KR20140103898A - 유기 분자의 정제를 위한, 표면 위에 지방족 유니트를 포함하는 흡착제 - Google Patents

유기 분자의 정제를 위한, 표면 위에 지방족 유니트를 포함하는 흡착제 Download PDF

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마르커스 아헨트
브욘 디겔
토마스 슈바르츠
게르하르트 스툼
마르틴 벨터
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Abstract

본 발명은 화학식(I)의 잔기를 포함하는 표면을 갖는 고체 지지체 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 상기 잔기는 단일 공유결합을 통하여 벌크 고체 지지체 물질 자체 또는 고체 지지체 물질의 표면상의 폴리머 필름의 표면상의 작용기에 부착된다. 또한, 본 발명은 유기 분자, 특히 약제학적 활성 화합물의 정제, 바람직하게는 크로마토그라피 적용 분야에서의 정제를 위한, 본 발명에 따르는 흡착제의 용도에 관한 것이다.

Description

유기 분자의 정제를 위한, 표면 위에 지방족 유니트를 포함하는 흡착제{SORBENT COMPRISING ON ITS SURFACE AN ALIPHATIC UNIT FOR THE PURIFICATION OF ORGANIC MOLECULES}
본 발명은 화학식(I)의 잔기를 포함하는 표면을 갖는 고체 지지체 물질을 포함하는 흡착제에 관한 것으로, 여기서 상기 잔기는 벌크 고체 지지체 물질 자체 또는 상기 고체 지지체 물질 표면상의 폴리머 필름의 표면 위의 작용기에 단일 공유결합을 통하여 부착되어 있다. 또한, 본 발명은 유기 분자, 특히 약제학적 활성 화합물을 정제, 바람직하게는 크로마토그라피 적용을 통한 정제에 있어서, 본 발명에 따르는 흡착제의 용도에 관한 것이다.
유기 분자 및 생물분자용 크로마토그라피 매질은 전통적으로 하기와 같은 샘플과의 가능한 상호반응 방식 중 하나 이상에 따라서 카테고리화되어있다:
- 소수성 상호반응 (역상: reversed phase)
- 친수성 상호반응 (정상: normal phase)
- 양이온 교환
- 음이온 교환
- 크기 배제
- 금속 이온 킬레이트화.
식물 추출물 또는 동물에서의 발견에 의해, 또는 화학적 합성에 의한 신규 화학적 화합물의 공급은 항상 새로운 크로마토그라피 소재의 공급, 공지되어 있는 크로마토그라피 소재의 추가적인 개발 또는 단순하고 비용-효과적인 화학적 화합물의 정제를 위한 새로운 방법의 발견을 필요로 한다. 즉, 필요로 하는 액체의 용적을 동일한 인수로 업-스케일하지 않고 대용량을 취급할 수 있는 고도로 선택적인 새로운 하류(downstream) 정제 기술이 항상 요구되고 있다.
제시된 분리 문제에 대한 상기 크로마토그라피 카테고리의 전통적인 단계식 적용은 생성물 순도의 단계적이고, 안정한 개선에 있어서는 반영되지만, 작업 시간 및 제품의 단가에 대해서는 언급하지 않고, 최종적으로는 심각하게 축적되는 모든 단계에서의 생성물 소실에도 반영된다. 일련의 연속적인 크로마토그라피 단계를 단 하나로 단축시키는 것이 여러번에 걸쳐서 증명될 수 있기 때문에 하류 공정에 초기 단계에서 친화성 크로마토그라피를 도입시키는 것이 이런 요구에 대한 정답일 수 있다. 친화성 크로마토그라피는 때때로 그 자체 부류로 간주되지만, 화학적 관점에서, 이는 상기한 바와 동일한 상호반응 방식을 기본으로 하나, 통상적으로는 2종 이상의 방식의 조합을 기본으로 한다. 친화성 크로마토그라피를 사용함으로써 분석물과 흡착제간의 특이적 상호반응이 분석물과 크로마토그라피 물질의 매트릭스 표면상에 결합되어 있는 활성 잔기 사이와, 분석물과 매트릭스 자체의 표면 특징 사이 모두에서 검증될 수 있다.
친화성 크로마토그라피는 대부분 벌크 겔-상 수지를 사용하여 수행되었다. 탁월한 겔 형성 물질은 매질-가교결합된 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드, 및 폴리(에틸렌)옥사이드이다. 그러한 하이드로겔은 흔히 이들의 연성 (입체 유연성, 탄성 모듈러스), 거대한 기공(pore) 시스템, 높은 극성 및 높은 수분함량, 뿐만 아니라 반응성 또는 변성 화학 그룹의 부재로 인하여 리간드의 활성 잔기와 이들과 상호반응하는 분석물을 모두 수용할 수 있다. 이들은 단백질과 같은 분석물을 이들의 천연 상태로 유지, 즉 이들의 정확하게 폴딩된, 3차원 구조, 연합 상태, 및 기능적 통합성(functional integrity)을 보존하거나, 복합 약제학적 활성 화합물의 구조를 화학적으로 변화시키지 않는다. 그러나, 이들 매질이 인가된 압력하에서 압축될 수 있고 교반, 컬럼 패킹 또는 높은 액체 유속에 의해 유발된 전단 스트레스를 견디지 못하기 때문에 이들의 기계적 내성은 무기 지지체 물질의 기계적 내성보다 훨씬 더 약하다. 그러므로, 거친 HPLC 가공 조건과 완전히 화합할 수 있는 친화성 흡착제가 드물다.
최근 지난 몇년 사이 정지상의 기계적 내성은 흡착제 지지체의 벌크 특성인 반면, 정지상과 이동상 간의 계면에서의 박층만이 물질 교환과 생물학적 분석물과의 상호반응에 관련 있는 것으로 인식되었다. 그러므로, 기계적으로 매우 경직성이며 치수적으로 안정한 다공성 3차원 코어와, 분석물을 결합시키기 위한 활성 잔기를 포함하는 겔-유사 계면층을 합하는 개념이 제기되었으며, 관련한 합성적 문제점이 기술적으로 해결되었다. 그러한 하이브리드 물질은 무기 산화물 또는 극성이 낮은 조밀하게 가교결합된 폴리머 기재상에, 극성이 높은 느슨하게 가교결합된 폴리머를 이용한다.
본 발명의 목적은 기계적 스트레스에 대해서 또는 용출제의 용해 특성면에서 물질의 높은 안정성이 요구되는 크로마토그라피 적용 분야에 사용될 때에도, 유기 분자의 단순하고 비용-효과적인 정제를 가능케 하는 크로마토그라피 적용 분야용 신규 흡착제를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 잔기를 포함하는 표면을 갖는, 고체 지지체 물질을 포함하는 흡착제를 제공한다:
[화학식 1]
……L―X (I)
여기서 상기 잔기는 고체 지지체 물질이 폴리머성 필름을 포함하는지 안하는지에 따라서, 화학식(I)에서 점선으로 표시된 단일 공유 결합을 통하여 벌크 고체 지지체 물질 자체 또는 고체 지지체 물질 표면 위의 폴리머 필름의 표면상의 작용기에 부착되며;
상기 식에서 사용되는 기호와 표시는 하기 의미를 갖는다:
L은 단일 공유결합을 나타내거나 -C(O)-, -S(O)2-, -CH2CH(OH)- 및 -C(O)NH-로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 유니트이고;
X는 탄소수가 1 내지 30인 1가 직쇄 지방족 탄화수소기 또는 탄소수가 3 내지 30인 분지된 또는 환식 지방족 탄화수소기를 나타내며;
여기서
상기 기 중의 CH2-잔기 1개 이상, 바람직하게는 1개가 O, S, -S(O)2-, -C(O)NH- 또는 -C(S)NH-로 치환될 수 있고;
수소 원자 1개 이상이 F, Cl, Br, -CN 또는 -NC로 치환될 수 있으며;
상기 기는 2개의 탄소 원자 사이에 이중결합을 1개 이상 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 하나의 실시양태로, 화학식(I)에 따르는 잔기가 고체 지지체 물질의 표면 위의 폴리머 필름의 작용기에 단일 공유결합을 통하여 부착되는 것이 바람직하다.
탄소수가 1 내지 30인 1가의 직쇄 지방족 탄화수소기 또는 탄소수가 3 내지 30인 분지된 또는 환식 지방족 탄화수소기는 바람직하게는 하기 기 중 하나이다: 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 2급-부틸 (1-메틸프로필), 3-부틸, 이소-펜틸, n-펜틸, 3급-펜틸 (1,1-디메틸프로필), 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필 (네오펜틸), 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, n-헥실, 이소-헥실, 1,2-디메틸부틸, 1-에틸-1-메틸프로필, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,2,2-트리메틸프로필, 1-에틸부틸, 1-메틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, n-헵틸, n-옥틸, n-노릴, n-데실, n-운데실, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, 1-헥실노닐, n-헥사데실, 1-헥실-데실, n-헵타데실, n-옥타데실, n-노나데실, -(CH2)20CH3, -(CH2)21CH3, -(CH2)22CH3, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 2-에틸헥실, 트리플루오르메틸, 펜타플루오르에틸, 2,2,2-트리플루오르에틸, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 사이클로펜테닐, 헥세닐, 사이클로헥세닐, 헵테닐, 사이클로헵테닐, 옥테닐 또는 사이클로옥테닐;
여기서,
상기 기 중의 CH2-잔기 1개 이상, 바람직하게는 1개가 수소 공여체 및/또는 수소 수용체 잔기가 있는 그룹, 예로서 O, S, -S(O)2-, -C(O)NH- 또는 -C(S)NH-로 치환될 수 있으며, 수소 원자 1개 이상이 F, Cl, Br, -CN 또는 -NC로 치환될 수 있고, 이때 F 및 -CN이 바람직하다.
X가 탄소수 1 내지 22인 1가 직쇄 지방족 탄화수소기, 또는 탄소수 3 내지 20인 1가 분지된 또는 환식 지방족 탄화수소기이며, 여기서
상기 기 중의 CH2-잔기 1개 이상, 바람직하게는 1개가 O, S, -S(O)2-, -C(O)NH- 또는 -C(S)NH-로 치환될 수 있고, 수소 원자 1개 이상이 F, Cl, Br, -CN 또는 -NC로 치환될 수 있고/있거나 상기 기가 2개의 탄소원자 사이에 이중결합을 1개 이상 포함할 수 있는 것이 바람직하다.
X가 각각 탄소수 1 내지 22 또는 3 내지 22인 직쇄 또는 분지된 지방족 탄화수소기인 것이 또한 바람직하며, 여기서 X가 탄소수 1 내지 22인 직쇄 지방족 탄화수소기인 것이 또한 바람직하다. 상기 언급한 바와 같이, 상기 기 중의 CH2-잔기 1개 이상, 바람직하게는 1개가 O, S, -S(O)2-, -C(O)NH- 또는 -C(S)NH-로 치환될 수 있으며, 수소 원자 1개 이상이 F, Cl, Br, -CN 또는 -NC로 치환될 수 있고, 이때 F 및 -CN이 더욱 바람직하다.
그러나, 상기 지방족 탄화수소기가 직쇄 또는 분지된 알킬인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에 따라서, 알킬은 헤테로원자를 갖지 않는다.
직쇄 알킬은 바람직하게는 C1-C22-알킬로, 이는 화학식 -(CH2)nCH3를 갖는 그룹을 의미하며, 여기서 n은 1 내지 22이며, n이 6 내지 15인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 8 내지 13이고, 가장 바람직하게는 11이다.
분지된 알킬은 바람직하게는 C3-C22-알킬로, 이는 추가의 탄소 원자 또는 L에 결합하는 3급 또는 4급 탄소 원자가 적어도 1개 존재하는 그룹을 의미한다.
분지된 C3-C22-알킬의 바람직한 예는 다음과 같다: 이소-프로필, 이소-부틸, 2급-부틸 (1-메틸프로필), 3급-부틸, 이소-펜틸, 3급-펜틸 (1,1-디메틸프로필), 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필 (네오펜틸), 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 이소-헥실, 1,2-디메틸부틸, 1-에틸-1-메틸프로필, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,2,2-트리메틸프로필, 1-에틸부틸, 1-메틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1-헥실노닐 및 1-헥실-데실.
지방족 탄화수소기중의 CH2-잔기 1개 이상이 O, S 또는 -S(O)2-로 치환될 경우, 모든 CH2-잔기 및 치환된 그룹과 함께 기준으로 하여, CH2-잔기의 최대 30 몰%가 1개 이상, 바람직하게는 1개의 이들 그룹으로 치환되는 것이 바람직하다. 이들 그룹의 바람직한 예는 다음과 같다: -(C1-C6-알킬렌)-Y-(C1-C15-알킬) 또는 -(C1-C6-알킬렌)-O-(CH2CH2O)h-(C1-C15-알킬), 여기서 Y는 O, S 또는 -S(O)2이고, C1-C6-알킬렌은 유니트 -(CH2)m-을 의미하며, 이때 m은 1 내지 6이고, C1-C15-알킬은 그룹 -(CH2)k-CH3을 의미하고, 이때 k는 1 내지 15이고, h는 1 내지 20이다.
상기 언급한 바와 같이, L은 단일 공유결합을 나타내거나 수소 공여체 및/또는 수소 수용체 잔기를 갖는 2가 유니트이다. 상기 2가 유니트가 바람직하게는 -C(O)-, -S(O)2-, -CH2CH(OH)- 및 -C(O)NH-로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 -C(O)-, -S(O)2- 및 -CH2CH(OH)-, 더더욱 바람직하게는 -C(O)- 및 -S(O)2-, 가장 바람직하게는 -C(O)-이다. L이 단일 공유결합을 나타내는 경우 상기 그룹 X는 고체 지지체 물질의 작용기에 직접 결합한다. L이 유니트 -C(O)-, -S(O)2-, -CH2CH(OH)- 및 -C(O)NH- 중 하나를 나타내는 경우, 자유 종결선(free ending line)을 갖는 첫번째 언급된 원자가 상기 위치에서 고체 지지체 물질에 연결되고 자유 종결선을 갖는 두번째 언급된 원자가 상기 위치에서 X에 연결되는 것이 바람직하다.
L과 X 중 적어도 하나가 수소 공여체 및/또는 수소 수용체 잔기를 포함하는 상기 언급된 그룹 중 1개를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 이는 본 발명에 따르는 흡착제의 표면이 한편에서는 수소결합을 통하여, 다른 한편으로는 X의 지방족 잔기에 의한 소수성 상호반응을 통하여 화합물을 결합시킬 가능성을 갖는다는 점에서 중요하다. 이는 구조내의 소수성 및 친수성 잔기 둘다 갖고 있는 화합물을 정제할 수 있도록 한다. 그러므로, L이 단일 공유결합을 나타내는 경우, 지방족 그룹 X의 CH2-잔기 중 적어도 1개가 수소 공여체 및/또는 수소 수용체 잔기를 갖는 그룹으로 치환되는 것이 바람직하다. L이 수소 공여체 및/또는 수소 수용체 잔기를 갖는 유니트 중 하나를 나타내는 경우, X는 직쇄 또는 분지된 알킬인 것이 바람직하다.
본 발명에 따르는 실시양태 중 하나로, L이 -C(O)-이고 X가 각각 탄소수가 1 내지 22 또는 3 내지 22인 직쇄 또는 분지된, 바람직하게는 직쇄인 지방족 탄화수소기인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 직쇄 C1-C22-알킬 또는 분지된 C3-C22-알킬, 추가로 바람직하게는 직쇄 C1-C22-알킬이고, 이때 C6-C15-알킬이 더욱더 바람직하며, C8-C13-알킬이 더더욱 바람직하고 C11-알킬이 가장 바람직하다.
하나의 실시양태로, 본 발명에 따르는 흡착제가 화학식(I)에 따르는 잔기만을 포함한다.
하나의 실시양태로, 본 발명의 흡착제가 화학식(I)에 따르는 다른 잔기일 수 있지만, 화학식(I)에 따르는 잔기와는 상이한 잔기, 예를 들어 방향족 또는 헤테로방향족기를 포함하는 잔기일 수도 있는 추가의 잔기를 포함할 수 있다.
고체 지지체 물질이 바람직하게는 거대다공성 물질이다. 고체 지지체 물질의 기공 크기는 바람직하게는 적어도 6 nm, 더욱 바람직하게는 10 내지 400 nm, 가장 바람직하게는 10 내지 250 nm이다. 상기 범위의 기공 크기는 정제 용량이 충분히 높도록 하는데 있어서 중요하다. 기공 크기가 상기 상한치를 넘을 경우, 표면상의 폴리머가 더 많이 가교-결합되어 유연성이 충분치 못한 폴리머가 된다. 결합기가 충분하게 정제시킬 화합물을 결합시키는데 중요한 위치에 이르지 못할 수 있을 것으로 생각된다. 기공 크기가 너무 작을 경우, 폴리머 필름이 기공을 커버/막을 수 있어 흡착제의 다공성 효과가 소실된다.
본 발명에 따르는 흡착제의 실시양태에 따라서, 고체 지지체 물질이 1 ㎡/g 내지 1000 ㎡/g, 더욱 바람직하게는 30 ㎡/g 내지 800 ㎡/g, 가장 바람직하게는 50 ㎡/g 내지 500 ㎡/g의 비표면적을 갖는다.
고체 지지체 물질이 30 내지 80 용적%의 다공도를 갖는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 40 내지 70 용적%, 가장 바람직하게는 50 내지 60 용적%의 다공도를 갖는다. 다공도는 DIN 66133에 따라서 수은 압입법(mercury intrusion)으로 측정할 수 있다. 상기 고체 지지체 물질의 기공 크기는 또한 DIN 66133에 따라서 수은 압입법을 사용하여 기공을 충전함으로써 측정할 수 있다. 상기 비표면적은 DIN 66132에 따라서 BET-방법을 사용하여 질소 흡착시킴으로써 측정할 수 있다.
고체 지지체 물질은 유기 폴리머성 물질 또는 무기 물질일 수 있다. 특히 본 발명에 따르는 흡착제가 1개 이상의 잔기를 포함하는 경우, 고체 지지체 물질이 무기 물질인 것이 바람직하다.
상기 고체 지지체 물질이 폴리머성 물질인 경우, 실질적으로 비-팽윤성이다. 그러한 이유로, 상기 폴리머성 물질이 높은 가교결합도를 갖는 것이 대개 바람직하다.
상기 폴리머성 물질이 폴리머성 물질중 가교결합가능한 그룹의 총수를 기준으로 하여, 바람직하게는 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 가장 바람직하게는 적어도 15% 가교결합된다. 바람직하게는, 폴리머성 물질의 가교결합도가 50%를 초과하지 않는다.
바람직하게는 상기 고체 지지체용 폴리머성 물질이 일반적인 또는 표면-개질된 폴리스티렌 (예, 폴리(스티렌-코-디비닐벤젠)), 폴리스티렌 술폰산, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알코올, 폴리사카라이드 (예로서, 전분, 셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 아밀로오스, 아가로오스, 세파로오스, 만난, 잔탄 및 덱스트란), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 가능하게 사용되는 폴리머성 물질은 가교결합이 수행되기 전에, 바람직하게는 10 내지 10000, 특히 바람직하게는 20 내지 5000, 매우 특히 바람직하게는 50 내지 2000개의 반복 유니트를 갖는다. 가교결합이 수행되기 전의 폴리머성 물질의 분자량 Mw는 바람직하게는 10000 내지 2000000 g/mol의 범위, 특히 바람직하게는 100000 내지 1500000 g/mol의 범위, 매우 특히 바람직하게는 200000 내지 1000000 g/mol의 범위를 갖는다. Mw의 측정은 예를 들어, 내부 표준물질로서 폴리스테렌을 사용하는 겔 투과 크로마토그라피(GPC)를 사용함으로써 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는 표준 기술에 따라서 수행될 수 있다.
상기 고체 지지체 물질이 무기 물질인 경우, 상기 무기 물질은 일부 종류의 무기 미네랄 산화물이며, 바람직하게는 실리카, 알루미나, 마그네시아, 티타니아, 지르코니아, 플루오로실, 마그네타이트, 제올라이트, 실리케이트 (셀라이트, 키젤거), 미카, 히드록시아파타이트, 플루오로아파타이트, 금속-유기 프레임워크(frameworks), 조절된 기공 유리 (예, 트리소펄(trisoperl))과 같은 세라믹 및 유리, 알루미늄, 실리콘, 철, 티탄, 구리, 은, 금과 같은 금속 및 또한 흑연 또는 무정형 탄소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 고체 지지체 물질이 폴리머성 물질이든 무기 물질이든 상관없이, 고체 지지체 물질은 불용성 지지체로서 작용하며 정지상과 이동상 간의 분할(partitioning) 공정을 위한 분자 기반(basis)으로서 분석물과의 상호반응 위치인 정지상과 이동상 간의 계면을 확대시키고, 기계적 강도와 연마성, 특히 유동 및/또는 가압 조건하에서의 기계적 강도와 연마성을 증가시키기 위한 분자 기반을 제공하는 최소의 강성(rigidity)과 경도(hardness)를 갖는 고체 기재(base)를 제공한다.
본 발명에 따르는 고체 지지체 물질은 동종성 또는 이종성 조성물일 수 있으며, 따라서 상기 언급한 물질 중 1종 이상의 조성물일 수 있는 물질, 특히 다중층 복합재를 포함한다.
상기 고체 지지체 물질이 입자 물질, 바람직하게는 입자 크기가 5 내지 500 ㎛인 입자 물질일 수 있다. 상기 고체 지지체 물질은 또한 멤브레인(membrane)과 같은 시트형- 또는 섬유형 물질일 수 있다. 따라서 고체 지지체 물질의 외부 표면은 평평하거나 (플레이트, 시트, 호일, 디스크, 슬라이드, 필터, 멤브레인, 편직 또는 부직포, 종이) 굴곡진 (오목하거나 볼록한 것: 스피어(spheres), 비드(beads), 그레인(grains), (중공)섬유, 튜브(tubes), 캐필러리(capillaries), 바이알(vials), 샘플 트레이 중 웰(wells)) 것일 수 있다.
상기 고체 지지체 물질의 내부 표면의 기공 구조는 그중에서도 특히, 규칙적이고 연속적인 모세관 채널로 이루어져 있거나 불규칙적인 (프랙탈: fractal) 기하학의 캐비티(cavities)로 이루어질 수 있다. 미시적으로는, 제조 방식에 따라, 연성이거나 거칠 수 있다. 기공 시스템은 전체 고체 지지체 물질을 통하여 연속적으로 연장되거나 (분지된) 캐비티에서 종결될 수 있다. 분석물의 이동상에서의 용매화(solvation)와 정지상의 표면상에서의 정체(retention) 간의 이의 계면 균형 속도 및 따라서 연속적인 유동 분리 시스템의 효율은 주로 고체 지지체 물질의 기공을 통한 확산을 통한 물질 전달에 의해, 따라서 이의 입자와 기공 크기의 특징적인 분포에 의해 결정된다. 기공 크기는 임의로 비대칭적인, 다중방식 및/또는 공간적으로 (예, 단면식으로) 불균질한 분포를 나타낼 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 고체 지지체 물질의 표면은 폴리머의 필름으로 덮여있는 것이 바람직하다. 상기 폴리머는 서로 공유결합에 의해 바람직하게 가교결합되어있는 개별적 쇄를 포함하거나 이들로 이루어져 있다. 또한, 상기 폴리머가 고체 지지체 물질의 표면에 공유결합식으로 결합되지 않은 것이 바람직하다. 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 특히 소수성 및 친수성 잔기를 둘다 갖고 있는 화합물의 정제에 있어서 폴리머가 소수성 및 친수성 (예를 들면, 수소 공여체 또는 수용체 상호반응) 잔기가 둘 다 정제할 화합물의 소수성 및 친수성 잔기와 접촉할 수 있도록 하는 배위가 되도록 하기에 충분히 유연한 것이 중요함을 발견하였다. 지지체 물질의 표면에 공유결합식으로 결합되는 폴리머 필름이 사용되는 경우, 본 발명의 발명자들은 정제 용량이 현격하게 감소됨을 발견하였다. 즉, 폴리머 필름으로서 비-표면 결합된 가교-결합된 폴리머가 3가지 장점을 갖는다: (1) 표면이 결합되지 않는다는 사실에 기인한 폴리머의 유연성; (2) 가교결합은 필름이 지지체 물질의 표면에 접착하여 소실되지 않도록 한다; (3) 폴리머가 폴리머에 공유결합에 의해 결합되지 않은 경우, 폴리머의 두께는 원하는 만큼 얇게 조절할 수 있다.
지지체 물질을 덮고 있는 폴리머가 친수성 폴리머인 것이 또한 바람직하다. 폴리머의 친수성 특성은 흡착제와 정제할 화합물간의 친수성 상호반응이 일어나도록 한다.
가교결합가능한 폴리머의 경우 바람직한 폴리머는 친수성기, 바람직하게는 측쇄에 친수성기를 포함하는 모노머로 조립된 것이 바람직하다. 바람직한 친수성기로는 -NH2, -NH-, -OH, -COOH, -OOCCH3, 무수물, -NHC(O)- 및 사카라이드가 있으며, -NH2 및 -OH가 더욱 바람직하며, -NH2가 가장 바람직하다.
코폴리머가 사용되는 경우, 바람직한 코모노머(co-monomers)는 단순 알켄 모노머 또는 비닐 피롤리돈과 같은 극성이며, 불활성인 모노머이다.
지지체 물질을 덮고 있는 폴리머의 예를 다음과 같다: 폴리아민, 예로서, 폴리비닐아민, 폴리에틸렌 이민, 폴리알릴아민, 폴리아민산 (예로서 폴리리신) 등, 뿐만 아니라 아미노기를 함유하는 것들을 제외한 작용성 폴리머, 예로서 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아세테이트, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 이들의 전구체 폴리머, 예로서 폴리(말레산 무수물), 폴리아미드, 또는 폴리사카라이드 (셀룰로오스, 덱스트란, 풀루란 등), 여기서 폴리비닐아민 및 폴리알릴아민과 같은 폴리아민이 더욱 바람직하며 폴리비닐아민이 가장 바람직하다.
탁월한 정제 용량에 있어서, 본 발명에 따르는 흡착제중 화학식(I)에 따르는 잔기 대 폴리머의 작용기의 양의 몰비 (유도체화도)가 바람직하게는 0.4 내지 0.8, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 0.7의 범위인 것이 또한 바람직하며, 여기서 화학식(I)에 따르는 잔기의 양은 원소분석법으로 측정하며 작용기의 양은 화학식(I)에 다르는 잔기를 인가하기 전에 흡착제의 적정법으로 측정한다.
또한, 본 발명에 따르는 흡착제는 흡착제의 전체 용적과 관련하여, 화학식(I)에 따르는 잔기를 바람직하게는 40 내지 240 μmol/㎖, 더욱 바람직하게는 70 내지 210 μmol/㎖의 범위로 함유하며, 여기서 상기 양은 원소분석법으로 측정한다.
본 발명에 따르는 흡착제의 자유 작용기의 양의 범위는 흡착제의 전체 용적과 관련하여, 5 내지 190 μmol/㎖이다. 상기 양은 적정법으로 측정한다. 1) 상기 몰비로부터 측정할 수 있는 자유 작용기의 양 및 화학식(I)에 따르는 잔기의 양과 2) 적정법으로 직접 측정한 값 사이의 불일치는 원소분석법 및 적정법을 통한 측정에서의 차이로 인한 것이다.
폴리머는 흡착, 증기상 침착, 액체, 가스 또는 플라즈마상으로부터의 중합반응, 스핀 코팅, 표면 축합, 습화(wetting), 침지(soaking), 딥핑(dipping), 러슁(rushing), 분무(spraying), 댐핑(damping), 증발, 전기장 또는 압력의 인가와 같은 자연적인 구동력하에서 일어날 수 있거나 조작하여 강제로 일어날 수 있는, 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는 모든 코팅 수단, 뿐만 아니라 예를 들어, 액체 결정, 랭뮤어 블로젯(Langmuir Blodgett)- 또는 층대층(layer-by-layer) 필름 형성법과 같은 분자의 자가-조립을 기본으로 하는 방법에 의해 거대다공성 지지체에 도포될 수 있다. 이에 따라 상기 폴리머는 단층으로 또는 다중층으로 또는 서로의 상부 위에 각각의 단층의 단계적 순서로서 직접 코팅될 수 있다. 본 발명에서는 상기 폴리머가 지지체 물질에 코팅되어 비-가교결합된 폴리머가 수용액중의 지지체 물질에 제공된 다음 가교-결합되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르는 흡착제에서 지지체 물질을 덮고 있는 폴리머의 중량 대 지지체 물질의 중량의 비율의 범위가 바람직하게는 0.005 내지 0.15, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.08이다. 상기 비율이 상한치보다 높을 경우, 폴리머 필름이 너무 두껍고 지지체 물질의 기공이 완전히 덮어져서 흡착제에 이용가능한 기공이 없게 된다. 상기 비율이 하한치보다 낮을 경우, 폴리머의 양이 전체 지지체 물질을 덮기에 충분치 못하다. 또한, 후자의 경우, 더 많은 양의 가교결합제가 사용되어야만 지지체 물질에 폴리머를 고정시키게 되어, 폴리머 필름의 유연성이 충분치 못하게 된다.
본 발명에 따르는 흡착제의 바람직한 실시양태에 따라서, 상기 가교결합된 폴리머의 가교결합도는 가교결합된 폴리머중의 가교결합가능한 기의 총수를 기준으로 적어도 2%이다. 더욱 바람직하게는, 가교결합도가 가교결합된 폴리머중의 가교결합가능한 기의 총수를 기준으로 5 내지 50%, 더욱 바람직하게는 5 내지 30%, 가장 바람직하게는 10 내지 20%이다. 가교결합도는 사용되는 가교결합제의 화학양론적 양에 의해 용이하게 조절될 수 있다. 거의 100 몰%의 가교결합제가 반응하여 가교결합을 형성하는 것으로 추정된다. 이는 분석 방법에 의해 변형될 수 있다. 가교결합도는 MAS-NMR 분광학 및 폴리머의 양과 관련하여 가교결합제의 양을 정량적 측정함으로써 측정될 수 있다. 이 방법이 가장 바람직하다. 가교결합도는 또한 보정 곡선을 사용하여 예를 들어 C-O-C 또는 OH 진동값을 기준으로 하는 IR 분광학으로 측정할 수 있다. 두 방법 모두 당해 분야의 숙련가에게 표준 분석 방법이다. 가교결합도가 상한치보다 높을 경우 폴리머 필름의 유연성이 충분치 못하여 정제 용량이 떨어지게 된다. 가교결합도가 상기 언급된 한계치보다 낮을 경우 필름이 지지체 물질의 표면에서 충분하게 안정하지 못하게 된다.
폴리머를 가교결합시키는데 사용되는 가교결합제가 바람직하게는 디카르복실산, 디아민, 디올, 우레아 및 비스-에폭사이드, 더욱 바람직하게는 디카르복실산 및 비스-에폭사이드, 예로서 에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르, 테레프탈산, 비페닐 디카르복실산 및 1,12-비스-(5-노르보르넨-2,3-디카르복스이미도)-데칸디카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르이 가장 바람직하다. 하나의 실시양태로 적어도 1종의 가교결합제는 원자수가 4 내지 20인 길이를 갖는 선형이고, 구조적으로 유연한 분자이다.
사용되는 폴리머의 바람직한 분자량 범위는, 이로 제한되는 것은 아니나, 5000 내지 50000 g/mol이며, 이는 폴리비닐아민에 대해 특히 맞는다. 분자량이 상기 제시된 범위의 하한치 근처인 폴리머는 더 좁은 기공을 갖는 담체라도 침투하는 것으로 밝혀졌으며 결과적으로 표면적이 높아 결과적으로 물질 운반 동력학, 분해능(resolution) 및 결합 능력이 양호한 고체 상태 물질이 본 발명의 흡착제에 사용될 수 있다.
추가의 실시양태에 따라서, 가교결합된 폴리머가 작용기, 즉, 상기 언급된 친수성기를 포함한다.
용어 "작용기"는 고체 지지체 물질의 표면에 가교결합된 폴리머 또는 고체 지지체 물질의 표면상에서 폴리머 필름의 제조중 가교결합성 폴리머에 속하는 임의의 단순하고, 별개인 화학 잔기를 의미한다. 이에 따라, 작용기는 화학적 부착점 또는 앵커(anchor)로서 작용할 수 있다. 작용기가 바람직하게는 적어도 1개의 약한 결합 및/또는 1개의 헤테로원자, 바람직하게는 친핵체 또는 친전자체로 행동하는 기를 함유한다.
화학식(I)의 잔기가 이들 기에 결합되기 전에 취해진 경우 바람직한 작용기는 1급 및 2급 아미노, 히드록실, 및 카르복실산 또는 에스테르기이다. 잔기가 작용기에 결합되어 있는 경우, 이들 기의 특성이 결합된 잔기의 구조에 따라 변화된다.
본 발명은 또한 흡착제, 바람직하게는 본 발명에 따르는 흡착제의 제조 방법에 관한 것으로, 이 방법은:
(i) 작용기를 갖는 폴리머를 제공하는 단계;
(ii) 담체의 표면위에 상기 폴리머의 필름을 흡착시키는 단계;
(iii) 상기 흡착된 폴리머의 상기 작용기의 구획된 영역을 적어도 1종의 가교결합제와 가교결합시키는 단계;
(iv) 상기 가교결합된 폴리머의 작용기의 구획된 영역을 화학식(I)에 따르는 잔기 1종 이상으로 유도체화시키는 단계를 포함한다.
담체의 표면위에 흡착시킬 폴리머를 수성 매질에 용해시키는 것이 바람직하며 상기 매질의 pH는 폴리머를 용해시키거나 현탁시키기에 적합하도록 조절한다. 담체의 표면상에 폴리머를 흡착시키는 것은 폴리머를 함유하는 용액 또는 현탁액에 담체를 딥핑(dipping)시켜 수행하는 것이 바람직하다. 이어서 상기 혼합물을 진탕시켜 성분들이 완전히 혼합되도록 하는 것이 바람직하다. 모세관력은 담체의 기공이 상기 용액 또는 현탁액으로 침지되도록 한다. 이후, 40 내지 60℃ 범위의 온도의 진공하에서 물을 증발시키는 것이 바람직하며, 이에 의해 폴리머가 기공의 벽에 필름의 형태로 침착된다. 이어서, 코팅된 물질을 유기 용매, 예로서 이소프로판올 또는 디메틸포름아미드(DMF)에 바람직하게 현탁시키고, 가교결합제, 예로서 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르를 사용하여, 바람직하게는 25 내지 60℃ 범위의 온도에서 4 내지 8시간 동안 가교결합시키는 것이 바람직하다.
작용기의 종류에 따라서 그리고 화학식(I)에 따르는 잔기에 따라서 고체 지지체의 상이한 유도체화 전략을 사용할 수 있다. 고체 지지체 물질이 작용기로서 아미노기를 함유할 경우, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 프로필포스폰산 무수물(T3P) 등과 같은 커플링제를 사용하거나, 이소시아네이트, 에폭사이드 또는 무수물과 같은 시약중의 반응성기를 사용하는 펩타이드 화학을 통한 카르복실산 탄소 원자를 통하여 아민 질소 원자에 카르복실산기를 함유하는 잔기를 부착시킬 수 있다. 고체 지지체 물질이 아미노기를 함유하는 경우, 화학식(I)에 따르는 잔기의 지방족 탄소 원자를 친핵성 지방족 치환을 통하여 아민 질소 원자에 결합시킬 수 있다.
고체 지지체 물질이 히드록시기를 함유하는 경우, 작용기에 부착되기 전에 카르복실산을 함유하는 화학식(I)에 따르는 잔기는 카르복실산 클로라이드 또는 카르복실산기의 에스테르를 사용하여 카르복실산 탄소 원자를 통하여 히드록실기의 산소 원자에 부착시킬 수 있다. 고체 지지체 물질이 히드록시를 함유하는 경우, 화학식(I)에 따르는 잔기의 지방족 탄소 원자는 친핵성 지방족 치환을 통하여 히드록시기의 산소 원자에 결합될 수 있다.
유기 합성 분야에서의 숙련가는 본 발명에 따르는 흡착제를 수득하기 위한, 지지체의 작용기와 화학식(I)에 따르는 잔기의 전구체 화합물간의 가능한 반응을 알고 있다.
본 발명의 흡착제는 유기 분자 (유기 화합물)의 정제 또는 특정의 유기 분자로부터 용액의 정제에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 또한 유기 분자, 펩타이드의 정제 또는 유기 분자로부터 용액의 정제를 위한, 본 발명에 따르는 흡착제의 용도에 관한 것이다.
용어 "유기 분자"는 저분자량의 유기 화합물 뿐만 아니라, 펩타이드 및 효소와 같은 생물분자를 포함할 수 있다.
용어 "정제"는 유기 분자를 함유하는 혼합물로부터 유기 분자의 분리, 또는 농도 및/또는 순도의 증가를 포함하는 것으로 언급된다.
다시 말해서 본 발명은 또한 본 발명의 흡착제를 사용하여 용액으로부터 유기 분자의 정제 방법에 관한 것으로 이는 원치않는 유기 분자를 분리하는 것을 또한 포함한다.
유기 분자의 정제를 위한 본 발명에 따르는 흡착제의 용도 또는 본 발명에 따르는 흡착제를 사용하여 용액으로부터 유기 분자를 정제하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 액체중에 용해시키거나 현탁시킬 유기 분자를 포함하는 조 혼합물을 본 발명에 따르는 흡착제 또는 본 발명의 방법에 따라서 제조된 흡착제를 함유하는 크로마토그라피 컬럼에 인가하는 단계;
(ii) 용출제를 사용하여 상기 컬럼으로부터 유기 분자를 용출시키는 단계.
상기 단계 (ii)에서 사용되는 용출제는 단계 (i)에서 액체용으로 사용되는 용매와 동일할 수 있지만, 유기 분자의 정제에 있어서 필수적인 조건에 따라 상이할 수도 있다. 단계 (i)에서 액체로서 또는 단계 (ii)에서 용출제로서 크로마토그라피 분야에 적용할 수 있는 모든 종류의 용매 또는 수성 완충 시스템이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 유기 용매, 특히 에틸 아세테이트 및 디크롤로메탄 등이 바람직하다.
본 발명의 흡착제에 의해 정제되는 유기 분자가 바람직하게는 약제학적 활성 화합물이다.
정제할 유기 분자가 바람직하게는 이의 분자내에 친수성 및 소수성 잔기를 갖는 화합물이다. 더욱 바람직하게는 유기 분자가 수소 공여체 또는 수소 수용체로 작용할 수 있는 소수성 탄화수소 잔기를 아래에 갖고 있는 화합물이다. 상기 유기 분자가 바람직하게는 -OH, -O- , -S- 및 -C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기를 1개 이상 갖고 있는 화합물이다.
상기 유기 분자의 분자량 범위는 바람직하게는 500 내지 200000 g/mol, 더욱 바람직하게는 500 내지 150000 g/mol, 가장 바람직하게는 500 내지 6000 g/mol이다.
본 발명의 용도/공법에 사용되는 유기 분자로서 특히 바람직한 것은 에베로리무스(everolimus) 또는 에베로리무스의 유도체이며, 더욱 바람직한 것은 하기 구조식을 갖는 에베로리무스이다:
Figure pct00001
또한, 본 발명에 따르는 흡착제는 용액으로부터 내독소를 분리하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 바와 같은 용어 "내독소"는 생화학적 물질의 부류를 언급한다. 내독소는 세균의 분해 산물로, 이는 인간에게서 다양한 생리학적 반응을 일으킬 수 있다. 내독소는 그램-네가티브 세균 또는 남조류(blue-green algae)의 외부 세포막(outer cell membrane, OM)의 성분이다. 화학적인 관점에서 내독소는 리포폴리사카라이드(LPS)로 이는 친수성 폴리사카라이드 성분과 친지성 지질 성분으로 이루어져 있다. 세균과는 대조적으로, 이들로부터 생긴 내독소는 열적으로 매우 안정하고 살균과정을 견딜 수 있다. 최근의 가장 감응성이 좋은 내독소 측정법은 리물루스 폴리페무스(limulus polyphemus)로부터 단리된 변형세포(amoebocytes)의 용해물에서의 응고 캐스케이드를 활성화시킴으로써 수행된다. 이 테스트는 소위 LAL-테스트로 일반적으로 알려져 있다.
본 발명에서는 부산물로부터 인슐린을 정제하기 위하여 본 발명에 따르는 흡착제를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 또한 튜브형 용개내에 정지상으로서 본 발명에 따르는 흡착제 또는 본 발명에 따르는 방법에 따라 제조된 흡착제와 임의의 추가 성분, 예로서 프리트(frits), 필터판, 유동 분배기, 씰(seals), 이음매(fittings), 스크류(screwings), 밸브(valves), 또는 기타 유체 취급 또는 연결 부재를 포함하는, 액체 크로마토그라피 또는 고체상 추출용 컬럼에 관한 것이다. 하나의 실시양태로, 상기 방법이 추가로, 20 바하(bar)까지 인가된 압력, 110℃까지 인가된 열, 뿐만 아니라 통상의 위생처리 프로토콜에 대한 물리적 및 화학적 내성이 있어, 1,000회 까지, 바람직하게는 5,000회 까지 반복적으로 사용할 수 있음을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 병행해서 가공될 수 있는, 마이크로플레이트 또는 마이크로칩 어레이, 또는 다중-모세관 또는 미세유동 장치 포맷의, 본 발명에 따르는 동일하거나 상이한 다수의 흡착제 또는 본 발명에 따르는 방법에 따라 제조된 흡착제의 콜렉션(collection)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 흡착제 또는 본 발명에 따르는 방법에 따라 제조된 흡착제 또는 본 발명에 따르는 컬럼 또는 본 발명에 따르는 흡착제 또는 컬럼의 콜렉션을 포함하며, 동일한 포장 유니트내에, 화학적 또는 생물학적 시약 및/또는 본 발명에 따르는 방법을 수행하는데 필수적인 일회용품들을 포함하는 진단 또는 실험실용 정제 키트 또는 이들과는 상이한 분석, 진단, 또는 실험 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 하기와 같은 실시양태에 관한 것이다:
(i) 본 발명에 따르는 흡착제를 사용하여 유기 분자를 정제하는 방법.
(ii) 상기 실시양태 (i)에 있어서, 유기 분자가 약제학적 활성 화합물인 방법.
(iii) 상기 실시양태 (i) 또는 (ii)에 있어서, 유기 분자의 분자량 범위가 500 내지 200000 g/mol인 방법.
(iv) 상기 실시양태 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나에 있어서, 유기 분자가 에베로리무스, 에베로리무스의 유도체, 인슐린, 인슐린의 유도체 및 내독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이들이 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다:
도 1: 실시예 2에 따르는 에베로리무스의 분획의 크로마토그램.
도 2: 조질 혼합물(연속선)과 비교한, 정제된 에베로리무스 (파선)의 분석적 크로마토그램.
도 3: 4-톨루엔 술폰산을 사용한 파괴 측정법(break-through measurement)(전단 분석)에 의해 아민기의 양을 측정하기 위한 샘플 곡선.
도 4: 실시예 3에서와 같이 생산된 본 발명에 따르는 흡착제에 의한 실시예 4에서의 방법에 따르는 인슐린과 이의 부산물인 데스아미도(Desamido)-인슐린-A21의 분획의 예비적 크로마토그램.
도 5: 실시예 4의 분리 방법에서 출발 혼합물로서 인가된 인슐린과 데스아미도-인슐린-A21의 조질 혼합물의 분석적 크로마토그램.
도 6: 실시예 4의 분리 방법으로 수득한 제1 분획의 분석적 크로마토그램.
도 7: 실시예 4의 분리 방법으로 수득한 제2 분획의 분석적 크로마토그램.
실시예:
분석 방법:
4-톨루엔 술폰산을 사용한 파괴 측정법(break-through measurement)에 의해 아민기의 양을 측정 (전단 분석: front analysis)(적정법):
각각의 흡착제를 치수가 33.5 x 4 mm (베드 용적 0.42 ㎖)인 컬럼에 패킹한다. 이어서 상기 충전된 컬럼을 다음과 같은 매질을 사용하여 1.0 ㎖/분의 유속으로 플러슁시킨다.
·5 ㎖의 물
·10 ㎖의 암모늄 아세테이트의 100 mM 수용액
·1 ㎖의 물
·10 ㎖의 트리플루오로아세트산의 100 mM 수용액
·10 ㎖의 물
기저선(base line)은 펌프와 UV-검출기가 있는 HPLC-장치를 통하여 물을 5분간 0.5 ㎖/분의 유속으로 펌핑시킨 후 상기 장치에서 검출한다. 이후 수중 4-톨루엔술폰산의 10 mM 용액을 펌핑시키는 한편, 용출제의 흡광치는 274 nm에서 검출된다. 흡광치는 수분내에 약 700 mAU의 수준으로 오르며 이 수준에서 일정하게 유지된다 (플러쉬-인 곡선). 25분 후 상기 컬럼을 펌프와 검출기 사이에 인가하고 10 mM의 4-톨루엔술폰산으로 0.5 ㎖/분의 유속으로 플러슁시킨다. 이어서 컬럼이 4-톨루엔술폰산과 결합하기 때문에 흡광치가 0 mAU로 떨어진다. 컬럼의 용량이 소진될 경우, 용출액의 흡광치가 대략 700 mAU의 출발 수준으로 다시 오른다.
4-톨루엔술폰산의 용량을 측정하기 위해서는 플러쉬-인 곡선의 수준 아래의 면적을 비교 면적으로 통합하여, 표면적과 4-톨루엔술폰산간의 관계를 수득할 수 있다. 상기 컬럼에 의해 흡수된 톨루엔 술폰산 용액의 면적 (파괴 면적)을 적정한 후, 장치의 용적과 컬럼의 데드(dead) 용적(0.5 ㎖)을 뺀다. 파괴 면적은 컬럼에 결합된 4-톨루엔 술폰산의 양을 바로 나타낸다. 이 양을 컬럼의 용적으로 나누면 흡착제 ㎖ 당 톨루엔 술폰산의 용량이 산출되며, 이에 따라 흡착제의 아민기의 양이 산출된다. 이 방법의 원활한 이해를 위하여 도 3에 그러한 예의 곡선이 제시되어 있다.
실시예 1: 하기 화학식: -C(O)-(CH2)10CH3 의 잔기를 포함하는 본 발명에 따르는 흡착제의 제조 방법:
폴리비닐아민의 수용액(300 g의 물 중 4.5 g, 트리플루오로아세트산(TFA)를 첨가하여 pH 8로 조절된 것)을 300 g의 Daisogel SP120 10 P에 제공하였다. 혼합물을 시브 진탕기상에서 5시간 동안 교반시키고 이후 50℃ 진공하에서 건조시켰다. 항량에 도달한 후 흡착제를 900 ㎖의 이소프로판올에 현탁시키고 50 ㎖ 중의 3.64 g의 에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르를 가하였다. 혼합물을 70℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 이후 흡착제를 여과하고 600 ㎖의 이소프로판올, 2400 ㎖의 수중 0.5M TFA, 600 ㎖의 물, 600 ㎖의 디메틸포름아미드(DMF), 1800 ㎖의 DMF 중 0.5M 트리에틸아민 및 600 ㎖의 DMF로 세척하였다.
적정법으로 측정할 수 있는 생성된 중간체의 아민기의 양은 약 144 μmol/㎖ 였다.
상기 흡착제를 900 ㎖의 DMF에 다시 현탁시키고 12.0 g의 라우르산, 22.8 g의 HBTU 및 8.4 ㎖의 트리에틸아민을 가하였다. 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반시키고 이후 여과하였다. 흡착제를 100 ㎖의 DMF, 300 ㎖의 DMF 중 0.5M TFA, 300 ㎖의 수중 0.5M TFA, 100 ㎖의 물, 100 ㎖의 DMF, 300 ㎖의 DMF 중 0.5M TEA, 100 ㎖의 물 및 200 ㎖의 메탄올로 세척하였다. 50℃ 진공하에서 건조시킨 후 흡착제는 사용할 준비가 된다.
생성된 흡착제는 적정법을 통하여 측정한 바, 약 15 μmol/㎖의 유리 아민기와, 원소분석법을 통하여 측정한 바, 약 85 μmol/㎖의 잔기 -C(O)-(CH2)10CH3 를 함유한다.
실시예 2: 실시예 1에서 제조된 흡착제를 사용한 에베로리무스의 정제:
실시예 1에서 제조된 흡착제를 25.4 x 250 mm 베드 크기를 갖는, 축방향으로 압축된 ModCol-컬럼에 충전하였다. 40 ㎖/분으로 에틸 아세테이트/디클로로메탄 1/1을 이동상으로 사용하여 1%의 샘플 부하량을 인가하였다. 필수적으로 80 내지 85 중량%의 에베로리무스와 15 내지 20 중량%의 라파마이신으로 이루어져 있는 조질 혼합물이 도 1에 따라서 분획화되었다. 도 2에는 조질 혼합물(연속선)과 비교된, 정제된 에베로리무스(파선)의 분석적 크로마토그램이 제시되어 있다. 상기 결과는 또한 하기 표 1에도 제시되어 있다:
[표 1]
표 1:
Figure pct00002
라파마이신은 주요 불순물이다. 분획 BT2 내지 BT7을 합할 때 에베로리무스가 99.18%의 순도와 73%의 수율로 수득될 수 있다.
유리 아민기를 5 μmol/㎖ 미만으로 포함하는, 실시예 1에 따라서 유사하게 제조된 흡착제로는 순도가 99%보다 훨씬 더 낮으며 수율도 70%보다 훨씬 더 낮게 에베로리무스를 수득하게 된다. 동일한 방식으로 유리 아민기를 190 μmol/㎖보다 더 포함하는 흡착제도 순도가 99%보다 훨씬 더 낮으며 수율도 70%보다 훨씬 더 낮게 에베로리무스를 수득하게 된다.
동일한 방식으로, 화학식(I)에 따르는 잔기 대 폴리머(유도체화 전)의 작용기의 양의 몰비가 0.4 미만이거나 0.8보다 큰 흡착제는 수득할 수 있는 에베로리무스의 순도와 수율면에서 20% 떨어진다. 상기 범위가 0.5 미만이거나, 0.7보다 큰 흡착제는 체류(the retention)가 너무 낮기 때문에, 수득할 수 있는 에베로리무스의 순도와 수율면에서 30% 이상 떨어진다.
실시예 3: 하기 화학식: -C(O)-(CH2)10CH3 의 잔기를 포함하는 본 발명에 따르는 흡착제의 제조 방법:
폴리비닐아민의 수용액 (400 g의 물 중 30 g, 염산(HCl)을 첨가하여 pH 8로 조절된 것)을 600 g의 Daisogel SP120 10 P에 제공하였다. 혼합물을 시브 진탕기상에서 6시간 동안 교반시키고 이후 50℃ 진공하에서 건조시켰다. 항량에 도달한 후 흡착제를 3000 ㎖의 이소프로판올에 현탁시키고 150 ㎖의 이소프로판올 중 12.1 g의 에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르를 가하였다. 혼합물을 55℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 이후 흡착제를 여과하고 3000 ㎖의 이소프로판올, 9000 ㎖의 수중 0.1M HCl, 3000 ㎖의 물 및 4500 ㎖의 메탄올로 세척하였다. 흡착제를 추후 사용할 때까지 건조 상태로 보관하였다.
적정법으로 측정할 수 있는 생성된 중간체의 아민기의 양은 약 316 μmol/㎖ 였다.
상기 흡착제 50 g을 300 ㎖의 디메틸렌 포름아미드 (DMF), 300 ㎖의 DMF 중 0.5M 트리에틸렌 아민 (TEA) 및 300 ㎖의 DMF로 다시 세척하였다. 최종적으로, 이를 150 ㎖의 DMF에 현탁시키고 5.0 g의 라우르산, 9.5 g의 HBTU 및 3.4 ㎖의 트리에틸아민을 가하였다. 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반시키고 이후 여과하였다. 흡착제를 300 ㎖의 DMF, 300 ㎖의 DMF 중 0.1M HCl, 300 ㎖의 수중 0.1M HCl, 300 ㎖의 물 및 300 ㎖의 메탄올로 세척하였다. 50℃ 진공하에서 건조시킨 후 흡착제는 사용할 준비가 된다.
생성된 흡착제는 적정법을 통하여 측정한 바, 약 173 μmol/㎖의 유리 아민기와, 원소분석법을 통하여 측정한 바, 약 202 μmol/㎖의 잔기 -C(O)-(CH2)10CH3 를 함유한다.
실시예 4: 실시예 3에서 제조된 흡착제를 사용한 인슐린의 정제:
인슐린과 주요 불순물로 데스아미도-인슐린-A21을 포함하는 조질(crude) 샘플 (3 mg/㎖ 물/아세토니트릴/트리플루오로아세트산 (95/5/0.1)을 4개 채널 저압 구배 펌프 (LPG 580, LPG 680 또는 LPG 3400), 자동 샘플러 (Gina 50, ASI-100 또는 WPS-300), 6개-채널 컬럼 스위치 밸브 (Besta), 컬럼 오븐 및 다이오드-어레이 UV 검출기 (UVD 170U, UVD 340S 또는 VWD 3400)으로 이루어진 Dionex HPLC 시스템을 사용하여 분리한다. 흡착제를 250x4 mm 스틸 컬럼에 충전하였다. 정제를 위하여 하기 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이 상이한 구배의 3종의 용출제를 사용하였다. 첫번째 용출제는 수중 10 mM NaKHPO4이고, 두번째 용출제는 수중 10 mM NaKHPO4/1M NaCl이며 세번째 용출제는 1-프로판올이다. 유속은 1 ㎖/분이었다. 주입 용적은 1 ㎖ 였다.
도 4에는 분획화 과정이 나타나 있다.
[표 2]
표 2: 3종의 상이한 용출제의 구배
Figure pct00003
도 4에는 실시예 3에 따르는 흡착제를 사용할 때 매우 양호한 분리가 수득될 수 있음이 제시되어 있다. 인슐린은 데스아미도-인슐린-A21보다 40분 이상 먼저 컬럼으로부터 용출된다. 즉, 본 발명에 따르는 흡착제상에서 데스아미도-인슐린-A21의 체류시간은 인슐린의 체류 시간과 비교할 때 매우 길다.
인슐린과 데스아미도-인슐린-A21의 조질(crude) 혼합물의 분석 크로마토그램은 실시예 4의 분리 방법에서 출발 혼합물로 인가되었다.
YMC Pack, Pro C18, 250 x 4.6 mm, 12 nm (이동상: 완충액 A: 100 ㎖ 아세토니트릴, 700 ㎖ 물, 200 ㎖ 황산염 완충액 pH 2.0 R, 완충액 B: 400 ㎖ 아세토니트릴, 400 ㎖ 물, 200 ㎖ 황산염 완충액 pH 2.0 R)을 사용하는 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같은 Pharmakopoe의 방법에 따른 분리의 분석에서는 상기 조질 혼합물에 대해 분석 크로마토그램에서 데스아미도-인슐린-A21이 30분 후에 용출되는 것으로 나타나 있다.
본 발명에 따르는 방법을 사용함으로써 첫번째 분획은 분석 크로마토그램에서 30분 후에 데스아미도-인슐린-A21이 용출되지 않는 것으로 나타났다 (도 6). 그러나, 본 발명에 따르는 방법의 두번째 분획의 크로마토그램은 데스아미도-인슐린-A21이 용출되는 것으로 나타났다 (도 7). 이런 분석결과는 데스아미도-인슐린-A21로부터 인슐린의 분리의 품질을 나타낸다.
화학식(I)에 따르는 잔기 대 폴리머(유도체화 전)의 작용기의 양의 몰비(유도체화도)가 0.4 미만인, 실시예 3에서와 유사하게 제조된 흡착제는 데스아미도-인슐린-A21의 좋지못한 체류로 인하여 인슐린과 데스아미도-인슐린-A21의 기저선 분리가 일어나지 못했다. 동일한 방식으로 유도체화도가 0.8 이상인 흡착제도 인슐린의 양호한 체류로 인하여 2가지 물질의 기저선 분리가 될 수 없다. 상기 비가 0.5 미만이거나 0.7보다 큰 흡착제는 상기 2가지 물질을 분리시키지만, 인슐린에 대한 수율이 50% 미만이었다.
동일한 방법으로 유리 아민기를 5 μmol/㎖ 내지 190 μmol/㎖ 포함하는 흡착제는 인슐린과 데스아미도-인슐린-A21의 기저선 분리를 일으키며, 유리 아민기를 5 μmol/㎖ 미만으로 또는 190 μmol/㎖보다 더 포함하는 흡착제는 인슐린과 데스아미도-인슐린-A21의 기저선 분리가 없는 것으로, 즉, 순수한 수율을 나타낸다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식(I)의 잔기를 포함하는 표면을 갖는 고체 지지체 물질을 포함하는 흡착제:
    ……L―X (I)
    여기서 상기 잔기는 고체 지지체 물질이 폴리머성 필름을 포함하는지 안하는지에 따라서, 화학식(I)에서 점선으로 표시된 단일 공유 결합을 통하여 벌크 고체 지지체 물질 자체 또는 고체 지지체 물질 표면 위의 폴리머 필름의 표면상의 작용기에 부착되며;
    상기 식에서 사용되는 기호와 표시는 하기 의미를 갖는다:
    L은 단일 공유결합을 나타내거나 -C(O)-, -S(O)2-, -CH2CH(OH)- 및 -C(O)NH-로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 유니트이고;
    X는 탄소수가 1 내지 30인 1가 직쇄 지방족 탄화수소기 또는 탄소수가 3 내지 30인 분지된 또는 환식 지방족 탄화수소기를 나타내며;
    여기서
    상기 기 중의 CH2-잔기 1개 이상은 O, S, -S(O)2-, -C(O)NH- 또는 -C(S)NH-로 치환될 수 있고;
    수소 원자 1개 이상이 F, Cl, Br, -CN 또는 -NC로 치환될 수 있으며;
    상기 기는 2개의 탄소 원자 사이에 이중결합을 1개 이상 포함할 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식(I)에 따르는 잔기가 고체 지지체 물질의 표면상의 폴리머 필름의 표면 위의 작용기에 부착되어 있는 흡착제.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, L이 -C(O)-, -S(O)2- 또는 -CH2CH(OH)- 인 흡착제.
  4. 제3항에 있어서, L이 -C(O)-인 흡착제.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, X가 직쇄 또는 분지된 알킬인 흡착제.
  6. 제5항에 있어서, X가 직쇄 C1-C22-알킬인 흡착제.
  7. 제6항에 있어서, X가 직쇄 C6-C15-알킬인 흡착제.
  8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 필름의 폴리머가 서로 공유결합에 의해 가교결합되어 있으나, 고체 지지체 물질의 표면에는 공유결합에 의해 결합되어 있지 않은 각각의 쇄를 포함하거나 이들로 이루어져 있는 것인 흡착제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리머가 친수성기를 포함하는 폴리머인 흡착제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리머가 폴리아민, 폴리비닐아민, 또는 폴리아민을 포함하는 코폴리머 또는 폴리머 블렌드인 흡착제.
  11. 유기 분자를 정제하기 위한, 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따르는 흡착제의 용도.
  12. 제11항에 있어서, 상기 유기 분자가 약제학적 활성 화합물인 용도.
  13. 제11항 또는 12항에 있어서, 상기 유기 분자가 친수성 잔기와 소수성 잔기를 둘 다 갖는 것인 용도.
  14. 제11항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 분자가 에베로리무스(everolimus), 에베로리무스의 유도체, 인슐린, 인슐린의 유도체 및 내독소(endotoxines)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
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