같이 본 발명에 따른 박테리아 및/또는 추출물의 사용이, 예를 들어 제한되지는 않지만 펩타이드들 hBD-2, hBD-3, S1007A 및 LL-31와 같은 항미생물성 펩타이드들의 생산을 유도하는 점에 있다. 이들 펩타이드들은 공생하는 미생물 균총의 정상적인 성장에 영향을 주지 않고도 장관에 군집하는 병원균들에 미치는 항미생물 효과를 가진다. 그 결과, 그들의 작용은 장에서 정상적인 미생물 균총을 회복시킨다.

보다 상세하게, 상기에서 언급된 바와 같이 박테리아 비트레오실라 필리포르 미스 (Gueniche A. et al ., 2006)의 추출물은 Omp A의 존재로 인한 TLR2 상의 활성, 또한 지질다당류들의 존재로 인한 TLR4 상의 활성으로 알려져 왔다. V. 필리 포르미스 박테리아에서는 편모의 부재 때문에, V. 필리포르미스로부터 획득된 추출물이 TLR5 활성을 전혀 가지지 않는다.

맨처음으로, 본 출원인은 TLR2 및 TLR4 상의 활성에 추가하여, TLR5 상의 활성을 가지는 본 발명에 따른 박테리아 추출물을 기술하고 있다.

따라서 본 발명은 상기에 기술된 바와 같이 TLR2, TLR4 및 TLR5의 활성인자로서 박테리아 및/또는 박테리아 추출물의 용도에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 상기 박테리아 추출물 TLR2, TLR4 및 TLR5의 활성인자는 편모로부터 나온 단백질들 모두 또는 일부를 포함하는 추출물로 구성된다. 본 경우에 예로서, 상기 추출물은 바람직하게 추출물 E0 또는 추출물 ES0이다.

상기 TLR5 활성화 활성은 TLR5가 소리아신 (psoriasin, S100A7) 및 hBD-2 (Glaser et al ., Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 641-649)와 같은 소정의 항미생물성 펩타이드들을 유도하는 것으로 알려져 있는 점에서 유의하게 흥미롭다. 게다가, TLR5 작동제들은 TLR2 및 TLR4의 작동제들과 상승 작용을 하여, 항미생물성 펩타이드들의 생산을 강화시키는 것을 가능하게 한다. TLR5를 항체로 차단하여, 후자가 거의 또는 전혀 생산되지 않는 점이 확인되었다.

따라서 본 관점은 상세하게 본 발명에 따른 박테리아 및/또는 추출물들에 대한 면역조정 출원들의 견지에서 혁신적이다.

따라서, 본 발명은 병리학, 상세하게는 감염과 또는 면역 반응 결함과 관련된 병리학의 치료 또는 예방 방법을 목적으로서 가지고, 여기에서 상기 병리학은 TRL2, TRL4 및 TLR5의 활성에서의 결함과 연관되고, 상기 치료 또는 예방은 하기 수용체들의 활성인자의 투여에 의해 상기 TRL2, TRL4 및 TLR5의 활성의 조정, 상세하게는 활성에서의 증가를 포함하고, 상기 방법은 상기 병리학을 가지거나 가질 가능성을 가진 환자에게 본 발명에 따른 박테리아 또는 박테리아 추출물의 유효량의 투여 단계를 포함한다.

또한 예기치 않는 방식으로, 본 출원인은 지금까지 기술된 박테리아 추출물들과는 대조적으로 PAR2로의 길항적 활성도 역시 보여주었다. 본 활성은 항염증 치료들의 맥락에서 유의하게 흥미롭다.

따라서 본 발명은, 매우 상세하게 상기 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 박테리아 추출물의 PAR2 길항제로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 병리학, 상세하게는 염증과 관련된 병리학의 치료 또는 예방 방법을 목적으로서 포함하고, 여기에서 상기 병리학은 PAR2의 부전과 연관되고, 상기 치료 또는 예방은 상기 PAR2의 조정, 상세하게는 하기 수용체의 길항제의 투여에 의한 것을 포함하고, 상기 방법은 상기 병리학을 가지거나 가질 가능성을 가진 환자에게 본 발명에 따른 박테리아 또는 박테리아 추출물의 유효량의 투여 단계를 포함한다.

바람직한 방식으로, 상기 PAR2 길항제 박테리아 추출물은 추출물 S0 또는 추출물 ES0로 구성된다.

PAR2는 내피세포들, 결장 근육세포들, 내장세포들, 내장 뉴런들, 면역세포들 및 각질세포들에서 과다 발현된다. 환경에 풍부하게 존재하는 프로테아제들 (트립신, 트립타제)은 PAR2를 본 동일한 수용체를 활성화하는 특이적 펩타이드를 노출하는 N-말단에서 절단한다 (자가-활성화의 현상). 결론적으로, 이것은 전염증성 사이토카인들의 생산을 활성화하고 염증을 촉발시킨다 (Vergnolle, N. 2009 Pharmacol. Ther. 123: 292-309). 본 현상은 야생의 마우스에서 관찰되지만 KO 마우스 (PAR2 결핍)에서는 출현하지 않는다. 항프로테아제 및/또는 PAR2 길항제로의 치료는 본 염증 현상을 피하는 것을 가능하게 한다.

이들 활성들 모두의 조합 및 상승작용은 본 박테리아 LMB64, 또는 본 동일한 박테리아로부터 나온 추출물이라면 모두에게 염증성 질환들, 매우 상세하게는 PAR2가 관여하는 및/또는 면역 체계가 약화되거나 교란되거나 불균형된 염증성 질환들을 치료하도록 높은 잠재력을 부여한다.

따라서 본 발명은 위창자 및 구강의 염증성 장애들의 치료 및/또는 예방을 목적으로 하는 조성물의 제조를 위한, 상기에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 상기 박테리아로부터 나온 추출물의 용도에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 상기 위창자 및 구강의 염증성 장애들은 크론병, 장염 또는 치주염을 포함한다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 특허 출원의 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 박테리아 및/또는 적어도 하나의 박테리아 추출물을 활성 성분으로서 포함하는, 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 위창자 및 구강의 염증성 장애들의 치료에 관한 것이다.

바람직한 방식으로, 상기 위창자 및 구강의 염증성 장애들은 크론병, 장염 또는 치주염을 포함한다.

따라서 본 발명은 상기에 더하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 상세한 설명에서, "약제학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"은 이차 반응들을 유발하지 않고, 또한 예를 들어 활성을 가진 화합물들의 투여를 용이하게 하여 신체에서 그들의 수명 및/또는 효율성을 증가시키거나, 용액에서 그들의 용해도를 증가시키거나 그들의 보존성을 개선시키는 약제학적 조성물의 일부가 되는 화합물 또는 화합물들의 조합을 말한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체들은 잘 알려져 있으며, 선택된 활성을 가진 화합물들의 성질 및 투여의 방식에 따라 당업자들에 의해 적응될 것이다.

바람직하게, 상기 화합물들은 근육내, 피부내, 복강내 또는 피하적 경로에 의해, 또는 경구적 경로에 의해 전신적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 항체들을 포함하는 조성물은 일정 기간에 걸쳐서 여러 번의 용량들로 투여될 수 있다.

그들의 최적의 투여 방식들, 투여 스케쥴들 및 생약 형태들은, 예를 들어, 환자의 연령 또는 체중, 환자의 일반적인 건강의 중증도, 치료에 대한 내성 및 주목된 부작용들과 같은 환자에게 적응된 치료의 확립에서 고려된 판정기준들에 따라 결정될 수 있다.

본 발명은 그의 범주를 제한하지 않고 본 발명을 설명하는 하기 실시예들의 고려할 시 더 잘 이해될 것이다.

도 1은 균주 LMB64의 16S rRNA를 코딩하는 서열의 계통유전학적 위치를 나타낸 것이다.
도 2A 및 2B는 투과 전자현미경 (A) 및 주사 전자현미경 (B) 하의 박테리아 LMB64의 영상들을 나타낸 것이다.
도 3은 R3 배양 배지의 온도, pH 및 염도의 함수로서 결정된 성장 최적 조건들을 나타낸 것이다.
도 4는 추출물 E0에 의한 표면 분자들 CD80, CD86, CD83 및 CD54의 유도 (용량-의존성 효과)를 나타낸 것이다.
도 5는 추출물 E0에 의한 IgE 수용체들의 저해를 나타낸 것이다.
도 6은 추출물 ES0에 의한 TLR2의 활성화를 나타낸 것이다.
도 7은 추출물 ES0에 의한 TLR4의 활성화를 나타낸 것이다.
도 8은 추출물 ES0에 의한 TLR5의 활성화를 나타낸 것이다.
도 9는 추출물 ES0에 의한 특이적 PAR2 길항제 활성을 나타낸 것이다.
도 10은 추출물 ES0의 SDS-PAGE 젤을 나타낸 것이다.
도 11은 항미생물성 펩타이드 유전자들의 TLR5-의존성 발현의 유도에서 ES0의 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 인간 구강 각질세포들에 미치는 ES0 활성이 TLR5에 의해 매개되는 것을 나타낸 것이다.
도 13은 래트의 급성 장염 모델에서 ES0의 항염증 효과를 나타낸 것이다.
도 14A 및 14B는 예방적으로 투여된 균주 LMB64가 TNBS에 의해 유도된 소장 병변들 [A]뿐만 아니라 염증성 반응 (MPO 활성)[B]도 감소시키는 것을 나타낸 것이다.

실시예 1: 박테리아 LMB64 의 선별 및 특성분석

박테리아 LMB64는 지하수로부터 분리되었다.

새로운 박테리아 LMB64의 분류적 위치는 도 1에 제안되어 있다.

보다 상세하게, 박테리아 LMB64는 대략 2.3 μm (± 0.3)의 길이 및 대략 1.0 μm (± 0.1)의 너비를 가진 막대-모양이다. 본 박테리아의 구별되는 특징은 극성 편모의 존재이다 (도 2A 및 2B). 이들 영상들에서 역시 관찰될 수 있는 바와 같이, 박테리아 LMB64는 비미세섬유성 박테리아이다.

상기에서 언급된 바와 같이, 박테리아 LMB64는 대략 11 kpb의 원형 플라스미드를 가진다. 본 플라스미드는 완전하게 서열결정 되었다 (서열번호 2).

16S rRNA를 코딩하는 유전자도 역시 서열결정 되었다 (서열번호 1). 박테리아는 합성 배지를 넣은 발효기에서 배양되었다. 성장 속도는 배지가 낮은 농도의 탄소 기질들을 가질 때 더 높다.

테스트된 배양 배지는 하기 표들 1a, 1b 및 1c에서 그들의 조성들이 각각 기술되어 있는 R3, MS-포도당 및 LB 배지이다.

박테리아 LMB64의 성장 속도들은 배양 배지의 함수로서 하기 표 2에 나타나 있다.

성장의 최적 조건들은 R3 배양 배지의 온도, pH 및 염도의 함수로서 결정되었다 (도 3).

박테리아에 의해 동화가능한 탄소의 출처들은 API 50CH 갤러리를 사용하여 (배양 온도: 25℃) 특성분석되었다. 그 결과들은 하기 표 3에 요약되어 있다.

API ZYM 갤러리 상에 관찰된 효소적 활성들로는: 알칼라인 포스파타제, 에스터라제 (C4), 에스터라제/리파제 (C8), 루이신 아릴아미다제, 발린 아릴아미다제, 산 포스파타제, 나프톨-AS-BI-포스포하이드로라제, 및 α-글루코시다제이다.

박테리아 LMB64는 하기 표 4에서 관찰된 바와 같이 테스트된 항생제들 모두에 대해 민감하다.

실시예 2: 분획들 E0 , S0 및 ES0 를 추출하는 방법

전배양 : 균주 AV13은 250 mL의 MS 포도당 피루베이트 배지를 포함하는 얼렌마이어 플라스크에 접종되고 (하기 표 5를 참조하라), OD₆₀₀ ≒ 1.5가 획득될 때까지 30℃ 및 200 rpm에서 대략 40시간 동안 교반 하에서 배양이 이어진다.

배양: 전배양액은 다음으로 3.7 L의 MS 피루베이트 배지 + 114 mL의 20% 포도당 용액을 포함하는 발효기 (아프리콘사 (Applikon))에 접종된다. 온도 센서가 바람직하게 30℃ 주변으로 온도를 조절한다. 산소 센서 (아플리센스사 (AppliSens))가 배지에 용해된 산소의 농도를 18 내지 25%로 유지하는 데 사용된다. pH 센서 (아플리센스사)가 고정된 유속 펌프를 통한 10% NH₄OH의 첨가에 의해 pH를 7로 유지하는 데 사용된다. 웨지우드 분석 센서가 실시간으로 광학 밀도에서 변화들을 감시하는 데 사용된다. 배양은 배지첨가-회분식 방식으로 프로그램화된다; 가변성 유속 펌프를 통해 배양액은 20% 포도당 용액이 보충된다. 발효는 OD₆₀₀ ≒22 내지 26일 때, 일반적으로 대략 30시간 이후에 정지된다.

추출 S0 : 상청액은 4℃에서 1시간 동안 4,000 rpm으로 원심분리에 의해 생물양으로부터 분리된다.

추출 E0 : 젖은 생물량은 NaCl 용액 (1　M)에 넣어둔다. 4℃에서 15분 동안 9,000 g로 원심분리 이후에, 상청액은 버리고 펠렛은 1　M NaCl 용액에 넣어둔다. 다음으로 시료 튜브는 식힌 초음파 수조 내에 50 내지 60　W의 전원 설정으로 수 분 동안 담구어 둔다. 4℃에서 30분 동안 6,000 g로 원심분리 이후에, 펠렛은 버리고 상청액은 회수된다. 두 배의 차가운 에탄올이 첨가되고 현탁액을 4℃에서 하룻밤 방치한다. 4℃에서 30분 동안 9,000 g로 원심분리 이후에, 상청액은 버리고 펠렛은 25　mM 트리스 완충액, pH 8.8에 넣어둔다.

추출 ES0: 배양액은 염기성 완충액으로 염기성 pH (pH 9 내지 11)로 맞춘다. 다음 단계는 4℃의 온도에서 5시간 동안 교반 하에서 배양이다. 원심분리 이후에, 상청액은 남아있는 생물량 잔재를 제거하도록 미리 여과된 다음 0.2 μm 필터 상에서 여과된다. 투명한 노란색 용액이 획득된다 (ES0).

단백질들은 DC 단백질 검정 키트 Ⅱ (바이오래드사) 프로토콜에 따라 검정된다. 슈가들은 페놀/황산 방법에 따라 포도당 당량으로 검정된다 (Dubois, M. et al., 1956).

예로서, 하기 표 6은 상기에 기술된 조건들 하에서 획득된 바와 같이 추출물 ES0의 소정의 특이적 특징들을 제시하고 있다.

상기 데이타는 본 명세서에서 단지 설명의 목적들을 위해 제시된 것으로 분명하게 이해된다.

보다 명확하게, 본 데이타는 세 개의 기본 밴드들을 나타내는 SDS-PAGE에 의해 획득된 단백질 프로파일에 관한 것이다.

SDS - PAGE 프로토콜:

추출물 ES0은 완충액 (20　mM 트리스-HCl, pH 8.0; 1　mM EDTA; 2.5% SDS 및 0.01% 브로모페놀 블루) 및 1　M DTT (1,4-디티오트레이톨)에 넣어둔다. 시료 및 분자량 마커들의 혼합물 (WesternC, 바이오래드사)은 8 내지 16% SDS-PAGE 아크릴아마이드 젤 (GeBaGel, 진 바이오-어플리케이션사 (Gene Bio-Application))의 웰들에 각각 올려졌다. 전개 완충액은 2.5　mM 트리스, 19.2　mM 글리신 및 0.01% SDS (w/v)를 포함한다. 전개는 대략 1시간 동안 160　V의 일정한 전압 하에서 진행되도록 허용된다 (GeBaGel 시스템). 다음으로 단백질 밴드들은 쿠마시 블루 (인스턴트 블루, 엑스페디온사 (Expedeon))로 염색되었다. 크기들은 기지의 표준들 (STD)과 대비하여 계산되었다.

획득된 젤은 도 10에 나타낸다.

본 발명의 한 가지 구현예에 따르면, 이들 세 개의 밴드들은 대략 34　kDa, 43　kDa 및 49　kDa의 분자량들을 각각 가진다.

실시예 3: 분획들 E0 및 ES0 의 약물학적 활성들의 확인

랑게르한스 세포들 (LC)은 프랑스 국립 혈액원 (French National Blood Service, Etablissement Francais du Sang (EFS) Pyrenees Mediterranee)으로부터 나온 백혈구-연층 파우치들로부터 분리된 인간 단핵구들로부터 시험관내 생성되었다: 피콜 구배 상의 분리 (림프구 분리 배지, 밀도 1.077　g/ml) 및 자기 면역선택에 의한 정제 (밀테니 바이오테크사 (Miltenyi Biotec)); LC 분화는 사이토카인 칵테일 (GM-CSF/IL-4/TGFβ)의 존재 시 6일 동안 수행된다. RPMI-5% FCS 배양 배지를 넣은 24-웰 플레이트들 상에 배분된 LC는 추출물 ES0와 함께 24시간 동안 배양된다.

표면 분자들은 유동 세포측정법 (FACSCalibur, BD Biosciences)에 의해 삼중 또는 사중 염색: CD1a/CD54/CD80/CD83/CD86/FcεRI으로 분석된다; 배양 상청액들에서 분비된 사이토카인들은 유동 세포측정법에서 세포측정법 비드 어레이 (Cytometry Bead Array, 카탈로그 번호 550749, BD)로 분석된다: IL-6, IL-8, TNF, IL-4, IL-10, IL-12.

3.1 랑게르한스 세포 성숙 및 IgE 수용체 ( Fc ε RI ) 저해

추출물 E0는 표면 분자들 CD80, CD86, CD83 및 CD54의 용량-의존성 유도에 의해 관찰되는 랑게르한스 세포들의 성숙을 유도한다 (도 4). 유사하게, 추출물 E0는 용량-의존성 효과에 따라 IgE 수용체들 (FcεRI)의 발현을 저해한다 (도 5).

3.2 톨-유사 수용체들 ( TLRs )의 활성화

추출물 EO의 TLR 활성은 TLR2, TLR4 또는 TLR5를 위한 유전자에 의해 또한 리포터 유전자 NFκB-sAP (분비된 알칼라인 포스파타제)에 의해 공형질전환된 HEK293 세포들의 모델을 사용하여 TLR2, TLR4 및 TLR5 상에서 평가되었다. 그의 TLR과 리간드의 결합은 전사인자 NFκB의 활성화를 유발하고; sAP 유전자는 NFκB에 의해 유도될 수 있는 프로모터의 조절 하에 배치된다. 본 리포터 유전자는 TLRs를 통한 세포 신호전달을 감시하는 것을 가능하게 한다: ES0에 의해 유도되고 비색 검정법에 의해 측정되는 sAP의 방출은 TLR2, TLR4 또는 TLR5 작동제로서 본 활성 성분의 활성을 결정하는 것을 가능하게 한다.

본 연구는 다음의 인간 배아 신장 (HEK293) 세포주들 상에서 수행되었다:

- TLR2를 위한 HEK-Blue^TM-2 세포들,

- TLR4를 위한 HEK-Blue^TM-4 세포들,

- TLR5를 위한 HEK-Blue^TM-5 세포들.

이들 세포주들은 HEK-Blue^TM 선택 10% FCS 배양 배지에서 유지되고, 다음으로 ES0 존재 시 HEK-Blue^TM 검출 배지를 넣은 96-웰 플레이트에 18시간 동안 배분되었다. 플레이트들은 620　nm에서 비색측정법을 사용하여 해독되었다.

3.2.1 TLR2의 활성화

추출물 ES0는 용량-의존성 효과에 따라 100　ng/mL에서 최대의 활성으로 TLR2의 활성화를 유도한다 (도 6).

3.2.2 TLR4의 활성화

추출물 ES0는 10　ng/mL에서 최대의 활성으로 TLR4의 활성화를 유도한다 (도 7).

3.2.3 TLR5의 활성화

추출물 ES0는 용량-의존성 방식으로 TLR5의 활성화를 유도한다. 본 활성은 항-TLR5 항체의 존재 시 저해되고, TLR5 상에서 추출물 ES0의 활성화 특이도를 보여준다 (도 8).

3.3 PAR2 의 저해

추출물 ES0에 의한 프로테아제-활성화 수용체들의 저해는 세포주 (HaCaT)로부터 나온 인간 각질세포들 상에서 각질층 트립신 효소 (SCTE)로 PAR2의 특이적 자극 이후에 유도된 세포내 칼슘 유입을 측정하여 평가된다. 형광성 탐침 Fluo-4/AM이 사용된다: 그의 에스테르화된 형태는 세포에서 수동적 확산에 의해 그의 침투를 용이하게 한다; 칼슘 이온들과 결합된 탈에스테르화된 형태만이 485 nm 형광 하에서 여기 가능하고 535 nm에서 방출한다.

형광성 탐침은 96-웰 플레이트들에 접종된 세포들에서 30분 동안 도입되고 다음으로 추출물 ES0가 30분 동안 배양된다. 칼슘 유동이 SCTE의 주입 이전 및 이후에 역학에 따라 실시간으로 웰마다 측정된다. 플레이트들은 미스라스 LB940^TM 리더 (베르톨드 테크놀로지사^® (Berthold Technologies^®)를 사용하여 해독된다.

추출물 ES0은 용량-의존성 방식으로 인간 SCTE에 의해 유도된 PAR2의 활성화를 저해한다 (도 9).

실시예 4: 치주염의 치료를 위한 추출물 ES0 의 용도

치주 질환들은 치주의 파괴를 유발할 수 있는 만성 염증성 질환들이다. 변화가 포르파이로모나스 진기발리스 (Porphyromonas gingivalis , Pg)와 같은 병원성 혐기성 균주들을 포함하는 세균총에서 발생한다. 이들 균주들은 치주 질환들을 앓고 있는 개체들의 치은 열구액 (gingival crevicular fluid)에서 적은 양들로 발견되는 항미생물성 펩타이드들에, 적어도 hBD-3에 대해 민감하다 (Brancatisano FL et al. (2011), Reduced human Beta defensin 3 in individuals with periodontal disease. J Dent Res. 90:241-245). 본 실험에서, 우리는 추출물 ES0가 구강 각질세포들에서 항미생물성 펩타이드들을 유도할 수 있는 것을 보여주고 있다.

일차 인간 구강 각질세포들은 각각의 TLR: TLR2 (aTLR2), TLR4 (aTLR4) 또는 TLR5 (aTLR5)를 특이적으로 차단하는 1 μg/mL의 항체의 존재 또는 부재 시, 10 μg/mL의 ES0로 48시간 동안 자극되었다. 다양한 항미생물성 펩타이드들 (하기 표 7)의 mRNA의 발현은 실시간 PCR에 의해 정량되었다.

자극 48시간 이후에, 세포들은 용해되고 전체 RNA가 추출되고 다음으로 나노드롭 N1000 (NanoDrop N1000) 분광측정기 (써모 피셔 사이언티픽사 (Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 검정되었다. cDNA가 1 μg/mL의 RNA로부터 합성되었다. 정량적 PCR 증폭 단계가 96-웰 플레이들에서 사이버 그린 (SYBR 그린 PCR 코아 시약들 키트, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 수행되었다. 사용된 프라이머들의 DNA 서열들이 하기 표 8에 나타나 있다.

순환 한계의 수치들 (Ct)이 기준 유전자들 (GAPDH: 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화효소; PPIA: 펩티딜프로릴 이소머라제 A; YWHAZ: 타이로신 3/트립토판 5-모노옥시게나제; RPLP0: 리보좀 단백질 P0)과 대비하여 정상화되었다. 다음으로 관심 있는 유전자의 발현 수준이 △Ct로 주어진다: △Ct = Ct_{(관심 유전자)} - Ct_{(기준 유전자)}. 각 관심있는 유전자에 대한 메신저 RNA의 상대적인 양 (RQ)이 해당하는 미치료된 대조군 세포와 대비하여 계산된다:

관심 있는 유전자의 발현은 RQ ≥ 2 (유도) 또는 RQ ≤ 2 (저해)일 때 조절되는 것으로 고려된다.

배양 상청액들에서 hBD-2 농도는 제조사의 권고사항들 (펩프로 테크사 (PeproTech))에 따라 시판되는 키트를 사용하는 엘라이자 (ELISA)에 의해 결정된다. 결과들은 평균 ± 표준 편차로서 표현되고, 유도된 생산의 저해 백분율은 유의하게 조정될 때 굵은 파란색으로 표시된다 (항체 없이 유도된 생산 "AB 없음"과 대비하여 평가됨).

결과들은 ES0가 연구된 항미생물성 펩타이드들 모두의 발현의 강력한 유도인자인 것을 보여주고 있다 (도 11, "AB 없음"). DEFB4 유전자의 과다발현은 hBD-2 단백질 분비에서의 큰 증가와 상관되어 있다 (도 12).

항-TLR2 또는 항-TLR4 항체와 함께 세포들의 전배양 이후에, 펩타이드 발현은 영향받지 않는다. 한편으로, 항-TLR5 항체의 존재 시, DEFB103, DEFB4, S100A7 및 RNase 7의 발현은 강하게 억제된다: 각각 71%, 94%, 99% 및 82%, (도 11). 유사하게, hBD-2 분비는 항-TLR5 항체 단독과 함께 82%까지 극적으로 감소된다 (도 12).

따라서 ES0는 항미생물성 펩타이드 발현 및 분비의 강력한 활성인자이다. 본 효과는 TLR5 활성화와 관련되어 있다. 지금까지, 유일한 기지의 TLR5 리간드는 플라젤린 (flagellin)이다. 따라서 ES0에 포함된 LMB64 플라젤린이 TLR5의 활성화 및 항미생물성 펩타이드들의 생산을 부여하는 것 같다.

실시예 5: 만성 염증성 대장 질환 ( IBD )의 치료를 위한 추출물 ES0 의 사용

ES0 효과는 실험적인 장염에 있는 염증성 반응 상에서 평가되었다. TNBS (2,4,6-트리니트로벤젠술폰산)에 의해 유도된 급성 장염의 래트 모델은 크론병을 모방하는 것으로 알려져 있다. ES0는 위장관을 통과하는 동안 그의 분해를 피하도록 직장으로 투여되었다. 본 명세서에서 ES0는 마이엘로퍼옥시다제 (MPO)의 저해에 의한 염증을 포함할 수 있는 것으로 확인된다.

살아있는 박테리아 LMB64의 경구적 경로에 의한 예방적 척도로서의 효과도 역시 IBD에서 평가되었다: 균주 LMB64의 효과는 TNBS에 의해 유도된 급성 장염의 래트 모델에서 평가되었다. 살아있는 균주 LMB64는 경구적 경로에 의해 투여되었다.

5.1 추출물 ES0

ES0의 효과는 실험적인 장염에 있는 염증성 반응 상에서 평가되었다. TNBS (2,4,6-트리니트로벤젠술폰산)에 의해 유도된 급성 장염의 래트 모델은 크론병을 모방하는 것으로 알려져 있다. ES0는 위장관에서 통과하는 동안 그의 분해를 피하도록 직장으로 투여되었다.

10마리의 위스타 래트들의 그룹들은 D0에서 30　mg의 TNBS를 직장으로 수여받았다. ES0의 다양한 용량들 (7.5, 0.75 및 0.075 mg의 단백질들/kg)이 D0로부터 D6까지 매일 투여되었다. 동물들은 D7에 희생되었고, 호중성구들에 존재하는 요소 마이엘로퍼옥시다제 (MPO)를 검정하여 국소적 염증 반응을 결정하였다. 간략하게, 직장의 절편이 균질화되었고 MPO 활성이 상청액에서 분광측정 검정법에 의해 정량되었다.

본 결과들은 평균 ± 표준 편차로서 표현된다.

데이타의 통계학적 분석은 본페로니 테스트 (Bonferroni test)가 이어지는 원-웨이 ANOVA를 사용하여 수행되었다.

TNBS의 투여는 미처리된 대조군 그룹과 대비하여 활성에서의 유의한 증가를 유도한다. 가장 강한 용량에서는 아니지만 0.75　mg/kg 또는 0.075　mg/kg의 용량들로 ES0를 수여받은 래트들에서, MPO 활성은 TNBS-처리된 양성 대조군 그룹과 대비하여 유의하게 저해된다. ES0의 효과는 MPO 활성이 정상으로 회복되어, 예로 TNBS로 처리되지 않은 음성 대조군 그룹의 활성과 유사하기 때문에, 강력하다 (도 13).

5.2 만성 염증성 대장 질환에서 예방적 척도로서 박테리아 LMB64

균주 LMB64의 효과는 TNBS에 의해 유도된 급성 장염의 래트 모델에서 평가되었다. LMB64 배양액은 원심분리되었고 생리적 완충액으로 세척되었다. 박테리아는 0.9% NaCl 생리적 완충액으로 재현탁되었다. 박테리아 LMB64의 수로 적정된 용액이 경구적 경로에 의해 동물에게 투여되었다.

10마리의 위스타 래트들의 그룹들은 D0에서 30　mg의 TNBS를 직장으로 수여받았다. LMB64의 다양한 용량들 (10⁸개 또는 10⁹개의 살아있는 박테리아들)이 D6으로부터 D0까지 매일 투여되었다. 기준 분자로서 또한 동일한 프로토콜에 따라 사용된 3 mg/kg의 프레드니졸론을 수여받은 래트들의 그룹도 역시 포함되었다. 동물들은 D7에서 희생되었다.

육안적 병변들이 평가되었고, 하기 표 9에서 기술된 매개변수들을 기초로 하여 점수에 따라 표현된다.

국소적 염증성 반응은 상기 기술된 바와 같이 MPO 검정법에 의해 결정되었다.

본 결과들은 평균 ± 표준 편차로서 표현된다. 데이타의 통계학적 분석은 본페로니 테스트가 이어지는 원-웨이 ANOVA를 사용하여 수행되었다.

본 결과들은 LMB64가 놀라운 방식으로 MPO 활성에 의해 표현되는 염증성 반응을 저해하는 것을 보여준다 (도 14B). 본 효과는 최대의 활성이 10⁹개의 박테리아 LMB64로 획득되는 용량-의존성이다.

본 용량에서, 균주 LMB64는 기준 분자인 프레드니졸론보다 더욱 효과적이다. LMB64는 병변 점수도 역시 극적으로 감소시킬 수 있지만, 단지 10⁹개의 박테리아 LMB64의 용량에서이다 (도 14A). 다시 본 균주는 기준 분자인 프레드니졸론보다 더욱 효과적인 것으로 입증된다.

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES CNCM04290 20100408

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE DERMO-COSMETIQUE PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> NOVEL BACTERIUM AND EXTRACTS OF SAID BACTERIUM AND THE USE OF SAME IN THERAPY <130> 359846D29307 <140> PCT/EP2011/073749 <141> 2011-12-22 <150> FR 1061082 <151> 2010-12-22 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1487 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel bacteria LMB64, belonging to the class of Betaproteobacteria, from groudwater <400> 1 agtttgatca tggctcagat tgaacgcggg cggcatgctt tacacatgca agtcgaacgg 60 cagcacgggc ttcggcctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt cggaacgcgc 120 cgagtagtgg gggataacgc agcgaaagct gtgctaatac cgcatacgta ctgaggtaga 180 aagtggggga ccttcgggcc tcacgctatt cgagcggccg acgtctgatt agctagttgg 240 tggggtaaag gcccaccaag gcgacgatca gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat 360 gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtctgaagaa ggccttcggg ttgtaaagga 420 cttttgtccg ggagcaaagc ctgcttgtta ataccgagtg gggatgagag taccggaaga 480 ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat 540 cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttgtgca agtctgatgt gaaagccccg 600 ggctcaacct gggaacggca ttggagactg cacggctaga gtgcgtcaga ggggggtaga 660 attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc 720 cccctgggat gacactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780 cctggtagtc cacgccctaa acgatgtcaa ttagctgttg ggggtttgaa tccttggtag 840 cgaagctaac gcgtgaaatt gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaag 900 gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa 960 aaccttacct gctcttgaca tgtaccgaag cctgaagaga tttgggtgtg cccgaaaggg 1020 agcggtaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080 tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgccatcat ttggttgggc actctaatga 1140 gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1200 agcagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg tcgccaagcc gcgaggtgga 1260 gccaatctca gaaagccgat cgtagtccgg atcgcactct gcaactcgag tgcgtgaagt 1320 cggaatcgct agtaatcgca gatcagcatg ctgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1380 acaccgcccg tcacaccatg ggagtggggg ataccagaag tgggtaggct aaccgcaagg 1440 gaggccgctt accacggtat gcttcatgac tggggtgaag tcgtaac 1487 <210> 2 <211> 10948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel bacteria LMB64, belonging to the class of Betaproteobacteria, from groudwater <400> 2 gggcgcagca ccatcgccca ggccaaaagc cacccgtgcc gattcggcgg cctgttgctc 60 gcgctcaatg cgctgcgcct ggtcggccaa gtcggcggct tgctgctcgg ccttgcccgc 120 cagggtgtca cgctcgcggg tcagttccgc cacctgctcg gctagggcat cgcgctcggc 180 ctcgatcacc tcaccagcgg ccgccagctc ggcggcttcg ctctgcgcct ggaccaagcg 240 gccctcgacc tcggcgcggg cctgggcggc tgcgcgctcg atctcggcgg caatggcggc 300 ggtcaatgcc tggggcagtt ccggcgcagc agcagcggcc accggccggg cctctcgcca 360 ggcagttaga tgcttgtgaa cggtattcgg gctgccggtg cccaaacgct cgcggatcgc 420 gcggatagtc ggctgctgcc cttcgccgac cagcgcatca gcggcggcgg cgaacgggtg 480 gcccgtgcag aggcccgcgt cgagcagatc gagcagcagg ccgccaaggc ggcacaggcc 540 cacgaagaag cccgcgccgc cgccacgcag gaagcccggc aagtgcaagc cgaacgcgac 600 gaagcccgca aggtggccgc cgaggcgcgc gagcagaccg cgcgcctggc tgggcaactc 660 gaagccctca ccgcgaagga gcgaaaagcc gatgaaagac cgtgaccaca acgaagcgat 720 ggccggcatg tttcaggccg acccccgatt tgccgccgac tatctgcgcc aggtgttggc 780 cgatggcgag cctaccgacg tgcgcgccgg cttgcggcaa atggcggatg tgctgcgcgt 840 cagtcaggcc gccgcgccga ccgattctgc gccttcggcg ggcctctttg accgggccgg 900 cgtgcgctac gaagtggcgt gcgatgtgat cggggcgttg attgcccatt acgccgaaat 960 catgggacgg gaacgcgagc aggcgcagcc gaatgaggcg gttttgcgcg tggccggagc 1020 catgaaggcg gcgctggccg gggagcggga tgatctcgat ccgcgcgata gcgccggcat 1080 cgaggcggcg atttcgcgct atgcgccact ggcgcgccgg ctgtatggcc aggctgaaaa 1140 cgaccacgcc cgccaggaac agcgtcgcgc cgatttcgac caggtgcatg cttcgctggc 1200 cttggagggg ctggccatga gcgcggacga tttggcggtt caggcgctgc tgatccgggg 1260 cgacattacc cacgatgagg cggtgcagtg ctaccgcatc ctgcatcgcc atgcgcggta 1320 aaaccgactg gccgcccgag gtggccggtg tgctgggttt gctcgaatcg cagccgccag 1380 aggcggcgat gctggtgggc tgttttctgg cggcggtagc ccatcccgat catgcggccg 1440 aattggcgat gttcgacaaa ttgccgccag cggcccggat ggtcgtcggg cgatttttcc 1500 tcgtttttct ggcgggcggc ctggacgatg ccgggcgcga aaaactgcat tcgcacatgc 1560 aggcatggtt tgtccgtcag cgccgttttc ggtgaatggc ttgcctcatc cactagggcc 1620 gggcaagggg tgaacagcgg gcgatgctgg cttgcgggac gaccccgcac ccccggaaaa 1680 cttgtcacac accacgcaac tcccgttgct tcgctaaaag ccttgtgccg caaggctttt 1740 agcgaggcga caccgaagac acatcgcggc gacaccgaaa gggccgaacc ggcctaaaac 1800 ccttgctgcg caaggagaac agccgcgctt tcgcgcgcga aagtgcttca aatgcctgtc 1860 ggcatcagca gggtatggat cggcacgccg aaggcgttgg cgatgcgctc caggttgtcc 1920 aaggagatgt ttctgacttg gcgctcgcag tgcgcaacga aggtgcgatg taggccgcac 1980 tcaaaggcga gcgcttcttg tgaccagcct ctttcccggc gtaatcggat catgttggcc 2040 gcgagcacgg cccgcgcgga atgcgcggtt ggtgcgggag gttgagcggc gggagacatg 2100 caaaccagtc tcctgatatg ccgcttttac gtcagccgtg tttaagtcac aatatggttt 2160 tctcatagag aaagacggcg tgacgatggg cagaaaaaca gcaatcaggc gagggggtgc 2220 cgtgttggcc agcctgttga tttgcgcaat tgaaccggtc ggcgcggcct ccctggtcgg 2280 cggtcaaacc gatgattccg tgtgcgacct gggcagcgcg ccacagaacg cccggaagct 2340 gtcggcagcg ggcgacttca tccgcgcgca gtgcaaaaac ggtcaaatgt tggtgggttc 2400 cggcatcgtg cctgccggcg ggtttgactc ggaagtggtg cgcctggcgc gcaccttctg 2460 ccgcatggcg gacattcaga ctcggcgcac gcagggcaac atggccggcc tcgtcatgga 2520 gatcgacgag gtacggtgca tcatcgggaa gttgccgaca tgagaaaagc gatgttggct 2580 ggctttctgg ccgttgtggt ggccaacgtg gttgccgctg agggcggtgc gcccttgcgc 2640 ggcggtgttt gcatcggacc gttccgtggc gctgattccg tcgtgcactg cgagcacatc 2700 ggcaaggtga cgatccgcca gatttacgaa aagggctttc gggtcgttca catgcaggac 2760 gacaagaaca cagccagcta cgttgtgctg gttatcgagg agcaggcgcg atgagggcga 2820 aagcgtggcg gatgctgttt gccgggcggc gctgggtgct ctggcttccc gtgccggcgt 2880 cggtatggct ggcactgccc gaatggcagc acattcccgc catgttgttg ggcggcctga 2940 tcgtgtggat tcccttctgg ctcgcgtggt ggctcagtga tggcttcgcg ggcatgtcca 3000 ggtggccagg aaccggcgca cctgcggtat ctggcggggt gaacccgcac accggcaagc 3060 catgcacggt gtatcaccag ccgtggggag ataccttcgt gggtggagac tgattatttg 3120 attgaggaac gatgacaagg gccagcaaca agctggccct tgtcgttttc tggactgttt 3180 tacccacaac atccgctctg ctgctgaatt ggcggacatg gcaccgagcc gaacgaacag 3240 aacacgcagc aatcccccgg cttggggcgc agcagcgtat ggcaggccgg gcactcgtag 3300 tagaactggc aggcgtccgt gggcatggtt tcctgctgtg cgtggccgca gtgcgggcag 3360 gtcagcacgg attcgagaat gacggcgctc atcgtggcgt tacctctgca cggtggacgg 3420 atagcctgcg ttcgtcgttg ccgaggtcaa cgcttccggc ttggccttgt cggcgtcata 3480 ggtgacggtg gccgttttct tgtcgaaatc gaccttgacg gcgctcacac cgggcacttt 3540 ctccagcgac ttcttgactg tgatcgggca tagctcgcag gtcatgttct gaacggccag 3600 cgtgacggtt ttcggggtgg cggccagcac ggcgagcggc acggcagcca gcagagcaat 3660 cagcagtttg cgcatgggag tctcctttca atagaacagc ggggcgaacc acggcacggc 3720 caacagggca agcaacagca cagtgacgat ccagaacgtc aggcgctgcc gctggcgtgt 3780 gcgcggatca gcgcatggcg tgccgggcgt gcagacctgc ggcaccagat agagcttgcg 3840 gaaggccagt ccgagaaaga gcagcgtcat gccgatgaaa aagggccggt acggctccat 3900 cgcggtcagg ctgccaaccc atgagccacc aatgccaagc accagcagga caagcggccc 3960 gacacagcac accgacgcgc cgatggcggt cagtacgctc acgatcaacg agcttttttc 4020 agtgagtcgt gccatgtcgc tttccttgta cctgtttgcc caagtgttac tctaaatccc 4080 gtacctaagt acggagtcaa gggggtgtga tgggaacaga actgaccatc ggcaagctgg 4140 ctgacgctgc cggggtgaat atcgagacga ttcgctacta ccagcggcgc ggcctgctgg 4200 atgagccgcc taaaccgcca ggggggcatc ggcgctatgc gcctgagcag gcaaaacgtg 4260 tgcgatttat caagcgggca caggcgcttg gtttcacgct ggacgaggta ggcgcgctac 4320 tgaccctgga tgcggcctgc gcctgcggtg agacgcgagc gctggctgtg cgcaagctgg 4380 gtctgatcga gcagaagatg gctgacctcg cggccatgcg gcaggcgctg ggtggattgg 4440 tgcagcagtg tgatgcgggc gacggtggag ccagctgtcc catcatcgac gtgctggcag 4500 gtaattagat gtgttcaaaa aatggtggtt ttctggacac atgccggttt gccctgtcct 4560 gagttgtcct gatgcgttaa agtgttcatt tattcgttca gctttcaatg tggcggaact 4620 gttcatgaat caacgcatcg gctatgcccg cgtttcgacc gacgaccaaa acctagacct 4680 gcaacgggac gcactccggc aggctggatg ctcaaccatt tacgaggaag cagccagcgg 4740 aaagagcgca gcaaggcccg agcttgagca gtgtcggaag gctctccggc ccggcgacac 4800 gcttgtggtg tggcggcttg atcgccttgg gcgcagcctg cccgacctgg tgcagatcgt 4860 ggctgatctt gaacagcgcg gcgtgcattt cgagagcctg accgagaaga tcgagacggg 4920 gagcgcagcg ggtaagctgc aattccatgt tttcgctgca ctcgccgagt tcgagcgcgg 4980 cctgatccgg gagcgaaccc gggcagggct ggatgcagct cgcgcccgtg gccgatccgg 5040 tggacgcaaa ccgaagctgg acgccaagca gatacgccac attaaggcgc tactacgtga 5100 cccgaatacc tgtgttgctg aactcgcccg tgactacggc gtgtcgagaa caactatcta 5160 taaacactgc ggtgtggttc tgccgcgtac agccgatgaa ggggcaatat gacaaaaaag 5220 acaacagcat tcgatgtatt cgagaaatgc gtccaagcag ttcaggctgg tgaactgatc 5280 gaatccgttt ctgcgaagga caaggaattc catttccaga actggtttca gaagcgcctc 5340 cagagcctgt cgatgcactt cgaggggtcg ggtcgcaaca cctacccgga cttctgcttg 5400 gtagagcaca ccgagggcta cgagatcaag ggtttggcat ggcctggccg cgagcgcgac 5460 tacgactcga acagccaagt gccgactggc tatcacaacg gccgtcaaat cttctacgtg 5520 ttcgggcgct accccgcaga cctgtctggc tatgccgatc agggcaacgg ccgcaggcag 5580 tacccggtgg ttgacctcgt ggtctgccac ggcgacttcc tcaacgccga tcacaactac 5640 gtccataaga acaagagcgt aaagggcttt ggcacctacg gcgacatcat gatccgcgac 5700 cggaagatgt acgtcgcgcc gacgccattt gcgctgaccg aaggcaccac tggcctgatg 5760 actttgatcc tgccggagaa cttcggcacc gatgaccgtt accaggtggt cggtaacctc 5820 actcgcgtcg aggcggaaac gctggtggtt ggctacaact ttgacctgcg cacgaacgag 5880 ctgagcgcag agcgcgtgcc caatcccaac gcaggcaccc agcaccgatt cgtggcctac 5940 cggctcaagg atcaagcgag caagcctgtc tccatgactg gcacccaggt gcagcccgac 6000 gagaacaacc tgccggacga cgaatgaaca ccatcaccga caagatcggg ttcgcttacc 6060 cggttgcagc gaccgcgctg gagtgcgact tcccgctggt cgaaatcagc cagatcgccg 6120 agcaggaaag ttggcgaaag gagatcaaca ggccgatcta ccacatccac aagtggtggg 6180 cgaccagact tgggtcggtg tttcgtggca ttacccttgg tgctttgagt cagcctggta 6240 ctgacctctg ggcgcagttc tacaaaacgc acgacctggc cggtaaggta gtgctcgatc 6300 ccttcatggg cagtggcacg acgcttggcg aggccgtcaa gctgggtgcc aaggccatcg 6360 gctgcgacat caacccagtc agtaccttcc tcgtacgtca ggcgttcacg ccggcgtccg 6420 aggcagagct gcgtgccgct ttcgagcggc tggaacgtga cgtggcaccg gagattcggc 6480 gctactacca gacgcgcgat cctaagacgg gcgagctgat tcaggtcttg tactacttct 6540 gggtcaagac ggtgacgacg cccgagggcg aggtaatccc cttgctgtcg cgctacgtgt 6600 tttcacaaga cgcctacccg aagaagaagc cgcgagcgca gatcgtgtgc cctggctgct 6660 ggagtgtgct ggaggatcgc tacgatgcga ctgacctgca ctgccagcac tgcggccacc 6720 agttcaatcc gcaggaaggc ccggccgctg gtcagtacgt caaaaccaag ggcggtcacc 6780 gttaccgcat caaggaacta ctgccaaagg acggtacgcc gccctctcat cgaatgtacg 6840 cgatgatggc cttgcgagcg gatggatcga aggtctatct gccggtgcgg aatgaggact 6900 tggccctcta cgaggaagcc caagaacgcc ttgctacaga ggcactgccg ctgccgaaaa 6960 cctctgttcg acctggccac aacaccgacc aggcgcgcgg ctacaactac acccaatggc 7020 gcgacttctt caatgcgcgc caactgctgt gccttggcct gctgctgcgg gaaatcctga 7080 ccatcgacga cctggcagtg caagagcaga tgctgtgctt gttctccagc accttggagt 7140 tcaacaacct gttttgcagc ttcaagggtg agggaacagg ggccgtgcgg catatgttct 7200 cgaaccacat cctcaagcca gagcgcaccc cgctggagaa ctccgtgtgg ggcactggca 7260 agagcagcgg tacgtttagc acgttgttcg agtctcgcct gctacgtgcg aagcgctacc 7320 tcgatgagcc gttcgagatc gcgttcgagc atgaccagga cggtaaccgc gcaggctcgc 7380 gcaagacggt ggctagccat ccgatccgcg cccgtcgcgt cgaaacctgg ccggaattgg 7440 aggccgcaga tcatggcctg ctgatcctca acggtgacag ctcgaagctg ccggtgcccg 7500 ctggttcggt ggatgccgtg gtgactgatc cgccctactt cgacttcgtt cattactcgg 7560 agttgagcga cttctttttt gcttggctca cccctgtgct gcgccagcgc tatccgtgga 7620 tggcccgcga ggactcgtct gaccaagggg aggtgcagca caaagaccct cgtgtgttcg 7680 cccgtcagct tgcgtcggtg ttcacggagg cgtgccgcgt gcttaaggac gatggagtgt 7740 tggcgttcag cttccaccac tcgcgtgccg agggctgggc ggccatctat gaagcgatca 7800 acaaggcggg cctggccgta gttgcggctc accctgtcca tgccgagctg cgcgcggcaa 7860 gtcccaagac tgcggccaaa gacccgatca gccttgatgc gattctggtg tgtcgcaaaa 7920 aggcgtttgc cctgcaccag tcgcctgcta tccaggatgt ccgccaggct gttgatgcgc 7980 tggcatcacg gctgcaagct gctggccttc gcatctcggc gggtgaccgc ttcgtgatcg 8040 gcgcagcgca aaccttgatt gcacgcgctg ctgatgacat gggcttcgac gagatcaagg 8100 ttgatcttga ggcaattcgg ctggccgtgg ggccaagggc tgcaacatca aaggctgcga 8160 gtgcgtggga tgacgatgtg cccttctgat tggctgcacg gccttgtcgg cgcatgcgtt 8220 ttgatggcag ccgctgcacg caagccgcgt ccctccgcgt aaagttcatt tatacgcaaa 8280 tacgtatttg cgtgatacaa taacgccata ttaatggagg tgcgtaaatg cggactattg 8340 ttgtggctag ccaaaaaggt ggcgtcggca agacaacgat tgcaggtcac ttgggtgtca 8400 tggccgagca gagcaaagag gggccagtgg cgctgatcga cacagaccca caaggctcgc 8460 tcgcgtcctg gtggaatgag cgaaccaatg aggcaccgct gtttgcacgg gtggaaatcg 8520 gcaagctgac cgagcacctt caggcattgt ccaagggtgg catcaagctg gccatcatcg 8580 acaccccgcc ctctgttacg gaaatgattc agcaggtgct ccgcaccgcc gacttggtac 8640 tgatccccac caggccgagt ccgcatgact tgcgcgcggt cggatctacc gtcgaactgg 8700 tggagaacgc aggcaagcga atgatcttcg tcatcaatgg ggcggcacct cgcgcgcgga 8760 tcgcgggtga ggctgccgtg gcgctttcgc agcatggcac ggttgccccc gtgacgctgt 8820 accagcgcac cgacttcgcc agctcgatga tcgacggccg caccgtccag gaaatcgacc 8880 ccaaggggcg gtcggccgaa gaaatcgggc agttgtggaa atacgtatct acacaactgc 8940 gtaaaatttg atataatacg tacatgcgta ttaatggaga tacgtaaatg gctaaaactg 9000 catctttgac tgccggcctg gtggccaaga aaggggaggc gtcccctgct acggttgtcg 9060 cggcacccca ggttcaacct atcgaagtga aggcatcggc gactggcggc ggccgggatt 9120 actacaaggc gttgaccgtc aagttggatc gtgaccgcta cgagagtctg aaaagcatgg 9180 gcgtgaagct ggacaagaag agccaggaaa tctttgtcga ggccctggat ttgtggatga 9240 agtcggccgc tggccagcaa cacgcctaag aggcccctat gcgttcagtg cgctctgccg 9300 tcgaactcgc caaggagttg gccgaaaaag ccaaggcccg ccgcctagcg gcggaaaaga 9360 acgagctggg acttgaaggc ccggcgcagg gcaacgccgg caccactccc agcccggtga 9420 aggttgcggc cgaagtggtg ggcgagcagc cggcacgacg caagggagcg ccgaaagggc 9480 cgcgtggcct gatgccggtg catcatccaa accgcgattt cttcttgtgc gatctgtttg 9540 actacgccct aaaggatgac ggcgtgagca tggaggcccc catcttcacc ttggcaacca 9600 ggccggacac ctctgtttgg cattgggaaa gcaaggatgg gacacgcgcc atcaccgtca 9660 cgccaagcgt gaaggggagg gccacgcagt ttgataagga tttacttatt tacgtagtta 9720 gccagatgac cgaggctatc aatcgcggtc ggcctgatgc gaacaatcga accgtgcgct 9780 ttcgcgtcta tgactacttg gtctcaacca acaagccgac tggcggcaag gagtaccagc 9840 gactggagga tgccctagac aggctgcggg gtacatcgat caagacgaac atcaagacgg 9900 gtggccagcg tgtgaaggaa ggcttcggca tcgtcgatag ctggacgatc atcgagaagg 9960 cccccgacga tgaccgcatg attgccgtcg aggtcacgct ctccaagtgg cttttcaatg 10020 cagtgcaggc ccacgaggtt ctgaccatca acccggacta tttccggctg cgtaagccaa 10080 ttgagcgccg tttgtacgag ctggccagga agcactgtgg cgaccaggcc ttttttgtga 10140 ttgggctgga actgttgcag gacaagtgcg gcagcaagtc ggcactgttc gagttccgcc 10200 gtgccttgcg cgagatcatc aaggccgaca ccttgccaga ctaccgcatg acgcttgatg 10260 acgagaaaga ccaggtgatt ttctacaccc gcgacacgaa gaagctagcg gcgtctaccg 10320 ctctggcccg gcgcttccag tgacgcccaa agtattgacg gtcaatactt cgttatttca 10380 cccatgcggt gttaccgctg cgtgttggac gttcccttga cctagcggcc gaggcagggc 10440 tttcgcgctt tgcattgagc caccaagtgc gtctcgctcc ttcgagcatc aagccctaac 10500 gcgtttcatg tcactttcgc gcacgaaagt cgaggcaaga ggcttgatcg tgtctatcgt 10560 tacatcaccc atgcctgtgg atggacacgt tacatcaccc atgttttctg tggatgggca 10620 cgttacatca 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8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-S100A7-142L <400> 8 ggcttggctt ctcaatcttg tcat 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-RNASE7-U <400> 9 gagtcacagc acgaagacca agc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H-RNASE7-L <400> 10 agcagcagaa gggggcagaa 20

Claims (21)

1. 하기 현탁액의 박테리아가 베타프로테오박테리아 (Betaproteobacteria) 목, 네이세리아시애 (Neisseriaceae) 아과에 속하는 비병원성 그램-음성 박테리아인 것을 특징으로 하고, 상기 박테리아의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아의 현탁액으로부터 획득된 박테리아 추출물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 박테리아는 서열번호 2의 서열, 또는 상기 서열번호 2의 서열과 적어도 80%의 일치도를 가지는 서열이라면 모두를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 박테리아는 CNCM 기관에 2010년 4월 8일자로 기탁번호 제 I-4290호 하에 기탁된 박테리아, 또는 상기 박테리아의 돌연변이체라면 모두인 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
   세포내 구성성분들을 제거하는 방식으로 상기 박테리아 현탁액의 처리 이후에 획득되는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 세포내 성분들은 적어도 핵산들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
   적어도 막 단백질들, 세포질 주변 단백질들 및 편모로부터 나온 단백질들을 포함하는 분획 E0를 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 막 단백질들은 포린들, Omp A, 지질다당류들 및/또는 지질단백질들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
8. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
   적어도 분비 펩타이드들 및 단백질들 또한 이차 대사물들을 포함하는 분획 S0를 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
9. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
   적어도 분획 E0 및 분획 S0를 포함하는 분획 ES0를 포함하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 분획 ES0는 각각 30 kDa 및 36 kDa, 41 kDa 및 45 kDa, 또한 47 kDa 및 51 kDa 사이 범위의 분자량들에 해당하는 세 개의 기본 밴드들을 포함하는, SDS-PAGE에 의해 획득된 단백질 프로파일을 가지는 것을 특징으로 하는, 박테리아 추출물.
11. TLR2, TLR4 및 TLR5의 활성인자로서, 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아 및/또는 제 1항 내지 제 7항 및 제 9항 내지 제 10항의 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물의 용도.
12. 항상성에 대한 Th1 반응들을 회복하기 위한, 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아 및/또는 제 1항 내지 제 7항 및 제 9항 내지 제 10항의 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물의 용도.
13. 항상성에 대한 Th2 반응들을 회복하기 위한, 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아 및/또는 제 1항 내지 제 7항 및 제 9항 내지 제 10항의 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물의 용도.
14. 항상성에 대한 Th17 반응들을 회복하기 위한, 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아 및/또는 제 4항 내지 제 8항 및 제 11항의 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물의 용도.
15. PAR2 길항제로서, 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아 및/또는 제 8항 내지 제 10항의 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물의 용도.
16. 위창자 및 구강의 염증성 질환들의 치료 및/또는 예방을 목적으로 하는 조성물의 제조를 위한, 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아 및/또는 제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물의 용도.
17. 제 16항에 있어서,
    상기 위창자 및 구강의 염증성 질환들은 크론병, 장염, 과민성 대장 증후군 또는 치주염으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 용도.
18. 적어도 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 박테리아 및/또는 적어도 하나의 제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 따른 박테리아 추출물을 활성 성분으로서 포함하는, 조성물.
19. 제 18항에 있어서,
    위창자 및 구장의 염증성 질환들의 치료를 위한, 조성물.
20. 제 19항에 있어서,
    상기 위창자 및 구강의 염증성 질환들은 크론병, 장염 또는 치주염으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
21. 제 18항 내지 제 20항의 어느 한 항에 있어서,
    상기에 더하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.

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