CN103298946A - 单萜烯糖基转移酶的利用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供新型萜烯8-位糖苷的制造方法。本发明提供利用萜烯8-位糖基转移酶的萜烯8-位糖苷的制造方法。本发明也提供导入萜烯8-位糖基转移酶基因的转化体及该转化对的制作方法。本发明还提供使具有使单萜烯化合物的8-位糖基化的活性的蛋白质的表达被抑制的植物。

Description

单萜烯糖基转移酶的利用方法

技术领域

本发明涉及单萜烯8-位糖苷的制造方法、高表达单萜烯8-位糖基转移酶的转化体以及根据所述方法制作的单萜烯的8-位糖苷及其应用。此外，本发明也涉及使具有使单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的表达被抑制的植物及其应用。 

背景技术

萜类化合物，特别是单萜烯(C10)、倍半萜烯(C15)等分子量较小的萜类是植物的主要香气成分，不仅广泛地用于食品、酒类的赋香，还广泛地用于化妆品、香水等工业产品。已知由芳樟醇所代表的单萜烯在植物细胞内合成，然而，其一部分作为糖苷蓄积，例如，已报道的有十字花科拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的8-位羟基化芳樟醇的糖苷(非专利文献1)。已知不仅是模式植物，作为工业上重要作物的大麻科的啤酒花(Humulus lupulus)(非专利文献2)、山茶科的茶(Camellia sinensis)(非专利文献3-6)、姜科的姜(Zingiber officinale)(非专利文献7)等中也蓄积有单萜烯糖苷。进而，由于在植物界中已有广泛报道(非专利文献8)，故而认为糖苷是作为香气成分前体的通常的方式。利用酶或非酶的方法将作为香气前体物质的萜烯糖苷的糖切除，并且如使香气成分挥发的人工控制，从工业应用的观点出发也已开始被研究(非专利文献9)。 

然而，迄今为止，可切断单萜烯糖苷的糖的酶(β-樱草糖苷酶(β-primeverosidase))已从茶中分离(非专利文献10)，但是将糖附加在单萜烯(糖基化)的分子机制仍不清楚。虽然通过拟南芥的UDP葡萄糖基转移酶(UDP-sugar dependent glycosyltransferase：UGT)的全面的活性筛选，有一部分的UGT酶在试管内与单萜烯反应，但是并未显示出生理性功能、或其活性的意义(非专利文献11)。由于芸香科的甜橙(Citrus sinensis)中也蓄积有单萜烯糖苷，所以进行了针对单萜烯的UGT的筛选，然而未成功鉴定出具有活性的 UGT酶基因(非专利文献12)。 

专利文献1：国际公开公报WO97/11184 

非专利文献1：Aharoni et al(2003)Plant Cell15,2866-2884 

非专利文献2：Kollmannsberger et al(2006)Mschr.Brauwissenschaft59,83-89 

非专利文献3：Guo et al(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58,1532-1534 

非专利文献4：Nishikitani et al(1996)Biosci.Biotech.Biochem.60,929-931 

非专利文献5：Moon et al(1996)Biosci.Biotech.Biochem.60,1815-1819 

非专利文献6：Ma et al(2001)Phytochemisty56,819-825 

非专利文献7：Sekiwa et al(1999)Biosci.Biotech.Biochem.63,384-389 

非专利文献8：Winterhalter and Skouroumounis(1997)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.55,73-105 

非专利文献9：Herman(2007)Angew.Chem.Int.Ed.46,5836-5863 

非专利文献10：Mizutani et al(2002)Plant Physiol.130,2164-2176 

非专利文献11：Caputi et al(2008)Chem.Eur.J.14,6656-6662 

非专利文献12：Fan et al(2010)Genome53,816-823 

非专利文献13：Winter et al(2007)PLoS One2,e718 

非专利文献14：Hou et al(2004)J.Biol.Chem.279,47822-47832 

非专利文献15：Kristensen et al(2005)Proc.Natl.Acd.Sci.USA102,1779-1784 

非专利文献16：Franks et al(2008)Funct.Plant Biol.35,236-246 

发明内容

在上述的情况下，期望鉴定出UGT酶基因及该基因所编码的蛋白质，并确立利用它们来高效地制造萜烯糖苷的方法。 

本发明人等从100种以上的候选基因(candidate gene)中，彻底地推进拟南芥的共表达分析(ATTED-II)的结果，发现了作为显示与芳樟醇合成酶基因(LIS)的高表达相关的UGT酶基因的UGT85A3及UGT85A1。此外，本发明人等进行了本酶基因的克隆，详细探讨其特性的结果，表明该基因所编码的蛋白 质对于单萜烯具有糖基化活性，特别是对于在8-位具有羟基的底物(8-羟基香叶醇、8-羟基芳樟醇)显示出高比活性。因此，UGT85A3基因及UGT85A1基因的表达方式与其生物化学上的酶功能，还有作为其生成物的单萜烯糖苷的蓄积区域全部一致，确认了UGT85A3及UGT85A1是生理性的芳樟醇糖基转移酶。基于上述见解完成了本发明。 

即本发明如下所示。 

[1].一种单萜烯8-位糖苷的制造方法，其特征在于，其包含使选自由以下(a)～(c)所组成的组中的任一项所述的蛋白质、UDP-糖、和单萜烯化合物反应，而使所述单萜烯化合物的8-位糖基化的工序， 

(a)由序列号2或9的氨基酸序列所组成的蛋白质； 

(b)由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入、和/或附加的氨基酸序列组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质； 

(c)具有相对于序列号2或9的氨基酸序列有75%以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质。 

[2].上述[1]中所述的方法，其特征在于，所述UDP-糖是UDP-葡萄糖。 

[3].上述[1]中所述的方法，其特征在于，所述单萜烯化合物是选自由8-羟基香叶烯、8-羟基橙花醇、8-羟基香叶醇及8-羟基芳樟醇所组成的组中的任一种。 

[4].一种非人转化体，其特征在于，其导入有选自由以下(a)～(e)所组成的组中任一项所述的多核苷酸， 

(a)含有序列号1、3、8或10的碱基序列的多核苷酸； 

(b)编码由序列号2或9的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸； 

(c)编码由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列所组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸； 

(d)编码具有相对于序列号2或9的氨基酸序列有75%以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸；及 

(e)与由序列号1、3、8或10的碱基序列互补的碱基序列所组成的多核苷 酸在高严谨条件下杂交，且编码具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸。 

[5].上述[4]中所述的转化体，其特征在于，其含有序列号1、3、8或10的碱基序列。 

[6].上述[4]中所述的转化体，其特征在于，所述多核苷酸插入表达载体。 

[7].上述[4]中所述的转化体，其特征在于，其是植物体。 

[8].一种提取物，其特征在于，其是上述[4]所述的转化体的提取物。 

[9].一种食品、香料、医药品或工业原料，其特征在于，其包含上述[8]所述的提取物。 

[10].一种具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的制造方法，其特征在于，其培养上述[4]所述的非人转化体。 

[11].一种植物，其特征在于，其是具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的表达被抑制的植物。 

[12].上述[11]所述的植物，其特征在于，所述蛋白质的表达由于RNA干扰而被抑制。 

[13].一种加工产品，其特征在于，其是上述[11]所述的植物的加工产品或是该植物的一部分的加工产品。 

[14].一种提取物，其特征在于，其是上述[11]所述的植物的提取物。 

[15].一种食品、香料、医药品或工业原料，其特征在于，其包含上述[14]所述的提取物。 

根据本发明的方法，可高效率地制造萜烯化合物的8-位糖苷。此外，由于本发明的转化体的萜烯化合物的8-位糖苷的含量高，所以从该转化体可高效率地提取·纯化萜烯化合物的8-位糖苷。 

附图说明

图1表示拟南芥中的单萜烯(芳樟醇)的代谢途径推测图。图中的箭头旁的数值表示依据ATTED-II所得的相关系数。 

图2表示AtLIS及UGT85A3的不同器官的基因表达图谱。图中的箭头表示在花瓣中的表达。 

图3表示CYP76C1及CYP76C3的基因表达图谱。图中的箭头表示花瓣 中的表达。 

图4表示在大肠杆菌中表达的组氨酸标签（HisTag）-UGT85A3嵌合蛋白的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果。图中的箭头表示组氨酸标签（HisTag）-UGT85A3嵌合蛋白。 

图5表示单萜烯糖苷的化学信息表。 

图6表示对于8-羟基香叶醇(图6A)及8-羟基芳樟醇(图6B)的UGT85A3的糖基化活性(LC-MS图谱)。箭头表示生成物(萜烯糖苷)的峰。 

图7表示通过UGT85A3所得到的香叶醇、8-羟基香叶醇、芳樟醇及8-羟基芳樟醇的生成物量的对比。 

图8表示UGT85A3的糖供体选择性(相对活性)。以活性最高的UDP-葡萄糖的活性作为100%。 

图9表示UGT85A1的不同器官的基因表达图谱。图中的箭头表示花瓣中的表达。 

图10表示在大肠杆菌所表达的组氨酸标签（HisTag）-UGT85A1嵌合蛋白的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果。图中的箭头表示组氨酸标签（HisTag）-UGT85A1嵌合蛋白。 

图11表示对于芳樟醇、8-羟基芳樟醇、香叶醇、8-羟基香叶醇的UGT85A1的糖基化活性(LC-MS图谱)。长方形框所围的峰表示生成物(萜烯糖苷)峰。 

图12表示UGT85A1的糖受体选择性(相对活性)。以活性最高的8-羟基香叶醇的活性作为100%。 

具体实施方式

下面，详细地说明本发明。下述的实施方式是为了说明本发明的例示，本发明并不限定于该实施方式的范围。本发明在不脱离其要旨的范围内，可通过各种方式来实施。 

另外，本说明书中所引用的全部文献、公开公报、专利公报及其它的专利文献作为参照均包含在本说明书中。此外，本说明书也包含2010年12月28日提出的成为本申请优先权主张的基础的日本专利申请(日本特愿2010-293237号)的说明书及附图所述的内容。 

本发明人等首次表明了单萜烯化合物的8-位的糖基化反应的酶蛋白质为UGT85A3及UGT85A1。 

UGT85A3的CDS序列、所推测氨基酸序列、基因组基因序列、cDNA序列及开放阅读框(ORF)序列分别为序列号1、2、3、4及5。此外，UGT85A1的CDS序列、所推测氨基酸序列、基因组基因序列及cDNA序列分别为序列号8、9、10及11。这些多核苷酸及酶，可通过后述的实施例所记载的方法、公知的基因工程的方法、公知的合成方法等来取得。 

1.单萜烯8-位糖苷的制造方法

本发明提供单萜烯化合物的8-位糖苷的制造方法，其包含使选自由以下(a)～(c)所组成的组中的任一项所述的蛋白质(以下，称作“本发明的蛋白质”)、UDP糖、和单萜烯化合物反应，而使所述单萜烯化合物的8-位糖基化的工序， 

(a)由序列号2或9的氨基酸序列所组成的蛋白质； 

(b)由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列所组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质； 

(c)具有相对于序列号2或9的氨基酸序列有75%以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质。 

上述(b)或(c)所述的蛋白质，其代表为天然存在的序列号2或9的多肽的突变体，例如，也包含可使用“Sambrook＆Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press2001”、“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons1987-1997”、“Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)”、“Gene,34,315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等所述的定点诱变法，通过人工所取得的物质。 

作为本说明书中所述的“由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入、和/或附加的氨基酸序列组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质”，可列举由序列号2或9的氨基酸序列中，例如1～125个、1～120个、1～115个、1～110个、1～105个、1～100个、1～95个、1～90个、1～85个、1～80个、1～75个、1～70个、1～65个、1～ 60个、1～55个、1～50个、1～49个、1～48个、1～47个、1～46个、1～45个、1～44个、1～43个、1～42个、1～41个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个(1～数个)、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列组成，且具有单萜烯化合物的8-位的糖基化活性的蛋白质。一般而言，上述氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或附加的数目越少越优选。 

此外，作为此类蛋白质，可列举具有与序列号2或9的氨基酸序列有75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上或99.9%以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质。上述序列同一性的数值通常越大越优选。 

在此，“单萜烯化合物的8-位糖基化活性”是指在作为苷元(aglycone)的单萜烯化合物的8-位羟基上附加UDP糖所包含的糖(糖基化)的活性。本发明的蛋白质也可具有单萜烯化合物的除8-位以外的糖基化活性，然而，与单萜烯化合物的除8-位以外的羟基相比，此时，本发明的蛋白质优先糖基化8-位的羟基。 

单萜烯化合物的8-位糖基化活性，在包含本发明的蛋白质1～500ng(优选50～200ng，最优选100ng)、UDP糖(例如，UDP-葡萄糖)1～1000μM(优选100～700μM，最优选500μM)及单萜烯化合物(例如，8-羟基芳樟醇)1～500μM(优选100～500μM，最优选250μM)的pH6.0～8.0的中性区域的缓冲液(例如，磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液)中，以20～40℃的温度孵育后，纯化所述单萜烯，再将所纯化的单萜烯通过液相色谱-质谱联用法(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry：LC-MS)等公知的方法进行分析来确认。 

此外，与单萜烯化合物的除8-位以外的羟基相比，本发明的蛋白质是否优先糖基化8-位的羟基，可将本发明的蛋白质、UDP糖(例如，UDP-葡萄糖)、在8-位上具有羟基的单萜烯化合物(例如，8-羟基芳樟醇)及在除8-位以外的部位具有羟基的单萜烯化合物(例如，芳樟醇)在与上述相同的条件下孵育后，纯化所述各单萜烯，再将纯化的单萜烯通过LC-MS等公知的方法进行分析来确认。 

通常，糖基化反应可在1分钟～12小时左右完成。 

在本发明的蛋白质的氨基酸序列中，有1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入和/或附加是指在同一序列中的任意1个或多个氨基酸序列中的位置中，1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入和/或附加，缺失、取代、插入及附加中的2种以上的情形也可同时发生。 

以下，例示可以相互取代的氨基酸残基。同一组所包含的氨基酸残基可以相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：哺氨酸、3-羟基哺氨酸、4-羟基哺氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。 

本发明的蛋白质可通过使编码该蛋白质的多核苷酸(参考下述“本发明的多核苷酸”)在适当的宿主细胞内表达而得到，也可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。此外，也可利用Advanced Automation Peptide Protein Technologies公司、Perkin Elmer公司、Protein Technologies公司、PerSeptive公司、Applied Biosystems公司、SHIMADZU公司等制造的肽合成仪来进行化学合成。 

本发明中，“单萜烯化合物”为以异戊间二烯为结构单元的烃，除由植物、昆虫及菌类等所产生的生物体物质以外，也包含化学合成的化合物。 

本发明中，单萜烯化合物只要在其8-位具有羟基(例如，8-羟基单萜类化合物)即可，无特别限定，除8-位以外的碳原子也可被包括羟基的任意基团所取代。 

作为此种单萜烯的例子，具有8-羟基香叶烯、8-羟基橙花醇、8-羟基香叶醇及8-羟基芳樟醇等，但是不限定于上述例子。优选8-羟基香叶醇或8-羟基芳樟醇。 

表1 

本发明中，“UDP-糖”是指尿苷二磷酸(Uridine DiPhosphate：UDP)结合型的糖，作为例子，可列举UDP-葡萄糖醛酸及UDP-葡萄糖，但不限定于以上例子。优选的UDP-糖为UDP-葡萄糖。 

本发明涉及的单萜烯8-位糖苷的制造方法，包含将本发明的蛋白质、UDP糖、单萜烯化合物进行反应而使所述单萜烯化合物的8-位糖基化的工序。本发明的方法可进一步包含将所述工序中生成的单萜烯化合物的8-位糖苷进行纯化的工序。 

单萜烯化合物的8-位糖苷，可通过适当的溶剂(水等的水性溶剂或醇、醚及丙酮等的有机溶剂)提取、醋酸乙酯或其它的有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography：HPLC)、气相色谱法、飞行时间质谱分析法(Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS)、超高效液相色谱法(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC)等公知的方法进行纯化。 

2.高含量含有单萜烯8-位糖苷的非人转化体

单萜烯8-位糖苷，也可使用本发明的蛋白质在细菌(大肠杆菌或酵母等)、植物、昆虫、除人以外的哺乳动物等的细胞内生成。由于本发明的蛋白质为来自拟南芥的酶或其突变体，所以可期待在细胞内环境具有高活性。此时，将编码本发明的蛋白质的多核苷酸(参考下述的“本发明的多核苷酸”)导入来自细菌、植物、昆虫、除人以外的哺乳动物等的宿主细胞中，而使本发明的蛋白质表达，再通过使本发明的蛋白质与存在于所述细胞内的UDP-糖及单萜烯化合物反应，可生成单萜烯8-位糖苷。导入编码本发明的蛋白质的基因而得到的非人转化体与其野生型相比，可期待获得高含量的单萜烯8-位糖苷。 

因此，本发明可提供导入选自由以下(a)～(e)所组成的组中的任一项所述多核苷酸(以下，称为“本发明的多核苷酸”)的非人转化体(以下，称为“本发明的转化体”)。 

(a)含有序列号1、3、8或10的碱基序列的多核苷酸； 

(b)编码由序列号2或9的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸； 

(c)编码由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入、和/或附加的氨基酸序列所组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性蛋白质的多核苷酸； 

(d)编码具有相对于序列号2或9的氨基酸序列有75%以上序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸；及 

(e)与由序列号1、3、8或10的碱基序列互补的碱基序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸。 

本说明书中，“多核苷酸”是指DNA或RNA。 

本说明书中，“在高严谨条件下杂交的多核苷酸”是指以例如由与序列号1、3、8或10的碱基序列互补的碱基序列所组成的多核苷酸，或由编码序列号2或9的氨基酸序列的碱基序列所组成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或南部印迹法（Southern杂交法）等而得到的多核苷酸。作为杂交的方法可利用文献，例如“Sambrook＆Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press2001”及“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons1987-1997”等所记载的方法。 

本说明书中，“高严谨条件”是指例如5×SSC、5×登哈特溶液(Denhardt’s solution)、0.5%SDS、50%甲酰胺、50℃或0.2×SSC、0.1%SDS、60℃、0.2×SSC、0.1%SDS、62℃、0.2×SSC、0.1%SDS、65℃的条件，但不限定于此。在上述条件中，温度越高，越可期待高效地得到具有高序列同一性的DNA。但是，作为影响杂交严谨性的因素，认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，所以本领域技术人员可适当选择这些因素，即可实现相同的严谨性。 

另外，使用市售的试剂盒来进行杂交时，例如可使用直接标记及检测系统（Alkphos Direct Labelling and Detection System）(GE Healthcare制造)。此时，依照试剂盒所附的说明(protocol)，与标记的探针孵育过夜后，在55～60℃的条件下以含0.1%(w/v)SDS的1次洗净缓冲液将膜(membrane)洗净后，可检测出杂交的DNA。或在基于与序列号1、3、8或10的碱基序列互补的碱基序列或编码序列号2或9的氨基酸序列的碱基序列的全部或一部分来制作探针时，在使用市售的试剂(例如，PCR标记混合剂(Roche Diagnostics公司)等) 将该探针用地高辛(DIG)标记时，可使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)检测杂交。 

作为除上述以外可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等的同源性检索软件，使用默认的参数计算时，可列举与序列号1、3、8或10的DNA或编码序列号2或9的氨基酸序列的DNA具有序列同一性60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上或99.9%以上的DNA。 

另外，氨基酸序列、碱基序列的序列同一性可使用根据FASTA(Science227(4693):1435–1441,(1985)、基于Karlin-Altschul的算法(algorithm)BLAST(基本局部比对搜索工具：Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268,1990;Proc Natl Acad Sci USA90:5873,1993)来确定。已开发有基于BLAST的算法而被称作blastn、blastx、blastp、tblastn、tblastx等程序(Altschul SF,et al:J Mol Biol215:403,1990)。使用blastn分析碱基序列时，参数可采用例如score（记分）=100、wordlength（字长）=12。此外，使用blastp分析氨基酸序列时，参数可采用例如score=50、wordlength=3。使用BLAST与Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。 

上述的本发明的多核苷酸可依照公知的基因工程的方法或公知的合成方法来取得。 

本发明的多核苷酸，优选以插入适当的表达载体的状态导入宿主中。 

适当的表达载体，通常构成为包含以下内容： 

(i)可在宿主细胞内转录的启动子； 

(ii)结合该启动子的本发明的多核苷酸；及 

(iii)作为构成要素包含有关RNA分子的转录终止及多聚腺苷化(polyadenylation)，且在宿主细胞内发挥功能的信号的表达盒(cassette)。 

作为表达载体的制作方法，可列举使用质粒、噬菌体或粘粒(cosmid)等的方法，无特别限定。 

载体的具体种类无特别限定，可适当选择在宿主细胞中可表达的载体。即根据宿主细胞的种类，为了确实地使本发明的多核苷酸表达，选择适当的启动子序列，然后将该启动子序列与本发明的多核苷酸整合入各种质粒等的载体作为表达载体使用即可。 

本发明的表达载体，依赖于拟导入的宿主的种类，含有表达调控区域(例如，启动子、终止子和/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，可使用惯用的启动子(例如，trc启动子、tac启动子、lac启动子等)，作为酵母用启动子，可列举例如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子、PH05启动子等，作为丝状菌用启动子，可列举例如淀粉酶、trpC等。此外，作为用于在植物细胞内表达目标基因的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子，将所述花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子的增强子序列附加到来自农杆菌的甘露碱(mannopine)合成酶启动子序列的5’侧的mac-1启动子等。作为动物细胞宿主用启动子，可列举病毒性启动子(例如，SV40早期启动子、SV40晚期启动子等)。 

表达载体优选包含至少1个选择标记。作为此种标记，可利用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、抗药性标记(潮霉素、吉欧霉素(Zeocin))、遗传霉素(geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(参考Marin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.81,p.337,1984)、浅蓝菌素(cerulenin)抗性基因(fas2m,PDR4)(分别参考猪腰淳嗣等,生化学,vol.64,p.660,1992；Hussain等,Gene,vol.101,p.149,1991)等。 

本发明的转化体的制作方法(生产方法)无特别限定，例如可列举将包含本发明的多核苷酸的表达载体导入宿主而进行转化的方法。在此，所使用的宿主细胞无特别限定，可合适地使用以往公知的各种细胞。具体而言，例如可列举大肠杆菌(Escherichia coli)等的细菌、酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe)、植物细胞、除人以外的动物细胞等。 

用于上述宿主细胞的适当的培养基及条件为该领域所周知。此外，成为转化的对象的生物也没有特别限定，可列举上述宿主细胞所例示的各种微生 物或植物或除人以外的动物。 

作为宿主细胞的转化方法，可利用通常所使用的公知的方法。例如，可实施电穿孔法（electroporation）(Mackenxie,D.A.等,Appl.Environ.Microbiol.,vol.66,p.4655-4661,2000)、粒子轰击法（particle delivery method）(日本特开2005-287403号公报“脂质生产菌的育种方法”所述的方法)、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.75,p.1929,1978)、醋酸锂法(J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983)、以及酵母遗传学方法（Methods in yeast genetics）,2000年版:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等所述的方法)，但不限定于这些。 

其它，有关一般的分子生物学的方法，可参考“Sambrook＆Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press2001”、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY)”等。 

在本发明的一个方式中，转化体可为植物转化体。涉及本实施方式的植物转化体可通过将包含本发明所涉及的多核苷酸的重组载体以由该多核苷酸所编码的多肽可表达的状态导入植物中来取得。 

使用重组表达载体时，用于植物体的转化的重组表达载体只要是在该植物内使本发明所涉及的多核苷酸可表达的载体，则没有特别限定。作为此种载体，例如可列举具有在植物细胞内使多核苷酸组成型表达的启动子的载体或具有通过外界刺激可诱导型活化的启动子的载体。 

作为在植物细胞内可使多核苷酸组成型表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子、mac-1启动子等。 

作为通过外界刺激可诱导型活化的启动子的例子，可列举小鼠乳腺癌病毒(MMTV)启动子、四环素反应性(tetracycline response)启动子、金属硫蛋白(metallothionein)启动子及热休克蛋白(heat shock protein)启动子等。 

本发明中成为转化对象的植物意指植物体整体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵组织等)或植物培养细胞或各种形态的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等的任一种。作为用于转化的植物 无特别限定，可为属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物的任一种。 

向植物导入基因可使用本领域技术人员所公知的转化方法(例如，农杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等)。例如，周知的方法有农杆菌介导的方法与直接导入植物细胞的方法。使用农杆菌法时，可将构建好的植物用表达载体导入适当的农杆菌(例如，农杆菌·根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))，再将该株按照叶盘法(内宫博文著，植物基因操作指南(1990)27～31页，讲谈社Scientific，东京)等，感染无菌培养叶片而得到转化植物。此外，也可使用Nagel等的方法(Micribiol.Lett.,67:325(1990))来得到。该方法首先例如将表达载体导入农杆菌，接下来将转化的农杆菌按照植物分子生物学手册（Plant Molecular Biology Manual）(Gelvin,S.B.等,Academic Press Publishers)所述的方法导入植物细胞或植物组织。在此，“植物组织”是指包含通过植物细胞的培养所得到的愈伤组织。使用农杆菌法进行转化时，可使用双元载体(pBI121或pPZP202等)。 

此外，作为将基因直接导入植物细胞或植物组织的方法，已知有电穿孔法、粒子枪法。使用粒子枪法时，可直接使用植物体、植物器官、植物组织本身，也可制备成切片后使用，也可制备成原生质体后使用。可将如此制备的试样使用基因导入装置(例如，PDS-1000(BIO-RAD公司)等)进行处理。处理条件根据植物或试样的不同而不同，但通常在450～2000psi左右的压力下，以4～12cm左右的距离进行。 

经导入基因的细胞或植物组织，先选择潮霉素抗性等的抗药性，接下来根据规定方法再生为植物体。从转化细胞到植物体的再生，可根据植物细胞的种类，采用本领域技术人员所公知的方法进行。 

使用植物培养细胞作为宿主时，其转化可利用基因枪、电穿孔法等将重组载体导入培养细胞。转化的结果所得到的愈伤组织、不定芽（shoot）、毛状根等，可直接用于细胞培养、组织培养或器官培养，此外，使用以往已知的植物组织培养法，通过投与适当浓度的植物激素(生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸(abscisic acid)、乙烯、油菜素内酯等)等可再生成植物体。 

确认本发明的多核苷酸是否导入植物中，可通过PCR法、南部印迹法（Southern杂交法）、北部印迹法（Northern杂交法）等进行。例如，从转化植物制备DNA，设计DNA特异性引物进行PCR。PCR可按照与所述制备质 粒所使用的条件相同的条件进行。其后，对于扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，通过溴化乙锭、荧光染料（SYBR Green液）等染色，然后通过将扩增产物以一条扩增带来检测，从而确认其转化。此外，使用预先通过荧光色素等标记的引物进行PCR，也可检测扩增产物。进而，也可采用将扩增产物与微孔板等固相结合，再通过荧光或酶反应等确认扩增产物的方法。 

一旦取得将本发明的多核苷酸整合入基因组内的转化植物体，即可通过该植物体的有性生殖或无性生殖得到其后代。此外，可由该植物体或其后代或它们的克隆，获得例如种子、果实、切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等，再以它们为基础大量生产该植物体。因此，本发明中也包含将本发明所涉及的多核苷酸以可表达状态导入的植物体或与该植物体具有相同性质的该植物体的后代或来自它们的组织。 

此外，对于各种植物转化方法已有报道。作为本发明所涉及的转化体植物，可列举茄科植物(例如，茄子、番茄、辣椒、马铃薯、烟草、曼陀罗花、酸浆、矮牵牛、小花矮牵牛、赛亚麻(Nierembergia)等)、豆科植物(例如，大豆、红豆、花生、四季豆、蚕豆、百脉根等)、蔷薇科植物(例如，草莓、梅、樱花、蔷薇、蓝莓、黑莓、山桑子、黑醋栗、覆盆子等)、石竹科植物(康乃馨、丝石竹等)、菊科植物(菊花、非洲菊、向日葵、雏菊等)、兰科植物(兰花等)、报春花科植物(仙客来等)、龙胆科植物(洋桔梗、龙胆等)、鸢尾科植物(小苍兰、鸢尾、唐菖蒲等)、玄参科植物(金鱼草、蓝猪耳等)、景天科植物(长寿花)、百合科植物(百合、郁金香等)、旋花科植物(牵牛花、红叶牵牛花、月光花、甘薯、茑萝、土丁桂(Evolvulus)等)、八仙花科植物(八仙花、溲疏(Deutzia crenata)等)、葫芦科植物(瓠子等)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)植物(天竺葵属(Pelargonium)、老鹳草属等)、木犀科植物(连翘等)、葡萄科植物(例如，葡萄等)、山茶科植物(山茶花、茶树等)、禾本科植物(例如，稻、大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、小米、稗子、高粱、甘蔗、竹、野燕麦、龙爪稷(eleusine coracana)、蜀黍(Sorghum)、茭白(Manchurian wild rice)、薏仁、牧草等)、桑科植物(桑、啤酒花、构树(Broussonetia kazinoki)、橡胶树、麻等)、茜草科植物(咖啡树、栀子花等)、壳斗科植物(橡树、山毛榉、槲树(Quercus dentata)等)、胡麻科植物(胡麻等)、芸香科植物(例如，酸橙、香橙、温州蜜柑、胡椒)及十字花科植 物(红甘蓝、羽衣甘蓝、萝卜、白荠菜、油菜、甘蓝、西兰花(broccoli)、花椰菜(cauliflower)等)、唇形科(一串红、紫苏、薰衣草、耳挖草等)。作为植物的优选例子，可列举具有芳香性的植物，例如，紫苏、薰衣草等，或原本几乎不具有芳香但商业价值高的园艺植物，例如康乃馨等。 

用本发明的多核苷酸转化的植物体(以下称为“本发明的植物”或“本发明的植物体”)与其野生型相比，包含大量的单萜烯化合物的8-位糖苷。 

本发明的植物可通过培育本发明的植物的种子、插条、球根等而容易地得到完整的植物体。 

据此，本发明的植物包含植物体整体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子、球根等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵组织等)或植物培养细胞或者各种形态的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。 

3.转化体的提取物及其利用

此外，本发明在另一种实施方式中，提供上述转化体的提取物。由于本发明的转化体与其野生型相比单萜烯8-位糖苷的含量高，因此认为其提取物中包含高浓度的单萜烯8-位糖苷。 

本发明的转化体的提取物可通过使用玻璃珠、均质器或超声波破碎仪等将转化体破碎，再将该破碎物离心处理，回收其上清液来得到。进而，也可通过上述单萜烯8-位糖苷的提取方法，实施进一步的提取工序。 

本发明的转化体的提取物可依照常规方法，用于例如食品、香料、医药品、工业原料(化妆料、肥皂等的原料)的制造等的用途。 

此外，在本发明的另一实施方式中，可提供包含本发明的转化体的提取物的食品、香料、医药、工业原料(化妆料、肥皂等的原料)。包含本发明的转化体的提取物的食品、香料、医药、工业原料的制备可依照常规方法进行。如此，包含本发明的转化体的提取物的食品、香料、医药、工业原料等，含有使用本发明的转化体而生成的单萜烯8-位糖苷。 

本发明的香料(组合物)或医药品(组合物)的剂型无特别限定，可采用溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型。此外，本发明的香料组合物或医药组合物除可使用油剂、洗液、霜、乳液、凝胶、洗发精、润丝精 (Hair Rinse)、护发素、指甲油、粉底、唇膏、香粉、面膜、软膏、香水、粉饼、古龙水、牙膏、肥皂、喷雾剂、洁面膏等的化妆料或皮肤外用药以外，还可使用浴用剂、育毛剂、皮肤美容液、防晒剂等。 

本发明的化妆料组合物，根据需要，还可进一步适当地配合其它的油脂和/或色素、香料、防腐剂、表面活性剂、颜料、抗氧化剂等。它们的配合比率根据目的，可由本领域技术人员适当地决定(例如，油脂可在组合物中含有1～99.99重量%，优选5～99.99重量%，更优选10～99.95重量%)。此外，本发明的医药组合物，根据需要还可进一步包含其它的医药活性成分(例如，消炎成分)或辅助成分(例如，润滑成分、载体成分)。 

作为本发明的食品的例子，可列举营养辅助食品、健康食品、功能性食品、幼儿用食品、老人用食品等。本说明书中，食品为包括固体、流体及液体以及它们的混合物的可食用的物质的总称。 

营养辅助食品是指强化了特定的营养成分的食品。健康食品是指健康的或对健康有益的食品，包含营养辅助食品、自然食品、减肥食品等。功能性食品是指用于补给可起到机体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用食品具有相同意义。幼儿用食品是指提供到约6岁为止的儿童用食品。老人用食品是指与无处理的食品相比，其为经处理而成为易于消化及吸收的食品。 

作为这些食品的形态的例子，可为面包、面类、米饭、糖果类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式糖果)、豆腐及其加工品等的农产食品，清酒、药酒、料酒(Mirin)、食用醋、酱油、豆酱等的发酵食品，酸奶、火腿、培根、香肠等的畜产食品，鱼糕(kamaboko)、炸鱼饼(ageten)、鱼肉山芋饼(hanpen)等的水产食品、果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等或调味料。 

4.单萜烯8-位糖基转移酶的表达被抑制的植物

通过抑制存在于植物中的内源性的具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的表达，可抑制单萜烯的糖基化。其结果，该植物的更多的单萜烯作为苷元存在，可期待其散发更强的芳香。 

因此，本发明可提供具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的表达被抑制的植物。 

具有单萜烯化合物的8-位糖基化的活性的蛋白质(以下，称为“单萜烯8-位糖基转移酶”)，具体而言，由选自由以下(a)～(e)所组成的组中任一项所述的多核苷酸编码。 

(a)含有序列号1、3、8或10的碱基序列的多核苷酸； 

(b)编码由序列号2或9的氨基酸序列所组成蛋白质的多核苷酸； 

(c)编码由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或附加的氨基酸序列所组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化的活性的蛋白质的多核苷酸； 

(d)编码具有相对于序列号2或9的氨基酸序列有75%以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化的活性的蛋白质的多核苷酸；及 

(e)与由序列号1、3、8或10的碱基序列互补的碱基序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交的多核苷酸，且编码具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸。 

关于(a)～(e)的多核苷酸的定义等，如“2.高含量含有单萜烯8-位糖苷的非人转化体”所述。 

作为抑制单萜烯8-位糖基转移酶的表达的方法的具体例，可列举可使该酶的信使RNA(mRNA)的表达量降低的物质，例如低分子化合物、激素、蛋白质及核酸等，其实施样式之一为抑制编码所述酶的基因的功能或表达的核酸。作为此种核酸的例子，可列举产生RNA干扰(RNAi)用的siRNA(小干扰RNA：small interfering RNA)的发夹状的shRNA(短发夹RNA：Short Hairpin RNA)、双链RNA(双链RNA：Double Stranded RNA:dsRNA)、反义核酸、诱饵（decoy）核酸或核酸适体(aptamer)等。通过这些抑制性核酸，可抑制上述基因的表达。成为抑制对象的单萜烯8-位糖基转移酶基因由上述(a)～(e)的多核苷酸构成，可分别获得其序列信息。在本发明中，除单萜烯8-位糖基转移酶基因的编码区以外，还可将其非编码区作为抑制对象区域来使用。 

RNA干扰(RNAi)为经过多个阶段而进行的多步骤过程(multi-step process)。最初，由RNAi表达载体所表达的dsRNA或shRNA通过双体(Dicer)识别，分解成为21～23个核苷酸的siRNAs。其次，siRNAs被导入称作RNA诱导沉默复合物(RNA-Induced Silencing Complex:RISC)的RNAi目标复 合物，RISC和siRNAs的复合物与包含与siRNA的序列互补的序列的目标mRNA结合,来分解mRNA。目标mRNA在与siRNA互补的区域的中央被切割，最终目标mRNA快速分解而蛋白表达量降低。已知效力最高的siRNA双链为19bp的双链的各3’末端具有2个尿嘧啶核苷残基的突出部分的21个核苷酸长度的序列(Elbashir S.M.等,Genes and Dev,15,188-200(2001))。 

通常，mRNA上的目标序列可从对应于mRNA的cDNA序列中选择。但在本发明中，不限定于该区域。 

siRNA分子可基于该领域中周知的基准来设计。例如，目标mRNA的目标片段可优选始于AA、TA、GA或CA的连续15～30个碱基，优选19～25个碱基的片段。siRNA分子的GC比为30～70%，优选35～55%。或者，RNAi的目标序列也可按照Ui-Tei K.等((2004)Nucleic Acids Res.32,936-948)的记载进行适当选择。 

将siRNA导入细胞，可采用将已合成的siRNA与质粒DNA连接并将其导入细胞的方法，或将双链RNA退火(anneal)的方法等。 

此外，本发明为了发挥RNAi效果可使用shRNA。shRNA称作短发夹RNA，是指单链的一部分区域具有用于与其它的区域形成互补链的茎环(stem-loop)结构的RNA分子。 

shRNA的一部分可设计成能形成茎环(stem-loop)结构。例如以某区域的序列作为序列A，相对于序列A的互补链为序列B，按照序列A、间隔序列(spacer)、序列B的顺序将这些序列以存在于单链的RNA链的方式来连接，从而设计成整体长度为45～60个碱基。间隔序列的长度也无特别限定。 

序列A为成为目标的单萜烯8-位糖基转移酶基因的一部分区域的序列，其目标区域无特别限定，可将任意区域作为其候补。其次，序列A的长度为19～25个碱基，优选19～21个碱基。 

进而，本发明也可使用微小RNA（microRNA）来抑制单萜烯8-位糖基转移酶的表达。认为微小RNA（microRNA）(miRNA)为存在于细胞内的长度约20～25个碱基的单链RNA，具有调节其它基因表达的功能的ncRNA(非编码RNA)的一种。miRNA为当转录成RNA时接受加工而生成，作为形成抑制目标序列的表达的发夹结构的核酸而存在。 

由于miRNA也是基于RNAi的抑制性核酸，故可以shRNA或siRNA为 准设计而合成。 

RNAi用的表达载体以pMuniH1质粒、pSINsi载体(Takara Bio)、pSIF1-H1(System Bioscience公司)等为基础，使用市售的DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems394型)而容易地制作。作为RNAi用的表达载体的例子，例如，可列举pSPB1876(国际公开公报WO2004/071467)，但不限定于此。RNAi用的表达载体还可委托Cosmo Bio株式会社、Takara Bio株式会社、Invitrogen公司、Promega公司等的第三方机构来制作。 

单萜烯8-位糖基转移酶的表达被抑制的植物的制造方法也可包括以下工序。 

(1)在宿主植物或其一部分中，导入相对于单萜烯8-位糖基转移酶的RNAi用的表达载体(例如，siRNA表达载体或miRNA表达载体)的工序。 

向宿主植物导入RNAi用的表达载体的方法，与项目“2.高含量含有单萜烯8-位糖苷的非人转化体”所述的方法相同。宿主植物可为植物体整体或作为其一部分的植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵组织等)或植物培养细胞或者各种形态的植物细胞(例如，悬浮培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等的任一种。关于植物的种类，与项目“2.高含量含有单萜烯8-位糖苷的非人转化体”所述的相同。 

(2)培育所述工序(1)所得的转化植物的工序 

所述工序(1)所使用的宿主植物为植物器官、植物组织、植物细胞、原生质体、叶的切片或愈伤组织等植物体的一部分时，可在适当环境下培育转化体至形成完整的植物体为止。关于由植物体的一部分培育完整的植物体的方法，可参考以下文献记载：生物化学实验法41，植物细胞工程入门，学会出版中心，ISBN4-7622-1899-5。 

通过栽培如此得到的单萜烯8-位糖基转移酶基因的表达被抑制的植物，可有效地制造单萜烯·苷元。 

5.单萜烯8-位糖基转移酶基因的表达被抑制的植物的加工产品

现在，不仅出售鲜花(例如，土壤栽培植物、盆栽植物、切花等)，鲜花的加工产品也可作为植物观赏用的产品来出售。由于单萜烯8-位糖基转移酶基 因的表达被抑制的植物芳香性强，因此作为此种鲜花的加工产品的材料也非常有用。因此，作为本发明的其它实施方式，可列举单萜烯8-位糖基转移酶基因的表达被抑制的植物(例如、鲜花、切花)或其一部分(例如叶、花瓣、茎、根、种子、球根等)的加工产品。作为所述加工产品的例子，可列举压花、干燥花、保鲜花、花材、树脂密封品等，但不限定于这些。 

6.单萜烯8-位糖基转移酶的表达被抑制的植物的提取物及其应用

在本发明的另一实施方式中，提供上述单萜烯8-位糖基转移酶的表达被抑制的植物的提取物。单萜烯8-位糖基转移酶的表达被抑制的植物与其野生型相比，由于单萜烯·苷元的含量高，因此认为其提取物包含高浓度的单萜烯·苷元。 

上述提取物的提取方法与上述的本发明的转化体的提取物的提取方法相同。 

如此得到的提取物可依照常规方法，例如用于食品、香料、医药品、工业原料(化妆料、肥皂等的原料)的制造等的用途。 

在本发明的另一实施方式中，提供包含所述提取物的食品、香料、医药、工业原料(化妆料、肥皂等的原料)。包含所述提取物的食品、香料、医药、工业原料的制备可依照常规方法进行。这种包含单萜烯8-位糖基转移酶的表达被抑制的植物的提取物的食品、香料、医药、工业原料等，含有使用单萜烯8-位糖基转移酶的表达被抑制的植物所生成的单萜烯·苷元。 

本发明的食品、香料、医药、工业原料等的种类及组成等与先前的项目“3.转化体的提取物及其利用”所述的相同。 

7.萜烯8-位糖苷含量高的植物或单萜烯·苷元含量高的植物的筛选方法

本发明提供筛选单萜烯·苷元含量高的植物的方法。具体而言，所述方法包含以下(1)～(3)的工序。 

(1)从受试植物中提取mRNA的工序； 

(2)使所述mRNA或由所述mRNA制备的cDNA以及与由本发明的多核苷酸互补的碱基序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交的多核苷酸进行杂交的工序； 

(3)检测所述杂交的工序。 

上述工序(1)可通过从受试植物中提取mRNA来进行。提取mRNA的受试植物的部位无特别限定，但优选花瓣。提取mRNA时，可通过逆转录由mRNA制备cDNA。 

工序(2)相对于上述提取的mRNA，将由与本发明的多核苷酸互补的碱基序列所组成的多核苷酸或寡核苷酸作为探针或引物，在高严谨条件下杂交而进行。高严谨条件如以上所述。多核苷酸或寡核苷酸的长度优选5～500bp，更优选10～200bp，进一步优选10～100bp。多核苷酸或寡核苷酸可使用各种自动合成装置(例如，AKTA oligopilot plus10/100(GE Healthcare))容易地合成，或者可委托第三方机构(例如，Promega公司或Takara公司)等。 

在工序(2)中，将由与本发明的多核苷酸互补的碱基序列所组成的多核苷酸作为探针使用时，工序(3)可通过通常的南部印迹法（Southern印迹法）、北部印迹法（Northern印迹法）(参考Sambrook,Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”第二版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)、微阵列（microarray）(Affymetrix公司；美国专利第6,045,996号、美国专利第5,925,525号及美国专利第5,858,659号)、聚合酶链反应（TaqMan PCR）(Sambrook,Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”第二版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)或荧光原位杂交（Fluorescent In Situ Hybridization）(FISH)(Sieben V.J.等,(2007-06).IET Nanobiotechnology1(3):27–35)等的杂交检测方法来进行。另一方面，在工序(2)中，使用由与本发明的多核苷酸互补的碱基序列所组成的多核苷酸作为引物时，可通过将工序(3)进行PCR扩增反应所得到的扩增产物经电泳或测序(sequencing)(Sambrook,Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”第二版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)等进行分析来检测杂交。 

检测到更多杂交的植物体与其它的植物体相比，由于表达更多具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质，所以可预测萜烯8-位糖苷的含量高。 

另一方面，检测到更少杂交的植物体与其它的植物体相比，具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的表达低，所以单萜烯·苷元的含量高，可预测在开花时释放特别强的芳香。 

实施例 

以下，使用实施例来更具体地说明本发明，但本发明的范围不限定于这些实施例。 

［实施例1］候选基因的分离 

本实施例中所使用的分子生物学的方法除另有详述以外，均按照分子克隆（Molecular Cloning）(Sambrookra,Cold Spring Harbour Laboratory Press,2001)所述的方法进行。 

据报道，在拟南芥中蓄积有作为单萜烯的一种的在芳樟醇的8-位羟基上附加葡萄糖的物质(图1)(非专利文献1)。基于芳樟醇的合成及其糖基化在时间·空间上协调的假说，将与拟南芥的芳樟醇合成酶(S-Linalool synthase(LIS):At1g69680)共表达的基因进行ATTED-II共表达分析(http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index)。其结果，从百数十种的候选基因中，发现了与芳樟醇合成酶显示出具有表达系数0.89的高相关的作为候补UGT基因的UGT85A3(At1g22380)。将这二种基因采用eFP浏览器(Browser)进行可视化的结果(http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi)(非专利文献13)，表明两基因特别是在花中强烈地表达(图2)。作为在芳樟醇的8-位导入羟基的酶而已知的细胞色素P450酶的CYP76C1及其同源基因CYP76C3，也在花瓣中强烈地表达(图3)(专利文献1)。关于CYP76C3，也显示出与LIS基因的0.82的强的表达相关性。以上结果强烈地示意出UGT85A3主要在花瓣细胞内与LIS及CYP76C1/C3发挥协调的功能。 

［实施例2］UGT85A3表达载体的构建 

将UGT85A3的全长ORF(序列号5)使用附加有下述限制酶切位点的引物(序列号6、7)通过PCR法进行扩增。且引物中附有下划线的碱基序列为在引物中附加的限制酶识别序列。 

UGT85A3cDNA(At1g22380): 

ATGGGATCCCGTTTTGTTTCTAACGAACAAAAACCACACGTAGTTTGCGTGCCTTACCCAGCTCAAGGCCACATTAACCCTATGATGAAAGTGGCTAA ACTCCTCCACGTCAAAGGCTTCCACGTCACCTTCGTCAACACCGTCTACAACCACAACCGTCTACTCCGATCCCGTGGGGCCAACGCACTCGATGGACTTCCTTCCTTCCAGTTCGAGTCAATACCTGACGGTCTTCCGGAGACTGGCGTGGACGCCACGCAGGACATCCCTGCCCTTTCCGAGTCCACAACGAAAAACTGTCTCGTTCCGTTCAAGAAGCTTCTCCAGCGGATTGTCACGAGAGAGGATGTCCCTCCGGTGAGCTGTATTGTATCAGATGGTTCGATGAGCTTTACTCTTGACGTAGCGGAAGAGCTTGGTGTTCCGGAGATTCATTTTTGGACCACTAGTGCTTGTGGCTTCATGGCTTATCTACACTTTTATCTCTTCATCGAGAAGGGTTTATGTCCAGTAAAAGATGCGAGTTGCTTGACGAAGGAATACTTGGACACAGTTATAGATTGGATACCGTCAATGAACAATGTAAAACTAAAAGACATTCCTAGTTTTATACGTACCACTAATCCTAACGACATAATGCTCAACTTCGTTGTCCGTGAGGCATGTCGAACCAAACGTGCCTCTGCTATCATTCTGAACACGTTTGATGACCTTGAACATGACATAATCCAGTCTATGCAATCCATTTTACCACCGGTTTATCCAATCGGACCGCTTCATCTCTTAGTAAACAGGGAGATTGAAGAAGATAGTGAGATTGGAAGGATGGGATCAAATCTATGGAAAGAGGAGACTGAGTGCTTGGGATGGCTTAATACTAAGTCTCGAAATAGCGTTGTTTATGTTAACTTTGGGAGCATAACAATAATGACCACGGCACAGCTTTTGGAGTTTGCTTGGGGTTTGGCGGCAACGGGAAAGGAGTTTCTATGGGTGATGCGGCCGGATTCAGTAGCCGGAGAGGAGGCAGTGATTCCAAAAGAGTTTTTAGCGGAGACAGCTGATCGAAGAATGCTGACAAGTTGGTGTCCTCAGGAGAAAGTTCTTTCTCATCCGGCGGTCGGAGGGTTCTTGACCCATTGCGGGTGGAATTCGACGTTAGAAAGTCTTTCATGCGGAGTTCCAATGGTATGTTGGCCATTTTTTGCTGAGCAACAAACAAATTGTAAGTTTTCTTGTGATGAATGGGAGGTTGGTATTGAGATCGGTGGAGATGTCAAGAGGGGAGAGGTTGAGGCGGTGGTTAGAGAGCTCATGGATGGAGAGAAAGGAAAGAAAATGAGAGAGAAGGCTGTAGAGTGGCGGCGCTTGGCCGAGAAAGCTACAAAGCTTCCGTGTGGTTCGTCGGTGATAAATTTTGAGACGATTGTCAACAAGGTTCTCTTGGGAAAGATCCCTAACACGTAA 

(序列号5) 

CACC-NdeI-UGT85A3-Fw: 

     5’-CACCCATATGGGATCCCGTTTTGTTTC-3’(序列号6) 

XhoI-stop-UGT85A3-Rv: 

     5’-CTCGAGTTACGTGTTAGGGATCTTTC-3’(序列号7) 

PCR反应液(50μl)的组成如下：来自拟南芥花瓣cDNA1μl、1×ExTaq缓冲液(TaKaRaBio)、0.2mM dNTPs、引物各0.4pmol/μl、ExTaq聚合酶2.5U。PCR反应为在94℃反应3分钟后，以94℃、1分钟，50℃、1分钟，72℃、2分钟的反应计进行30次循环的扩增。将PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色的结果，在约1.4kb的大小处得到分别由模板DNA所推测的扩增带。 

这些PCR产物以制造业者所推荐的方法亚克隆在pENTR-TOPO定向载体(Invitrogen)。使用DNA序列分析仪3100型(Applied Biosystems)，通过合成寡核苷酸引物的引物步行法，确认在插入片段内无由PCR引起的突变。 

利用附加在引物的NdeI及XhoI的限制酶切部位，截切约1.4kb的UGT85A3片段，连接于作为大肠杆菌表达载体的pET15b(Novagen公司)的NdeI及XhoI位点，得到本酶基因的大肠杆菌表达载体。本载体设计成为在本载体NdeI位点的上游的组氨酸标记(His tag)和UGT85A3基因的开放阅读框相符合，而能表达UGT85A3与组氨酸标记(His tag)融合而成的嵌合蛋白。 

［实施例3］酶表达及纯化 

为了表明本酶的生物化学功能，使本酶在大肠杆菌中表达。使用上述所得到的UGT85A3大肠杆菌表达用质粒，根据规定方法转化大肠杆菌BL21(DE3)株。所得到的转化体在包含50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白胨（Typtone pepton），5g/l酵母提取物，1g/l NaCl)4ml中，在37℃下震荡培养过夜。将达到静止期的培养液4ml接种于相同组成的培养基80ml中，在37℃下震荡培养。当菌体浊度(OD600)达到大约0.5时，添加终浓度成为0.5mM的IPTG，在18℃下震荡培养20hr。 

以下所有操作均在4℃下进行。将培养的转化体通过离心分离(5,000×g， 10min)收集菌体，添加缓冲液S［20mM HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲液(pH7.5)，20mM咪唑,14mMβ-巯基乙醇］，以1ml/g细胞使之悬浮。接着，再进行超声波破碎(15秒（sec）×8次)及离心分离(15,000×g，15min)。将所得到的上清作为粗酶液进行回收。将粗酶液负载于经缓冲液S平衡化的His SpinTrap(产品名称，GE Healthcare)，再进行离心(70×g，30sec)。用缓冲液洗净后，使用包含100mM及500mM的咪唑的缓冲液S各5ml，将结合于柱上的蛋白质进行阶段洗脱。各洗脱成分使用Microcon YM-30(产品名称，Amicon)，以20mM HEPES缓冲液(pH7.5)、14mMβ-巯基乙醇进行缓冲液置换(透析倍率1000倍)。 

经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后的CBB染色的结果，由于在200mM咪唑洗脱组分处，组氨酸标签（HisTag）融合UGT85A3嵌合蛋白的推测分子量约56.7kDa附近确认了蛋白质，所以使用了该组分进行酶分析(图4)。 

［实施例4］活性测定 

标准的酶反应条件如下所述。将反应液(2mM UDP-葡萄糖，1.5mM糖受体底物，100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，纯化UGT85A3酶溶液25μl)用蒸馏水制备成50μl，在30℃下反应1小时。 

将酶反应液5μl按照下述条件进行LC-MS分析。 

LC条件

柱:卡赛帕克（CAPCELL PAK）C18-UG120(2.0mm内径×150mm) 

流动相：A:水(含有+0.05%甲酸),B:乙腈 

梯度：15分钟，从B浓度15%到90%以直线浓度曲线进行 

流速：每分钟0.2ml 

柱温：40℃ 

MS条件

ESI(负离子模式) 

SIM模式:(m/z315,338,361,363,331,354,377,429等) 

认为在反应液中可能与4种单萜烯(香叶醇、8-羟基香叶醇、芳樟醇、8-羟基芳樟醇)所产生的生成物的信息如图5所示。 

酶反应液的分析结果，得到了认为8-羟基香叶醇及8-羟基芳樟醇可能附加有1分子葡萄糖的分子量的峰(图6A及图6B)。它们的保留时间与香叶醇单葡萄糖苷及芳樟醇8-O-单葡萄糖苷的合成标准品一致。由于它们的峰在空载体区没有发现，所以可确认是由UGT85A3所提供的。进而，由于在香叶醇与芳樟醇的任一种情况下，对于8-位羟基化合物的活性均高(图7)，所以可判明UGT85A3为对单萜烯的8-位羟基具有高特异性的糖基转移酶。为了表明本酶的糖供体选择性，将8-羟基香叶醇作为糖受体，使用UDP-半乳糖或UDP-葡萄糖酸试行反应。其结果这些糖供体与UDP-葡萄糖相比，只能得到1/10以下的生成物(图8)。因此，显示出本酶为以UDP-葡萄糖作为糖供体的葡萄糖苷转移酶。 

进而，调查本酶的底物特异性的结果，认为对于松油醇、橙花叔醇及香茅醇(citronellol)也具有糖基化活性。但是，对于黄烷酮(Naringenin)、黄酮醇(Quercetin)、黄酮(Apigenin)、二苯乙烯(Resveratrol)及香豆素(Esculetin)等的苯丙素类次生代谢产物就没有表现出糖基化活性。 

如上所述，鉴定了对于萜烯、特别是单萜烯的8-位具有高特异性的糖基转移酶基因的UGT85A3。本酶强烈地示意出主要在拟南芥的花瓣中涉及8-位羟基化单萜烯的糖基化。迄今为止对于UGT85家族的糖基转移酶的功能几乎未有报道，但是已知拟南芥的UGT85A1在体外试验中，可转移一分子葡萄糖至作为植物激素的细胞分裂素的分子种的反式玉米素(trans-zeatin)和羟基玉米素(hydrozeatin)的羟基上(非专利文献14)。此外，已知蜀黍(Sorghum bicolor)的UGT85B1也可转移一分子葡萄糖至对羟基扁桃腈(p-hydroxymandelonitrile)而生成作为含氰苷的蜀黍苷(Dhurrin)的活性(非专利文献15)。同样地，作为扁桃(Prunus dulcis)的含氰苷的糖基转移酶，已报道有UGT85A19(非专利文献16)。因此，此次所发现的对于8-位羟基化单萜烯的活性可谓UGT85家族中新型的酶活性。 

［实施例5］UGT85A1 

在拟南芥的基因组中已发现至少6个分子种的对于单萜烯显示糖基化活性的与UGT85A3属于相同亚家族的基因(UGT85A1,A2,A3,A4,A5,A7)。关于拟南芥的不同器官的基因表达，使用拟南芥（Arabidopsis）eFB浏览器 (http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi)进行拟南芥基因共表达分析(ATTED-II)的结果，确认了与UGT85A3同源性最高的UGT85A1也与UGT85A3同样地在花瓣中强烈地表达(图9：箭头)。编码UGT85A1的CDS序列及其推测的氨基酸序列分别示于序列号8及9。 

其次，关于UGT85A1也仿照上述实施例1～3的方法使大肠杆菌表达与组氨酸标签（HisTag）融合的蛋白质。载体构建用基因的扩增使用下述的PCR引物组(序列号12及13)。 

NdeI-AtUGT85A1-Fw 

     5’-CACCCATATGGGATCTCAGATCATTCATAAC-3’(序列号12) 

BamHI-AtUGT85A1-Rv 

     5’-GGATCCTTAATCCTGTGATTTTTGTCCCAAAAG-3’(序列号13) 

纯化后，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法来确认表达蛋白质(图10)。在图10中，箭头指示在约50KDa处所检测出来的重组UGT85A1蛋白质，P表示沉淀、S表示可溶性组分、FT表示过柱组分、E500表示洗脱组分。此外，在图10中，方框表示洗脱出的组氨酸标签（HisTag）融合UGT85A1蛋白质。 

与实施例4同样，以芳樟醇、8-羟基芳樟醇、香叶醇、8-羟基香叶醇作为糖受体进行活性测定。图11所示的4个方框(panel)按照从上到下的顺序依次表示以芳樟醇、8-羟基芳樟醇、香叶醇、8-羟基香叶醇作为糖受体与UGT85A1反应的反应液的MS分析色谱图。芳樟醇及香叶醇的m/z为315[M-H]，它们的甲酸加合物作为m/z361来检测。8-羟基芳樟醇与8-羟基香叶醇的m/z为331[M-H]，它们的甲酸加合物作为m/z377来检测。方框处表示各反应液中的生成物峰。关于任一单萜烯化合物均检测出糖基化了的生成物(图11)。但是，测定对于这些糖受体的单位反应时间(5分钟)的相对活性的结果，表明与UGT85A3同样，UGT85A1对于芳樟醇的相对活性极低，与芳樟醇相比，对于香叶醇的选择性高，特别是对于8-位羟基化合物显示出高活性(图12)。它们的相对活性表明，本酶与芳樟醇等的叔醇（3级醇）相比，对于香叶醇、 8-位经羟基化的单萜烯等的伯醇（1级醇）表现出高的特异性。 

以上的结果表明，结构及表达方式类似的2种拟南芥糖基转移酶UGT85A1及UGT85A3对于单萜烯类具有糖基化活性，特别是对于8-位的羟基可进行选择性的糖基化。由于认为在拟南芥中单萜烯醇作为8-位糖苷而蓄积(非专利文献1)，所以认为提供8-位糖基化的单萜烯化合物的本酶为该反应的催化剂。 

工业实用性 

根据本发明，通过体外试验或在宿主细胞中导入本发明的基因，可将一分子葡萄糖转移于单萜烯类上，因此可更简便地生产对新型功能性食品原材料的开发、次生代谢分子育种等具有贡献的萜烯糖苷或可减少其生产，所以在此方面本发明极为有用。 

序列表自由内容（free text） 

序列号6：合成DNA 

序列号7：合成DNA 

序列号12：合成DNA 

序列号13：合成DNA 

序列表 。

Claims (15)

1.一种单萜烯8-位糖苷的制造方法，其特征在于，其包含使选自由以下(a)～(c)所组成的组中的任一项所述的蛋白质、UDP-糖、和单萜烯化合物反应而使所述单萜烯化合物的8-位糖基化的工序，

(a)由序列号2或9的氨基酸序列所组成的蛋白质；

(b)由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入、和/或附加的氨基酸序列所组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质；

(c)具有相对于序列号2或9的氨基酸序列有75%以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述UDP-糖是UDP-葡萄糖。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单萜烯化合物是选自由8-羟基香叶烯、8-羟基橙花醇、8-羟基香叶醇及8-羟基芳樟醇所组成的组中的任一种。

4.一种非人转化体，其特征在于，其导入有选自由以下(a)～(e)所组成的组中任一项所述的多核苷酸，

(a)含有序列号1、3、8或10的碱基序列的多核苷酸；

(b)编码由序列号2或9的氨基酸序列所组成的蛋白质的多核苷酸；

(c)编码由序列号2或9的氨基酸序列中，1～125个氨基酸发生缺失、取代、插入、和/或附加的氨基酸序列所组成，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸；

(d)编码具有相对于序列号2或9的氨基酸序列有75%以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸；及

(e)与由序列号1、3、8或10的碱基序列互补的碱基序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的转化体，其中，其含有序列号1、3、8或10的碱基序列。

6.根据权利要求4所述的转化体，其中，所述多核苷酸插入表达载体。

7.根据权利要求4所述的转化体，其中，其是植物体。

8.一种提取物，其特征在于，其是权利要求4所述的转化体的提取物。

9.一种食品、香料、医药品或工业原料，其特征在于，其包含权利要求8所述的提取物。

10.一种具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的制造方法，其特征在于，其培养权利要求4所述的非人转化体。

11.一种植物，其特征在于，其是具有单萜烯化合物的8-位糖基化活性的蛋白质的表达被抑制的植物。

12.根据权利要求11所述的植物，其中，所述蛋白质的表达由于RNA干扰而被抑制。

13.一种加工产品，其特征在于，其是权利要求11所述的植物的加工产品或是该植物的一部分的加工产品。

14.一种提取物，其特征在于，其是权利要求11所述的植物的提取物。

15.一种食品、香料、医药品或工业原料，其特征在于，其包含权利要求14所述的提取物。

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