KR20140092230A - 모노테르펜 배당체화 효소의 이용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 테르펜 8 위치 배당체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 테르펜 8 위치 배당체화 효소를 이용한 테르펜 8 위치 배당체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자를 도입한 형질 전환체 및 당해 형질 전환체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질의 발현이 억제된 식물을 제공한다.

Description

모노테르펜 배당체화 효소의 이용 방법 {METHOD FOR UTILIZING MONOTERPENE GLYCOSYLTRANSFERASE}

본 발명은 모노테르펜 8 위치 배당체의 제조 방법, 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소를 고발현하는 형질 전환체 그리고 상기 방법에 의해 제조된 모노테르펜의 8 위치 배당체 및 그 이용에 관한 것이다. 또, 본 발명은 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질의 발현이 억제된 식물 및 그 이용에 관한 것이다.

테르페노이드, 특히 모노테르펜 (C10) 이나 세스퀴테르펜 (C15) 등 분자량이 비교적 작은 테르페노이드류는 식물의 주요 향기 성분으로, 식품, 주류의 플레이버뿐만 아니라 화장품이나 향수에 이르는 공업 제품에까지 폭넓게 이용되고 있다. 리날로올로 대표되는 모노테르펜은 식물 세포 내에서 합성되지만, 일부는 배당체로서 축적되어 있는 것이 알려져 있고, 예를 들어 십자화과 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 에서는 8 위치 수산화리날로올의 배당체가 보고되어 있다 (비특허문헌 1). 모델 식물뿐만 아니라 산업상 중요한 작물인 삼과 홉 (Humulus lupulus) (비특허문헌 2) 이나 동백나무과 차 (Camellia sinensis) (비특허문헌 3 ∼ 6) 나 생강과 생강 (Zingiber officinale) (비특허문헌 7) 에 있어서도 모노테르펜 배당체가 축적되어 있는 것이 알려져 있다. 또한 식물계에 폭넓게 보고되어 있는 점에서 (비특허문헌 8), 배당체는 향기 성분의 전구체로서 일반적인 형태인 것으로 생각된다. 향기 전구 물질인 테르펜 배당체를 효소 혹은 비효소적으로 당을 절제하고, 향기 성분을 휘발시킨다는 인공 제어에 대해서도 산업 응용적인 견지로부터 검토되어 있다 (비특허문헌 9).

그러나 지금까지 모노테르펜 배당체의 당을 자르는 효소 (β-프리메베로시다아제 (β-primeverosidase)) 는 차로부터 단리되어 있지만 (비특허문헌 10), 모노테르펜에 당이 부가되는 (배당체화되는) 분자 기구에 대해서는 불분명하다. 애기장대의 UDP-sugar 의존적 배당체화 효소 (UDP-sugar dependent glycosyltransferase : UGT) 의 망라적 활성 스크리닝에 의해 일부의 UGT 효소가 시험관 내에서 모노테르펜에 반응하는 것이 보고되어 있지만, 생리적인 역할이나 그 활성의 의의는 나타나 있지 않다 (비특허문헌 11). 밀감과 스위트 오렌지 (Citrus sinensis) 에도 모노테르펜 배당체가 축적되어 있기 때문에, 모노테르펜에 대한 UGT 의 스크리닝이 실시되었지만, 활성이 있는 UGT 효소 유전자의 동정 (同定) 에 이르지 못하였다 (비특허문헌 12).

국제 공개공보 WO97/11184

Aharoni et al (2003) Plant Cell 15, 2866-2884 Kollmannsberger et al (2006) Mschr. Brauwissenschaft 59, 83-89 Guo et al (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1532-1534 Nishikitani et al (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 929-931 Moon et al (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 1815-1819 Ma et al (2001) Phytochemisty 56, 819-825 Sekiwa et al (1999) Biosci. Biotech. Biochem. 63, 384-389 Winterhalter and Skouroumounis (1997) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 55, 73-105 Herman (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 5836-5863 Mizutani et al (2002) Plant Physiol. 130, 2164-2176 Caputi et al (2008) Chem. Eur. J. 14, 6656-6662 Fan et al (2010) Genome 53, 816-823 Winter et al (2007) PLoS One 2, e718 Hou et al (2004) J. Biol. Chem. 279, 47822-47832 Kristensen et al (2005) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 102, 1779-1784 Franks et al (2008) Funct. Plant Biol. 35, 236-246

상기와 같은 상황하에서, UGT 효소 유전자 및 당해 유전자에 코드되는 단백질을 동정하고, 이들을 이용한 테르펜 배당체의 효율적인 제조 방법을 확립하는 것이 요망되고 있다.

본 발명자들은 100 종류 이상의 후보 유전자 중에서 철저하게 애기장대의 공발현 해석 (ATTED-Ⅱ) 을 추진한 결과, 리날로올 합성 효소 유전자 (LIS) 와 높은 발현 상관을 나타내는 UGT 효소 유전자로서 UGT85A3 및 UGT85A1 을 알아냈다. 또, 본 발명자들은 본 효소 유전자를 클로닝하고, 상세하게 캐릭터리제이션을 실시한 결과, 당해 유전자에 코드되는 단백질은 모노테르펜에 대해 배당체화 활성을 갖고 있고, 특히 8 위치에 하이드록시기를 갖는 기질 (8-하이드록시게라니올이나 8-하이드록시리날로올) 에 대해 높은 비활성 (比活性) 을 나타내는 것을 해명하였다. 따라서, UGT85A3 유전자 및 UGT85A1 유전자의 발현 패턴과 그 생화학적인 효소 기능, 그리고 그 생성물인 모노테르펜 배당체의 축적 영역은 모두 일치하고 있어, UGT85A3 및 UGT85A1 이 생리적인 리날로올 배당체화 효소인 것이 확인되었다. 본 발명은 상기 지견에 기초하는 것이다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 이하의 (a) ∼ (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것에 기재된 단백질과 UDP-당과 모노테르펜 화합물을 반응시켜 상기 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 공정을 포함하는 모노테르펜 8 위치 배당체의 제조 방법.

(a) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질 ;

(c) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 대해, 75 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질

[2] 상기 UDP-당이 UDP-글루코오스인 상기 [1] 에 기재된 방법.

[3] 상기 모노테르펜 화합물이 8-하이드록시미르센, 8-하이드록시네롤, 8-하이드록시게라니올 및 8-하이드록시리날로올로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 것인 상기 [1] 에 기재된 방법.

[4] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 비인간 형질 전환체.

(a) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 ;

(b) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;

(c) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;

(d) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 대해, 75 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(e) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 높은 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드

[5] 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열을 함유하는 상기 [4] 에 기재된 형질 전환체.

[6] 상기 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터에 삽입된 것인 상기 [4] 에 기재된 형질 전환체.

[7] 식물체인 상기 [4] 에 기재된 형질 전환체.

[8] 상기 [4] 에 기재된 형질 전환체의 추출물.

[9] 상기 [8] 에 기재된 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약품 또는 공업 원료.

[10] 상기 [4] 에 기재된 비인간 형질 전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질의 제조 방법.

[11] 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질의 발현이 억제된 식물.

[12] 상기 단백질의 발현이 RNA 간섭에 의해 억제된 상기 [11] 에 기재된 식물.

[13] 상기 [11] 에 기재된 식물 또는 그 식물의 일부의 가공 제품.

[14] 상기 [11] 에 기재된 식물의 추출물.

[15] 상기 [14] 에 기재된 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약품 또는 공업 원료.

본 발명의 방법에 의해 고효율로 테르펜 화합물의 8 위치 배당체를 제조할 수 있다. 또, 본 발명의 형질 전환체는, 테르펜 화합물의 8 위치 배당체의 함유량이 높기 때문에, 이들 형질 전환체로부터 효율적으로 테르펜 화합물의 8 위치 배당체를 추출·정제할 수 있다.

도 1 은 애기장대에 있어서의 모노테르펜 (리날로올) 의 추정 대사 경로를 나타낸다. 도 중의 화살표의 수치는 ATTED-Ⅱ 에 의한 상관 계수를 나타낸다.
도 2 는 AtLIS 및 UGT85A3 의 기관별 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 도 중의 화살표는 꽃잎에서의 발현을 나타낸다.
도 3 은 CYP76C1 및 CYP76C3 의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 도 중의 화살표는 꽃잎에서의 발현을 나타낸다.
도 4 는 대장균에서 발현시킨 HisTag-UGT85A3 키메라 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 도 중의 화살표는 HisTag-UGT85A3 키메라 단백질을 나타낸다.
도 5 는 모노테르펜 배당체의 화학 정보 테이블.
도 6 은 8-하이드록시게라니올 (도 6A) 및 8-하이드록시리날로올 (도 6B) 에 대한 UGT85A3 의 배당체화 활성 (LC-MS차트). 화살표는 생성물 (테르펜 배당체) 피크를 나타낸다.
도 7 은 UGT85A3 에 의한 게라니올, 8-하이드록시게라니올, 리날로올 및 8-하이드록시리날로올의 생성 물량의 비교.
도 8 은 UGT85A3 의 당공여체 선택성 (상대 활성). 가장 활성이 높은 UDP-글루코오스에 대한 활성을 100 ％ 로 한다.
도 9 는 UGT85A1 의 기관별 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 도 중의 화살표는 꽃잎에서의 발현을 나타낸다.
도 10 은 대장균에서 발현시킨 HisTag-UGT85A1 키메라 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 도 중의 화살표는 HisTag-UGT85A1 키메라 단백질을 나타낸다.
도 11 은 리날로올, 8-하이드록시리날로올, 게라니올, 8-하이드록시게라니올에 대한 UGT85A1 의 배당체화 활성 (LC-MS 차트). 테두리로 둘러싼 피크는 생성물 (테르펜 배당체) 피크를 나타낸다.
도 12 는 UGT85A1 의 당수용체 선택성 (상대 활성). 가장 활성이 높은 8-하이드록시게라니올에 대한 활성을 100 ％ 로 한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 이하의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로, 본 발명을 이 실시형태에만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 다양한 형태로 실시할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌 및 공개공보, 특허공보와 그 밖의 특허문헌은 참조로서 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 또, 본 명세서는 2010년 12월 28일에 출원된 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 (일본 특허출원 2010-293237호) 의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명자들은 모노테르펜 화합물의 8 위치의 배당체화 반응의 효소 단백질이 UGT85A3 및 UGT85A1 인 것을 처음으로 해명하였다.

UGT85A3 의 CDS 배열, 추정 아미노산 배열, 게놈 유전자 배열, cDNA 배열 및 오픈 리딩 프레임 (ORF) 배열은 각각 배열 번호 1, 2, 3, 4 및 5 이다. 또, UGT85A1 의 CDS 배열, 추정 아미노산 배열, 게놈 유전자 배열 및 cDNA 배열은 각각 배열 번호 8, 9, 10 및 11 이다. 이들 폴리뉴클레오티드 및 효소는 후술하는 실시예에 기재한 수법, 공지된 유전자 공학적 수법, 공지된 합성 수법 등에 의해 취득할 수 있다.

1. 모노테르펜 8 위치 배당체의 제조 방법

본 발명은 이하의 (a) ∼ (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것에 기재된 단백질 (이하, 「본 발명의 단백질」이라고 한다) 과 UDP 당과 모노테르펜 화합물을 반응시켜 상기 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 공정을 포함하는 모노테르펜 화합물의 8 위치 배당체의 제조 방법을 제공한다.

(a) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질 ;

(c) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 대해, 75 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질

상기 (b) 또는 (c) 에 기재된 단백질은 대표적으로는 천연에 존재하는 배열 번호 2 또는 9 의 폴리펩티드의 변이체이지만, 예를 들어, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)", "Gene, 34, 315 (1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)" 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 인위적으로 취득할 수 있는 것도 포함된다.

본 명세서 중, 「배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질」로는, 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 예를 들어, 1 ∼ 125 개, 1 ∼ 120 개, 1 ∼ 115 개, 1 ∼ 110 개, 1 ∼ 105 개, 1 ∼ 100 개, 1 ∼ 95 개, 1 ∼ 90 개, 1 ∼ 85 개, 1 ∼ 80 개, 1 ∼ 75 개, 1 ∼ 70 개, 1 ∼ 65 개, 1 ∼ 60 개, 1 ∼ 55 개, 1 ∼ 50 개, 1 ∼ 49 개, 1 ∼ 48 개, 1 ∼ 47 개, 1 ∼ 46 개, 1 ∼ 45 개, 1 ∼ 44 개, 1 ∼ 43 개, 1 ∼ 42 개, 1 ∼ 41 개, 1 ∼ 40 개, 1 ∼ 39 개, 1 ∼ 38 개, 1 ∼ 37 개, 1 ∼ 36 개, 1 ∼ 35 개, 1 ∼ 34 개, 1 ∼ 33 개, 1 ∼ 32 개, 1 ∼ 31 개, 1 ∼ 30 개, 1 ∼ 29 개, 1 ∼ 28 개, 1 ∼ 27 개, 1 ∼ 26 개, 1 ∼ 25 개, 1 ∼ 24 개, 1 ∼ 23 개, 1 ∼ 22 개, 1 ∼ 21 개, 1 ∼ 20 개, 1 ∼ 19 개, 1 ∼ 18 개, 1 ∼ 17 개, 1 ∼ 16 개, 1 ∼ 15 개, 1 ∼ 14 개, 1 ∼ 13 개, 1 ∼ 12 개, 1 ∼ 11 개, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 9 개 (1 ∼ 수 개), 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 7 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개, 1 ∼ 2 개, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는 일반적으로는 작을수록 바람직하다.

또, 이와 같은 단백질로는, 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열과 75 ％ 이상, 76 ％ 이상, 77 ％ 이상, 78 ％ 이상, 79 ％ 이상, 80 ％ 이상, 81 ％ 이상, 82 ％ 이상, 83 ％ 이상, 84 ％ 이상, 85 ％ 이상, 86 ％ 이상, 87 ％ 이상, 88 ％ 이상, 89 ％ 이상, 90 ％ 이상, 91 ％ 이상, 92 ％ 이상, 93 ％ 이상, 94 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상, 99.1 ％ 이상, 99.2 ％ 이상, 99.3 ％ 이상, 99.4 ％ 이상, 99.5 ％ 이상, 99.6 ％ 이상, 99.7 ％ 이상, 99.8 ％ 이상, 또는 99.9 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 배열 동일성의 수치는 일반적으로 클수록 바람직하다.

여기서, 「모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성」이란, 아글리콘인 모노테르펜 화합물의 8 위치 하이드록시기에 UDP 당에 포함되는 당을 부가하는 (배당체화하는) 활성을 의미한다. 본 발명의 단백질은 모노테르펜 화합물의 8 위치 이외를 배당체화하는 활성을 갖고 있어도 되는데, 이 경우, 본 발명의 단백질은 모노테르펜 화합물의 8 위치 이외의 하이드록시기와 비교하여, 8 위치의 하이드록시기를 우선적으로 배당체화한다.

모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성은, 본 발명의 단백질 1 ∼ 500 ng (바람직하게는 50 ∼ 200 ng, 가장 바람직하게는 100 ng), UDP 당 (예를 들어, UDP-글루코오스) 1 ∼ 1000 μM (바람직하게는 100 ∼ 700 μM, 가장 바람직하게는 500 μM), 및 모노테르펜 화합물 (예를 들어, 8-하이드록시리날로올) 1 ∼ 500 μM (바람직하게는 100 ∼ 500 μM, 가장 바람직하게는 250 μM) 을 함유하는 pH 6.0 ∼ 8.0 의 중성 영역의 완충액 (예를 들어, 인산나트륨 버퍼 또는 인산칼륨 버퍼) 중에 있어서, 20 ∼ 40 ℃ 의 온도에서 인큐베이트한 후에 상기 모노테르펜을 정제하고, 정제된 모노테르펜을 액체 크로마토그래피­질량 분석 (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry : LC-MS) 등의 공지된 수법에 의해 분석함으로써 확인할 수 있다.

또, 본 발명의 단백질이 모노테르펜 화합물의 8 위치 이외의 하이드록시기와 비교하여, 8 위치의 하이드록시기를 우선적으로 배당체화하는지의 여부는 본 발명의 단백질, UDP 당 (예를 들어, UDP-글루코오스), 8 위치에 하이드록시기를 갖는 모노테르펜 화합물 (예를 들어, 8-하이드록시리날로올) 및 8 위치 이외의 부위에 하이드록시기를 갖는 모노테르펜 화합물 (예를 들어, 리날로올) 을 상기와 동일한 조건으로 인큐베이트한 후에 상기 각 모노테르펜을 정제하고, 정제된 모노테르펜을 LC-MS 등의 공지된 수법에 의해 분석함으로써 확인할 수 있다.

배당체화 반응은 일반적으로 1 분 ∼ 12 시간 정도에서 종료한다.

본 발명의 단백질의 아미노산 배열에 있어서 하나 혹은 복수 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되었다는 것은, 동일 배열 중의 임의 또한 하나 혹은 복수 개의 아미노산 배열 중의 위치에 있어서, 하나 혹은 복수 개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가가 있는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 및 부가 중 2 종 이상이 동시에 발생해도 된다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다. A 군 : 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌 ; B 군 : 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 ; C 군 : 아스파라긴, 글루타민 ; D 군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산 ; E 군 : 프롤린, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린 ; F 군 : 세린, 트레오닌, 호모세린 ; G 군 : 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 이것을 코드하는 폴리뉴클레오티드 (후술하는 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」를 참조) 를 적절한 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 얻을 수 있지만, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또, Advanced Automation Peptide Protein Technologies 사 제조, Perkin Elmer 사 제조, Protein Technologies 사 제조, PerSeptive 사 제조, Applied Biosystems 사 제조, SHIMADZU 사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 「모노테르펜 화합물」이란, 이소프렌

[화학식 1]

을 구성 단위로 하는 탄화수소로, 식물, 곤충 및 균류 등에 의해 생성되는 생체 물질 외에, 화학적으로 합성된 화합물도 포함한다.

본 발명에 있어서, 모노테르펜 화합물은 8 위치에 하이드록시기를 갖는 것 (예를 들어, 8-하이드록시모노테르페노이드) 이면 특별히 한정되지 않고, 8 위치 이외의 탄소는 하이드록시기를 포함하는 임의의 기로 치환되어 있어도 된다.

이와 같은 모노테르펜의 예로는, 8-하이드록시미르센, 8-하이드록시네롤, 8-하이드록시게라니올 및 8-하이드록시리날로올 등이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 8-하이드록시게라니올 또는 8-하이드록시리날로올이다.

본 발명에 있어서, 「UDP-당」이란, 우리딘이인산 (Uridine DiPhosphate : UDP) 결합형의 당으로, 예로는 UDP-글루크론산 및 UDP-글루코오스를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 UDP-당은 UDP-글루코오스이다.

본 발명에 관련된 모노테르펜 8 위치 배당체의 제조 방법은 본 발명의 단백질과 UDP 당과 모노테르펜 화합물을 반응시켜 상기 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 공정을 포함한다. 본 발명의 방법은 추가로 상기 공정에서 생성된 모노테르펜 화합물의 8 위치 배당체를 정제하는 공정을 포함하고 있어도 된다.

모노테르펜 화합물의 8 위치 배당체는 적절한 용매 (물 등의 수성 용매 또는 알코올, 에테르 및 아세톤 등의 유기 용매) 에 의한 추출, 아세트산에틸과 그 밖의 유기 용매 : 물의 구배, 고속 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography : HPLC), 가스 크로마토그래피, 비행 시간형 질량 분석 (Time-of-Flight mass spectrometry : TOF-MS), 초고성능 액체 크로마토그래피 (Ultra (High) Performance Liquid chromatography : UPLC) 등의 공지된 방법에 의해 정제할 수 있다.

2. 모노테르펜 8 위치 배당체 고함유 비인간 형질 전환체

모노테르펜 8 위치 배당체는 본 발명의 단백질을 사용하여 세균 (대장균 또는 효모 등), 식물, 곤충, 인간을 제외한 포유 동물 등의 세포 내에서 생성할 수도 있다. 본 발명의 단백질은 애기장대에서 유래하는 효소 또는 그 변이체이기 때문에, 세포 내 환경에 있어서도 높은 활성을 갖는 것이 기대되기 때문이다. 이 경우, 본 발명의 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 (후술하는 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」를 참조) 를 세균, 식물, 곤충, 인간을 제외한 포유 동물 등에서 유래하는 숙주 세포에 도입하여 본 발명의 단백질을 발현시키고, 본 발명의 단백질과 상기 세포 내에 존재하는 UDP-당 및 모노테르펜 화합물을 반응시킴으로써 모노테르펜 8 위치 배당체를 생성할 수 있다. 본 발명의 단백질을 코드하는 유전자를 도입하여 얻어지는 비인간 형질 전환체는 그 야생형과 비교하여 모노테르펜 8 위치 배당체의 함유량이 높은 것이 기대된다.

그래서, 본 발명은 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것에 기재된 폴리뉴클레오티드 (이하, 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」라고 한다) 가 도입된 비인간 형질 전환체 (이하, 「본 발명의 형질 전환체」라고 한다) 를 제공한다.

(a) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 ;

(b) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;

(c) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;

(d) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 대해, 75 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(e) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 높은 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드

본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」란, DNA 또는 RNA 를 의미한다.

본 명세서 중, 「높은 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」란, 예를 들어, 배열 번호 1, 3, 8 혹은 10 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 배열 번호 2 혹은 9 의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로 하여, 콜로니 하이브리디제이션법, 플라크 하이브리디제이션법 또는 서던 하이브리디제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 하이브리디제이션의 방법으로는, 예를 들어, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001" 및 "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서 중, 「높은 스트린전트 조건」이란, 예를 들어, 5 × SSC, 5 × 덴하르트 용액, 0.5 ％ SDS, 50 ％ 포름아미드, 50 ℃ 또는 0.2 × SSC, 0.1 ％ SDS, 60 ℃, 0.2 × SSC, 0.1 ％ SDS, 62 ℃, 0.2 × SSC, 0.1 ％ SDS, 65 ℃ 의 조건이지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 이들 조건에 있어서, 온도를 높일수록 높은 배열 동일성을 갖는 DNA 가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리디제이션의 스트린전시에 영향을 미치는 요소로는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염 농도 등의 복수의 요소를 생각할 수 있으며, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 스트린전시를 실현할 수 있다.

또한, 하이브리디제이션에 시판되는 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어 Alkphos Direct Labelling and Detection System (GE Healthcare) 을 사용할 수 있다. 이 경우에는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라, 표지 (標識) 한 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 실시한 후, 멤브레인을 55 ∼ 60 ℃ 의 조건하에서 0.1 ％ (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 버퍼로 세정 후, 하이브리다이즈한 DNA 를 검출할 수 있다. 혹은, 배열 번호 1, 3, 8 혹은 10 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열, 또는 배열 번호 2 혹은 9 의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열의 전부 또는 일부에 기초하여 프로브를 제조할 때, 시판되는 시약 (예를 들어, PCR 라벨링 믹스 (로슈·다이아그노스틱스사) 등) 을 사용하여 그 프로브를 디곡시게닌 (DIG) 라벨한 경우에는, DIG 핵산 검출 키트 (로슈·다이아그노스틱스사) 를 사용하여 하이브리디제이션을 검출할 수 있다.

상기 이외에 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드로는, FASTA, BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해 디폴트의 파라미터를 사용하여 계산하였을 때, 배열 번호 1, 3, 8 혹은 10 의 DNA, 또는 배열 번호 2 혹은 9 의 아미노산 배열을 코드하는 DNA 와 60 ％ 이상, 61 ％ 이상, 62 ％ 이상, 63 ％ 이상, 64 ％ 이상, 65 ％ 이상, 66 ％ 이상, 67 ％ 이상, 68 ％ 이상, 69 ％ 이상, 70 ％ 이상, 71 ％ 이상, 72 ％ 이상, 73 ％ 이상, 74 ％ 이상, 75 ％ 이상, 76 ％ 이상, 77 ％ 이상, 78 ％ 이상, 79 ％ 이상, 80 ％ 이상, 81 ％ 이상, 82 ％ 이상, 83 ％ 이상, 84 ％ 이상, 85 ％ 이상, 86 ％ 이상, 87 ％ 이상, 88 ％ 이상, 89 ％ 이상, 90 ％ 이상, 91 ％ 이상, 92 ％ 이상, 93 ％ 이상, 94 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상, 99.1 ％ 이상, 99.2 ％ 이상, 99.3 ％ 이상, 99.4 ％ 이상, 99.5 ％ 이상, 99.6 ％ 이상, 99.7 ％ 이상, 99.8 ％ 이상, 또는 99.9 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.

또한, 아미노산 배열이나 염기 배열의 배열 동일성은 FASTA (Science 227 (4693) : 1435-1441, (1985)) 나 칼린 및 앨트슐에 의한 알고리즘 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990 ; Proc Natl Acad Sci USA 90 : 5873, 1993) 을 사용하여 결정할 수 있다. BLAST 의 알고리즘에 기초한 blastn, blastx, blastp, tblastn 이나 tblastx 로 불리는 프로그램이 개발되어 있다 (Altschul SF, et al : J Mol Biol 215 : 403, 1990). blastn 을 사용하여 염기 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score ＝ 100, wordlength ＝ 12 로 한다. 또, blastp 를 사용하여 아미노산 배열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score ＝ 50, wordlength ＝ 3 으로 한다. BLAST 와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.

상기한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 공지된 유전자 공학적 수법 또는 공지된 합성 수법에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 적절한 발현 벡터에 삽입된 상태에서 숙주에 도입된다.

적절한 발현 벡터는, 통상적으로,

(ⅰ) 숙주 세포 내에서 전사 가능한 프로모터 ;

(ⅱ) 그 프로모터에 결합된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 ; 및

(ⅲ) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관하여, 숙주 세포 내에서 기능하는 시그널을 구성 요소로서 포함하는 발현 카세트

를 포함하도록 구성된다.

발현 벡터의 제조 방법으로는, 플라스미드, 파지 또는 코스미드 등을 사용하는 방법을 들 수 있지만 특별히 한정되지 않는다.

벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 숙주 세포 중에서 발현 가능한 벡터가 적절히 선택될 수 있다. 즉, 숙주 세포의 종류에 따라 확실하게 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 적절히 프로모터 배열을 선택하고, 이것과 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 각종 플라스미드 등에 삽입된 벡터를 발현 벡터로서 사용하면 된다.

본 발명의 발현 벡터는 도입되어야 하는 숙주의 종류에 의존하여 발현 제어 영역 (예를 들어, 프로모터, 터미네이터 및/또는 복제 기점 등) 을 함유한다. 세균용 발현 벡터의 프로모터로는 관용적인 프로모터 (예를 들어, trc 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등) 가 사용되고, 효모용 프로모터로는 예를 들어, 글리세르알데히드3인산데히드로게나아제 프로모터, PH05 프로모터 등을 들 수 있고, 사상균용 프로모터로는 예를 들어, 아밀라아제, trpC 등을 들 수 있다. 또, 식물 세포 내에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 프로모터의 예로는, 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S RNA 프로모터, rd29A 유전자 프로모터, rbcS 프로모터, 상기 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S RNA 프로모터의 인핸서 배열을 아그로박테리움 유래의 만노핀 합성 효소 프로모터 배열의 5' 측에 부가한 mac-1 프로모터 등을 들 수 있다. 동물 세포 숙주용 프로모터로는, 바이러스성 프로모터 (예를 들어, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터 등) 를 들 수 있다.

발현 벡터는 적어도 1 개의 선택 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같은 마커로는, 영양 요구성 마커 (ura5, niaD), 약제 내성 마커 (hygromycine, 제오신), 게네티신 내성 유전자 (G418r), 구리 내성 유전자 (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984), 세룰레닌 내성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각, 이노코시 준지 등, 생화학, vol. 64, p. 660, 1992 ; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 형질 전환체의 제조 방법 (생산 방법) 은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환하는 방법을 들 수 있다. 여기서 사용되는 숙주 세포는 특별히 한정되는 것은 아니며, 종래 공지된 각종 세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli) 등의 세균, 효모 (출아 효모 Saccharomyces cerevisiae, 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe), 식물 세포, 인간을 제외한 동물 세포 등을 들 수 있다.

상기 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당 분야에서 주지이다. 또, 형질 전환의 대상이 되는 생물도 특별히 한정되는 것은 아니며, 상기 숙주 세포에서 예시한 각종 미생물 또는 식물 또는 인간을 제외한 동물을 들 수 있다.

숙주 세포의 형질 전환 방법으로는 일반적으로 사용되는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션법 (Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000), 파티클 딜리버리법 (일본 공개특허공보 2005-287403호「지질 생산균의 육종 방법」에 기재된 방법), 스페로플라스트법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), 아세트산리튬법 (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983), Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법) 으로 실시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

그 밖에, 일반적인 분자 생물학적인 수법에 관해서는, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)" 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 형질 전환체는 식물 형질 전환체일 수 있다. 본 실시형태에 관련된 식물 형질 전환체는 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터를 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드가 발현될 수 있도록 식물 중에 도입함으로써 취득된다.

재조합 발현 벡터를 사용하는 경우, 식물체의 형질 전환에 사용되는 재조합 발현 벡터는 당해 식물 내에서 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 벡터이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 벡터로는, 예를 들어, 식물 세포 내에서 폴리뉴클레오티드를 구성적으로 발현시키는 프로모터를 갖는 벡터 또는 외적인 자극에 의해 유도적으로 활성화되는 프로모터를 갖는 벡터를 들 수 있다.

식물 세포 내에서 폴리뉴클레오티드를 구성적으로 발현시키는 프로모터의 예로는, 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S RNA 프로모터, rd29A 유전자 프로모터, rbcS 프로모터, mac-1 프로모터 등을 들 수 있다.

외적인 자극에 의해 유도성으로 활성화되는 프로모터의 예로는, mouse mammary tumor virus (MMTV) 프로모터, 테트라사이클린 응답성 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 및 히트 쇼크 프로테인 프로모터 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 형질 전환의 대상이 되는 식물은 식물체 전체, 식물 기관 (예를 들어 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자 등), 식물 조직 (예를 들어 표피, 사부, 유조직, 목부, 유관속, 책상 조직, 해면상 조직 등) 또는 식물 배양 세포, 혹은 여러 가지 형태의 식물 세포 (예를 들어, 현탁 배양 세포), 프로토플라스트, 잎의 절편, 캘러스 등 중 어느 것을 의미한다. 형질 전환에 사용되는 식물로는 특별히 한정되지 않으며, 단자엽 식물강 또는 쌍자엽 식물강에 속하는 식물 중 어느 것이어도 된다.

식물로의 유전자의 도입에는, 당업자에게 공지된 형질 전환 방법 (예를 들어, 아그로박테리움법, 유전자총법, PEG 법, 일렉트로포레이션법 등) 이 사용된다. 예를 들어, 아그로박테리움을 통한 방법과 직접 식물 세포에 도입하는 방법이 주지이다. 아그로박테리움법을 사용하는 경우에는, 구축한 식물용 발현 벡터를 적당한 아그로박테리움 (예를 들어, 아그로박테리움·튜머퍼시언스) 에 도입하고, 이 주를 리프 디스크법 (우치미야 히로후미 저술, 식물 유전자 조작 메뉴얼 (1990) 27 ∼ 31 페이지, 코단샤 사이언티픽, 도쿄) 등에 따라 무균 배양 엽편에 감염시켜 형질 전환 식물을 얻을 수 있다. 또, Nagel et al 의 방법 (Micribiol. Lett., 67 : 325 (1990)) 이 사용될 수 있다. 이 방법은, 먼저, 예를 들어 발현 벡터를 아그로박테리움에 도입하고, 이어서 형질 전환된 아그로박테리움을 Plant Molecular Biology Manual (Gelvin, S.B. et al., Academic Press Publishers) 에 기재된 방법으로 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법이다. 여기서, 「식물 조직」이란, 식물 세포의 배양에 의해 얻어지는 캘러스를 포함한다. 아그로박테리움법을 사용하여 형질 전환을 실시하는 경우에는, 바이너리 벡터 (pBI121 또는 pPZP202 등) 를 사용할 수 있다.

또, 유전자를 직접 식물 세포 또는 식물 조직에 도입하는 방법으로는, 일렉트로포레이션법, 파티클건법이 알려져 있다. 파티클건을 사용하는 경우에는, 식물체, 식물 기관, 식물 조직 자체를 그대로 사용해도 되고, 절편을 조제한 후에 사용해도 되고, 프로토플라스트를 조제하여 사용해도 된다. 이와 같이 조제한 시료를 유전자 도입 장치 (예를 들어 PDS-1000 (BIO-RAD 사) 등) 를 사용하여 처리할 수 있다. 처리 조건은 식물 또는 시료에 따라 상이한데, 통상적으로는 450 ∼ 2000 psi 정도의 압력, 4 ∼ 12 ㎝ 정도의 거리에서 실시한다.

유전자가 도입된 세포 또는 식물 조직은 먼저 하이그로마이신 내성 등의 약제 내성에 의해 선택되고, 이어서 정법에 의해 식물체에 재생된다. 형질 전환 세포로부터 식물체의 재생은 식물 세포의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법으로 실시할 수 있다.

식물 배양 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 형질 전환은 재조합 벡터를 유전자총, 일렉트로포레이션법 등으로 배양 세포에 도입한다. 형질 전환의 결과 얻어지는 캘러스나 슈트, 모상근 등은 그대로 세포 배양, 조직 배양 또는 기관 배양에 사용할 수 있고, 또 종래 알려져 있는 식물 조직 배양법을 사용하여 적당한 농도의 식물 호르몬 (옥신, 시토키닌, 지베렐린, 아브시스산, 에틸렌, 브라시놀리드 등) 의 투여 등에 의해 식물체에 재생시킬 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드가 식물에 도입되었는지의 여부의 확인은 PCR 법, 서던 하이브리디제이션법, 노던 하이브리디제이션법 등에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 형질 전환 식물로부터 DNA 를 조제하고, DNA 특이적 프라이머를 설계하여 PCR 을 실시한다. PCR 은 상기 플라스미드를 조제하기 위해 사용한 조건과 동일한 조건으로 실시할 수 있다. 그 후에는, 증폭 산물에 대해 아가로오스 겔 전기 영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 캐필러리 전기 영동 등을 실시하고, 브롬화 에티듐, SYBR Green 액 등에 의해 염색하고, 그리고 증폭 산물을 1 개의 밴드로서 검출함으로써 형질 전환된 것을 확인할 수 있다. 또, 미리 형광 색소 등에 의해 표지한 프라이머를 사용해서 PCR 을 실시하여 증폭 산물을 검출할 수도 있다. 또한, 마이크로 플레이트 등의 고상에 증폭 산물을 결합시키고, 형광 또는 효소 반응 등에 의해 증폭 산물을 확인하는 방법도 채용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에 삽입된 형질 전환 식물체가 일단 취득되면, 당해 식물체의 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻을 수 있다. 또, 당해 식물체 또는 그 자손, 혹은 이들의 클론으로부터, 예를 들어, 종자, 과실, 꺾꽂이순, 덩이줄기, 덩이뿌리, 그루터기, 캘러스, 프로토플라스트 등을 얻고 그것들을 기초로 당해 식물체를 양산할 수 있다. 따라서, 본 발명에는, 본 발명에 관련된 폴리뉴클레오티드가 발현 가능하게 도입된 식물체, 혹은 당해 식물체와 동일한 성질을 갖는 당해 식물체의 자손, 또는 이들 유래의 조직도 포함된다.

또, 여러 가지 식물에 대한 형질 전환 방법이 이미 보고되어 있다. 본 발명에 관련된 형질 전환체 식물로는, 가지과 식물 (예를 들어, 가지, 토마토, 고추, 감자, 담배, 흰독말풀, 꽈리, 피튜니아, 칼리브라코아, 니에렘베르기아 등), 콩과 식물 (예를 들어, 대두, 팥, 땅콩, 강낭콩, 누에콩, 벌노랑이 등), 장미과 식물 (예를 들어, 딸기, 매화, 벚나무, 장미, 블루베리, 블랙베리, 빌베리, 카시스, 라즈베리 등), 패랭이꽃과 식물 (카네이션, 안개꽃 등), 국화과 식물 (국화, 거베라, 해바라기, 데이지 등), 난초과 식물 (난초 등), 앵초과 식물 (시클라멘 등), 용담과 식물 (꽃도라지, 용담 등), 붓꽃과 식물 (프리지어, 붓꽃, 글라디올러스 등), 현삼과 식물 (금어초, 한해살이풀 등), 꿩의비름 (칼랑코에), 백합과 식물 (백합, 튤립 등), 메꽃과 식물 (나팔꽃, 미국 나팔꽃, 밤메꽃, 고구마, 유홍초, 에볼블루스 등), 수국과 식물 (수국, 병꽃나무 등), 박과 식물 (박 등), 쥐손이풀과 식물 (펠라르고늄, 제라늄 등), 물푸레나무과 식물 (개나리 등), 포도과 식물 (예를 들어, 포도 등), 동백나무과 식물 (동백나무, 차나무 등), 벼과 식물 (예를 들어, 벼, 보리, 밀, 귀리, 호밀, 옥수수, 조, 피, 고량, 사탕수수, 대나무, 메귀리, 향모, 수수, 줄, 율무, 목초 등), 뽕나무과 식물 (뽕나무, 홉, 닥나무, 고무나무, 삼 등), 꼭두서니과 식물 (커피나무, 치자나무 등), 너도밤나무과 식물 (졸참나무, 너도밤나무, 떡갈나무 등), 참깨과 식물 (참깨 등), 밀감과 식물 (예를 들어, 등자, 유자, 온주 밀감, 산초나무) 및 십자화과 식물 (붉은 양배추, 모란채, 왜무, 백냉이, 유채, 양배추, 브로콜리, 콜리플라워 등), 차조기과 (샐비어, 차조기, 라벤더, 황금 등) 를 들 수 있다. 식물의 바람직한 예로는, 방향성을 갖는 식물, 예를 들어, 차조기나 라벤더 등, 혹은 본래 그다지 방향을 갖고 있지 않지만 상업적 가치가 높은 원예 식물, 예를 들어, 카네이션 등을 들 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질 전환된 식물체 (이하, 「본 발명의 식물」또는 「본 발명의 식물체」) 는 그 야생형과 비교하여 모노테르펜 화합물의 8 위치 배당체를 많이 함유한다.

본 발명의 식물은 본 발명의 식물의 종자, 꺾꽂이, 구근 등을 육성함으로써 용이하게 완전한 식물체를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 식물에는, 식물체 전체, 식물 기관 (예를 들어 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자, 구근 등), 식물 조직 (예를 들어 표피, 사부, 유조직, 목부, 유관속, 책상 조직, 해면상 조직 등) 또는 식물 배양 세포, 혹은 여러 가지 형태의 식물 세포 (예를 들어, 현탁 배양 세포), 프로토플라스트, 잎의 절편, 캘러스 등이 포함된다.

3. 형질 전환체의 추출물 및 그 이용

본 발명은 또, 다른 실시형태에 있어서, 상기 형질 전환체의 추출물을 제공한다. 본 발명의 형질 전환체는, 그 야생형과 비교하여 모노테르펜 8 위치 배당체의 함유량이 많기 때문에, 그 추출물에는 모노테르펜 8 위치 배당체가 고농도로 함유되는 것으로 생각된다.

본 발명의 형질 전환체의 추출물은 형질 전환체를 유리 비즈, 호모게나이저 또는 소니케이터 등을 사용하여 파쇄하고, 당해 파쇄물을 원심 처리하고, 그 상청을 회수함으로써 얻을 수 있다. 또한, 상기에서 서술한 모노테르펜 8 위치 배당체의 추출 방법에 따라 추가적인 추출 공정을 실시해도 된다.

본 발명의 형질 전환체의 추출물은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 식품, 향료, 의약품, 공업 원료 (화장료, 비누 등의 원료) 의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다.

본 발명은 또, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 형질 전환체의 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약, 공업 원료 (화장료, 비누 등의 원료) 를 제공한다. 본 발명의 형질 전환체의 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약, 공업 원료의 조제는 통상적인 방법에 따른다. 이와 같이, 본 발명의 형질 전환체의 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약, 공업 원료 등은 본 발명의 형질 전환체를 사용하여 생성된 모노테르펜 8 위치 배당체를 함유한다.

본 발명의 향료 (조성물) 또는 의약품 (조성물) 의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 용액상, 페이스트상, 겔상, 고체상, 분말상 등 임의의 제형을 취할 수 있다. 또, 본 발명의 향료 조성물 또는 의약 조성물은, 오일, 로션, 크림, 유액, 겔, 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 에나멜, 파운데이션, 립스틱, 분, 팩, 연고, 향수, 파우더, 오드콜로뉴, 치약, 비누, 에어로졸, 클렌징폼 등의 화장료 혹은 피부 외용약 외에, 욕용제, 양모제, 피부 미용액, 자외선 방지제 등에 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 필요에 따라 추가로 그 밖의 유지 및/또는 색소, 향료, 방부제, 계면 활성제, 안료, 산화 방지제 등을 적절히 배합할 수 있다. 이들의 배합 비율은 목적에 따라 당업자가 적절히 결정할 수 있다 (예를 들어, 유지는 조성물 중에 1 ∼ 99.99 중량％, 바람직하게는 5 ∼ 99.99 중량％, 보다 바람직하게는 10 ∼ 99.95 중량％ 함유될 수 있다). 또, 본 발명의 의약 조성물은 필요에 따라 추가로 그 밖의 의약 활성 성분 (예를 들어, 소염 성분) 또는 보조 성분 (예를 들어, 윤활 성분, 담체 성분) 을 함유하고 있어도 된다.

본 발명의 식품의 예로는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 노인용 식품 등을 들 수 있다. 본 명세서 중, 식품은 고체, 유동체 및 액체, 그리고 그들의 혼합물로서, 섭식 가능한 것의 총칭이다.

영양 보조 식품이란, 특정 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적이거나 또는 건강에 좋다고 여겨지는 식품을 말하고, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등을 포함한다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하고, 특정 보건 용도 식품과 동일한 의미이다. 유아용 식품이란, 약 6 세까지의 아이에게 주기 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 무처리의 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다.

이들 식품의 형태의 예로는, 빵, 면류, 밥, 과자류 (캔디, 추잉껌, 구미, 정과 (錠菓), 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품, 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품, 요구르트, 햄, 베이컨, 소세지 등의 축산 식품, 어묵, 유부, 한펜 (半片) 등의 수산 식품, 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알코올 음료, 차 등 또는 조미료이어도 된다.

4. 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현이 억제된 식물

식물 중에 내재적으로 존재하는 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질의 발현을 억제함으로써, 모노테르펜의 배당체화가 저해된다. 그 결과, 당해 식물에서는, 보다 많은 모노테르펜이 아글리콘으로서 존재하게 되어, 보다 강한 방향이 발해지는 것을 기대할 수 있다.

그래서, 본 발명은 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질의 발현이 억제된 식물을 제공한다.

모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질 (이하, 「모노테르펜 8 위치 배당체화 효소」라고 한다) 이란, 구체적으로는 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드된다.

(a) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 ;

(b) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;

(c) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;

(d) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 대해, 75 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ; 및

(e) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 높은 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드

(a) ∼ (e) 의 폴리뉴클레오티드의 정의 등에 대해서는, 「2. 모노테르펜 8 위치 배당체 고함유 비인간 형질 전환체」에서 서술한 바와 같다.

모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현을 억제하는 방법의 구체예로는, 당해 효소의 메신저 RNA (mRNA) 의 발현량을 저하시키는 물질, 예를 들어, 저분자 화합물, 호르몬, 단백질 및 핵산 등을 들 수 있고, 하나의 실시양태에서는, 상기 효소를 코드하는 유전자의 기능 또는 발현을 억제하는 핵산이다. 이와 같은 핵산의 예로는, RNA 간섭 (RNAi) 용의 siRNA (small interfering RNA 를 생성시키는 헤어핀상의 shRNA (Short Hairpin RNA), 2 개 사슬 RNA (Double Stranded RNA : dsRNA), 안티센스 핵산, 디코이 핵산, 또는 압타머 등을 들 수 있다. 이들 저해성 핵산에 의해 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 저해의 대상이 되는 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자는 상기 (a) ∼ (e) 의 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 각각 배열 정보를 입수할 수 있다. 본 발명에 있어서, 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자의 코드 영역뿐만 아니라, 비코드 영역을 저해 대상 영역으로서 사용할 수도 있다.

RNA 간섭 (RNAi) 은 복수의 단계를 거쳐 실시되는 멀티 스텝 프로세스이다. 우선, RNAi 발현 벡터로부터 발현된 dsRNA 또는 shRNA 가 Dicer 에 의해 인식되고, 21 ∼ 23 뉴클레오티드의 siRNAs 에 분해된다. 다음으로, siRNAs 는 RNA 유도형 사일런싱 복합체 (RNA-Induced Silencing Complex : RISC) 로 불리는 RNAi 표적 복합체에 삽입되고, RISC 와 siRNAs 의 복합체가 siRNA 의 배열과 상보적인 배열을 포함하는 표적 mRNA 에 결합되어 mRNA 를 분해한다. 표적 mRNA 는 siRNA 에 상보적인 영역의 중앙에서 절단되고, 최종적으로 표적 mRNA 가 신속하게 분해되어 단백 발현량이 저하된다. 가장 효력이 높은 siRNA 이중 사슬은 19 bp 의 이중 사슬의 각 3' 말단에 우리딘 잔기 2 개의 돌출 부분을 갖는 21 뉴클레오티드 길이의 배열인 것이 알려져 있다 (Elbashir S.M. et al., Genes and Dev, 15, 188-200 (2001)).

일반적으로 mRNA 상의 표적 배열은 mRNA 에 대응하는 cDNA 배열에서 선택할 수 있다. 단, 본 발명에 있어서는 이 영역에 한정되는 것은 아니다.

siRNA 분자는 당 분야에 있어서 주지의 기준에 기초하여 설계할 수 있다. 예를 들어, 표적 mRNA 의 표적 세그먼트는 바람직하게는 AA, TA, GA 또는 CA 에서 시작되는 연속하는 15 ∼ 30 염기, 바람직하게는 19 ∼ 25 염기의 세그먼트를 선택할 수 있다. siRNA 분자의 GC 비는 30 ∼ 70 ％, 바람직하게는 35 ∼ 55 ％ 이다. 혹은, RNAi 의 표적 배열은 Ui-Tei K. et al. ((2004) Nucleic Acids Res. 32, 936-948) 의 기재를 따라 적절히 선택할 수 있다.

siRNA 를 세포에 도입하려면, 합성된 siRNA 를 플라스미드 DNA 에 연결하여 이것을 세포에 도입하는 방법, 2 개 사슬 RNA 를 어닐하는 방법 등을 채용할 수 있다.

또, 본 발명은 RNAi 효과를 가져오기 위해 shRNA 를 사용할 수도 있다. shRNA 란, 쇼트 헤어핀 RNA 로 불리고, 1 개 사슬의 일부의 영역이 다른 영역과 상보 사슬을 형성하기 위해 스템 루프 구조를 갖는 RNA 분자이다.

shRNA 는 그 일부가 스템 루프 구조를 형성하도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 어느 영역의 배열을 배열 A 로 하고, 배열 A 에 대한 상보 사슬을 배열 B 로 하면, 배열 A, 스페이서, 배열 B 의 순서로 이들 배열이 1 개의 RNA 사슬에 존재하도록 연결하여, 전체가 45 ∼ 60 염기의 길이가 되도록 설계한다. 스페이서의 길이도 특별히 한정되는 것은 아니다.

배열 A 는 표적이 되는 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자의 일부의 영역의 배열이고, 표적 영역은 특별히 한정되는 것이 아니며, 임의의 영역을 후보로 할 수 있다. 그리고 배열 A 의 길이는 19 ∼ 25 염기, 바람직하게는 19 ∼ 21 염기이다.

또한 본 발명은 마이크로 RNA 를 사용하여 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현을 저해할 수 있다. 마이크로 RNA (miRNA) 란, 세포 내에 존재하는 길이 20 ∼ 25 염기 정도의 1 개 사슬 RNA 로, 다른 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 것으로 생각되고 있는 ncRNA (non coding RNA) 의 일종이다. miRNA 는 RNA 에 전사되었을 때에 프로세싱을 받아 생성되어, 표적 배열의 발현을 억제하는 헤어핀 구조를 형성하는 핵산으로서 존재한다.

miRNA 도 RNAi 에 기초하는 저해성 핵산이기 때문에, shRNA 또는 siRNA 에 준하여 설계하고 합성할 수 있다.

RNAi 용의 발현 벡터는 pMuniH1 플라스미드, pSINsi 벡터 (다카라 바이오), pSIF1-H1 (시스템 바이오 사이언스사) 등을 베이스로, 시판되는 DNA/RNA 신디사이저 (예를 들어, Applied Biosystems394 형) 를 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. RNAi 용의 발현 벡터의 예로는, 예를 들어, pSPB1876 (국제 공개공보 WO2004/071467) 을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. RNAi 용의 발현 벡터는 코스모·바이오 주식회사, 다카라·바이오 주식회사, Invitrogen 사, Promega 사 등의 제삼자 기관에 제조를 위탁할 수도 있다.

모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현이 억제된 식물의 제조 방법은 이하의 공정을 포함하고 있어도 된다.

(1) 숙주 식물 또는 그 일부에 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소에 대한 RNAi 용의 발현 벡터 (예를 들어, siRNA 발현 벡터 또는 miRNA 발현 벡터를 도입하는 공정

숙주 식물에 RNAi 용의 발현 벡터를 도입하는 방법은 항목 「2. 모노테르펜 8 위치 배당체 고함유 비인간 형질 전환체」에 서술한 방법과 동일하다. 숙주 식물은 식물체 전체 또는 그 일부인 식물 기관 (예를 들어 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자 등), 식물 조직 (예를 들어 표피, 사부, 유조직, 목부, 유관속, 책상 조직, 해면상 조직 등) 또는 식물 배양 세포, 혹은 여러 가지 형태의 식물 세포 (예를 들어, 현탁 배양 세포), 프로토플라스트, 잎의 절편, 캘러스 등 중 어느 것이어도 된다. 식물의 종류에 대해서도 항목 「2. 모노테르펜 8 위치 배당체 고함유 비인간 형질 전환체」에 서술한 것과 동일하다.

(2) 상기 공정 (1) 에 의해 얻어진 형질 전환 식물을 육성하는 공정

상기 공정 (1) 에서 사용한 숙주 식물이 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 프로토플라스트, 잎의 절편 또는 캘러스와 같은 식물체의 일부인 경우에는, 완전한 식물체를 형성할 때까지 형질 전환체를 적절한 환경에서 육성해도 된다. 식물체의 일부로부터 완전한 식물체를 육성하는 방법에 대해서는, 이하의 문헌의 기재를 참조할 수 있다 : 생물 화학 실험법 41 식물 세포 공학 입문 학회 출판 센터 ISBN 4-7622-1899-5.

이와 같이 하여 얻어진 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자의 발현이 억제된 식물을 재배함으로써, 효율적으로 모노테르펜·아글리콘을 제조할 수 있다.

5. 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자의 발현이 억제된 식물의 가공 제품

현대에서는 생화 (예를 들어, 토양 육성 식물, 분재 식물, 자른 꽃가지 등) 뿐만 아니라, 생화의 가공 제품도 식물 관상용 제품으로서 판매되고 있다. 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자의 발현이 억제된 식물은 방향이 강하기 때문에, 이와 같은 생화의 가공 제품의 재료로서도 매우 유용하다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태로서 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소 유전자의 발현이 억제된 식물 (예를 들어, 생화, 자른 꽃가지) 또는 그 일부 (예를 들어, 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 종자, 구근 등) 의 가공 제품을 들 수 있다. 상기 가공 제품의 예로는, 말린 꽃, 드라이 플라워, 프리저브드 플라워, 매테리얼 플라워, 수지 밀봉품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

6. 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현이 억제된 식물의 추출물 및 그 이용

본 발명은 또, 다른 실시형태에 있어서, 상기 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현이 억제된 식물의 추출물을 제공한다. 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현이 억제된 식물은, 그 야생형과 비교하여 모노테르펜·아글리콘의 함유량이 높기 때문에, 그 추출물에는 모노테르펜·아글리콘이 고농도로 함유되는 것으로 생각된다.

상기 추출물의 추출 방법은 상기에서 서술한 본 발명의 형질 전환체의 추출물의 추출 방법과 동일하다.

이와 같이 하여 얻어진 추출물은 통상적인 방법에 따라 예를 들어, 식품, 향료, 의약품, 공업 원료 (화장료, 비누 등의 원료) 의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다.

본 발명은 또, 다른 실시형태에 있어서, 상기 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약, 공업 원료 (화장료, 비누 등의 원료) 를 제공한다. 상기 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약, 공업 원료의 조제는 통상적인 방법에 따른다. 이와 같이, 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현이 억제된 식물의 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약, 공업 원료 등은 모노테르펜 8 위치 배당체화 효소의 발현이 억제된 식물을 사용하여 생성된 모노테르펜·아글리콘을 함유한다.

본 발명의 식품, 향료, 의약, 공업 원료 등의 종류 및 조성 등은 앞선 항목 「3. 형질 전환체의 추출물 및 그 이용」에서 서술한 것과 동일하다.

7. 테르펜 8 위치 배당체 함유량이 높은 식물 또는 모노테르펜·아글리콘 함유량이 높은 식물을 스크리닝하는 방법

본 발명은 모노테르펜·아글리콘 함유량이 높은 식물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 방법은 이하의 (1) ∼ (3) 의 공정을 포함한다.

(1) 피검식물로부터 mRNA 를 추출하는 공정

(2) 상기 mRNA 또는 상기 mRNA 로부터 조제한 cDNA 와, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 높은 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 하이브리다이즈시키는 공정

(3) 상기 하이브리디제이션을 검출하는 공정

상기 공정 (1) 은 피검식물로부터 mRNA 를 추출함으로써 실시할 수 있다. mRNA 를 추출하는 피검식물의 부위는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 꽃잎이다. mRNA 를 추출한 경우에는, 역전사함으로써 mRNA 로부터 cDNA 를 조제해도 된다.

공정 (2) 는 상기에서 추출한 mRNA 에 대해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드를 프로브 또는 프라이머로 하여, 높은 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈시킴으로써 실시할 수 있다. 높은 스트린전트 조건은 이미 서술한 바와 같다. 폴리뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 5 ∼ 500 bp, 보다 바람직하게는 10 ∼ 200 bp, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 100 bp 의 길이이다. 폴리뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드는 각종 자동 합성 장치 (예를 들어, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)) 를 사용하여 용이하게 합성할 수 있고, 혹은 제삼자 기관 (예를 들어, Promega 사 또는 Takara 사) 등에 위탁할 수도 있다.

공정 (2) 에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 프로브로서 사용한 경우에는, 공정 (3) 은 통상적인 서던 블로팅, 노던 블로팅 (Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning : A Laboratory Manual" 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), 마이크로 어레이 (Affymetrix 사 ; 미국 특허 제6,045,996호, 동 제5,925,525호 및 동 제5,858,659호 참조), TaqMan PCR (Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning : A Laboratory Manual" 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), 또는 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)(Sieben V.J. et al., (2007-06). IET Nanobiotechnology 1 (3) : 27-35) 등의 하이브리디제이션 검출 방법에 의해 실시할 수 있다. 한편, 공정 (2) 에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 사용한 경우에는, 공정 (3) 은 PCR 증폭 반응을 실시하고, 얻어진 증폭 산물을 전기 영동 또는 시퀀싱 (Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning : A Laboratory Manual" 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) 등에 의해 해석함으로써, 하이브리디제이션을 검출할 수 있다.

하이브리디제이션이 보다 많이 검출된 식물체는 다른 식물체와 비교하여 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질을 보다 많이 발현하고 있다고 할 수 있으므로, 테르펜 8 위치 배당체 함유량이 많을 것이 예측된다.

한편, 하이브리디제이션이 보다 적게 검출된 식물체는 다른 식물체와 비교하여 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질의 발현이 낮기 때문에, 모노테르펜·아글리콘 함유량이 많고, 특히 개화시에 강한 방향을 발할 것이 예측된다.

실시예

이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

[실시예 1] 후보 유전자의 단리

본 실시예에 있어서 사용하는 분자 생물학적 수법은, 달리 상세하게 서술하지 않는 한, Molecular Cloning (Sambrookra, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001) 에 기재된 방법에 따랐다.

애기장대에 있어서는 모노테르펜의 일종인 리날로올의 8 위치의 수산기에 글루코오스가 부가된 것이 축적되어 있는 것으로 보고되어 있다 (도 1) (비특허문헌 1). 리날로올 합성과 그 배당체화는 시공적·공간적으로 협조하고 있다는 가설에 기초하여 애기장대의 리날로올 합성 효소 (S-Linalool synthase (LIS) : At1g69680) 와 공발현하는 유전자를 ATTED-Ⅱ 공발현 해석을 실시하였다 (http://prime.psc.riken.jp/?action＝coexpression_index). 그 결과, 백 수십 종류의 후보 유전자 중에서 리날로올 합성 효소와 발현 계수 0.89 로 높은 상관을 나타내는 후보 UGT 유전자로서 UGT85A3 (At1g22380) 을 알아냈다. 이들 2 종의 유전자를 eFP 브라우저로 가시화한 결과 (http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi) (비특허문헌 13), 양 유전자는 특히 꽃에서 강하게 발현하는 것이 밝혀졌다 (도 2). 리날로올의 8 위치에 수산기를 도입하는 효소로서 알려져 있는 시토크롬 P450 효소인 CYP76C1 및 그 호모 로그인 CYP76C3 에 대해서도 꽃잎에서 강하게 발현하였다 (도 3) (특허문헌 1). CYP76C3 에 대해서는 LIS 유전자와 0.82 라는 강한 발현 상관을 나타냈다. 이상의 결과로부터, UGT85A3 는 LIS 및 CYP76C1/C3 과 주로 꽃잎 세포 내에 있어서 협조적인 역할을 하고 있는 것이 강하게 시사되었다.

[실시예 2] UGT85A3 발현 벡터의 구축

UGT85A3 의 완전 길이 ORF (배열 번호 5) 를 하기의 제한 효소 사이트를 부가한 프라이머 (배열 번호 6, 7) 를 사용하여 PCR 법에 의해 증폭시켰다. 또한, 프라이머 중의 밑줄을 그은 염기 배열은 프라이머에 부가한 제한 효소 인식 배열이다.

PCR 반응액 (50㎕) 은 애기장대 꽃잎 유래 cDNA 1 ㎕, 1 × ExTaq buffer (TaKaRaBio), 0.2 mM dNTPs, 프라이머 각 0.4 p㏖/㎕, ExTaq polymerase 2.5 U 로 이루어지는 조성으로 하였다. PCR 반응은, 94 ℃ 에서 3 분간 반응시킨 후, 94 ℃ 에서 1 분간, 50 ℃ 에서 1 분간, 72 ℃ 에서 2 분간의 반응을 합계 30 사이클의 증폭을 실시하였다. PCR 산물을 0.8 ％ 아가로오스 겔에 의한 전기 영동하고, 에티듐브로마이드 염색한 결과, 각각의 주형 DNA 로부터 추정된 약 1.4 kb 의 사이즈로 증폭 밴드가 얻어졌다.

이들 PCR 산물은 pENTR-TOPO Directional 벡터 (Invitrogen) 에 제조업자가 추장하는 방법으로 서브 클로닝하였다. DNA Sequencer model 3100 (Applied Biosystems) 을 사용하여, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 프라이머 워킹법에 의해 삽입 단편 내에 PCR 에 의한 변이가 없는 것을 확인하였다.

프라이머에 부가된 NdeI 및 XhoI 의 제한 효소 부위를 이용하여 약 1.4 kb 의 UGT85A3 단편을 잘라내고, 대장균 발현 벡터인 pET15b (Novagen 사) 의 NdeI 및 XhoI 사이트로 연결하여, 본 효소 유전자의 대장균 발현 벡터를 얻었다. 본 벡터 NdeI 사이트 상류에 있는 His 태그와 UGT85A3 유전자의 오픈 리딩 프레임이 합쳐져, UGT85A3 와 His 태그가 융합된 키메라 단백질이 발현하도록 설계하였다.

[실시예 3] 효소 발현 및 정제

본 효소의 생화학적인 기능을 밝히기 위해 본 효소를 대장균에서 발현시켰다. 상기에서 얻어진 UGT85A3 대장균 발현용 플라스미드를 사용하여 정법에 따라 대장균 BL21 (DE3) 주를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체를 50 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 LB 배지 (10 g/ℓ typtone pepton, 5 g/ℓ yeast extract, 1 g/ℓ NaCl) 4 ㎖ 로 37 ℃ 에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 정지기에 이른 배양액 4 ㎖ 를 동 조성의 배지 80 ㎖ 에 접종하고, 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 균체 탁도 (OD600) 가 대략 0.5 에 도달한 시점에서 최종농도 0.5 mM 의 IPTG 를 첨가하고, 18 ℃ 에서 20 hr 진탕 배양하였다.

이하의 모든 조작은 4 ℃ 에서 실시하였다. 배양된 형질 전환체를 원심 분리 (5,000 × g, 10 min) 로 집균하고, Buffer S [20 mM HEPES 버퍼 (pH 7.5), 20 mM imidazol, 14 mM β-메르캅토에탄올] 1 ㎖/g cell 을 첨가하여 현탁하였다. 계속해서, 초음파 파쇄 (15 sec × 8 회) 를 실시하고, 원심 분리 (15,000 × g, 15 min) 를 실시하였다. 얻어진 상청을 조 (粗) 효소액으로서 회수하였다. 조효소액을 Buffer S 로 평형화한 His SpinTrap (GE Healthcare) 에 부하하고, 원심분리 (70 × g, 30 sec) 하였다. Buffer 로 세정 후, 100 mM 및 500 mM 의 imidazole 을 함유하는 Buffer S 각 5 ㎖ 로 칼럼에 결합한 단백질을 단계적으로 용출하였다. 각 용출 획분을 Microcon YM-30 (Amicon) 을 사용하여 20 mM HEPES 버퍼 (pH 7.5), 14 mM β-메르캅토에탄올에 버퍼 치환하였다 (투석 배율 1000 배).

SDS-PAGE 분리 후의 CBB 염색의 결과, 200 mM imidazole 용출 획분에 있어서 HisTag 융합 UGT85A3 키메라 단백질의 추정 분자량 약 56.7 kDa 부근에 단백질을 확인하였기 때문에, 이 획분을 효소 해석에 사용하였다 (도 4).

[실시예 4] 활성 측정

표준적인 효소 반응 조건은 이하와 같다. 반응액 (2 mM UDP-글루코오스, 1.5 mM 당수용체 기질, 100 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 7.5), 정제 UGT85A3 효소 용액 25 ㎕) 을 증류수로 50 ㎕ 로 조제하고, 30 ℃, 1 시간 반응시켰다.

효소 반응액 5 ㎕ 를 하기의 조건으로 LC-MS 분석을 실시하였다.

LC condition

칼럼 : CAPCELL PAK C18-UG120 (2.0 ㎜ I.D. × 150 ㎜)

이동상 : A : 물 (＋0.05 ％ 포름산 함유), B : 아세토니트릴

그라디언트 : 15 분간의 B 농도 15 ％ 내지 90 ％ 에 대한 직선 농도 구배

유속 : 매분 0.2 ㎖

칼럼 오븐 : 40 ℃

MS condition

ESI (negative mode)

SIM mode : (m/z 315, 338, 361, 363, 331, 354, 377, 429 etc)

4 종의 모노테르펜 (게라니올, 8-하이드록시게라니올, 리날로올, 8-하이드록시리날로올) 과의 반응액에 있어서 생성되는 것으로 생각되는 생성물의 정보를 도 5 에 나타낸다.

효소 반응액의 분석 결과, 8-하이드록시게라니올 및 8-하이드록시리날로올에 대해 글루코오스가 1 분자 부가된 것으로 생각되는 분자량의 피크가 얻어졌다 (도 6A 및 도 6B). 이들의 유지 시간은 게라니올모노글루코사이드 및 리날로올 8-O-모노글루코사이드의 합성 표준품과 일치하였다. 이들의 피크는 빈 벡터구에서는 확인되지 않았기 때문에, UGT85A3 에 의해 부여된 것을 확인할 수 있었다. 또한 게라니올과 리날로올 중 어느 경우에 있어서도 8 위치 수산화체에 대한 활성이 높았기 때문에 (도 7), UGT85A3 은 모노테르펜의 8 위치 수산기에 높은 특이성을 갖는 배당체화 효소인 것이 판명되었다. 본 효소의 당공여체 선택성을 밝히기 위해 8-하이드록시게라니올을 당수용체로 하여 UDP- 가 락토오스 또는 UDP-글루콘산을 사용하여 반응을 시도하였다. 그 결과, 이들 당공여체는 UDP-글루코오스에 비해 1/10 이하의 생성물 밖에 얻어지지 않았다 (도 8). 따라서, 본 효소는 UDP-글루코오스를 당공여체로 하는 글루코실트란스페라아제인 것이 나타났다.

또한 본 효소의 기질 특이성을 조사한 결과, 테르피네올, 네롤리돌 및 시트로넬롤에 대해서도 배당체화 활성이 확인되었다. 그러나, 플라바논 (Naringenin), 플라보놀 (Quercetin), 플라본 (Apigenin), 스틸벤 (Resveratrol) 및 쿠마린 (Esculetin) 등의 페닐프로파노이드계 2 차 대사물에 대해서는 배당체화 활성을 나타나지 않았다.

이상과 같이, 테르펜, 특히 모노테르펜의 8 위치에 대해 특이성이 높은 배당체화 효소 유전자인 UGT85A3 을 동정하였다. 본 효소는 주로 애기장대의 꽃잎에 있어서 8 위치 수산화모노테르펜의 배당체화에 관여하고 있는 것으로 강하게 시사된다. 지금까지 UGT85 패밀리의 배당체화 효소의 기능은 거의 보고되어 있지 않지만, 애기장대의 UGT85A1 이 in vitro 에서 식물 호르몬인 시토키닌의 분자종인 트랜스제아틴 (trans-zeatin) 과 하이드로제아틴 (hydrozeatin) 의 하이드록시기에 글루코오스를 1 분자 전이하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 14). 또 수수 (Sorghum bicolor) 의 UGT85B1 은 p-하이드록시만델로니트릴 (p-hydroxymandelonitrile) 에 글루코오스를 1 분자 전이시켜 청산 배당체인 Dhurrin 을 생성하는 활성이 알려져 있다 (비특허문헌 15). 동일하게 아몬드 (Prunus dulcis) 의 청산 배당체의 배당체화 효소로서 UGT85A19 가 보고되어 있다 (비특허문헌 16). 따라서, 이번에 알아낸 8 위치 수산화모노테르펜에 대한 활성은 UGT85 패밀리 중에서도 신규 효소 활성이라고 할 수 있다.

[실시예 5] UGT85A1

모노테르펜에 대해 배당체화 활성을 나타낸 UGT85A3 과 동일한 서브 패밀리에 속하는 유전자는 애기장대의 게놈 중에 적어도 6 분자종 발견되었다 (UGT85A1, A2, A3, A4, A5, A7). 애기장대의 기관별 유전자 발현에 대해 Arabidopsis eFB Browser (http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi) 를 사용하여 애기장대 유전자 공발현 해석 (ATTED-Ⅱ) 을 실시한 결과, UGT85A3 과 가장 상동성이 높은 UGT85A1 도 UGT85A3 과 동일하게 꽃잎에서 강하게 발현하는 것이 확인되었다 (도 9 : 화살표). UGT85A1 을 코드하는 CDS 배열 및 그 추정 아미노산 배열을 각각 배열 번호 8 및 9 에 나타낸다.

다음으로, UGT85A1 에 대해서도 상기 실시예 1 ∼ 3 의 방법에 따라 대장균에서 HisTag 와 융합된 단백질을 발현시켰다. 벡터 구축을 위한 유전자의 증폭에는 하기의 PCR 프라이머 세트를 사용하였다 (배열 번호 12 및 13).

정제 후, SDS-PAGE 법에 의해 발현 단백질을 확인하였다 (도 10). 도 10 에 있어서, 화살표는 약 50 KDa 로 검출된 재조합 UGT85A1 단백질을 나타내고, P 는 침전, S 는 가용성 획분, FT 는 칼럼을 지나친 획분, E500 은 용출 획분을 나타낸다. 또, 도 10 에 있어서, 사각 테두리는 용출된 HisTag 융합 UGT85A1 단백질을 나타낸다.

실시예 4 와 동일하게, 리날로올, 8-하이드록시리날로올, 게라니올, 8-하이드록시게라니올를 당수용체로 하여 활성 측정을 실시하였다. 도 11 에 나타내는 4 개의 패널은 위로부터 순서대로 리날로올, 8-하이드록시리날로올, 게라니올, 8-하이드록시게라니올를 당수용체로 하여 UGT85A1 을 반응시킨 반응액의 MS 분석 크로마토그램을 나타낸다. 리날로올 및 게라니올의 m/z 는 315 [M-H], 그들의 포름산 애덕트는 m/z 361 로서 검출되었다. 8-하이드록시리날로올과 8-하이드록시게라니올은 m/z 331 [M-H], 그들의 포름산 애덕트는 m/z 377 로서 검출되었다. 사각 테두리는 각 반응액 중의 생성물 피크를 나타낸다. 어느 모노테르펜 화합물에 대해서도 배당화된 생성물이 검출되었다 (도 11). 그러나, 이들 당수용체에 대한 단위 반응 시간 (5 분) 당의 상대 활성을 측정한 결과, UGT85A3 과 동일하게 UGT85A1 은 리날로올에 대한 상대 활성은 매우 낮은 것, 리날로올보다 게라니올에 대한 선택성이 높은 것, 특히 8 위치 수산체에 의해 높은 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다 (도 12). 이들 상대 활성으로부터, 본 효소는 리날로올과 같은 3 급 알코올보다 게라니올이나 8 위치가 수산화된 모노테르펜과 같은 1 급 알코올쪽에 대해 특이성이 높은 것이 밝혀졌다.

이상의 결과로부터 구조 및 발현 패턴이 유사한 2 종의 애기장대 배당체화 효소 UGT85A1 및 UGT85A3 은 모노테르펜류에 배당체화 활성을 갖고 있는 것, 특히 8 위치의 수산기를 선택적으로 배당화하는 것이 밝혀졌다. 애기장대에 있어서, 모노테르펜알코올은 8 위치의 배당체로서 축적되어 있는 것으로 생각되기 때문에 (비특허문헌 1), 8 위치배당화 모노테르펜 화합물을 부여하는 본 효소가 그 반응에 촉매 작용을 미치고 있는 것으로 생각된다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의하면, in vitro 에서 혹은 숙주 세포에 본 발명의 유전자를 도입함으로써, 모노테르펜류에 글루코오스를 1 분자 전이하는 것이 가능해지고, 신규 기능성 식품 소재의 개발이나 2 차 대사 분자 육종 등에 공헌할 수 있는 테르펜 배당체를 보다 간편하게 생산하거나 혹은 감소시킬 수 있는 점에서, 본 발명은 매우 유용한 것이다.

배열표 프리 텍스트

배열 번호 6 : 합성 DNA

배열 번호 7 : 합성 DNA

배열 번호 12 : 합성 DNA

배열 번호 13 : 합성 DNA

배열표

SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY HOLDINGS LIMITED <120> Method for Using Monoterpene Glycosyltransferase <130> PCT11-0066 <150> JP 2010-293237 <151> 2010-12-28 <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1464 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1464) <400> 1 atg gga tcc cgt ttt gtt tct aac gaa caa aaa cca cac gta gtt tgc 48 Met Gly Ser Arg Phe Val Ser Asn Glu Gln Lys Pro His Val Val Cys 1 5 10 15 gtg cct tac cca gct caa ggc cac att aac cct atg atg aaa gtg gct 96 Val Pro Tyr Pro Ala Gln Gly His Ile Asn Pro Met Met Lys Val Ala 20 25 30 aaa ctc ctc cac gtc aaa ggc ttc cac gtc acc ttc gtc aac acc gtc 144 Lys Leu Leu His Val Lys Gly Phe His Val Thr Phe Val Asn Thr Val 35 40 45 tac aac cac aac cgt cta ctc cga tcc cgt ggg gcc aac gca ctc gat 192 Tyr Asn His Asn Arg Leu Leu Arg Ser Arg Gly Ala Asn Ala Leu Asp 50 55 60 gga ctt cct tcc ttc cag ttc gag tca ata cct gac ggt ctt ccg gag 240 Gly Leu Pro Ser Phe Gln Phe Glu Ser Ile Pro Asp Gly Leu Pro Glu 65 70 75 80 act ggc gtg gac gcc acg cag gac atc cct gcc ctt tcc gag tcc aca 288 Thr Gly Val Asp Ala Thr Gln Asp Ile Pro Ala Leu Ser Glu Ser Thr 85 90 95 acg aaa aac tgt ctc gtt ccg ttc aag aag ctt ctc cag cgg att gtc 336 Thr Lys Asn Cys Leu Val Pro Phe Lys Lys Leu Leu Gln Arg Ile Val 100 105 110 acg aga gag gat gtc cct ccg gtg agc tgt att gta tca gat ggt tcg 384 Thr Arg Glu Asp Val Pro Pro Val Ser Cys Ile Val Ser Asp Gly Ser 115 120 125 atg agc ttt act ctt gac gta gcg gaa gag ctt ggt gtt ccg gag att 432 Met Ser Phe Thr Leu Asp Val Ala Glu Glu Leu Gly Val Pro Glu Ile 130 135 140 cat ttt tgg acc act agt gct tgt ggc ttc atg gct tat cta cac ttt 480 His Phe Trp Thr Thr Ser Ala Cys Gly Phe Met Ala Tyr Leu His Phe 145 150 155 160 tat ctc ttc atc gag aag ggt tta tgt cca gta aaa gat gcg agt tgc 528 Tyr Leu Phe Ile Glu Lys Gly Leu Cys Pro Val Lys Asp Ala Ser Cys 165 170 175 ttg acg aag gaa tac ttg gac aca gtt ata gat tgg ata ccg tca atg 576 Leu Thr Lys Glu Tyr Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Ile Pro Ser Met 180 185 190 aac aat gta aaa cta aaa gac att cct agt ttt ata cgt acc act aat 624 Asn Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile Pro Ser Phe Ile Arg Thr Thr Asn 195 200 205 cct aac gac ata atg ctc aac ttc gtt gtc cgt gag gca tgt cga acc 672 Pro Asn Asp Ile Met Leu Asn Phe Val Val Arg Glu Ala Cys Arg Thr 210 215 220 aaa cgt gcc tct gct atc att ctg aac acg ttt gat gac ctt gaa cat 720 Lys Arg Ala Ser Ala Ile Ile Leu Asn Thr Phe Asp Asp Leu Glu His 225 230 235 240 gac ata atc cag tct atg caa tcc att tta cca ccg gtt tat cca atc 768 Asp Ile Ile Gln Ser Met Gln Ser Ile Leu Pro Pro Val Tyr Pro Ile 245 250 255 gga ccg ctt cat ctc tta gta aac agg gag att gaa gaa gat agt gag 816 Gly Pro Leu His Leu Leu Val Asn Arg Glu Ile Glu Glu Asp Ser Glu 260 265 270 att gga agg atg gga tca aat cta tgg aaa gag gag act gag tgc ttg 864 Ile Gly Arg Met Gly Ser Asn Leu Trp Lys Glu Glu Thr Glu Cys Leu 275 280 285 gga tgg ctt aat act aag tct cga aat agc gtt gtt tat gtt aac ttt 912 Gly Trp Leu Asn Thr Lys Ser Arg Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe 290 295 300 ggg agc ata aca ata atg acc acg gca cag ctt ttg gag ttt gct tgg 960 Gly Ser Ile Thr Ile Met Thr Thr Ala Gln Leu Leu Glu Phe Ala Trp 305 310 315 320 ggt ttg gcg gca acg gga aag gag ttt cta tgg gtg atg cgg ccg gat 1008 Gly Leu Ala Ala Thr Gly Lys Glu Phe Leu Trp Val Met Arg Pro Asp 325 330 335 tca gta gcc gga gag gag gca gtg att cca aaa gag ttt tta gcg gag 1056 Ser Val Ala Gly Glu Glu Ala Val Ile Pro Lys Glu Phe Leu Ala Glu 340 345 350 aca gct gat cga aga atg ctg aca agt tgg tgt cct cag gag aaa gtt 1104 Thr Ala Asp Arg Arg Met Leu Thr Ser Trp Cys Pro Gln Glu Lys Val 355 360 365 ctt tct cat ccg gcg gtc gga ggg ttc ttg acc cat tgc ggg tgg aat 1152 Leu Ser His Pro Ala Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn 370 375 380 tcg acg tta gaa agt ctt tca tgc gga gtt cca atg gta tgt tgg cca 1200 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Ser Cys Gly Val Pro Met Val Cys Trp Pro 385 390 395 400 ttt ttt gct gag caa caa aca aat tgt aag ttt tct tgt gat gaa tgg 1248 Phe Phe Ala Glu Gln Gln Thr Asn Cys Lys Phe Ser Cys Asp Glu Trp 405 410 415 gag gtt ggt att gag atc ggt gga gat gtc aag agg gga gag gtt gag 1296 Glu Val Gly Ile Glu Ile Gly Gly Asp Val Lys Arg Gly Glu Val Glu 420 425 430 gcg gtg gtt aga gag ctc atg gat gga gag aaa gga aag aaa atg aga 1344 Ala Val Val Arg Glu Leu Met Asp Gly Glu Lys Gly Lys Lys Met Arg 435 440 445 gag aag gct gta gag tgg cgg cgc ttg gcc gag aaa gct aca aag ctt 1392 Glu Lys Ala Val Glu Trp Arg Arg Leu Ala Glu Lys Ala Thr Lys Leu 450 455 460 ccg tgt ggt tcg tcg gtg ata aat ttt gag acg att gtc aac aag gtt 1440 Pro Cys Gly Ser Ser Val Ile Asn Phe Glu Thr Ile Val Asn Lys Val 465 470 475 480 ctc ttg gga aag atc cct aac acg 1464 Leu Leu Gly Lys Ile Pro Asn Thr 485 <210> 2 <211> 488 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Gly Ser Arg Phe Val Ser Asn Glu Gln Lys Pro His Val Val Cys 1 5 10 15 Val Pro Tyr Pro Ala Gln Gly His Ile Asn Pro Met Met Lys Val Ala 20 25 30 Lys Leu Leu His Val Lys Gly Phe His Val Thr Phe Val Asn Thr Val 35 40 45 Tyr Asn His Asn Arg Leu Leu Arg Ser Arg Gly Ala Asn Ala Leu Asp 50 55 60 Gly Leu Pro Ser Phe Gln Phe Glu Ser Ile Pro Asp Gly Leu Pro Glu 65 70 75 80 Thr Gly Val Asp Ala Thr Gln Asp Ile Pro Ala Leu Ser Glu Ser Thr 85 90 95 Thr Lys Asn Cys Leu Val Pro Phe Lys Lys Leu Leu Gln Arg Ile Val 100 105 110 Thr Arg Glu Asp Val Pro Pro Val Ser Cys Ile Val Ser Asp Gly Ser 115 120 125 Met Ser Phe Thr Leu Asp Val Ala Glu Glu Leu Gly Val Pro Glu Ile 130 135 140 His Phe Trp Thr Thr Ser Ala Cys Gly Phe Met Ala Tyr Leu His Phe 145 150 155 160 Tyr Leu Phe Ile Glu Lys Gly Leu Cys Pro Val Lys Asp Ala Ser Cys 165 170 175 Leu Thr Lys Glu Tyr Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Ile Pro Ser Met 180 185 190 Asn Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile Pro Ser Phe Ile Arg Thr Thr Asn 195 200 205 Pro Asn Asp Ile Met Leu Asn Phe Val Val Arg Glu Ala Cys Arg Thr 210 215 220 Lys Arg Ala Ser Ala Ile Ile Leu Asn Thr Phe Asp Asp Leu Glu His 225 230 235 240 Asp Ile Ile Gln Ser Met Gln Ser Ile Leu Pro Pro Val Tyr Pro Ile 245 250 255 Gly Pro Leu His Leu Leu Val Asn Arg Glu Ile Glu Glu Asp Ser Glu 260 265 270 Ile Gly Arg Met Gly Ser Asn Leu Trp Lys Glu Glu Thr Glu Cys Leu 275 280 285 Gly Trp Leu Asn Thr Lys Ser Arg Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe 290 295 300 Gly Ser Ile Thr Ile Met Thr Thr Ala Gln Leu Leu Glu Phe Ala Trp 305 310 315 320 Gly Leu Ala Ala Thr Gly Lys Glu Phe Leu Trp Val Met Arg Pro Asp 325 330 335 Ser Val Ala Gly Glu Glu Ala Val Ile Pro Lys Glu Phe Leu Ala Glu 340 345 350 Thr Ala Asp Arg Arg Met Leu Thr Ser Trp Cys Pro Gln Glu Lys Val 355 360 365 Leu Ser His Pro Ala Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn 370 375 380 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Ser Cys Gly Val Pro Met Val Cys Trp Pro 385 390 395 400 Phe Phe Ala Glu Gln Gln Thr Asn Cys Lys Phe Ser Cys Asp Glu Trp 405 410 415 Glu Val Gly Ile Glu Ile Gly Gly Asp Val Lys Arg Gly Glu Val Glu 420 425 430 Ala Val Val Arg Glu Leu Met Asp Gly Glu Lys Gly Lys Lys Met Arg 435 440 445 Glu Lys Ala Val Glu Trp Arg Arg Leu Ala Glu Lys Ala Thr Lys Leu 450 455 460 Pro Cys Gly Ser Ser Val Ile Asn Phe Glu Thr Ile Val Asn Lys Val 465 470 475 480 Leu Leu Gly Lys Ile Pro Asn Thr 485 <210> 3 <211> 1811 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 ttacgtgtta gggatctttc ccaagagaac cttgttgaca atcgtctcaa aatttatcac 60 cgacgaacca cacggaagct ttgtagcttt ctcggccaag cgccgccact ctacagcctt 120 ctctctcatt ttctttcctt tctctccatc catgagctct ctaaccaccg cctcaacctc 180 tcccctcttg acatctccac cgatctcaat accaacctcc cattcatcac aagaaaactt 240 acaatttgtt tgttgctcag caaaaaatgg ccaacatacc attggaactc cgcatgaaag 300 actttctaac gtcgaattcc acccgcaatg ggtcaagaac cctccgaccg ccggatgaga 360 aagaactttc tcctgaggac accaacttgt cagcattctt cgatcagctg tctccgctaa 420 aaactctttt ggaatcactg cctcctctcc ggctactgaa tccggccgca tcacccatag 480 aaactccttt cccgttgccg ccaaacccca agcaaactcc aaaagctgtg ccgtggtcat 540 tattgttatg ctcccaaagt taacataaac aacgctattt cgagacttag tattaagcca 600 tcccaagcac tcagtctcct ctttccatag atttgatccc atccttccaa tctcactatc 660 ttcttcaatc tccctgttta ctaagagatg aagcggtccg attggataaa ccggtggtaa 720 aatggattgc atagactgga ttatgtcatg ttcaaggtca tcaaacgtgt tcagaatgat 780 agcagaggca cgtttggttc gacatgcctc acggacaacg aagttgagca ttatgtcgtt 840 aggattagtg gtacgtataa aactaggaat gtcttttagt tttacattgt tcattgacgg 900 tatccaatct ataactgtgt ccaagtattc cttcgtcaag caactcgcat ctgcaaaatc 960 catcacactt tattttatca ttttatctct caatatttat ttataaaatt aatgcacaga 1020 cttagcatac acaatttaat gtattttata gtgatagtct tgtttcagag ctagttggca 1080 aacaaatggc ttagagagtg atgttggcct atttgcatta agctttattt atggttgtac 1140 tttgagattc ggttaaataa gagttctagg ccaacatcac tttctaggcc taattgcaaa 1200 taaagtgacc aagctcatgg tgtcttaaga gttcttacgt gaaattttat tttataacgt 1260 cgattaattc aataataaat gcaagaaaac gtacctttta ctggacataa acccttctcg 1320 atgaagagat aaaagtgtag ataagccatg aagccacaag cactagtggt ccaaaaatga 1380 atctccggaa caccaagctc ttccgctacg tcaagagtaa agctcatcga accatctgat 1440 acaatacagc tcaccggagg gacatcctct ctcgtgacaa tccgctggag aagcttcttg 1500 aacggaacga gacagttttt cgttgtggac tcggaaaggg cagggatgtc ctgcgtggcg 1560 tccacgccag tctccggaag accgtcaggt attgactcga actggaagga aggaagtcca 1620 tcgagtgcgt tggccccacg ggatcggagt agacggttgt ggttgtagac ggtgttgacg 1680 aaggtgacgt ggaagccttt gacgtggagg agtttagcca ctttcatcat agggttaatg 1740 tggccttgag ctgggtaagg cacgcaaact acgtgtggtt tttgttcgtt agaaacaaaa 1800 cgggatccca t 1811 <210> 4 <211> 1467 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 atgggatccc gttttgtttc taacgaacaa aaaccacacg tagtttgcgt gccttaccca 60 gctcaaggcc acattaaccc tatgatgaaa gtggctaaac tcctccacgt caaaggcttc 120 cacgtcacct tcgtcaacac cgtctacaac cacaaccgtc tactccgatc ccgtggggcc 180 aacgcactcg atggacttcc ttccttccag ttcgagtcaa tacctgacgg tcttccggag 240 actggcgtgg acgccacgca ggacatccct gccctttccg agtccacaac gaaaaactgt 300 ctcgttccgt tcaagaagct tctccagcgg attgtcacga gagaggatgt ccctccggtg 360 agctgtattg tatcagatgg ttcgatgagc tttactcttg acgtagcgga agagcttggt 420 gttccggaga ttcatttttg gaccactagt gcttgtggct tcatggctta tctacacttt 480 tatctcttca tcgagaaggg tttatgtcca gtaaaagatg cgagttgctt gacgaaggaa 540 tacttggaca cagttataga ttggataccg tcaatgaaca atgtaaaact aaaagacatt 600 cctagtttta tacgtaccac taatcctaac gacataatgc tcaacttcgt tgtccgtgag 660 gcatgtcgaa ccaaacgtgc ctctgctatc attctgaaca cgtttgatga ccttgaacat 720 gacataatcc agtctatgca atccatttta ccaccggttt atccaatcgg accgcttcat 780 ctcttagtaa acagggagat tgaagaagat agtgagattg gaaggatggg atcaaatcta 840 tggaaagagg agactgagtg cttgggatgg cttaatacta agtctcgaaa tagcgttgtt 900 tatgttaact ttgggagcat aacaataatg accacggcac agcttttgga gtttgcttgg 960 ggtttggcgg caacgggaaa ggagtttcta tgggtgatgc ggccggattc agtagccgga 1020 gaggaggcag tgattccaaa agagttttta gcggagacag ctgatcgaag aatgctgaca 1080 agttggtgtc ctcaggagaa agttctttct catccggcgg tcggagggtt cttgacccat 1140 tgcgggtgga attcgacgtt agaaagtctt tcatgcggag ttccaatggt atgttggcca 1200 ttttttgctg agcaacaaac aaattgtaag ttttcttgtg atgaatggga ggttggtatt 1260 gagatcggtg gagatgtcaa gaggggagag gttgaggcgg tggttagaga gctcatggat 1320 ggagagaaag gaaagaaaat gagagagaag gctgtagagt ggcggcgctt ggccgagaaa 1380 gctacaaagc ttccgtgtgg ttcgtcggtg ataaattttg agacgattgt caacaaggtt 1440 ctcttgggaa agatccctaa cacgtaa 1467 <210> 5 <211> 1467 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 atgggatccc gttttgtttc taacgaacaa aaaccacacg tagtttgcgt gccttaccca 60 gctcaaggcc acattaaccc tatgatgaaa gtggctaaac tcctccacgt caaaggcttc 120 cacgtcacct tcgtcaacac cgtctacaac cacaaccgtc tactccgatc ccgtggggcc 180 aacgcactcg atggacttcc ttccttccag ttcgagtcaa tacctgacgg tcttccggag 240 actggcgtgg acgccacgca ggacatccct gccctttccg agtccacaac gaaaaactgt 300 ctcgttccgt tcaagaagct tctccagcgg attgtcacga gagaggatgt ccctccggtg 360 agctgtattg tatcagatgg ttcgatgagc tttactcttg acgtagcgga agagcttggt 420 gttccggaga ttcatttttg gaccactagt gcttgtggct tcatggctta tctacacttt 480 tatctcttca tcgagaaggg tttatgtcca gtaaaagatg cgagttgctt gacgaaggaa 540 tacttggaca cagttataga ttggataccg tcaatgaaca atgtaaaact aaaagacatt 600 cctagtttta tacgtaccac taatcctaac gacataatgc tcaacttcgt tgtccgtgag 660 gcatgtcgaa ccaaacgtgc ctctgctatc attctgaaca cgtttgatga ccttgaacat 720 gacataatcc agtctatgca atccatttta ccaccggttt atccaatcgg accgcttcat 780 ctcttagtaa acagggagat tgaagaagat agtgagattg gaaggatggg atcaaatcta 840 tggaaagagg agactgagtg cttgggatgg cttaatacta agtctcgaaa tagcgttgtt 900 tatgttaact ttgggagcat aacaataatg accacggcac agcttttgga gtttgcttgg 960 ggtttggcgg caacgggaaa ggagtttcta tgggtgatgc ggccggattc agtagccgga 1020 gaggaggcag tgattccaaa agagttttta gcggagacag ctgatcgaag aatgctgaca 1080 agttggtgtc ctcaggagaa agttctttct catccggcgg tcggagggtt cttgacccat 1140 tgcgggtgga attcgacgtt agaaagtctt tcatgcggag ttccaatggt atgttggcca 1200 ttttttgctg agcaacaaac aaattgtaag ttttcttgtg atgaatggga ggttggtatt 1260 gagatcggtg gagatgtcaa gaggggagag gttgaggcgg tggttagaga gctcatggat 1320 ggagagaaag gaaagaaaat gagagagaag gctgtagagt ggcggcgctt ggccgagaaa 1380 gctacaaagc ttccgtgtgg ttcgtcggtg ataaattttg agacgattgt caacaaggtt 1440 ctcttgggaa agatccctaa cacgtaa 1467 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 cacccatatg ggatcccgtt ttgtttc 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 actcgagtta cgtgttaggg atctttc 27 <210> 8 <211> 1467 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1467) <400> 8 atg gga tct cag atc att cat aac tca caa aaa cca cat gta gtt tgt 48 Met Gly Ser Gln Ile Ile His Asn Ser Gln Lys Pro His Val Val Cys 1 5 10 15 gtt cca tat ccg gct caa ggc cac atc aac cct atg atg aga gtg gct 96 Val Pro Tyr Pro Ala Gln Gly His Ile Asn Pro Met Met Arg Val Ala 20 25 30 aaa ctc ctc cac gcc aga ggc ttc tac gtc acc ttc gtc aac acc gtc 144 Lys Leu Leu His Ala Arg Gly Phe Tyr Val Thr Phe Val Asn Thr Val 35 40 45 tac aac cac aat cgt ttc ctt cgt tct cgt ggg tcc aat gcc cta gat 192 Tyr Asn His Asn Arg Phe Leu Arg Ser Arg Gly Ser Asn Ala Leu Asp 50 55 60 gga ctt cct tcg ttc cga ttt gag tcc att gct gac ggt cta cca gag 240 Gly Leu Pro Ser Phe Arg Phe Glu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Pro Glu 65 70 75 80 aca gac atg gat gcc acg cag gac atc aca gct ctt tgc gag tcc acc 288 Thr Asp Met Asp Ala Thr Gln Asp Ile Thr Ala Leu Cys Glu Ser Thr 85 90 95 atg aag aac tgt ctc gct ccg ttc aga gag ctt ctc cag cgg atc aac 336 Met Lys Asn Cys Leu Ala Pro Phe Arg Glu Leu Leu Gln Arg Ile Asn 100 105 110 gct gga gat aat gtt cct ccg gta agc tgt att gta tct gac ggt tgt 384 Ala Gly Asp Asn Val Pro Pro Val Ser Cys Ile Val Ser Asp Gly Cys 115 120 125 atg agc ttt act ctt gat gtt gcg gag gag ctt gga gtc ccg gag gtt 432 Met Ser Phe Thr Leu Asp Val Ala Glu Glu Leu Gly Val Pro Glu Val 130 135 140 ctt ttt tgg aca acc agt ggc tgt gcg ttc ctg gct tat cta cac ttt 480 Leu Phe Trp Thr Thr Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ala Tyr Leu His Phe 145 150 155 160 tat ctc ttc atc gag aag ggc tta tgt ccg cta aaa gat gag agt tac 528 Tyr Leu Phe Ile Glu Lys Gly Leu Cys Pro Leu Lys Asp Glu Ser Tyr 165 170 175 ttg acg aag gag tac tta gaa gac acg gtt ata gat ttt ata cca acc 576 Leu Thr Lys Glu Tyr Leu Glu Asp Thr Val Ile Asp Phe Ile Pro Thr 180 185 190 atg aag aat gtg aaa cta aag gat att cct agc ttc ata cgt acc act 624 Met Lys Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile Pro Ser Phe Ile Arg Thr Thr 195 200 205 aat cct gat gat gtt atg att agt ttc gcc ctc cgc gag acc gag cga 672 Asn Pro Asp Asp Val Met Ile Ser Phe Ala Leu Arg Glu Thr Glu Arg 210 215 220 gcc aaa cgt gct tct gct atc att cta aac aca ttt gat gac ctt gag 720 Ala Lys Arg Ala Ser Ala Ile Ile Leu Asn Thr Phe Asp Asp Leu Glu 225 230 235 240 cat gat gtt gtt cat gct atg caa tct atc tta cct ccg gtt tat tca 768 His Asp Val Val His Ala Met Gln Ser Ile Leu Pro Pro Val Tyr Ser 245 250 255 gtt gga ccg ctt cat ctc tta gca aac cgg gag att gaa gaa ggt agt 816 Val Gly Pro Leu His Leu Leu Ala Asn Arg Glu Ile Glu Glu Gly Ser 260 265 270 gag att gga atg atg agt tcg aat tta tgg aaa gag gag atg gag tgt 864 Glu Ile Gly Met Met Ser Ser Asn Leu Trp Lys Glu Glu Met Glu Cys 275 280 285 ttg gat tgg ctt gat act aag act caa aat agt gtc att tat atc aac 912 Leu Asp Trp Leu Asp Thr Lys Thr Gln Asn Ser Val Ile Tyr Ile Asn 290 295 300 ttt ggg agc ata acg gtt ttg agt gtg aag cag ctt gtg gag ttt gct 960 Phe Gly Ser Ile Thr Val Leu Ser Val Lys Gln Leu Val Glu Phe Ala 305 310 315 320 tgg ggt ttg gcg gga agt ggg aaa gag ttt tta tgg gtg atc cgg cca 1008 Trp Gly Leu Ala Gly Ser Gly Lys Glu Phe Leu Trp Val Ile Arg Pro 325 330 335 gat tta gta gcg gga gag gag gct atg gtt ccg ccg gac ttt tta atg 1056 Asp Leu Val Ala Gly Glu Glu Ala Met Val Pro Pro Asp Phe Leu Met 340 345 350 gag act aaa gac cgc agt atg cta gcg agt tgg tgt cct caa gag aaa 1104 Glu Thr Lys Asp Arg Ser Met Leu Ala Ser Trp Cys Pro Gln Glu Lys 355 360 365 gta ctt tct cat cct gct att gga ggg ttt ttg acg cat tgc ggg tgg 1152 Val Leu Ser His Pro Ala Ile Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp 370 375 380 aac tcg ata ttg gaa agt ctt tcg tgt gga gtt ccg atg gtg tgt tgg 1200 Asn Ser Ile Leu Glu Ser Leu Ser Cys Gly Val Pro Met Val Cys Trp 385 390 395 400 cca ttt ttt gct gac cag caa atg aat tgt aag ttt tgt tgt gac gag 1248 Pro Phe Phe Ala Asp Gln Gln Met Asn Cys Lys Phe Cys Cys Asp Glu 405 410 415 tgg gat gtt ggg att gag ata ggt gga gat gtg aag aga gag gaa gtt 1296 Trp Asp Val Gly Ile Glu Ile Gly Gly Asp Val Lys Arg Glu Glu Val 420 425 430 gag gcg gtg gtt aga gag ctc atg gat gga gag aag gga aag aaa atg 1344 Glu Ala Val Val Arg Glu Leu Met Asp Gly Glu Lys Gly Lys Lys Met 435 440 445 aga gaa aag gcg gta gag tgg cag cgc tta gcc gag aaa gcg acg gaa 1392 Arg Glu Lys Ala Val Glu Trp Gln Arg Leu Ala Glu Lys Ala Thr Glu 450 455 460 cat aaa ctt ggt tct tcc gtt atg aat ttt gag acg gtt gtt agc aag 1440 His Lys Leu Gly Ser Ser Val Met Asn Phe Glu Thr Val Val Ser Lys 465 470 475 480 ttt ctt ttg gga caa aaa tca cag gat 1467 Phe Leu Leu Gly Gln Lys Ser Gln Asp 485 <210> 9 <211> 489 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 9 Met Gly Ser Gln Ile Ile His Asn Ser Gln Lys Pro His Val Val Cys 1 5 10 15 Val Pro Tyr Pro Ala Gln Gly His Ile Asn Pro Met Met Arg Val Ala 20 25 30 Lys Leu Leu His Ala Arg Gly Phe Tyr Val Thr Phe Val Asn Thr Val 35 40 45 Tyr Asn His Asn Arg Phe Leu Arg Ser Arg Gly Ser Asn Ala Leu Asp 50 55 60 Gly Leu Pro Ser Phe Arg Phe Glu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Pro Glu 65 70 75 80 Thr Asp Met Asp Ala Thr Gln Asp Ile Thr Ala Leu Cys Glu Ser Thr 85 90 95 Met Lys Asn Cys Leu Ala Pro Phe Arg Glu Leu Leu Gln Arg Ile Asn 100 105 110 Ala Gly Asp Asn Val Pro Pro Val Ser Cys Ile Val Ser Asp Gly Cys 115 120 125 Met Ser Phe Thr Leu Asp Val Ala Glu Glu Leu Gly Val Pro Glu Val 130 135 140 Leu Phe Trp Thr Thr Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ala Tyr Leu His Phe 145 150 155 160 Tyr Leu Phe Ile Glu Lys Gly Leu Cys Pro Leu Lys Asp Glu Ser Tyr 165 170 175 Leu Thr Lys Glu Tyr Leu Glu Asp Thr Val Ile Asp Phe Ile Pro Thr 180 185 190 Met Lys Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile Pro Ser Phe Ile Arg Thr Thr 195 200 205 Asn Pro Asp Asp Val Met Ile Ser Phe Ala Leu Arg Glu Thr Glu Arg 210 215 220 Ala Lys Arg Ala Ser Ala Ile Ile Leu Asn Thr Phe Asp Asp Leu Glu 225 230 235 240 His Asp Val Val His Ala Met Gln Ser Ile Leu Pro Pro Val Tyr Ser 245 250 255 Val Gly Pro Leu His Leu Leu Ala Asn Arg Glu Ile Glu Glu Gly Ser 260 265 270 Glu Ile Gly Met Met Ser Ser Asn Leu Trp Lys Glu Glu Met Glu Cys 275 280 285 Leu Asp Trp Leu Asp Thr Lys Thr Gln Asn Ser Val Ile Tyr Ile Asn 290 295 300 Phe Gly Ser Ile Thr Val Leu Ser Val Lys Gln Leu Val Glu Phe Ala 305 310 315 320 Trp Gly Leu Ala Gly Ser Gly Lys Glu Phe Leu Trp Val Ile Arg Pro 325 330 335 Asp Leu Val Ala Gly Glu Glu Ala Met Val Pro Pro Asp Phe Leu Met 340 345 350 Glu Thr Lys Asp Arg Ser Met Leu Ala Ser Trp Cys Pro Gln Glu Lys 355 360 365 Val Leu Ser His Pro Ala Ile Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp 370 375 380 Asn Ser Ile Leu Glu Ser Leu Ser Cys Gly Val Pro Met Val Cys Trp 385 390 395 400 Pro Phe Phe Ala Asp Gln Gln Met Asn Cys Lys Phe Cys Cys Asp Glu 405 410 415 Trp Asp Val Gly Ile Glu Ile Gly Gly Asp Val Lys Arg Glu Glu Val 420 425 430 Glu Ala Val Val Arg Glu Leu Met Asp Gly Glu Lys Gly Lys Lys Met 435 440 445 Arg Glu Lys Ala Val Glu Trp Gln Arg Leu Ala Glu Lys Ala Thr Glu 450 455 460 His Lys Leu Gly Ser Ser Val Met Asn Phe Glu Thr Val Val Ser Lys 465 470 475 480 Phe Leu Leu Gly Gln Lys Ser Gln Asp 485 <210> 10 <211> 2757 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 atgggatctc agatcattca taactcacaa aaaccacatg tagtttgtgt tccatatccg 60 gctcaaggcc acatcaaccc tatgatgaga gtggctaaac tcctccacgc cagaggcttc 120 tacgtcacct tcgtcaacac cgtctacaac cacaatcgtt tccttcgttc tcgtgggtcc 180 aatgccctag atggacttcc ttcgttccga tttgagtcca ttgctgacgg tctaccagag 240 acagacatgg atgccacgca ggacatcaca gctctttgcg agtccaccat gaagaactgt 300 ctcgctccgt tcagagagct tctccagcgg atcaacgctg gagataatgt tcctccggta 360 agctgtattg tatctgacgg ttgtatgagc tttactcttg atgttgcgga ggagcttgga 420 gtcccggagg ttcttttttg gacaaccagt ggctgtgcgt tcctggctta tctacacttt 480 tatctcttca tcgagaaggg cttatgtccg ctaaaaggta cgtattctta cattgattat 540 tgatttaaat gacgttatga tattaaattt aacgtaagaa cccttaagac acctcgagca 600 gggtgagttt ttaatctgag atatatcgtt tgtatattgg ataaaaaata tccatttagc 660 taccatattt agcgaagcca tagactatcc taatcgatcc acccgcacga cgagaccggt 720 caagactcaa gatggtcatg ttgtaatata tactcaattt tatacaattg ttacattgta 780 gcctaggttt ttgagcatta ctaaatatat agtatcaaga gaaatgtcca tattttaata 840 tatacataac gtaatgaatg ttttgatatg ttttttattt cgatgcgttt gcagttttct 900 tgtaatatat atattacagt tttcttagcc aaaaaaaaaa taaataatta gagaagatac 960 attgttgatt tattttaaag cattgatatc tttttaacct tccgcttccc ctatccgctg 1020 gtgaattttg agtgacatta aagattgaac agaaatccca tattttattt tgttaagaga 1080 tgcgtagatt cttaactttg attacagttt aaaatcatgt taaaggaaat gatgatgttc 1140 aaaattccat ttcgtatttt acataaattt tgttgttaac ttatcttaaa gttatatgat 1200 atttgcaaac gtcgtctttc tatgattttt attattagtt tgaacgtaaa caaaatatat 1260 ttaatatttg tgaaaaggct tgaaaattgt aaaagaggga tttttaaata gtaacaaatt 1320 ttaggtgaac tatagcgtat ataaaagata ggttatttat ttgtgtaaag attatctgtt 1380 tgtattggtt ccaatttttt tcggtgacct ttaataacat agatgcatca cacatgaaca 1440 tttggtatga aaacaaaaag ataaccaata ttgccaaaaa aaaaagaagg agagagacgg 1500 cgggaaagtt tgttgaggaa aaaaataaaa ttgggtaata tccaaacatg aaagtgaaat 1560 aaaccgtaaa aaatcaatgc aatttggcat atcattgtcc agggaccagg ccactctgtc 1620 tttcggtcat attcataact ctttctggct ctgaaattac acaatgaatg ccgtgtccta 1680 gagaatcata tagacgtgga tgcttacgta aatgcataat tttttctaaa atgcggtgct 1740 tgtattttta ttaactaata tcatgagact tatcttgatt aataaatggt gattgatttg 1800 gcagatgaga gttacttgac gaaggagtac ttagaagaca cggttataga ttttatacca 1860 accatgaaga atgtgaaact aaaggatatt cctagcttca tacgtaccac taatcctgat 1920 gatgttatga ttagtttcgc cctccgcgag accgagcgag ccaaacgtgc ttctgctatc 1980 attctaaaca catttgatga ccttgagcat gatgttgttc atgctatgca atctatctta 2040 cctccggttt attcagttgg accgcttcat ctcttagcaa accgggagat tgaagaaggt 2100 agtgagattg gaatgatgag ttcgaattta tggaaagagg agatggagtg tttggattgg 2160 cttgatacta agactcaaaa tagtgtcatt tatatcaact ttgggagcat aacggttttg 2220 agtgtgaagc agcttgtgga gtttgcttgg ggtttggcgg gaagtgggaa agagttttta 2280 tgggtgatcc ggccagattt agtagcggga gaggaggcta tggttccgcc ggacttttta 2340 atggagacta aagaccgcag tatgctagcg agttggtgtc ctcaagagaa agtactttct 2400 catcctgcta ttggagggtt tttgacgcat tgcgggtgga actcgatatt ggaaagtctt 2460 tcgtgtggag ttccgatggt gtgttggcca ttttttgctg accagcaaat gaattgtaag 2520 ttttgttgtg acgagtggga tgttgggatt gagataggtg gagatgtgaa gagagaggaa 2580 gttgaggcgg tggttagaga gctcatggat ggagagaagg gaaagaaaat gagagaaaag 2640 gcggtagagt ggcagcgctt agccgagaaa gcgacggaac ataaacttgg ttcttccgtt 2700 atgaattttg agacggttgt tagcaagttt cttttgggac aaaaatcaca ggattaa 2757 <210> 11 <211> 1470 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 11 atgggatctc agatcattca taactcacaa aaaccacatg tagtttgtgt tccatatccg 60 gctcaaggcc acatcaaccc tatgatgaga gtggctaaac tcctccacgc cagaggcttc 120 tacgtcacct tcgtcaacac cgtctacaac cacaatcgtt tccttcgttc tcgtgggtcc 180 aatgccctag atggacttcc ttcgttccga tttgagtcca ttgctgacgg tctaccagag 240 acagacatgg atgccacgca ggacatcaca gctctttgcg agtccaccat gaagaactgt 300 ctcgctccgt tcagagagct tctccagcgg atcaacgctg gagataatgt tcctccggta 360 agctgtattg tatctgacgg ttgtatgagc tttactcttg atgttgcgga ggagcttgga 420 gtcccggagg ttcttttttg gacaaccagt ggctgtgcgt tcctggctta tctacacttt 480 tatctcttca tcgagaaggg cttatgtccg ctaaaagatg agagttactt gacgaaggag 540 tacttagaag acacggttat agattttata ccaaccatga agaatgtgaa actaaaggat 600 attcctagct tcatacgtac cactaatcct gatgatgtta tgattagttt cgccctccgc 660 gagaccgagc gagccaaacg tgcttctgct atcattctaa acacatttga tgaccttgag 720 catgatgttg ttcatgctat gcaatctatc ttacctccgg tttattcagt tggaccgctt 780 catctcttag caaaccggga gattgaagaa ggtagtgaga ttggaatgat gagttcgaat 840 ttatggaaag aggagatgga gtgtttggat tggcttgata ctaagactca aaatagtgtc 900 atttatatca actttgggag cataacggtt ttgagtgtga agcagcttgt ggagtttgct 960 tggggtttgg cgggaagtgg gaaagagttt ttatgggtga tccggccaga tttagtagcg 1020 ggagaggagg ctatggttcc gccggacttt ttaatggaga ctaaagaccg cagtatgcta 1080 gcgagttggt gtcctcaaga gaaagtactt tctcatcctg ctattggagg gtttttgacg 1140 cattgcgggt ggaactcgat attggaaagt ctttcgtgtg gagttccgat ggtgtgttgg 1200 ccattttttg ctgaccagca aatgaattgt aagttttgtt gtgacgagtg ggatgttggg 1260 attgagatag gtggagatgt gaagagagag gaagttgagg cggtggttag agagctcatg 1320 gatggagaga agggaaagaa aatgagagaa aaggcggtag agtggcagcg cttagccgag 1380 aaagcgacgg aacataaact tggttcttcc gttatgaatt ttgagacggt tgttagcaag 1440 tttcttttgg gacaaaaatc acaggattaa 1470 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 cacccatatg ggatctcaga tcattcataa c 31 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 ggatccttaa tcctgtgatt tttgtcccaa aag 33

Claims (15)

1. 이하의 (a) ∼ (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것에 기재된 단백질과 UDP-당과 모노테르펜 화합물을 반응시켜 상기 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 공정을 포함하는 모노테르펜 8 위치 배당체의 제조 방법.
   (a) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 ;
   (b) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질 ;
   (c) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 대해, 75 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 UDP-당이 UDP-글루코오스인 방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 모노테르펜 화합물이 8-하이드록시미르센, 8-하이드록시네롤, 8-하이드록시게라니올 및 8-하이드록시리날로올로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 것인 방법.
4. 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 비인간 형질 전환체.
   (a) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 ;
   (b) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
   (c) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 있어서, 1 ∼ 125 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
   (d) 배열 번호 2 또는 9 의 아미노산 배열에 대해, 75 ％ 이상의 배열 동일성을 갖는 아미노산 배열을 갖고, 또한 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ; 및
   (e) 배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 높은 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드
5. 제 4 항에 있어서,
   배열 번호 1, 3, 8 또는 10 의 염기 배열을 함유하는 형질 전환체.
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터에 삽입된 것인 형질 전환체.
7. 제 4 항에 있어서,
   식물체인 형질 전환체.
8. 제 4 항에 기재된 형질 전환체의 추출물.
9. 제 8 항에 기재된 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약품 또는 공업 원료.
10. 제 4 항에 기재된 비인간 형질 전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당체화하는 활성을 갖는 단백질의 제조 방법.
11. 모노테르펜 화합물의 8 위치를 배당화하는 활성을 갖는 단백질의 발현이 억제된 식물.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 단백질의 발현이 RNA 간섭에 의해 억제된 식물.
13. 제 11 항에 기재된 식물 또는 그 식물의 일부의 가공 제품.
14. 제 11 항에 기재된 식물의 추출물.
15. 제 14 항에 기재된 추출물을 함유하는 식품, 향료, 의약품 또는 공업 원료.

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