KR20140088805A - 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 상기 약제 조성물은 COX-2의 발현이 감소하고 타입 2 콜라겐의 발현을 증가시킬 수 있다.
Description
본 발명은 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 레스베라트롤 단독 투여보다 향상된 관절염 예방 및 치료 효과를 갖는 약제 조성물을 제공하는 것이다.
관절염이란 세균이나 외상과 같은 다양한 원인에 의해 관절 내에 염증성 변화로 유발되는 질환을 말하는 것으로서 관절염의 발생 빈도는 60세 이상 인구의 약 30% 정도로 추산되고 있고, 외국 통계에 따르면 심장질환 다음으로 자주 발생하고 있는 질병으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 최근 보건사회 연구원의 조사에 따르면 우리나라의 경우 50세 이후를 대상으로 당뇨병과 고혈압을 제치고 관절염이 가장 높은 발병율을 보이는 질병으로 보고된 바 있다. 따라서 많은 연구자들은 암이나 심혈관계 질환과 더불어 21세기의 인류의 삶의 질을 저해할 수 있는 가장 중요한 질환으로 관절염이 대두될 것으로 예상하고 있다.
한편, 관절염은 크게 비 염증성 관절염과 염증성 관절염으로 나눌 수 있는데, 비 염증성 관절염으로 골 관절염을, 염증성 관절염으로는 류마티스 관절염을 대표적으로 들 수 있다.
퇴행성 관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여 연골세포에서 관절의 기질물질들인 타입 2 콜라겐(type II collagen) 및 프로테오글리칸(proteoglycan) 등의 합성이 저해됨과 동시에 인터루킨-1β 및 종양괴사인자 등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라 관절기질을 분해하는 기질 금속 단백질 분해효소(matix metalloproteinase; 이하 "MMP"라 함.)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다. 또한, 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘 E2(prostagladin E2; 이하 "PGE2" 라고 함)의 생성을 증가시켜 관절에서 염증반응을 유발시킨다. 또한, 류마티스 관절염은 전신성 염증반응으로 인체 내 많은 조직과 기관(피부, 혈관, 심장, 폐, 근육)들에 영향을 주며, 특히 관절에 영향을 주어 비가역적인 증식성 활막염을 일으키며 이는 관절연골의 파괴와 관절의 강직으로 진행된다. 주요 증상으로는 피로, 무력감, 동통 등이며, 관절염이 진행되면서 발열 및 체력쇠약을 동반한다. 또한 염증이 일어난 관절 부근에 근육강직(muscle atrophy)과 근육경축(muscle spasm)이 나타나 관절의 움직임에 영향을 준다.
따라서 관절염을 치료하기 위한 목적은 관절의 통증과 염증을 감소시키고, 관절의 변형을 방지할 뿐만 아니라 보다 근본적으로는 관절염을 유발하는 세포내 작용 메커니즘을 밝히고 그 기작을 제어하는 데 있다. 한편, 현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성 관절염의 치료는 약물치료제(진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등)나 연골보호제(히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등)를 이용하거나 수술적 처치(관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절 부분 치환술, 슬관절 전치환술 등)에 의한다. 그러나 이들 방법은 연골세포 퇴행이나 MMP의 활성 및 합성의 제어 등의 근본적인 원인 제거와는 직접적인 연관성이 없다. 즉, 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며, 연골보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다. 더구나 이러한 약물들은 체중증가, 고혈압 유발, 소화성 궤양 유발 등의 부작용도 나타내기 때문에 선택에 신중을 기하여야 한다. 이에 최근에는 생체내 적용시 비교적 부작용이 적으며 관절염의 증상을 완화시킬 수 있는 효과가 뛰어난 새로운 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
따라서 본 발명은 생체내 적용시 비교적 부작용이 적으며 관절염의 증상을 완화시킬 수 있는 효과가 뛰어난 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 레스베라트롤; 및 p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제(p38 mitogen-activated protein kinase; p38 MAP kinase; p38 kinase; 이하 "p38 키나아제") 활성 억제제; 를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 레스베라트롤 및 p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제 활성 억제제를 1 ~ 5 : 10 ~ 1 중량비로 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제 활성 억제제는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염에 약효를 발휘하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 레스베라트롤을 포함하는 오디, 땅콩, 포도, 라스베리 및 크렌베리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 추출된 추출물 또는 이의 분획물; 및 p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제(p38 mitogen-activated protein kinase; p38 MAP kinase; p38 kinase) 활성 억제제; 를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, C1 ~ C4로 추출된 추출물을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제 활성 억제제는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 관절염은 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염에 약효를 발휘하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 종래의 약물 치료제보다 부작용이 적으며 관절염의 증상을 완화시킬 수 있는 효과가 뛰어난 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공한다.
도 1은 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 타입 2 콜라겐(type 2 collagen) 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 2는 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 타입 2 콜라겐(type 2 collagen) 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램으로 정량화한 결과이다.
도 3은 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 24시간 동안 처리한 후 타입 2 콜라겐(type 2 collagen) 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 4는 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 24시간 동안 처리한 후 타입 2 콜라겐(type 2 collagen) 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램으로 정량화한 결과이다.
도 5는 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 3시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 6은 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 3시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램을 사용하여 정량화한 결과이다.
도 7은 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 8은 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램을 사용하여 정량화한 결과이다.
도 9는 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 PGE2의 발현량을 확인한 결과이다.
도 10는 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 3시간 동안 처리한 후 PGE2의 발현량을 확인한 결과이다.
도 11은 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제인 SB203590을 복합처리하여 타입 2 콜라겐(type 2 collagen), COX-2, pp38 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 2는 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 타입 2 콜라겐(type 2 collagen) 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램으로 정량화한 결과이다.
도 3은 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 24시간 동안 처리한 후 타입 2 콜라겐(type 2 collagen) 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 4는 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 24시간 동안 처리한 후 타입 2 콜라겐(type 2 collagen) 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램으로 정량화한 결과이다.
도 5는 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 3시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 6은 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 3시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램을 사용하여 정량화한 결과이다.
도 7은 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
도 8은 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 COX-2 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램을 사용하여 정량화한 결과이다.
도 9는 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤을 다양한 시간 동안 처리한 후 PGE2의 발현량을 확인한 결과이다.
도 10는 연골세포에 다양한 농도의 레스베라트롤을 3시간 동안 처리한 후 PGE2의 발현량을 확인한 결과이다.
도 11은 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제인 SB203590을 복합처리하여 타입 2 콜라겐(type 2 collagen), COX-2, pp38 및 액틴(actin)의 발현을 확인한 웨스턴블럿 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이 종래의 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며 연골보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다. 더구나 이러한 약물들은 체중증가, 고혈압 유발, 소화성 궤양 유발 등의 부작용도 나타내기 때문에 선택에 신중을 기해야 한다.
따라서 관절염을 궁극적으로 치료하기 위해서는 연골세포에서 관절기질물질의 생성 감소를 일으키는 기작, 염증반응을 일으키는데 관여하는 연골세포내 신호전달과정, 유전자 발현조절 및 관련된 조절 단백질의 특성과 작용에 대한 규명이 선행되어야 한다.
본 발명은 단백질 인산화효소의 하나인 p38 마이토겐-활성화 단백질 키나아제(p38 mitogen-activeted protein kinase; p38 MAP kinase; 이하 "p38 키나아제") 활성 억제제; 및 레스베라트롤; 을 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 또한, 본 발명의 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물은 종래의 약물 치료제보다 부작용이 적으며 관절염의 증상을 완화시킬 수 있는 효과가 뛰어난 약제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제를 포함하는 관절염 예방 및/또는 치료용 약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제 조성물은 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제의 함량은 관절염 예방 및/또는 치료용 활성이 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제를 1 ~ 5 : 10 ~ 1 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물에 포함된 레스베라트롤은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 시중에서 판매되고 있는 것이라면 모두 사용 가능하며 천연 성분인 오디, 땅콩, 포도, 라스베리 및 크렌베리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 추출된 것을 사용할 수 있다. 상기 추출 용매는 통상적으로 천연물의 추출 또는 이의 분획에 사용되는 용매라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 C1 ~ C4의 알코올 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물에 포함된 레스베라트롤은 미세소관결합 단백질키나아제(mitogen activated protein kinases; 이하 "MAPK"라고 함)의 활성을 유도할 수 있다.
상기 MAPK는 세포의 성장, 분화, 사멸 등 거의 모든 생리현상에 핵심적인 역할을 하는 중요한 신호전달 단백질로서, 특별히 한정되지는 않지만 대표적으로 p38 키나제, 세포외 신호 조절 단백질 키나제-1/-2(extracellular signal regulated protein kinase-1/-2; 이하 "ERK-1/-2"라고 함), C-Jun N-말단 키나제(C-Jun N-terminal kinase; JNK) 및 단백질 인산화 효소 B(protein kinase B; Akt) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 p38 키나제 및 ERK-1/-2 중에서 선택된 1종 이상을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "p38 키나아제 활성 억제제"는 p38 키나아제를 표적으로 하거나, p38 키나아제를 저하시키거나 억제하는 화합물에 관련된다. p38 키나아제 활성 억제제는 특별히 한정되지는 않지만, 4-(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설파닐페닐)-1H-이미다졸-5-닐)피리딘(4-(4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methyl sulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl)pyridine; 이하 "SB203580"이라 함.) 및 6-(5-시클로프로필카르바모일-3-플루오로-2-메틸-페닐)-N-(2,2-디메틸프로필)-니코틴아미드(6-(5-cyclopropylcarbamoyl-3-fluoro-2-methyl-phenyl)-N-(2,2-dimethylpropyl)-nicotinamide), 이들의 염, 이들의 유도체를 포함한다. 특히 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(4-(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설파닐페닐)-1H-이미다졸-5-닐)피리딘; SB203580) 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
또한, 본 발명의 약제 조성물에 포함된 레스베라트롤은 무릎관절연골성분인 타입 2 콜라겐의 발현을 유도하는 특징이 있다. 나아가, 본 발명의 약제 조성물에 포함된 p38 키나아제 활성 억제제는 레스베라트롤 투여로 인해 증가된 COX-2의 발현을 레스베라트롤 투여 이전보다 더 감소시키는 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 타입 2 콜라겐의 발현을 유도하고 COX-2의 발현을 감소시키는 특징이 있다.
본 발명은 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 관절염은 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
또한, 본 발명은 레스베라트롤을 포함하는 오디, 땅콩, 포도, 라스베리 및 크렌베리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 추출물 또는 이의 분획물; 및 p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제(p38 mitogen-activated protein kinase; p38 MAP kinase; p38 kinase) 활성 억제제; 를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공한다. 상기 약제 조성물은 관절에 생긴 통상적인 염증에서 약효를 발휘하지만, 바람직하게는 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염에서 약효를 발휘할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약제 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벨 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약제 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약제 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량'이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 ㎎/㎏ 의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 의 양을 일일 1회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
준비예
1. 연골세포 배양
토끼관절연골세포는 효소처리된 뉴질랜드 흰토끼 연골 슬라이스에서 얻었다. 무균 상태에서 토끼관절연골세포를 절개하여 얻은 연골 슬라이스는 이후 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, 미국 캘리포니아 소재 Invitrogen에서 구매)에서 6시간 동안 0.2% 콜라제나제 타입 2(미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매, 381 U/㎎ 고체)로 처리하였다. 상기 완충용액, 0.2% 콜라제나제 및 연골 슬라이스의 혼합액을 20 ℃에서 230 xg로 10분 동안 원심분리하여 연골세포를 얻었다. 상기 연골세포는 10%의 송아지 태아 혈청(fetal bovine calf serum, 미국캘리포니아 소재 Invitrogen에서 구매), 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매) 및 50 unit/㎖ 페니실린(미국 캘리포니아 Sigma에서 구매)이 포함된 DMEM에서 재부유 시켰다.
이후 상기 재부유시킨 연골세포와 DMEM은 배양 접시에 5×104 cells/cm2의 밀도로 분주 후 배양하였으며, 배양된 세포들을 하기 실험들에서 사용하였다.
실험예
1.
레스베라트롤의
연골세포 분화 조절
레스베라트롤이 연골세포 분화에 미치는 영향을 알기 위해서, 준비예 1에서 배양한 연골세포에 레스베라트롤(미국 캘리포니아 소재 Sigma사에서 구매)을 다양한 농도(0, 10, 20, 50, 100 μM), 다양한 처리 시간(0, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간)으로 처리한 후 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 상기 웨스턴블럿 분석은 연골세포 분화 단백질 표현자인 타입 2 콜라겐의 발현을 확인하기 위해 수행한 것이다.
상기 웨스턴블럿 분석은 단백질의 정량분석을 위해 50 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl), pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 및 0.1% 소듐 도데실설페이트(Sodium dodecylsulfate; SDS)가 함유된 완충액(buffer)에 단백질 억제제(10g/㎖ 아프로티닌, 10g/㎖ 류펩틴, 10g/㎖ 펩스타틴 A 및 1mM 4-(2-아미노에틸) 벤젠셀포닐 플루오라이드)와 포스파타아제 억제제(1mM Na3VO4 및 1mM NaF)를 첨가하여 전체 세포 용해물을 준비하였다. 상기 용해물은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리하였으며, 이를 니트로 셀룰로오즈 막으로 이동시켰다. 상기 분리된 단백질의 발현 분석을 위하여 각 분리된 단백질에 특이적인 항체인 타입 2 콜라겐(미국 마이에미 덴버 소재 Cell Signaling Technology에서 구매), COX-2(미국 마이에미 덴버 소재 Cell Signaling Technology에서 구매), pp38(미국 마이에미 덴버 소재 Cell Signaling Technology에서 구매), pERK(미국 마이에미 덴버 소재 Cell Signaling Technology에서 구매), pJNK(미국 마이에미 덴버 소재 Cell Signaling Technology에서 구매), Akt(미국 마이에미 덴버 소재 Cell Signaling Technology에서 구매) 및 액틴(actin, 미국 캘리포니아 산타 크루즈 소재 산타 크루즈 바이오 테크놀로지에서 구매)을 사용하여 항체반응을 수행했다.
상기 웨스턴블럿 분석 결과를 이미지 J 프로그램으로 정량화하였다.
상기 웨스턴블럿 분석 및 상기 정량화 결과, 레스베라트롤 처리로 인해 타입 2 콜라겐의 발현량이 변하는 것을 확인하였다. 레스베라트롤을 처리한 연골세포에서 타입 2 콜라겐의 발현은 레스베라트롤 처리시간 의존적으로 증가하였고, 처리시간 중에서도 24시간까지는 증가 및 감소를 반복하다가 24시간 이후부터 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 2). 특히, 72시간 동안 레스베라트롤을 처리한 연골세포에서는 레스베라트롤을 처리하지 않은 대조구에 비해 약 2.5배 증가된 타입 2 콜라겐 발현량을 확인할 수 있었다.
또한, 레스베라트롤 농도 20 μM를 처리한 연골세포에서 타입 2 콜라겐이 가장 많이 발현한 것을 확인할 수 있었다(도 3 및 4). 또한, 20 μM 농도보다 높은 농도에서는 다시 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 연골세포에서 레스베라트롤의 처리는 연골세포 분화 단백질 표현자인 타입 2 콜라겐의 발현량을 조절하여 연골세포 분화를 조절한다는 것을 확인하였다.
실험예
2.
레스베라트롤의
COX
-2 및
PGE2
발현 조절
레스베라트롤이 연골세포 염증 유발에 미치는 영향을 알기 위해서, 준비예 1에서 배양한 연골세포에 레스베라트롤(미국 캘리포니아 소재 Sigma사에서 구매)을 다양한 농도(0, 10, 20, 50, 100 μM), 다양한 처리 시간(0, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간)으로 처리한 후 실험예 1에서 실시했던 웨스턴블럿 분석과 같은 방법의 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 이후 상기 웨스턴블럿 분석 결과는 이미지 J 프로그램으로 정량화하였다. 상기 웨스턴블럿 분석은 연골세포 염증 유발 물질인 COX-2의 발현을 확인하기 위해 수행한 것이다.
상기 웨스턴블럿 분석 및 상기 정량화 결과, 레스베라트롤 처리로 인해 COX-2의 발현량이 변하는 것을 확인하였다. 레스베라트롤을 처리한 연골세포에서 COX-2의 발현은 레스베라트롤의 처리농도 의존적으로 증가한 것을 확인하였다(도 5 및 6).
또한, 레스베라트롤을 처리한 연골세포에서 처리시간에 따라 COX-2의 발현량이 변하는 것을 확인하였다. 처리시간 중에서도 3시간까지는 증가하다가 3시간 이후부터 감소하는 것을 확인하였다(도 7 및 8). 특히, 3시간 동안 레스베라트롤을 처리한 연골세포에서는 레스베라트롤을 처리하지 않은 대조구에 비해 약 9배 증가된 COX-2 발현량을 확인할 수 있었다.
레스베라트롤 처리에 의해 염증반응을 촉진하는 PGE2의 발현량 변화를 알기 위해 상기와 같은 방법의 웨스턴블럿 분석 및 정량화를 진행하였다. PGE2의 발현량 분석 결과, 20 μM 농도의 레스베라트롤을 처리한 연골세포에서 처리 시간이 0 ~ 3시간까지는 PGE2의 발현량이 증가하였고, 처리시간이 3시간 이후부터는 감소하는 것을 확인하였다(도 9). 또한, 레스베라트롤을 0, 10, 20, 50, 100 μM의 농도로 처리한 연골세포에서 PGE2의 발현량은 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 10).
따라서, 연골세포에서 레스베라트롤의 처리는 연골세포 염증 유발자인 COX-2 및 PGE2의 발현을 촉진하여 연골세포의 염증 반응을 촉진하는 것을 알 수 있으며, 따라서 레스베라트롤 단독으로는 관절염 치료 및 예방에 적합하지 않음을 알 수 있었다.
실험예
3.
레스베라트롤
및 신호 단백질 활성 억제제의 동시 투여 효과
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 레스베라트롤이 단독으로는 관절염 치료 및 예방에 적합하지 않음을 확인하였다. 하지만, 연골세포에서 염증 유발인자인 COX-2 및 PGE2의 발현이 p38 키나아제의 활성과 관련이 있을 것이라 예상하고 하기 실험을 실행하였다.
연골세포에 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제를 처리하여 COX-2 및 타입 2 콜라겐의 발현 변화를 측정하였다. 준비예 1에서 배양한 연골세포에 20 μM 농도의 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제 중 SB203580을 처리하여 실험예 1에서 사용한 웨스턴블럿 분석 및 정량화를 수행하였다.
상기 웨스턴블럿 분석 및 정량화 결과, 상기 연골세포에서 레스베라트롤이 증가시킨 COX-2를 p38 키나아제 활성 억제제인 SB203580이 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 11). 또한, 상기 연골세포에서 레스베라트롤이 증가시킨 타입 2 콜라겐의 발현은 p38 키나아제 활성 억제제인 SB203580의 투여로 인해 변하지 않는 것을 확인하였다.
따라서, 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제의 복합 투여는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물로 적합한 것을 확인할 수 있었다.
앞서 실시한 실시예를 통하여 알 수 있듯, 연골세포에서 레스베라트롤은 타입 2 콜라겐의 발현을 유도하였으며, 염증유발 인자인 COX-2의 발현을 증가시켜 레스베라트롤 단독으로는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물로서 적합하지 않았다. 하지만, 연골세포에 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제인 SB203580의 복합 투여시 타입 2 콜라겐의 발현은 유도되고 COX-2의 발현은 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 레스베라트롤 및 p38 키나아제 활성 억제제의 복합 투여는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물로 적합한 것을 확인할 수 있었다.
Claims (8)
- 레스베라트롤; 및
p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제(p38 mitogen-activated protein kinase; p38 MAP kinase; p38 kinase) 활성 억제제;
를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물. - 제 1항에 있어서, 상기 약제 조성물은 레스베라트롤 및 p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제 활성 억제제를 1 ~ 5 : 10 ~ 1 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제 활성 억제제는 화학식 (I)로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물.
(I)
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물.
- 레스베라트롤을 포함하며 오디, 땅콩, 포도, 라스베리 및 크렌베리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 추출된 추출물 또는 이의 분획물; 및
p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제(p38 mitogen-activated protein kinase; p38 MAP kinase; p38 kinase) 활성 억제제;
를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물. - 제 5항에 있어서, 상기 추출물이 C1 ~ C4로 추출된 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 p38 마이토젠-활성화 단백질 키나아제 활성 억제제는 화학식 (I)로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물.
(I)
- 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약제 조성물.
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