JP2007504836A - グリコシルトランスフェラーゼの核酸を発現する細胞を含有するバイオリアクター - Google Patents
グリコシルトランスフェラーゼの核酸を発現する細胞を含有するバイオリアクター Download PDFInfo
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Abstract
Description
i)図1a、図2a、図3a、図4a、図4b、図5a、図5b、図6a、図6b、図7a、図7b、図8a、図8b、図9a、図9b、図10a、図10b、図11a、図12a及び図12bに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ii)上記(i)に表される核酸配列に対してハイブリダイズし、且つグリコシルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、及び
iii)上記(i)及び(ii)で規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換により改変される上記細胞、及び上記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である、少なくとも1つの外生的基質を包含し、上記細胞の増殖を維持する栄養培地を含み、
該栄養培地が、UDP−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽が提供される。
i)図1a、図2a、図3a、図4a、図4b、図5a、図5b、図6a、図6b、図7a、図7b、図8a又は図8bに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ii)上記(i)の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
iii)上記(i)及び(ii)に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞が提供される。
i)図1a、図2a、図3a、図4a、図4b、図5a、図5b、図6a、図6b、図7a、図7b、図8a又は図8bに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ii)上記(i)の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
iii)上記(i)及び(ii)に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターが提供される。
i)図9a、図9b、図10a、図10b、図11a、図12a及び図12bに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ii)上記(i)の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンをグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
iii)上記(i)及び(ii)に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞が提供される。
i)図9a、図9b、図10a、図10b、図11a、図12a及び図12bに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ii)上記(i)の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンをグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
iii)上記(i)及び(ii)に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターが提供される。
発酵槽システムにおける全細胞バイオリアクターアッセイ
UGT全細胞生体触媒の大規模な分析に、6L容のガラス製の加圧滅菌が可能な発酵槽システム(アプリコン・バイオテクノロジー社(Applikon Biotechnology Ltd.)製)を用いた。UGTを発現しているE.coliBL21の一晩培養物(40ml)を、事前に30℃でpH7.4に平衡化させた2LのLB培地を含有する発酵槽システムへ移した。溶存O2濃度は、1時間は95%に維持されたが、残りのプロセスでは60%に減少された。培養物の吸光度が0.2に達したら、温度を20℃に下げた。細菌培養物の吸光度が0.6に達した後、0.1mMのイソプロプル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド及び2gのケルセチンを添加した。サンプルを周期的に採取し、菌体を遠心分離により除去した。得られた上清画分(培養液)をHPLCにて分析した。
生体触媒の効率に影響し得る多様な条件がある。これらには、発酵槽の温度、培養液中の溶解酸素濃度及びpH、加えられる基質の濃度、並びに基質の調製に使用される溶媒が挙げられる。
1.ケルセチン
2.エスクレチン
3.トランス−ゼアチン
4.ジヒドロゼアチン
5.N6−イソペンテニルアデニン(iP)
6.N6−ベンジルアデニン
7.カイネチン
アッセイ混合物(200μl)に、2μgの組み換えタンパク質、100mMのTris−HCl(pH7.0)、5mMのUDP−グルコース、1.4mMの2−メルカプトエタノール及び0.5mMのケルセチンを含有させた。30℃で1時間反応させ、急速冷凍し、−20℃で保存後、逆相HPLC分析にかけた。
アッセイ混合物(200μl)は、2μgの組み換えタンパク質、100mMのTris−HCl(pH8.0)、5mMのUDP−グルコース、0.5mMのATP、50mMのMgCl2及び0.5mMのサイトカイニンを含有した。30℃で3時間反応させ、急速冷凍し、−20℃で保存後、逆相HPLC分析にかけた。
Columbus5μC18カラム(250×4.60mm、フェノメネックス社(Phenomenex)製)を用いて、逆相HPLC(Spectra SYSTEM HPLCシステム及びUV6000LPフォトダイオード・アレイ検出器、サーモクエスト社(Thermo Quest)製)分析を行った。H2O中10〜75%のアセトニトリル(全ての溶液は、0.1%のトリフルオロ酢酸を含有した)の直線勾配により、20分かけて1ml/分で、ケルセチングルコシド類をアグリコンから分離し、370nmで調べた。H2O中10〜100%のメタノール(N6−イソペンテニルアデニン(iP)、N6−ベンジルアデニン及びカイネチンにおいて)又はH2O中10〜60%のメタノール(トランス−ゼアチン及びジヒドロゼアチンにおいて)の直線勾配により、20分かけて1ml/分で、サイトカイニングルコシド類をそれらのアグリコンから分離した。全ての溶液は、0.25%の酢酸、0.04%のトリエチルアミン及びトリフルオロ酢酸を含有した。206nm及び252nmで分離を調べた。生成物の同定は、基準グルコシド類と比較して確認された。
1.7−N−グルコシド(76C1、76C2)
2.9−N−グルコシド(76C1、76C2)
3.O−グルコシド(トランス−ゼアチン及びジヒドロゼアチンにのみ適用する)(トランス−ゼアチンに関しては85A1;ジヒドロゼアチンに関しては85A1及び73C5)
発酵を7リットル容の発酵槽(アプリコン・バイオコンソールADI1025(Applicon Biotconsole ADI1025))で行った。処理を3日連続して行った。以下のパラメータ、すなわち温度、pH、O2飽和度の割合を連続的に観察し、制御した。系(system)の平衡化後、LB成長培地に15mlのスタータ・カルチャーを播種した。IPTGで細胞が誘導される時に、基質を添加する。等間隔で一定分量を抜き取り、グリコシドの生成物をHPLC分析で調べた。
カラム:Phenomenex Luna 5μ C18(2)、逆相250×10分;容積およそ19.6ml
使用システム:TFにおけるAKTA FPLCシステム(アマシャム・ファルマシア・バイオテク(株)社製)
植物UGTによるin vitroでのケルセチングルコシド類の合成
ケルセチンに対するアラビドプシス組み換えUGTの活性を、以前に開発されたプラットフォームを用いて求めた15。これらのデータセットにおいて、合計で4つの主要なモノグルコシド類しか見られず、逆相HPLCを用いたそれらの分離を、図13Bに示す。これらの生成物の構造は、1H NMRを用いて分析され、それらのスペクトルを公表されているデータと比較した17。生成物は、ケラチンの3−O−、7−O−、3’−O−、及び4’−O−モノグルコシドとして確認された(表2を参照)。C5−OHに対する有意な活性は、分析された組み換え酵素のいずれにも認められなかった。分析された91個の組み換えUGTのうち、29個の酵素がケルセチンに対する有意な触媒活性を呈し、その詳細を表1に示す。表を要約すると、基質をグルコシル化するさらなる選択性があった。14個の酵素が、ケルセチン上で一箇所の部位だけ認識し、そのうち12個はC3−OHをグルコシル化し、2個のUGTがC7−OHをグルコシル化した。15個の酵素が、2箇所以上の部位をグルコシル化し、そのうち11個は2箇所の部位のみ認識し、3個は3箇所の部位を認識することがわかった。1個のUGTは4箇所の部位全てをグルコシル化できることがわかった。
全細胞生体触媒としての植物UGT
先行の実施例で構築された基盤を用いて、本発明者等は、ケルセチンのグルコシドを合成する、全細胞生体触媒としての植物UGTを発現しているE.coliの潜在能力を調べた。まず第1に、本発明者等は、75mlの標準培養液で増殖されたE.Coliを用いた。UGT71C1を用いて形質転換された細胞を用いた実験予備セットの結果を、図14に示す。面白いことに、48時間の経時変化を通じて、大量のアグリコン及びグルコシド類が培養液中で回収され(図14A)、6時間以内におよそ50%のアグリコンがグルコシド類に変換された(図14B)。これらの研究から、いかなる補充UDP−グルコースが存在せずとも、標準培養液中の細胞は、十分量の添加された基質をグルコシル化することができたことが示された。表3に、7個の異なるUGTがE.coli中に発現され、且つ培養液中に回収された異なるグルコシド類の同定及び定量をHPLCにて分析した結果を記載する。in vivoでのグルコシル化の位置選択性のパターンは、in vitroでの各UGTにより発現されたものとかなり酷似したことを示唆した。細胞により合成された種々のグルコシド類の量はかなり異なり、これらの非最適化条件下にも関わらず、4つのモノグルコシド類及び2つのジ−O−グルコシド類が、それぞれ形成された。
発酵
UGT73B3及び1.5gのケルセチンを、ケルセチン−3−O−グルコシド(Q−3−G)の生成に使用した。4リットルの発酵を行った後、粗上清のHPLC分析を行い、Q−3−Gの生成を確認した。ブタノール抽出、溶媒蒸発及び50%のメタノール中での抽出物の再懸濁を経て、Q−3−Gの精製を行った。
UGT84B1及び0.5gのケルセチンを、ケルセチン−7−O−グルコシド(Q−7−G)の生成に使用した。2リットルの発酵を行った後、粗上清のHPLC分析を行い、Q−7−Gが生成されたことを確認した。上述したQ−3−Gの時のように、ブタノール抽出、溶媒蒸発及び50%のメタノール中での抽出物の再懸濁を経て、Q−7−Gの精製を行った。ピーク画分を、充填中の全流量と共に回収した。
Claims (22)
- 遺伝的に改変された細胞を含む反応槽であって、
i)図1a、図2a、図3a、図4a、図4b、図5a、図5b、図6a、図6b、図7a、図7b、図8a、図8b、図9a、図9b、図10a、図10b、図11a、図12a及び図12bに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ii)前記(i)に表される核酸配列に対してハイブリダイズし、且つグリコシルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、及び
iii)前記(i)及び(ii)で規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換により改変される前記細胞、及び前記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である、少なくとも1つの外生的基質を含む、前記細胞の増殖を維持する栄養培地を包含し、
該栄養培地が、UDP−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽。 - 前記反応槽がバイオリアクターである、請求項1に記載の反応槽。
- 前記反応槽が発酵槽である、請求項1又は2に記載の反応槽。
- 前記核酸分子が、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、図1a、図2a、図3a、図4a、図4b、図5a、図5b、図6a、図6b、図7a、図7b、図8a、図8b、図9a、図9b、図10a、図10b、図11a、図12a及び図12bに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の反応槽。
- 前記細胞が、前記核酸分子を含むベクターを用いて形質移入又は形質転換される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の反応槽。
- 前記細胞が、図1b、図2b、図3b、図4c、図5c、図6c、図7c、図8c、図9c、図10c、図11b又は図12cに表されるアミノ酸配列により表されるようなポリペプチド、又は少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換により改変された変異ポリペプチドをコードする、核酸分子を用いて形質移入又は形質転換される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の反応槽。
- 核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該細胞は、
i)図1a、図2a、図3a、図4a、図4b、図5a、図5b、図6a、図6b、図7a、図7b、図8a又は図8bに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ii)前記(i)の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
iii)前記(i)及び(ii)に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞。 - 前記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図1a、図2a、図3a、図4a、図4b、図5a、図5b、図6a、図6b、図7a、図7b、図8a又は図8bに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項7に記載の細胞。
- 前記抗酸化物がケルセチンである、請求項7又は8に記載の細胞。
- 前記抗酸化物がエスクレチンである、請求項7又は8に記載の細胞。
- 核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該細胞は、
i)図9a、図9b、図10a、図10b、図11a、図12a及び図12bに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ii)前記(i)の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンのグルコシル化であるグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
iii)前記(i)及び(ii)に規定された配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞。 - 前記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図9a、図9b、図10a,図10b、図11a、図12a及び図12bに表される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項11に記載の細胞。
- 前記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、N6−イソペンテニルアデニン、N6−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される、請求項11又は12に記載の細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項7〜13のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞又は植物細胞から成る群から選択される、請求項14に記載の細胞。
- 前記細胞が植物細胞である、請求項15に記載の細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項7〜13のいずれか1項に記載の細胞。
- 請求項16に記載の細胞を含む種子。
- 抗酸化物をグルコシル化する方法であって、請求項7〜10又は請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック細胞、請求項1〜6のいずれか1項に記載の反応槽中で前記トランスジェニック細胞の増殖を維持する栄養培地、及び前記トランスジェニック細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含み、前記栄養培地がUPD−グルコースの外生的供給を包含しない、該方法。
- 前記抗酸化物が、ケルセチン又はエスクレチンである、請求項19に記載の方法。
- サイトカイニンをグルコシル化する方法であって、請求項11〜13又は請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック細胞、本発明による反応槽中で前記トランスジェニック細胞の増殖を維持する栄養培地、及び前記トランスジェニック細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含み、前記栄養培地がUPD−グルコースの外生的供給を含まない、該方法。
- 前記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、N6−イソペンテニルアデニン、N6−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される、請求項21に記載の方法。
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