CN103974765A - 用于有机分子提纯、表面上具有脂族单元的吸附剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如通式(I)的残基，其中所述残基通过共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面的官能团或者本体固体支承材料本身表面上的官能团。而且，本发明涉及所述吸附剂的用途，优选在色谱应用方面，其用于有机分子尤其是药学活性化合物的提纯。

Description

用于有机分子提纯、表面上具有脂族单元的吸附剂
技术领域
本发明涉及一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如通式(I)的残基，其中所述残基通过共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面的官能团或者本体固体支承材料本身表面上的官能团。
而且，本发明涉及本发明的吸附剂的用途，优选在色谱应用方面，其用于有机分子尤其是药学活性化合物的提纯。
背景技术
根据以下一个或多个与样品可能的反应模式，对用于有机分子以及生物分子的色谱介质进行传统分类。
疏水性反应（反相）
亲水性反应（正相）
阳离子交换
阴离子交换
体积排阻
金属离子螯合
通过植物提取或动物性或化学合成等方式提供新化合物往往要求提供新色谱材料、现有色谱材料的进一步研发、或者简单廉价的化合物提纯新方法。即，一直需要高度选择性下游提纯新技术，其能够在相同条件下无需扩大所需液体容积而大规模地处理。
对于给定的分离问题以上类别色谱的传统步骤应用，得到的结果是每个阶段在产品纯度一步步地稳定提高的同时将导致产品损失，最后严重累积，更不用说操作时间和商品成本。将连续系列的顺序色谱步骤缩减为仅一个已经被多次证明，因此将前阶段的亲和色谱引入下游工艺中会解决这个问题。从化学的观点来看，尽管亲和色谱是基于上述的相同反应模式，但通常是基于两个以上的模式的组合，亲和色谱有时被视为它自身的类别。通过采用亲和色谱，在分析物和吸附剂之间的特定反应可以在分析物和结合于色谱材料基质表面上的活性残基之间、以及在分析物和上述基质自身表面特性之间得到证实。
亲和色谱大多数采用本体凝胶相树脂。优异的凝胶成型材料为中等交联多糖、聚丙烯酰胺、以及聚环氧乙烯。此类水凝胶一般确保相容性界面，由于其软度（变形挠性、弹性模数）、大孔体系、高极性、高含水量以及无反应性或者变性化学基团，所述界面能够很好地容纳所述配位体的活性残基和与之反应的分析物。它们能够保有分析物（诸如蛋白质）于其自然状态，即保持它们正确折叠三维结构、连接状态、以及功能整体性，或者不会以化学方式改变复杂药学活性化合物的结构。但是，由于在施加压力的情况下会被压缩并且不能耐受因搅拌、柱填充或高液流速率导致的剪切应力，这些介质的机械耐性要远弱于无机支承材料。因此，与剧烈的HPLC处理条件完全相容的亲和吸附剂是非常少的。
仅仅在不久之前，发现固定相的机械耐性是上述吸附剂支承体的主体性质，而仅仅是固定相和流动相之间界面上的薄层负责物质交换及与生物性分析物的反应。因此，结合了机械性能极硬和尺寸稳定性、多孔三维核以及生物相容、凝胶状界面层功能的概念被提出，上述凝胶状界面层运载上述活性残基用于结合上述分析物，并且相关的合成问题已经得到技术性解决。此类混合材料采用了在无机氧化物或紧密交联的低极性聚合物的基体上松散交联的高极性聚合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种色谱用新吸附剂，即使是在应用于考虑机械应力或洗脱剂的溶液性质的情况下需要高稳定性材料的色谱时，该吸附剂也能简单廉价地提纯有机分子。
因此，本发明提供一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如以下通式(I)的残基，
其中，取决于所述固体支承材料是否包括聚合物膜，所述残基通过通式(I)中虚线所示的共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面上的官能团或者本体固体支承材料本身表面上的官能团；并且
其中所用符号和参数具备以下含义：
L表示共价单键或选自由-C(O)-、-S(O)2-、-CH2CH(OH)-和-C(O)NH-组成的组中的二价单元，
X表示具有1到30个碳原子的单价直链脂肪烃基或具有3到30个碳原子的支链烃基或脂环烃基，
其中，
所述基团中的一个或多个，优选一个CH2-部分被O、S、-S(O)2-、-C(O)NH-或-C(S)NH-，
一个或多个氢原子可以由F、Cl、Br、-CN或-NC取代;以及
所述基团可以包括一个或多个位于两个碳原子间的双键。
根据本发明的一个实施方式，优选上述根据通式（I）的残基通过共价单键连接到上述固体支承材料表面的聚合物膜上的官能团。
具有1到30个碳原子的单价直链脂肪烃基或具有3到30个碳原子的支链烃基或脂环烃基优选为以下基团之一：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基(1-甲基丙基)、叔丁基、异戊基、正戊基、叔戊基(1,1-二甲基丙基)、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基(新戊基)、1-乙基丙基、2-甲基丁基、正己基、异己基、1,2-二甲基丁基、1-乙基-l-甲基丙基、l-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基丁基、1-甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、1-己基壬基、正十六烷基、1-己基-癸基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、-(CH2)20CH3、-(CH2)21CH3、-(CH2)22CH3、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、2-乙基己基、三氟甲基、五氟乙基、2,2,2-三氟乙基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、环戊烯基、己烯基、环己烯基、庚烯基、环庚烯基、辛烯基或环辛烯基，其中，
所述基团中的一个或多个、优选一个CH2-部分可以被具有氢供体和/或氢受体部分的如下基团取代，即，O、S、-S(O)2-、-C(O)NH-或-C(S)NH-，以及
其中一个或多个氢原子可以由F、Cl、Br、-CN或-NC取代，其中优选F和-CN。
优选X是具有1到22个碳原子的单价直链脂肪烃基或具有3到20个碳原子的单价直链烃基支链烃基或脂环烃基，其中，
所述基团中的一个或多个、优选一个CH2-部分可以被O、S、-S(O)2-、-C(O)NH-或-C(S)NH-取代；
一个或多个氢原子可以由F、Cl、Br、-CN或-NC取代；和/或
所述基团可以包括一个或多个位于两个碳原子间的双键。
更优选X是具有1到22个碳原子或3到22个碳原子的直链或支链脂肪烃基，其中更优选X是具有1到22个碳原子的直链脂肪烃基。如上所述，所述基团中的一个或多个、优选一个CH2-部分可以被O、S、-S(O)2-、-C(O)NH-或-C(S)NH-取代，并且，一个或多个氢原子可以由F、Cl、Br、-CN或-NC取代，更优选F和-CN。
但是更优选脂肪烃基是直链或支链烷基。根据本发明，烷基不含杂原子。
直链烷基优选C1-C22-烷基，意思是通式-(CH2)nCH3所示的基团，其中，n是1到22，其中优选n是6到15，更优选8到13，最优选11。
支链烷基优选为C3-C22-烷基，意思是其中至少存在一个叔碳原子或季碳原子的基团，其结合到其他碳原子或L上。
支链C3-C22-烷基的优选实例为：异丙基、异丁基、仲丁基(1-甲基丙基)、叔丁基、异戊基、叔戊基(1,1-二甲基丙基)、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基(新戊基)、1-乙基丙基、2-甲基丁基、异己基、1,2-二甲基丁基、1-乙基-l-甲基丙基、l-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基丁基、1-甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-己基壬基和1-己基-癸基。
如果脂肪烃基中的一个或多个CH2-部分被O、S、-S(O)2-取代，则优选相对于全部CH2-部分和所述取代基，最多30mol%的CH2-部分由此类基团中的一个或多个、优选一个所述基团取代。优选这些基团的实例为：-(C1-C6-亚烷基)-Y-(C1-C15-烷基)或-(C1-C6-亚烷基)-O-(CH2CH2O)h-(C1-C15-烷基)，其中Y为O或S或-S(O)2，(C1-C6-亚烷基)的意思是-(CH2)m-单元，其中m是1到6，C1-C15-烷基的意思是-(CH2)k-CH3，其中k是1到15，h是1到20。
如上所述，L代表一个共价单键或一个具有氢供体和/或氢受体部分的二价单元。所述二价单元优选选自由-C(O)-、-S(O)2-、-CH2CH(OH)-和-C(O)NH-组成的组中的二价单元，更优选-C(O)-、-S(O)2-和-CH2CH(OH)-，更为优选-C(O)-和-S(O)2-，最优选-C(O)-。如果L代表共价单键，则所述基团X直接结合到固体支承材料的所述官能团上。如果L代表-C(O)-、-S(O)2-、-CH2CH(OH)-和-C(O)NH-中的一个单元，优选首次提到的具有一个自由端线（free ending line）的原子于此位置连接到所述固体支承材料，第二次提到的具有一个自由端线（free ending line）的原子于此位置连接到X。
特别优选至少一个L和X包括一个如上所述的具有一个氢供体和/或氢受体部分的基团。从这个观点来看，重要的是本发明的吸附剂的表面具有与化合物结合的可能性，其一方面是通过氢键另一方面是通过采用X的脂族部分的疏水反应来实现的。这就确保了同时具有疏水性部分和亲水性部分的化合物可以被提纯。因此，如果L代表共价单键，则优选脂族基团X中的至少一个CH2-部分被具有氢供体和/或氢受体部分的基团取代。如果L代表具有氢供体和/或氢受体部分的单元中的一个，X优选是直链或支链烷基。
在本发明的吸附剂的一个实施方式中，优选L是-C(O)-且X是分别具有1到22个碳原子或3到22个碳原子的直链或支链，优选是直链脂肪烃基，更优选直链C1-C22-烷基或支链C3-C22-烷基，更优选直链C1-C22-烷基，其中更为优选C6-C15-烷基，C8-C13-烷基仍为更优选的，C11-烷基最优选。
在本发明的吸附剂的一个实施方式中，仅包括通式（I）的残基。
在本发明的吸附剂的一个实施方式中，所述吸附剂可以包括通式（I）所示的其他残基，但也可以包括不同于通式（I）所示的其他残基，例如可以是含有芳香基或杂芳基的残基。
固体支承材料优选为大孔材料。所述固体支承材料的孔径优选至少是6nm，更优选是10到400nm，并且最优选是10～250nm。孔径在此范围对于确保最够高的提纯能力是很重要的。如果孔径比上述上限高，则表面上的聚合物就需要越多地交联，导致聚合物不够柔韧。人们认为孔径处于这个范围对于确保足够高的提纯能力是重要的。如果所述孔径超出以上高限，在表面上的必定交联的聚合物越多，导致聚合物韧性不够。人们认为，所述结合基团可能无法进入到对于结合被充分提纯的化合物来说很重要的位置上。如果所述孔径太小，则聚合物膜将阻碍所述孔，并且所述吸附剂的孔隙效应丧失了。
本发明的吸附剂的一个实施方式，其中，所述固体支承材料具有1m2/g到1000m2/g，更优选30m2/g到800m2/g，以及最优选50m2/g到500m2/g的比表面积。
优选固体支承材料具有30到80%（按体积计），优选40到70%（按体积计），最优选50到60%（按体积计）的孔隙度。上述孔隙度是依照DIN66133通过压汞法来测定的。上述固体支承材料的孔径也可以利用依照DIN66133的压汞法通过孔填充来测定。上述比表面积可以利用依照DIN66132的BET法通过氮吸附来测定。
所述固体支承材料可为有机聚合物材料或无机材料。特别是如果本发明的吸附剂具有一个以上残基，则固体支承材料优选无机材料。
如果上述固体支承材料为聚合物材料，它基本是不膨胀的。出于这个原因，最优选所述聚合物材料具有高交联度。
上述聚合物材料，基于聚合物材料中的可交联基团的总量，优选至少5%，更优选至少10%以及最优选至少15%的程度进行交联。优选地，所述聚合物材料的交联度不超过50%。
优选用于所述固体支承材料的聚合物材料选自由普通或表面改性聚苯乙烯（例如，聚（苯乙烯-共-二乙烯基苯））、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、多糖（诸如淀粉、纤维素、纤维素酯、直链淀粉、琼脂糖、琼脂糖(凝胶)、甘露聚糖、黄原胶以及右旋糖酐）、以及其混合物组成的组。
本发明可用的聚合物材料，在所述交联实施前，优选具有10到10000，特别优选20到5000并且非常特别优选50到2000个重复单元。所述聚合物材料交联前的分子重量MW范围优选10000到2000000g/mol、特别优选100000到1500000g/mol、并且非常特别优选200000到1000000g/mol。根据现有标准技术通过利用凝胶渗透色谱（GPC）采用聚苯乙烯（例如）作为内标，可以进行MW的测定。
如果上述固体支承材料为无机材料，上述无机材料为某种无机矿物氧化物，优选选自由氧化硅、氧化铝、氧化镁、氧化钛、氧化锆、氟硅酸盐、磁铁矿、沸石、硅酸盐(硅藻土（cellite）,kieselguhr)、云母、羟磷灰石、氟磷灰石、金属有机骨架、陶瓷以及玻璃、如可控孔度玻璃(例如Trisoperl)、金属诸如铝、硅、铁、钛、铜、银、金以及石墨或无定型碳。
无论所述固体支承材料是聚合物材料或无机材料，所述固体支承材料提供作为不溶性支撑的最小刚度和硬度的固体基础，并且提供一种基础，所述基础增加了固定相和流动相间的界面，所述界面为与分析物反应的场所，作为所述相之间的分离工艺的分子基础，并且所述基础特别在流动和/或压力条件下可用于提高强度和磨损性。
本发明的所述固体支承材料可为均质或多相复合物，并且由此可包括一种或多种上述提到的材料的复合物，特别是多层复合物。
所述固体支承材料可为粒状材料，优选具有5到500μm的粒度。所述固体支承材料可为片状或纤维状材料诸如膜。所述固体支承材料的外部表面可以是平坦的（板、片、箔、盘、滑板（slides）、滤片（filters）、膜、织物或无纺物、纸），或为弯曲的（凹形或者凸形、球、珠、粒、（空心）纤维、管、毛细管、瓶、样品盘中的孔）。
所述固体支承材料的内部表面的孔结构，其中包括构成规则、连续毛细管道或者构成不规则（不规则碎片）几何形状的空腔。微观地，其为平滑或粗糙的，取决于制作的方式。所述孔体系将连续地延伸贯穿整个固体支承材料或者终结于（分支）空腔。分析物在其溶解于流动相和保留在固定相表面之间的界面平衡速率、以及连续流动分离体系的效率，主要由通过扩散穿过上述固体支承材料的孔的物质传递和颗粒的特性分布及孔径来决定。孔径可任选地表示为非对称、多峰地（multimodal）和/或螺旋(例如，剖面)的不均匀分布。
如上述，上述固体支承材料的表面优选覆盖聚合物膜，所述聚合物包括或由优选地彼此共价交联的独立链段组成。而且，所述聚合物优选不是共价连接到上述固体支承材料的表面。本发明的发明人惊奇地发现，特别是用于提纯同时具有疏水性和亲水性部分的化合物时，重要的是所述聚合物容易弯曲足以变形到可以让疏水性和亲水性（例如，氢供体或受体反应）部分均可以与待提纯化合物的疏水性和亲水性部分接触。本发明的发明人观察发现，如果使用共价连接到所述支承材料的表面的聚合物膜，则提纯能力显著降低了。即，采用非共价表面结合交联聚合物作为聚合物膜具有三个优点：（1）聚合物的柔性，由于其不是表面结合；（2）交联确保所述膜结合于所述支承材料的表面且不丢失；（3）如果所述聚合物不共价连接到所述聚合物，则聚合物的厚度就能够被调整到所需薄的程度。
进一步优选，覆盖所述支承材料的聚合物为亲水性聚合物。聚合物的亲水性确保亲水反应在吸附剂和待提纯的化合物间得以发生。
用于所述可交联聚合物的聚合物优选由至少包括亲水基的单体（优选在其侧链）组装。优选亲水基为-NH2、-NH-、-OH、-COOH、-OOCCH3、酸酐、-NHC(O)-以及糖,其中更优选-NH2和-OH，并且最优选-NH2。
如果采用共聚物，优选共聚单体为简单烯烃单体或极性、惰性单体如乙烯基吡咯烷酮。
覆盖所述支承材料的聚合物实例：聚胺诸如聚乙烯胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、如聚赖氨酸等的聚氨基酸，以及除了那些含有氨基之外的功能聚合物诸如聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸，其前体聚合物诸如聚马来酸酐、聚酰胺或多糖（纤维素、右旋糖酐、支链淀粉等）,其中聚酰胺诸如聚乙烯胺和聚烯丙胺是更优选的，并且聚乙烯胺是最优选的。
至于优异的提纯能力，进一步优选，在本发明的吸附剂中，通式（I）的残基与上述聚合物的官能团的数量(衍生度)的摩尔比率范围优选为0.4到0.8，更优选的范围是0.5到0.7，其中通式（I）的残基的数量通过元素分析确定，并且，在通式（I）的残基应用之前，所述官能团数量通过吸附剂的滴定来确定。
而且，本发明的吸附剂优选含有通式（I）的残基，相对于所述吸附剂的总体积，残基含量范围为40到240μmol/mL，更优选70到210μmol/mL，其中数量通过元素分析确定。
本发明的吸附剂的自由官能团数量相对于所述吸附剂的总体积，含量范围为5到190μmol/mL。自由官能团数量通过滴定来确定。自由官能团的数量的矛盾在于，1）可由所述的摩尔比及通式（I）的残基的数量来确定；2）值由滴定直接确定，通过元素分析和通过滴定来确定。
所述聚合物可以通过本领域已知的所有涂覆方式应用于所述大孔支承体，所述涂覆方式诸如：吸附、气相沉积、（液相、气相或等离子相）聚合反应、旋涂、表面凝结、润湿、浸泡、浸渍、冲洗、喷涂、湿润加工（damping）、蒸涂、施加电场或压力，以及基于分子自组装法，诸如（例如）液晶、LB膜技术或层膜成型。因此，所述聚合物可以直接涂覆作为单层或多层或在各层之上作为单独单层按顺序进行。优选在本发明中，所述聚合物涂覆于所述支承材料，其中所述非交联聚合物以水溶液形式加到所述支承材料之后交联。
在本发明的吸附剂中，覆盖所述支承材料的聚合物重量与所述支承材料的重量之比优选范围为0.005到0.15，更优选0.01到0.08。如果上述比例超出高限，上述聚合物膜太厚，并且所述支承材料的孔被完全覆盖，导致吸附剂没有可用的孔。如果上述比例低于所述低限，所述聚合物的量不足以覆盖全部支承材料。而且，在后一种情况下，不得不使用更多交联剂以将所述聚合物固定于上述支承材料上，再次导致聚合物膜不够柔韧。
根据本发明的吸附剂的优选实施方式，基于所述交联聚合物中的可交联基团的总数量，所述交联聚合物的交联度至少为2%。基于所述交联聚合物中的可交联基团的总数量，更优选所述交联度为5到50%，再优选5到30%，最优选10到20%。所述交联度可以通过所使用的上述交联剂的化学计量予以方便地调节。据推断，将近100mol%的交联剂发生反应并形成交联。这点可以通过分析方法证实。上述交联度可以通过MAS-NMR光谱法和所述交联剂量与聚合物量的关系的定量测定来确定。本方法是最优选的。所述交联度还可以通过红外光谱法采用校正曲线基于例如C-O-C或OH振动来确定。这两种方法都是本领域常规的标准分析方法。如果上述交联度超出高限，则上述聚合物膜不够柔韧，导致提纯能力较差。如果所述交联度低于上述低限，则所述膜在上述支承材料的表面上不够稳定。
用于交联所述聚合物的交联剂优选选自由二羧酸、二胺、二醇、脲和双环氧基化合物组成的组，更优选二羧酸和双环氧化合物，诸如对苯二甲酸、联苯二羧酸、以及1,12-双-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-癸烷二羧酸（decanedicarboxylic acid）、乙二醇二缩水甘油醚，最优选乙二醇二缩水甘油醚。在一个实施方式中，所述至少一个交联剂为直链、其柔韧可变形的分子长度为4-20个原子。
优选所述聚合物的分子量使用范围为5000到50000g/mol，但不限于该范围，该范围特别适用于聚乙烯胺。具有接近以上给定范围低限分子量的聚合物表现出能穿透载体上很窄的孔，所以具有高表面积及良好物质传递动力学、溶解率以及结合能力的固态材料可以用于本发明的吸附剂。
根据另一个实施方式，所述交联聚合物具有官能团，即以上提到的亲水基。
术语“官能团”是指任意简单清楚的化学部分，其属于位于所述固体支承材料表面上的交联聚合物，或属于在所述固体支承材料表面上聚合物制备过程中的可交联聚合物。因此，所述官能团可作为化学连接位点或锚定。官能团优选含有至少一个弱键和/或一个杂原子，优选基团作为亲核试剂或亲电试剂。
当前述通式（I）的残基结合于所述基团之前，优选官能团为伯和仲胺、羟基、以及羧酸或酯基。当所述残基结合到官能团，这些基团的性质将根据上述结合残基的结构而变化。
本发明还涉及一种制备吸附剂的方法，优选地制备本发明的吸附剂的方法包括：
(i)提供具有官能团的聚合物；
(ii)所述聚合物的膜吸附到载体表面；
(iii)所述吸附的聚合物的所述官能团上的限定部分与至少一种交联剂进行交联；
(iv)所述交联聚合物的所述官能团上的其他限定部分与一个或多个根据通式(I)的残基结合（derivatising）。
被吸附在所述载体表面的聚合物优选溶解于水性介质中，其中所述pH可以适当调整以溶解或悬浮所述聚合物。所述聚合物于所述载体表面的吸附优选通过将所述载体浸渍于含有所述聚合物的溶液或悬浮液中进行。然后，所述混合物优选振荡以实现所述成分的充分混合。毛细力确保所述载体的孔吸满所述溶液或悬浮液。然后，优选所述水在40-60℃的温度下真空蒸发，由此将所述聚合物以膜形式沉积在所述孔的壁上。然后，所述涂覆材料优选在有机溶剂中悬浮，诸如异丙醇或二甲基甲酰胺（DMF），并且优选通过交联剂如乙二醇二甘油醚进行交联，优选在25-60℃的温度下交联4到8小时。
依据所述官能团的种类并依据通式(I)的残基，可以采用所述固体支承体的各种衍生方法（derivatization strategies）。如果所述固体支承材料含有氨基作为官能团，含有羧酸基团的残基可通过羧基碳原子并通过肽化学采用耦合剂或通过采用试剂中的反应性基团连接到胺基氮原子上，所述耦合剂例如2-(lH-苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(lH-6-氯代苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HCTU)、六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基-三-吡咯烷基磷（PyBOP)、丙基磷酸酐(T3P)等，所述试剂如异氰酸酯、环氧化物或酸酐。如果所述固体支承材料含有氨基，通式(I)的残基中的脂族碳原子可通过饱和碳原子亲核取代反应结合于所述胺基氮原子。
如果所述固体支承材料含有羟基，在连接到所述官能团上之前，含有羧酸基团的通式(I)的残基可采用羧酸酰氯或羧酸酯基通过羧基碳原子连接到所述羟基的氧原子上。如果上述固体支承材料含有羟基，通式(I)的残基的脂族碳原子可通过饱和碳原子亲核取代反应连接到上述羟基的氧原子上。
有机合成领域的技术人员知晓支撑材料的官能团与通式（I）残基的前体化合物的可能反应由此获得本发明的吸附剂。
本发明的吸附剂可用于有机分子（有机化合物）的提纯，或者特定有机分子的溶液的提纯。可以说是，本发明进一步涉及本发明的吸附剂提纯有机分子、肽、或提纯有机分子溶液的用途。
术语“有机分子”不仅包括低分子量的有机化合物，还包括生物分子例如肽和酶。
术语“提纯”是指包括从含有所述有机分子的混合物中分离或增加有机分子的浓度和/或纯度。
换言之，本发明涉及提纯有机分子的方法，其还包括通过使用本发明吸附剂从溶液中分离不需要的有机分子。
本发明吸附剂在提纯有机分子上的应用，或者通过使用本发明吸附剂用于提纯有机分子的方法，包括以下步骤：
（i）将溶解或悬浮在液体中的含有有机分子的粗混合物应用在具有本发明吸附剂或本发明方法制备的吸附剂的色谱柱；
（ii）通过采用洗脱剂将所述有机分子从所述色谱柱中洗脱。
在步骤（ii）中使用的洗脱剂可以是与步骤（i）中所用液体相同的溶剂，但也可以不同，这取决于提纯有机分子的必需条件。作为步骤（i）的液体或步骤（ii）的洗脱剂，可以采用色谱领域内采用的各种溶剂或缓冲体系。本发明的有机溶剂特别优选乙酸乙酯和二氯甲烷等。
通过本发明的吸附剂提纯的所述有机分子优选为药物活性化合物。
待提纯的有机分子优选其分子中具有亲水性及疏水性部分的化合物。更优选地，上述有机分子除上述之外还（beneath）具有可作为氢供体或氢受体的疏水性烃部分基团的化合物。上述有机分子优选为具有选自-OH、-O-、-S-以及-C(O)-组成的组中的一个或多个部分的化合物。
有机分子优选分子量范围为500到200000g/mol、更优选500到150000g/mol、最优选500到6000g/mol。
特别优选本发明的用途/工艺中使用的有机分子为依维莫司或依维莫司的衍生物，更优选如下结构的依维莫司：
而且，本发明吸附剂还可用于从溶液中分离内毒素。本发明中使用的术语“内毒素”是指一类生物化学物质。内毒素为细菌的分解产物，其可以引起人体中的多种生理反应。内毒素为革兰氏阴性菌或蓝藻的外细胞膜（OM）的成分。从化学的角度来说，内毒素为脂多糖类（LPS），其由亲水性多糖组分和亲脂性脂质组分构成。与上述起源于细菌的内毒素对比，内毒素热稳定性非常好，并且耐受杀菌。目前最灵敏的内毒素测定方法是通过活化从鲎（Limulus polyphemus）中分离的阿米巴菌的溶菌产物的凝血级联而来实现的。该测试就是众所周知的LAL测试。
在本发明中更优选本发明的吸附剂在从胰岛素的副产物中提纯胰岛素的应用。
本发明还涉及用于液相色谱或固相提取柱，所述柱包括本发明吸附剂或本发明方法制备的吸附剂作为管状容器中的固定相，以及可选择的其他部件诸如：筛板（frits）、过滤板、流动分配器、密封件、连接件、螺栓、阀门或其他流体处理或连接元件。在一个实施方式中，上述方法进一步的特征在于其物理及化学耐性，可承受高达20bar的处理压力、高达110℃的加热、以及常规消毒方法（sanitisation protocols），因此其重复使用次数可高达1,000次，优选高达5,000次。本发明还涉及一批多个相同或不同的本发明吸附剂，或一批本发明方法制备的吸附剂，或一批微板或微芯片阵列形式的本发明的柱，亦或是能够并行处理的多毛细管或微流体装置。
本发明还涉及诊断或实验室提纯试剂盒，所述试剂盒具有本发明吸附剂，或本发明方法制备的吸附剂，或本发明的柱，或一批本发明吸附剂或柱，并且在同一包装单元中，进一步包括用于实现本发明方法或不同的分析、诊断或实验方法所需的其他化学或生物试剂和/或一次性产品。
本发明还涉及以下实施方式：
（i）通过使用本发明吸附剂提纯有机分子的方法。
（ii）根据实施方式（i）的方法，其中所述有机分子为药物活性化合物。
（iii）根据实施方式（i）或（ii）的方法，其中所述有机分子的分子量范围为500到200000g/mol。
（iv）根据实施方式（i）到（iii）的方法，其中所述有机分子选自由依维莫司、依维莫司的衍生物、胰岛素、胰岛素衍生物及内毒素组成的组。
附图说明
通过以下附图和实施例进一步解释说明本发明，所述附图与实施例不应当理解为对本发明保护范围的限制。
图1.实施例2的依维莫司的分级色谱。
图2.提纯的依维莫司的分析色谱（长划线）与粗混合物的分析色谱（实线）比较。
图3.通过采用4-甲苯磺酸（前期分析）突破测试确定胺基数量的试样曲线。
图4.利用本发明的实施例3中制备的吸附剂根据实施例4的方法得到的胰岛素及其副产物脱酰胺胰岛素-A21的馏分的制备色谱。
图5.用作实施例4分离方法中的起始混合物的、胰岛素及脱酰胺胰岛素-A21的粗混合物的分析色谱。
图6.通过实施例4的分离方法获得的第一馏分的分析色谱。
图7.通过实施例4的分离方法获得的第二馏分的分析色谱。
具体实施方式
分析方法：
通过采用4-甲苯磺酸（前期分析）突破测试确定胺基数量（滴定方法）：
向尺寸33.5x4mm(床容量0.42mL)的柱中填充各自的吸附剂。随后所述填充柱采用以下介质以1.0mL/min的流速冲洗：
·5 mL 水
·10 mL 100 mM 乙酸铵水溶液
·1 mL 水
·10 mL 100 mM 三氟乙酸水溶液
·10 mL 水
在水以0.5mL/min速率被泵送通过上述装置5分钟之后，在具有泵和紫外检测仪的HPLC装置中检测到基线。在泵送10mM的4-甲苯磺酸水溶液后，检测到在274nm处洗脱剂消失。在数分钟内，所述消失升高到约700mAU的水平，并且保持稳定在这个水平（冲洗曲线）。在25分钟后，上述柱被应用在泵和检测仪之间，并且用10mM4-甲苯磺酸以0.5mL/min的速度冲洗。由于上述柱与4-甲苯磺酸结合，上述消失下降到0mAU。如果所述柱的容量被耗尽，上述洗脱剂的消失再次上升至开始的水平约为700mAU。
为了确定4-甲苯磺酸的容量，在冲洗曲线水平下方的区域被集成为一个对照区，因此获得表面区和4-甲苯磺酸的量之间的关系。之后，滴定由柱吸附的所述甲苯磺酸溶液区域（突破区），并且减去所述装置的容积和所述柱的死体积（0.5mL）。所述突破区直接表示结合到上述柱上的上述4-甲苯磺酸的数量。将该数量除以上述柱的容量则得到每mL吸附剂的甲苯磺酸容量，还得到吸附剂的胺基数量。为了更好地理解本方法，图3给出这样的试验曲线。
实施例1：含有通式-C(O)-(CH2)10CH3的残基的本发明吸附剂制备方法:
聚乙烯胺水溶液(4.5g溶于300g水，通过加入三氟乙酸（TFA）调整为pH8)给入300g的Daisogel SP12010P中。所述混合物在振筛机上搅拌5个小时，并且之后在50℃下真空干燥。在达到重量恒定后，所述吸附剂悬浮于900mL异丙醇并加入50ml的含3.64g聚乙二醇二甘油醚。所述混合物在70℃下搅拌6小时。之后，所述吸附剂经过滤，并且所述吸附剂分别以600mL异丙醇、2400mL0.5M TFA的水溶液、600mL水、600mL的二甲基甲酰胺（DMF）、1800mL0.5M三乙胺（TEA）的DMF溶液和600mL DMF洗涤。
所得通过滴定确定的中间体上的胺基数量为约144μmol/mL。
所述吸附剂再次悬浮于900mL DMF，并且加入12.0g月桂酸、22.8gHBTU和8.4mL三乙胺。所述混合物在50℃下搅拌2小时之后过滤。所述吸附剂分别以100mL DMF、300mL0.5M TFA的DMF溶液、300mL0.5M TFA的水溶液、100mL水、100mLDMF、300mL0.5M TEA的DMF溶液、100mL水以及200mL甲醇洗涤。之后于50℃下真空干燥，所述吸附剂备用。
通过滴定测定，所得的吸附剂含有约15μmol/mL的自由胺基，经元素分析测定，残基-C(O)-(CH2)10CH3的含量约85μmol/mL。
实施例2：通过使用实施例1制备的吸附剂提纯依维莫司：
实施例1中制备的吸附剂填充到床尺寸为25.4x250mm的轴向压缩的ModCol-柱。采用乙酸乙酯/二氯甲烷（1/1）流动相以40mL/min负载1%的试样。根据图1所示，将主要由80到85重量%的依维莫司和15到20重量%的雷帕霉素构成的粗混合物分级。图2示出提纯的依维莫司的分析色谱（长划线）与粗混合物的分析色谱（实线）比较。其结果也表示在下面的表1中。
表1
雷帕霉素是主要杂质。当合并馏分BT2到BT7时可获得的依维莫司纯度为99.18%和产率为73%。
类似于实施例1制备的吸附剂包括低于5μmol/mL的自由胺基，导致可获得的依维莫司的纯度远低于99%且产率远低于70%。同样地，具有190μmol/mL的自由胺基的吸附剂同样会导致可获得的依维莫司的纯度远低于99%且产率远低于70%。
同样地，吸附剂具有的通式（I）的残基与聚合物（在结合之前）的官能团的数量的摩尔比小于0.4或大于0.8，则可获得的依维莫司纯度和产率都下降20%。如果上述相同范围低于0.5或大于0.7，则由于保留率太低可获得的依维莫司纯度和产率都下降30%。
实施例3：含有通式-C(O)-(CH2)10CH3的残基的本发明吸附剂制备方法:
聚乙烯胺水溶液(30g溶于400g水，通过加入盐酸（HCl）调整为pH8)给入600g的Daisogel SP12010P中。所述混合物在振筛机上搅拌6个小时，并且之后在50℃下真空干燥。在达到重量恒定后，所述吸附剂悬浮于3000mL异丙醇并加入12.1g聚乙二醇二甘油醚的150mL异丙醇溶液。所述混合物在55℃下搅拌6小时。之后，所述吸附剂经过滤，并且所述吸附剂分别以3000mL异丙醇、9000mL0.1M HCl的水溶液、3000mL水、和4500mL甲醇洗涤。吸附剂干燥备用。
所得通过滴定确定的中间体上的胺基数量为约316μmol/mL。
所述吸附剂50g分别再次用300mL二甲基甲酰胺（DMF）、300mL0.5M三乙胺（TEA）和300mL DMF冲洗。最后将其悬浮于150mL DMF，并且加入5.0g月桂酸、9.5g HBTU和3.4mL三乙胺。所述混合物在50℃下搅拌4小时之后过滤。所述吸附剂分别以300mL DMF、300mL0.1M HCl的DMF溶液、300mL0.1M HCl的水溶液、300mL水、300mL甲醇洗涤。之后于50℃下真空干燥，所述吸附剂备用。
通过滴定测定，所得的吸附剂含有约173μmol/mL的自由胺基，经元素分析测定，残基-C(O)-(CH2)10CH3的含量约202μmol/mL。
实施例4：使用实施例3制备的吸附剂提纯胰岛素：
通过采用四通道低压梯度泵（LPG580、LPG680、或LPG3400）、自动进样器（Gina50,ASI-100或WPS-300）、六通道柱转换阀（Besta）、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪（UVD170U、UVD340S、VWD3400）构成的Dionex HPLC系统，得以分离含有胰岛素和主要杂质为脱酰胺胰岛素-A21（3mg/mL水/乙腈/三氟乙酸（95/5/0.1））的所述粗样品。所述吸附剂被填充于250x4mm钢柱。为了提纯，可以采用不同级别的三种洗脱剂见以下表2。第一洗脱剂为10mM的NaKHPO4的水溶液，第二洗脱剂为10mMNaKHPO4/1M NaCl的水溶液，第三洗脱剂为1-丙醇，流速为1mL/min。进样量为1mL。
图4表明了分级的过程
表2：三种不同洗脱剂的梯度
时间[分钟] 10mM NaKHPO4(7，3) 10mM NaKHPO4，1M NaCl(7，3) 1-丙醇
0 70 10 20
0 70 10 20
50 70 10 20
50 30 50 20
70 30 50 20
70 70 10 20
90 70 10 20
图4表明当使用实施例3的吸附剂时可以获得非常优异的分离。胰岛素早于脱酰胺胰岛素-A21在大于40分钟时从柱洗脱。也就是说，脱酰胺胰岛素在本发明吸附剂上的保留与胰岛素的保留相比非常高。
将胰岛素和脱酰胺胰岛素的粗混合物用作实施例4的分离方法中的起始混合物的分析色谱。
根据本领域周知的Pharmakopoe方法，采用YMC Pack、Pro C18、250x4.6mm、12nm（流动相：缓冲液A：100mL乙腈、700mL水、200mL硫酸盐缓冲液pH2.0R;缓冲液B:400mL乙腈、400mL水、200mL硫酸盐缓冲液pH2.0R）对上述分离进行分析，表明在粗混合物的分析色谱中脱酰胺胰岛素-A21在30分钟后洗脱。
采用本发明的方法显示在分析色谱中的第一馏分在30分钟后（图6）脱酰胺胰岛素-A21未洗脱。而本发明的第二馏分的分析色谱表明脱酰胺胰岛素-A21洗脱（图7）。上述分析表明从脱酰胺胰岛素-A21中分离胰岛素的品质。
类似于实施例3制备的吸附剂具有通式（I）的残基与聚合物（在结合之前）的官能团的数量的摩尔比（结合度）低于0.4，并未因脱酰胺胰岛素-A21的这种较差的保留而导致胰岛素与脱酰胺胰岛素-A21基线分离。同样地，具有大于0.8的衍生度的吸附剂同样未因胰岛素的良好保留而导致这两种物质的基线分离。吸附剂的上述相同比例低于0.5或高于0.7都会使这两种物质分离，但是胰岛素的产率低于50%。
同样地，具有5μmol/mL到190μmol/mL的自由胺基的吸附剂，会导致胰岛素与脱酰胺胰岛素-A21基线分离，而具有低于5μmol/mL或高于190μmol/mL的自由胺基的吸附剂也显示不会基线分离，即是纯度产率。

Claims (14)

1.一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如以下通式(I)的残基，
其中，取决于所述固体支承材料是否包括聚合物膜，所述残基通过通式(I)中虚线所示的共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面上的官能团或者本体固体支承材料本身表面上的官能团；并且
其中所用符号和参数具备以下含义：
L表示共价单键或选自由-C(O)-、-S(O)2-、-CH2CH(OH)-和-C(O)NH-组成的组中的二价单元，
X表示具有1到30个碳原子的单价直链脂肪烃基或具有3到30个碳原子的支链烃基或脂环烃基，
其中，
所述基团中的一个或多个CH2-部分可以被O、S、-S(O)2-、-C(O)NH-或-C(S)NH-取代，
一个或多个氢原子可以由F、Cl、Br、-CN或-NC取代，以及
所述基团可以包括一个或多个位于两个碳原子间的双键。
2.如权利要求1所述的吸附剂，其中所述通式(I)的残基连接到固体支承材料表面上的聚合物膜表面的官能团上。
3.如权利要求1或2所述的吸附剂，其中L为-C(O)-、-S(O)2-或-CH2CH(OH)-。
4.如权利要求3所述的吸附剂，其中L为-C(O)-。
5.如权利要求1到4中任一项所述的吸附剂，其中X为直链或支链烷基。
6.如权利要求5所述的吸附剂，其中X为直链C1-C22-烷基。
7.如权利要求6所述的吸附剂，其中X为直链C6-C15-烷基。
8.如权利要求1到7中任一项所述的吸附剂，其中所述聚合物膜的聚合物包括彼此共价交联的单独链段或由彼此共价交联的单独链段构成，但所述单独链段未共价结合于所述固体支承材料的表面。
9.如权利要求8所述的吸附剂，其中聚合物包括亲水性基团。
10.如权利要求9所述的吸附剂，其中聚合物为聚胺、聚乙烯胺、或含有聚胺的共聚物或共混聚合物。
11.如权利要求1到10中任一项所述的吸附剂在有机分子提纯中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其中所述有机分子为药学活性化合物。
13.如权利要求11或12所述的应用，其中所述有机分子同时具有亲水性部分和疏水性部分。
14.如权利要求11到13中任一项所述的应用，其中所述有机分子选自由依维莫司、依维莫司的衍生物、胰岛素、胰岛素的衍生物、内毒素组成的组。
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