KR20140081757A

KR20140081757A - 다발성골수종 치료방법

Info

Publication number: KR20140081757A
Application number: KR1020137030119A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 존 번스; 앤드류 스펜서; 캐서린 앤 모나건
Original assignee: 와이엠 바이오사이언시즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디
Priority date: 2011-05-02
Filing date: 2012-05-01
Publication date: 2014-07-01
Also published as: SG194212A1; MX2013012785A; PE20140750A1; CL2013003143A1; AP2013007281A0; US20140171433A1; ZA201308918B; CN103533939A; AU2012250491A1; CA2834414A1; EP2704722A1; CO6900134A2; EP2704722A4; MD20130089A2; BR112013028420A2; EA201391591A1; JP2014514337A; MA35129B1; IL228981A0; WO2012149602A1

Abstract

(1) IL-6 비반응성이고/이거나 (2) CD45- 표현형을 갖는 다발성골수종 세포의 출현율 증가로 특징지어지는 단계의 다발성골수종을 보유한 대상자에게 하기 일반식(Ib)의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상자의 치료 방법.

Description

다발성골수종 치료방법{MULTIPLE MYELOMA TREATMENT}

본 발명은 효소 야누스(Janus) 키나제 2 또는 JAK2에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 다발성골수종 및 관련된 골수증식종양(myeloproliferative neoplasm)의 치료제로서의 JAK2 억제제의 용도에 관한 것이다.

다발성골수종(MM)은 골수에 나타나는 난치성 약물내성 클론 B 세포 악성 종양이며 궁극적으로 형질 세포에 의한 모노클로날 항체의 과다생성이 초래되어 골파괴, 골용해 병소 및 신장과 심장 기능장애의 말단 기관 손상을 일으킨다. 종래 연구는 인터루킨-6(IL-6) 활성의 강하 약물에 집중되어 있으며, 상기 IL-6은 형질 세포 성장 및 증식을 담당하는 JAK/STAT 경로를 자극함으로써 MM의 발병에 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

일부 사람 골수종 세포주(HMCL)는 외인성 IL-6이 없으면 증식 또는 생존할 수 없으며[9,10], 종래의 일부 약물은 IL-6의 존재하에서 효과가 없다[11-13]. 다발성골수종 세포(이하, MM 세포)에 지지 신호를 제공하는 것으로 알려진 골수미세환경(BMME)은 IL-6을 생성하므로[14], IL-6의 생존촉진 효과를 강하시키면 MM의 약물내성 표현형을 제거할 수 있다.

야누스-활성화 키나제(JAK) 계열은 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 유형을 포함하여 성상이 잘 밝혀져 있는 신호전달 키나제로서 JAK 돌연변이가 골수증식성 질환[1-3]과 백혈병[4]의 발병에 참여하는 것으로 밝혀짐에 따라 혈액암에서 중요한 인자이다. JAK는 많은 세포를 위한 신호전달에 일정 역할을 한다[5에서 리뷰]. MM에서 JAK는 인터루킨-6(IL-6)[6,7], 인터페론-α[6,8] 및 상피세포성장인자[6]을 포함하여 다양한 사이토킨에 의해 활성화된다. 악성 세포들은 JAK의 많은 하위 경로를 활용한다.

최근에 여러 종류의 JAK 억제제가 개발되었고, 이들을 MM 치료제로 이용하고자 하는 연구가 진행중에 있다. CYT387은 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2 키나제 활성을 억제할 수 있는 새로운 JAK 억제제이다[15,16]. 이 화합물의 구조와 함께 개발되고 있다는 것이 최근에 공개되었다[17]. 현재 다양한 개발 및 연구 단계에 있는 다른 JAK 억제제로는 INCB000020[18], INCB16562[19], AG490[20,21], AZD1480[22], 피리돈 6[23] 및 WP1066[24]가 포함된다. IL-6가 MM 약물 내성에 일정 역할을 한다는 추정하에서 JKA 억제제를 MM의 단독 또는 병용 치료제로 이용하고자 하는 JKA 억제제의 잠재적 용도에 대한 연구가 이루어지고 있다. 게다가, 예비적인 시험관내 데이터에 따르면, JAK/STAT를 억제함으로써 MM 세포가 종래 요법에 반응하도록 유도할 수 있다는 가능성이 입증되고 있다[21]. 이러한 노력에도 불구하고, MM은 여전히 난치병으로 자리잡고 있으며 이로 인해 매년 11,000명이 사망하고 매년 16,000명의 환자가 추가로 발생하고 있다. 따라서, 이 질환을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 제공되는 새로운 물질 및 방법은 유익하게 사용될 것이다.

본 발명에 이르러, CYT387이 다발성골수종의 치료에, 특히 MM 표적 세포의 유형이 CD45- 이고/이거나 IL-6 비반응성인 다발성골수종의 치료에 활성적인 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 CYT387의 효과로 인하여 CYT387은 JAK 억제 활성을 나타내는 다른 물질에 비하여 다발성골수종의 치료 유형이 광범위하다.

보다 자세하게는, 한 가지 관점에서 본 발명은 CD45-표현형을 갖는 MM 세포의 성장 및/또는 증식(즉, 생존력)을 억제하기 위한 CYT387의 용도를 제공한다. 추가적으로, 다른 관점에서 본 발명은 IL-6 비반응성인 것으로 판단되는 MM 세포의 성장 및/또는 증식(즉, 생존력)을 억제하기 위한 CYT387의 용도를 제공한다. CYT387과 유사한 JAK 키나제 억제 프로필을 갖는 화합물도 또한 본 발명의 방법에 유용하다.

CYT387의 활성은 MM 세포가 CD45+ 표현형으로부터 대부분 CD45- 표현형으로 변화하는 단계인 후기의 MM을 치료할 수 있고, 결과적으로 치료를 포기한 환자들의 수명을 연장시켜 줄 수 있다.

연관된 관점에서, 본 발명의 방법은 대상자 또는 이로부터 채취한 생물학적 샘플을 평가하는 단계, 상기된 기준가운데 하나 이상을 충족하는 다발성골수종 환자를 동정하는 단계 및 동정된 환자를 CYT387 또는 관련 화합물로 치료하는 단계를 포함한다.

다른 관점에서, 본 발명은 CYT387 또는 관련 화합물과, 이와 함께, 상기된 기준 가운데 하나 이상을 충족하는 대상자의 치료를 표시한 라벨을 포함하는 제품을 제공한다.

연관된 관점에서, 본 발명은 CYT387 또는 관련 화합물을, 본원에 기술된 선정 기준을 기초로 하여 CYT387 또는 관련 화합물 요법에 맞는 대상자를 선정하는 방법을 교시한 설명서와 함께, 포함하는 키트를 제공한다.

이하에서, 첨부된 도면을 참고로 하여 본 발명의 상기 및 기타 관점 및 양태를 보다 상세하게 설명한다.
도 1: CYT387은 IL-6의 하위 신호전달 또는 공동배양 자극을 억제한다. HMCL을 CYT387(0.5 내지 2 ㎛)과 함께 또는 CYT387 없이 배양한 후 10 ng/ml IL-6으로 15분간 자극하였다. 이어서, 세포를 수확하고 p-STAT3(pY705)를 다음과 같이 측정하였다. (A) 세포내 FACS에 의해 기하평균 형광강도를 측정하고 그래프로 나타냈다 (n=3, 평균±SE, 자극받은 세포±CYT387의 분석은 일원배치분산분석 및 튜키 사후검정으로 수행하였다 *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001). (B) p-STAT3(pY705), 총 STAT3 및 α-튜불린(로딩 대조군으로서)을 웨스턴 블롯하였다. (C) HS5 불멸화된 골수 간질 세포 또는 일차 골수 간질 세포와의 직접 공동배양(CC) 또는 HS5와의 트랜스웰(TW) "가용성 한정적인" CC을 사용하여 HMCL에서 p-STAT3을 유도하였다. HMCL은 CD38 또는 CD138로 형광 표지되었고 2 μM CYT387로 15분간 동시처리하거나 이러한 처리없이 자극되었다. NCI-H929의 대표적인 플롯(n=3, NCI-H929, OCI-MY1 및 U266). (D) NCI-H929, OCI-MY1 및 U266 세포에 밤새 영향공급을 중단한 후 15분간 5 ng/ml IL-6 및 100 ng/ml IGF-1로 2 μM CYT387와 동시처리하여 자극하거나 이러한 동시처리 없이 자극하였다. p-AKT(pS473) 및 p-ERK1/29pT202/pY204)를 세포내 FACS하여 기하평균 형광 강도를 비처리(UT) 대조군으로 정규화하고 평균을 산정하였다(n=4, 평균±SE. 자극받은 세포±CYT387의 분석은 일원배치분산분석 및 튜키 사후검정으로 수행하였다 *=p<0.05, **=p<0.01).
도 2: CYT387은 HMCL 증식을 억제한다. (A) CYT387은 HMCL을 시간 및 용량 의존 방식으로 억제한다. IL-6 표현형 HMCL(ANBL-6, OCIMY1, U266 및 XG-1) 및 비-IL-6 표현형 HMCL(LP-1, NCI-H929, OPM2 및 RPMI-8226)을 24, 48 및 72시간 동안 비처리하거나, CYT387(0.1, 0.5, 1, 2.5 또는 5 μM)과 함께 배양하거나 비히클(DMSO)와 함께 배양하였다. 그런 후 MTS 검정에 의해 세포 증식을 결정하였다(72시간 데이터가 나타나 있음, n=3, 평균±SE). (B) CYT387로의 처리는 IL-6의 존재에서 조차 골수종 세포 증식을 억제한다. IL-6(10 ng/ml)로만(비처리) 배양된 HMCL, CYT387(0.5 내지 1 μM)과 함께 배양된 HMCL 또는 IL-6 및 CYT387과 함께 배양된 HMCL을 혈구계로 계수하여 생존 세포의 절대수를 결정하였다. CYT387과의 배양물에서는 72시간 내내(0시간에서만 처리) HMCL의 증식이 상당히 감소하였다. 이들 결과는 3회 독립 실험의 평균±SE이다. (C) CYT387은 세포 주기를 억제한다. HMCL을 CYT387(1 μM 또는 5 μM)로 24 및 72시간 처리한 후 이들을 수확하고 고정한 다음 세포 주기를 FACS로 분석하였다. 24 또는 72 시간 동안의 CIH929 UT 또는 5 μM CYT387의 대표적인 세포 주기 플롯(세포 주기의 G2/M 단계에서 세포 주기의 4회 독립 실험의 평균±SE).
도 3: CYT387은 HMCL의 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. (A) NCI-H929의 대표적인 아넥신-V 및 프로피듐 요오다이드(PI) 플롯. UT, 비히클(DMSO) 처리, 24시간 5 μM CYT387 처리 및 72시간 5 μM CYT387 처리. (B) UT와 비교하여 CYT387 처리 후의 생존(아넥신-V 및 PI-) 세포의 비율. 나타낸 데이터는 4회 독립 실험의 평균±SE이다.
도 4: CYT387은 HMCL에서 멜팔란(melphalan) 및 보르테조밉(bortezomib)과 상승효과를 나타낸다. CYT387(0.5 내지 10 μM)의 24 및 48시간 처리 후 배경 사멸(비처리)을 공제한 PI+세포의 비율로 결정된 NCI-H929, OCI-MY1 및 U266의 용량 효과 곡선. 4회 독립 실험의 평균±SE. (B) CYT387과 멜팔란 또는 보르테조밉의 배합물은 상승작용을 나타낸다. 상승효과는 Calcusyn^TM소프트웨어로 계산된 조합지수(combination index)를 사용하여 측정하였다. 조합지수가 1미만이면 상승효과를 나타내며 약물의 여러 용량/비율에서 사멸된 세포에 대해 플롯한 것이다. 멜팔란과 CYT387사이의 상승효과는 일정 범위의 용량/비율/세포주 및 시점에서 관찰된다. 보르테조밉과 CYT387은 24개 배합물중 18개에서 상승효과 또는 약간의 추가 효과가 증명되었다. 상승작용은 4회 독립 실험의 평균값에 대한 용량 효과 곡선으로부터 계산되었다.
도 5: CYT387은 단일 물질로서 또는 멜팔란 및 보르테조밉과의 배합물로서 일차 샘플의 아폽토시스를 유도한다. (A) 48시간 CYT387 처리 후 아폽토시스(Apo 2.7+) CD38+CD45- 일차 환자 골수종 세포의 비율(n=6). (B) 일차 환자 CD38+CD45- 세포를 CYT387과 멜팔란 또는 보르테조밉으로 처리한 후 Calcysyn 소프트웨어에 의해 결정된 상승작용.

CYT387은 CAS 등록번호가 CAS 1056634-68-4인 페닐아미노피리디미딘 화합물이고, 화학명은 N-(시아노메틸)-4-[2-[[4-(4-모르폴리닐)페닐]아미노]-4-피리미디닐]-벤즈아미드이며, 구조는 다음과 같다:

CYT387의 제법, 제형 및 치료 용도는 2008년 9월 18일에 공개된 WO2008/109943 및 Blood, 2010, 115(25):5232-40에 기술되어 있다. 물론, CYT387은 필요한 경우 염, 용매화물 또는 프로드럭(prodrug)로서 사용할 수 있다.

"관련 화합물"은 이들의 선택적인 JAK 억제 특징에 의해 CYT387과 관련된 화합물로서, JAK3 및 이 키나제 계열의 다른 유형에 비하여 JAK2 및 JAK1과 우선적으로 결합하고 억제하며, 하기 일반식(Ib)의 화합물 또는 이의 거울상이성질체, 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:

상기 식에서,

Z는 독립적으로 N 및 CH중에서 선택되고;

R¹은 독립적으로 H, 할로겐, OH, CONHR², CON(R²)₂, CF₃, R²OR², CN, 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노-1, 1-디옥사이드, 치환된 또는 비치환된 피페리디닐, 치환된 또는 비치환된 피페라지닐, 이미다졸릴, 치환된 또는 비치환된 피롤리디닐 및 C_1-4알킬렌(여기서, 탄소원자는 NR^Y로 임의로 치환되고/되거나 O는 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노-1,1-디옥사이드, 치환된 또는 비치환된 피페리디닐, 치환된 또는 비치환된 피페라지닐, 이미다졸릴 또는 치환된 또는 비치환된 피롤리디닐이다)중에서 선택되고;

R²는 치환된 또는 비치환된 C_1-4알킬이고;

R^Y는 H 또는 치환된 또는 비치환된 C_1-4알킬이고;

R⁸은 R^XCN이고;

R^X는 치환된 또는 비치환된 C_1-4알킬렌(여기서, 2개 이하의 탄소원자는 CO, NSO₂R¹, NR^Y, CONR^Y, SO, SO₂또는 O로 임의로 치환될 수 있다)이고;

R¹¹은 H 또는 C_1-4알킬이다.

용어 "C_1-4알킬"은 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 기를 가리킨다. 이의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 이차부틸 및 삼차부틸이 포함된다.

용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 가리킨다.

용어 "치환된"은 C_1-4알킬, C_3-6사이클로알킬, C_2-6알케닐, C_2-6알키닐, C_1-6알킬아릴, 아릴, 헤테로사이클릴, 할로, 할로C_1-6알킬, 할로C_3-6사이클로알킬, 할로C_2-6알케닐, 할로C_2-6알키닐, 할로아릴, 할로헤테로사이클릴, 하이드록시, C_1-6알콕시, C_2-6알케닐옥시, C_2-6알키닐옥시, 아릴옥시, 헤테로사이클릴옥시, 카르복시, 할로C_1-6알콕시, 할로C_2-6알케닐옥시, 할로C_2-6알키닐옥시, 할로아릴옥시, 니트로, 니트로C_1-6알킬, 니트로C_2-6알케닐, 니트로아릴, 니트로헤테로사이클릴, 아지도, 아미노, C_1-6알킬아미노, C₂ _- ₆알케닐아미노, C₂ _- ₆알키닐아미노, 아릴아미노, 헤테로사이클아미노 아실, C₁ _- ₆알킬아실, C₂ _- ₆알케닐아실, C₂ _- ₆알키닐아실, 아릴아실, 헤테로사이클릴아실, 아실아미노, 아실옥시, 알데하이도, C_1-6알킬설포닐, 아릴설포닐, C_1-6알킬설포닐아미노, 아릴설포닐아미노, C_1-6알킬설포닐옥시, 아릴설포닐옥시, C_1-6알킬설페닐, C_2-6알킬설페닐, 아릴설페닐, 카르보알콕시, 카르보아릴옥시, 메르캅토, C_1-6알킬티오, 아릴티오, 아실티오, 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 그룹들로 치환된 것을 가리킨다. 바람직한 치환체는 C₁ _- ₄알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬, C₂ _- ₆알케닐, C₂ _- ₆알키닐, C_1-6알킬아릴, 아릴, 헤테로사이클릴, 할로, 할로아릴, 할로헤테로사이클릴, 하이드록시, C₁ _- ₄알콕시, 아릴옥시, 카르복시, 아미노, C_1-6알킬아실, 아릴아실, 헤테로사이클릴아실, 아실아미노, 아실옥시, C₁ _- ₆알킬설페닐, 아릴설포닐 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택된다.

용어 "아릴"은 방향족 탄화수소의 단일, 다핵, 공액 또는 융합 잔기를 가리킨다. 이의 예로는 페닐, 바이페닐, 테르페닐, 쿼터페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 안트라세닐, 디하이드로안트라세닐, 벤즈안트라세닐, 디벤즈안트라세닐 및 펜안트레닐이 포함된다.

용어 "불포화 N-함유 5 또는 6-원 헤테로사이클릴"은 한 개 이상의 질소를 함유한 불포화 사이클릭 탄화수소 기를 가리킨다.

적합한 N-함유 헤테로사이클릭 기로는 1개 내지 4개의 질소 원자를 함유한 불포화 5- 또는 6-원 헤테로모노사이클릭 기(예, 피롤릴, 피롤리닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 트리아졸릴 또는 테트라졸릴), 1개 또는 2개의 탄소 원자와 1개 내지 3개의 질소 원자를 함유한 불포화 5- 또는 6-원 헤테로모노사이클릭 기(예, 옥사졸릴, 이속사졸릴 또는 옥사디아졸릴) 및 1개 또는 2개의 황 원자와 1개 내지 3개의 질소 원자를 함유한 불포화 5- 또는 6-원 헤테로모노사이클릭 기(예, 티아졸릴 또는 티아디아졸릴)이 포함된다.

바람직한 양태로서, CYT387과 관련된 화합물은 R¹이 파라 위치에서 모르폴리닐에 의해 치환되고 오쏘 위치에서 H에 의해 치환되고, Z가 탄소이고, R¹¹이 H, 메틸 또는 메톡시인 화합물을 포함한다.

특히 바람직한 양태로서, R⁸은 -C(O)-NH-CH₂-CH=N, -C(O)-NH-C(CH₃)₂CH=N 또는 -NH-C(O)-CH₂-CH=N이다.

본 발명의 방법에 따라 유용한 CYT387과 관련된 특정 화합물은 다음의 화합물을 포함한다:

N-(시아노메틸)-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;

N-(시아노메틸)-3-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;

N-(시아노메틸)-3-메틸-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;

N-(시아노메틸)-2-메틸-4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;

2-시아노-N-(3-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤질)아세트아미드;

2-시아노-N-(3-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)페닐)아세트아미드;

N-(시아노메틸)-4-(2-(3-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드;

N-(시아노메틸)-4-(2-(4-티오모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드; 및

N-(시아노메틸)-4-(2-(4-(모르폴리노메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드.

본 발명에서, CYT387 및 관련 화합물은 CD45 음성(CD45-) 표현형을 갖는 다발성골수종(MM) 세포 및/또는 IL-6 비반응성으로 고려되는 MM 세포를 치료하는데 사용된다. MM 세포는 다발성골수종의 전형적인 특징인 형질세포종을 형성하는 질병 세포이다. "CD45- 표현형"은 모든 조혈 세포의 마커로 잘 알려져 있는 단백질 마커 CD45의 표면 발현이 음성이거나 미미한 정도(중간 내지 강한 수준과는 확연히 구별되는 정도)인 MM 세포를 가리킨다. 또한, 본원에서 CD45- 표현형은 MM 세포 집단내에서 CD45- 세포의 출현율이 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 적어도 50%인 MM 세포 집단을 가리킨다. 세포 표면상의 CD45 검출은 형광-표지된 CD45 모노클로날 항체 및 형광-활성화 세포 분류 기술(FACS)와 같은 정립된 기술, 또는 CD45 항체와 결합하는 세포를 동정하는 임의 관련 수단을 사용하여 용이하게 달성할 수 있다. 이와 관련하여 예를 들면 공지 문헌[Moreau et al., Haematologica, 2004, 89(5):547 및 Kumar et al., Leukemia, 2005, 19:1466]을 참조할 수 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.

"IL-6 비반응성"인 MM 세포는 생존을 위해 인터루킨-6(IL-6)를 필요로 하지 않는 세포로서 정의된다. 따라서, IL-6 비반응성인 MM 세포는 자극량의 IL-6와 함께 배양되었을 때 예를 들어 IL-6 수용체 자극 또는 하위 신호전달 경과에서 유의적이지 않은 반응을 보인다. 이러한 MM 세포는 특히 골수 환경에 내재하고 이 환경에서 골수 간질 세포로서 성장하는 MM 세포를 포함하지만 또한 골수 환경에 노출되지 않고 순환하는 MM 세포도 포함한다.

MM의 영역 및 MM의 진행 및 발생에서, CD45는 질병 MM 세포의 초기 마커를 대표한다. 질병이 진행됨에 따라, MM 세포의 CD45 표현형에서 변화가 일어나는데 우점종 CD45+ 세포가 점차 줄어들어 질병 형질 세포의 집단에서는 CD45-가 우점종이 된다 (참조: Kumar et al., Leukemia, 2005, 19(8):1466). 또한, IL-6 비반응성 세포 수에서도 변화가 발생하는데 이 세포 형태는 질병의 후기에서 우점종이 된다.

본 발명의 방법에서는 CD45- 및/또는 IL-6 비반응성 표현형을 획득한 MM 세포 및 이로부터 발생하는 형질세포종의 치료를 위해 JAK 억제제의 사용이 제시된다. 이러한 특정 세포 집단에 JAK 억제의 효과는 IL-6 수용체의 자극에 대한 JAK2 반응이 MM의 진행에서 핵심적이고 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 상황하에서 놀라운 것이다. 이러한 IL-6 경로가 MM 질병 진행에 연루되어 있지 않을때 조차, CYT387은 이들 MM 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 작용을 한다.

"관련 질환"은 모노클로날 단백질(M 단백질 또는 파라단백질)을 생성하는 조혈 B 세포의 클론 집단에 의해 특징적으로 나타나는 형질세포 질병으로서 MM과 관련된 질환이다. 이들 질환의 임상 증세는 형질세포 클론의 비조절성 및 진행성 증식, 정상적인 골수 이식의 영향 및 모노클로날 단백질의 과다생성에 기인한다. MM은 형질세포 이상(plasma cell dyscrasia)이고 처음으로 진단된 MM뿐만 아니라 재발된 MM을 포함한다.

MM을 보유한 대상자, 대체로 사람 환자는 정립된 진단 기준 및 병기(staging) 매개변수를 사용하여 분별가능하다. 이들은 International Myeloma Workshop에 의해 정립된 것으로 혈청 또는 뇨중의 M 단백질, 클론 골수 형질세포증가증 또는 형질세포종 및 관련 기관 및 조직 손상의 존재에 의해 증상성 MM 대상자를 비증상성 MM 또는 유의성이 불명료한 감마글로불린병증(MGUS)을 가진 대상자와 구별하는 기준을 포함한다. MM의 병기는 Southwest Oncology Group(SWOG)에 의해 제안된 가이드라인에 따라 필수적으로 β2-마이크로글로불린 및 혈청 알부빈의 상대적 수준을 측정하여 결정할 수 있으며, >5.5mg/L β2-M 및 <3.0g/dL은 질병 4기를 가리킨다. Duire 및 Salmon 병기결정 시스템을 사용하는 다른 가이드라인이 유용한 것으로 정립되었는데, 이 경우는 헤모글로빈, 혈청 칼슘, 방사선촬영 및 M 단백질을 이용한다.

본 발명의 방법에 따른 치료에 선정된 대상자는 MM 세포 집단내에 존재하는 CD45- 세포의 증가를 나타내는 MM 보유자이다. CD45- 세포의 증가는 비정형 MM 또는 MGUS를 앓고 있는 대상자에 비하여 MM이 처음 진단된 대상자 또는 MM이 재발된 대상자에서 발견된다. CD45- MM 세포가 비교적 급격히 증가한 대상자는 특히 질병 3기 또는 4기로 진단된 MM 환자를 포함한다. 바람직한 양태로서, 집단내 CD45- 세포의 수는 집단 전체중 적어도 10%, 예를 들어 전체 MM 세포 집단의 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 이상이다. 따라서, 대상자로부터 추출한 100개 MM 세포를 대표적인 샘플로 하여, 본 발명의 방법에 따른 치료 대상 환자 집단은 MM 세포중 10-50% 또는 그 이상이 CD45 마커가 음성으로 판정된 MM 세포 집단 보유자를 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 비정형 MM 병기와 같이 질병의 초기 단계를 앓고 있는 대상자에 비하여 CD45- 표현형이 증가된 MM 세포 집단 보유 대상자를 선정하기 위해 일차적으로 MM이 진단된 대상자를 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 대상자로부터 추출된 MM 세포 집단을 예를 들어 CD45 MAb-기초 유세포분석으로 검정하여 CD45- MM 세포의 증가를 나타낸 대상자를 동정함으로써 달성한다. 또한, IL-6 비반응성 세포의 존재가 본 발명의 방법에 따른 치료 후보자를 판정하는 지표이기 때문에, MM 세포 집단에서 IL-6 비반응성 세포의 출현율을 평가할 수도 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 CYT387 또는 관련 화합물은 표준 의약 관행에 따라 제형한다.

화합물은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 및 알킬암모늄과 같은 약제학적으로 허용되는 양이온의 염; 염산, 오쏘인산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산, 설팜산 및 브롬화수소산과 같은 약제학적으로 허용되는 무기산의 산부가염; 또는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 타르타르산, 말레산, 하이드록시말레산, 푸마르산, 시트르산, 락트산, 점액산, 글루콘산, 벤조산, 석신산, 옥살산, 페닐아세트산, 메탄설폰산, 트리할로메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 이세티온산, 살리실산, 설파닐산, 아스파트산, 글루탐산, 에데트산, 스테아르산, 팔미트산, 올레산, 라우르산, 판토텐산, 탄닌산, 아스코르브산, 발레르산 및 오로트산과 같은 약제학적으로 허용되는 유기산의 염으로서 제조될 수 있다. 아민 기의 염은 또한 아미노 질소 원자가 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 아르알킬 잔기와 같은 적합한 유기 기를 가진 4급 암모늄염을 포함할 수도 있다.

화합물이 비대칭 중심을 가진 경우 이 화합물은 정제된 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 또는 임의 비율의 입체이성질체 혼합물로서 사용될 수 있다. 그러나, 혼합물은 목적하는 수준의 효능과 선택성을 제공하는 바람직한 이성체를 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5% 또는 99% 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 일반식(Ib)의 화합물의 프로드럭이 투여될 수 있다. 예를 들면, 유리 아미노, 아미도, 하이드록시 또는 카르복실산 기를 갖는 일반식(Ib)의 화합물은 프로드럭으로 전환될 수 있다. 프로드럭은 1개의 아미노산 잔기, 또는 2개 이상(예, 2개, 3개 또는 4개)의 아미노산 잔기가 펩타이드 결합을 통해 공유결합된 폴리펩타이드 쇄가 본 발명의 유리 아미노, 하이드록시 및 카르복실산 기에 결합된 화합물을 포함한다. 아미노산 잔기로는 흔히 3문자 심볼로 표기되는 20개의 천연 아미노산이 포함되고, 또한 4-하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 데모신, 이소데모신, 3-메틸히스티틴, 노르블린, 베타-알라닌, 감마-아미노부티르산, 시트룰린, 호모시스테인, 호모세린, 오르니틴 및 메티오닌 설폰이 포함된다. 또한, 프로드럭으로는 카르보네이트, 카르바메이트, 아미드 및 알킬 에스테르가 본 발명의 화합물의 상기 치환체에 카르보닐 탄소 프로드럭 측쇄를 통해 공유결합된 화합물이 포함된다. 또한, 프로드럭으로는 일반식(Ib)의 화합물의 유리 하이드록실에 인-산소 결합을 통해 결합된 화합물의 포스페이트 유도체(예, 산, 산의 염 또는 에스테르)가 포함된다. 또한, 프로드럭으로는 일반식(Ib)에서 적당한 질소 및 황 원자의 N-옥사이드 및 S-옥사이드가 포함될 수 있다.

화합물은 일반식(Ib)의 화합물중 한 가지 이상과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 상기 담체는 "약제학적으로 허용되는" 것이어야 하며, 이 용어는 담체가 조성물의 다른 성분과 혼화가능하고 대상자에게 유해한 영향을 미치지 않음을 의미한다. 조성물은 하기된 다른 치료제를 함유할 수 있고 예를 들면 통상적인 고체 또는 액체 비히클 또는 희석제뿐만 아니라 목적하는 투여 방식에 적합한 유형의 약제학적 첨가제(예, 부형제, 결합제, 보존제, 안정화제, 풍미제 등)를 제약 분야에 잘 알려져 있는 것과 같은 기술(참조예: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippincott Williams & Wilkins)에 따라 사용하여 제형할 수 있다.

화합물은 어떠한 적합한 수단에 의해서도 투여될 수 있으며, 예로는 정제, 캡슐, 과립 또는 산제 형태와 같은 경구 투여; 설하; 피하, 정맥내, 근육내, 경피 또는 낭내 주사 또는 주입 기술(예, 수성 또는 비수성 무균 주사 용액 또는 현탁액으로서)과 같은 비경구 투여; 흡인분무 또는 흡입(insufflation)과 같은 비내 투여; 크림 또는 연고 형태와 같은 국소 투여; 용액 또는 현탁액 형태의 안내 투여; 페서리, 탐폰 또는 크림 형태의 질내 투여; 좌제 형태의 직장내 투여; 또는 약제학적으로 허용되는 무독성 비히클 또는 희석제를 함유한 단위용량형으로 투여를 들 수 있다. 화합물은 예를 들어 즉시 방출 또는 지연 방출에 적합한 형태로 투여될 수 있다. 즉시 방출 또는 지연 방출은 해당 화합물을 함유하는 적합한 약제학적 조성물을 사용하여 달성할 수 있거나, 특히 지연 방출의 경우로서 피하 임플란트 또는 삼투압 펌프와 같은 기구를 이용하여 달성할 수 있다.

투여를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 편리하게는 단위용량형으로 제형할 수 있고 제약 분야에서 잘 알려져 있는 방법으로 제조할 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 일반식(Ib)의 화합물을 한 가지 이상의 부가적인 성분에 해당하는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 화합물을 액체 담체 또는 미세 분말의 고형 담체 또는 이들 두 가지 형태의 담체와 균일하고 조밀하게 혼합한 다음 혼합물을 목적하는 형태로 제형함으로써 제조할 수 있다. 약제학적 조성물에 활성 화합물은 질병의 진행 또는 상태에 대해 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 함유된다. 본원에 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 특정 양으로 함유한 생성물뿐만 아니라 직접적으로 또는 간접적으로 특정 성분을 특정 양으로 배합하여 얻은 임의의 생성물을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구용으로 적합한 형태일 수 있으며, 예로는 정제, 트로키제, 로젠지제, 수성 또는 유성 현탁제, 분산성 산제 또는 과립제, 에멀젼제, 경질 또는 연질 캡슐 또는 시럽 또는 엘릭서제를 들 수 있다. 경구용 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 관한 본 분야의 공지 방법중 어떠한 것으로도 제조할 수 있으며 이러한 조성물은 예를 들어 약제학적으로 안정하고 감미로운 제제를 제공하기 위해 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제와 같은 한 가지 이상의 물질을 함유할 수 있다. 정제는 일반식(Ib)의 화합물을 정제의 제조에 적합한 약제학적으로 허용되는 무독성 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제의 예로는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토즈, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 과립화제 및 붕해제; 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산 또는 탈크와 같은 윤활제를 들 수 있다. 정제는 코팅하지 않거나 공지 기술에 의해 코팅하여 위장관내에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 장기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연제를 사용할 수 있다. 또한, 정제를 코팅하여 방출을 조절하는 삼투압 치료 정제를 형성할 수 있다.

경구용 제제는 또한 경질 젤라틴 캡슐로서 제공할 수 있으며, 이 경우 일반식(Ib)의 화합물은 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 같은 불활성 고형 희석제와 혼합한다. 또한 경구용 제제는 연질 젤라틴 캡슐로서 제공할 수 있고, 이 경우에는 일반식(Ib)의 화합물이 물 또는 오일 매질(예, 낙화생유, 유동파라핀 또는 올리브유)과 혼합된다.

수성 현탁제는 활성 물질을 수성 현탁제의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제로는 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 하이드록시-프로필메틸셀룰로즈, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 트라가칸트검(gum tragacanth) 및 아카시아검과 같은 현탁화제이다. 분산제 또는 습윤제는 천연 인지질일 수 있고, 이의 예로는 레시틴 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물(예, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트) 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물(예, 헵타데카에틸렌옥시세타놀) 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산과 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물(예, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트) 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물(예, 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트)를 들 수 있다. 수성 현탁제는 또한 한 가지 이상의 보존제(예, 에틸, n-프로필 또는 p-하이드록시벤조에이트), 한 가지 이상의 착색제, 한 가지 이상의 풍미제 및 한 가지 이상의 감미제(예, 수크로즈 또는 사카린)를 함유할 수 있다.

유성 현탁제는 일반식(Ib)의 화합물을 식물성유(예, 아라키스유, 올리브유, 호마유 또는 코코넛유) 또는 광유(예, 유동파라핀)중에 현탁시켜 제형할 수 있다. 유성 현탁제는 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 점증제를 함유할 수 있다. 감미로운 경구 제제를 제공하기 위해 상기된 바와 같은 감미제 및 풍미제를 첨가할 수 있다. 이들 조성물은 아스코르빈산과 같은 산화방지제를 첨가하여 보존할 수 있다.

물의 첨가에 의해 수성 현탁제를 제조하는데 적합한 분산성 산제 및 과립제는 활성 화합물을 분산제 또는 습윤제, 현탁화제 및 한 가지 이상의 보존제와 혼합하여 함유한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제의 예는 상기 언급된 바와 같다. 감미제, 풍미제 및 착색화제와 같은 추가의 부형제가 또한 함유될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 유상은 올리브유 또는 아라키스유와 같은 식물성유 또는 유동 파라핀과 같은 광유 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 검(예, 아카시아검 또는 트라가칸트검)이거나 천연 인지질일 수 있으며, 인지질의 예로는 대두, 레시틴, 지방산과 헥사톨 무수물로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르(예, 솔비탄 모노올레이트) 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물(예, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레이트)을 들 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제 및 풍미제를 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭서제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 솔비톨 또는 수크로즈와 같은 감미제로 제형할 수 있다. 이와 같은 제제는 또한 보호제, 보존제, 풍미제 및 착색제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 수성 또는 유성 멸균 주사 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁제는 상기된 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지 기술에 따라 제형할 수 있다. 멸균 주사제는 또한 비경구적으로 허용되는 무독성 희석제 또는 용매중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액으로서)일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는 물, 링거액 및 염화나트륨 등장액을 들 수 있다. 또한, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 편리하게 사용된다. 이 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정유도 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

비내 투여를 포함하여 기도로 투여하는 경우 활성 화합물은 기도로의 투여에 관해 본 분야에서 사용되는 임의의 방법 및 제형에 따라 투여할 수 있다.

따라서, 일반적으로 활성 화합물은 용액, 현탁액 또는 무수 산제의 형태로 투여할 수 있다.

액제 및 현탁제는 일반적으로 수성일 수 있고, 예를 들어 물(예, 멸균수 또는 발열성물질제거수)만으로 제조하거나 물과 생리학적으로 허용되는 보조용매(co-solvent)(예, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 PEG 400과 같은 폴리에틸렌 글리콜)로 제조한다.

이러한 액제 또는 현탁제는 추가로 다른 부형제, 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드와 같은 보존제, 폴리솔베이트와 같은 가용화제/계면활성제(예, 트윈 80, 스팬 80, 벤즈알코늄 클로라이드), 완충제, 등장성-조정제(예, 염화나트륨), 흡수강화제 및 점도증강제를 함유할 수 있다. 현탁제는 추가로 현탁화제(예, 미세결정 셀룰로즈 및 카르복시메틸 셀룰로즈 나트륨)를 함유할 수 있다.

액제 또는 현탁제는 통상적인 수단, 예를 들어 적하기, 피펫 또는 분무기로 비강에 직접 적용한다. 이들 제제는 단일용량형 또는 수회용량형으로 제공될 수 있다. 수회용량형의 경우 바람직하게는 용량 계량 수단이 제공된다. 적하기 또는 피펫의 경우에는 대상자 스스로 적당한 예정량의 용액 또는 현탁액을 투여할 수 있다. 분무기는 예를 들어 계량 분무 펌프(metering atomising spray pump)일 수 있다.

기도로의 투여는 또한 에어로졸 제형에 의해 달성될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 화합물은 클로로플루오로카본(CFC)(예, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄 또는 디클로로테트플루오로메탄), 이산화탄소 똔느 다른 적당한 기체와 같은 적합한 추진제로 가압된 팩에 제공된다. 또한, 에어로졸은 편리하게 레시틴과 같은 계면활성제를 함유할 수 있다. 활성 화합물의 용량은 계량 밸브에 의해 조절될 수 있다.

또한, 활성 화합물은 무수 산제의 형태, 예를 들면 락토즈, 전분, 전분 유도체(예, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 적합한 산제 기재에 활성 화합물의 분말 믹스로 제공될 수 있다. 산제 담체는 비강내에서 젤을 형성하는 것이 적당하다. 산제 조성물은 단위용량형으로 제공될 수 있으며, 예를 들면 젤라틴 캡슐 또는 카트리지(cartridge) 또는 흡입기 수단에 의해 분말을 투여할 수 있는 블리스터팩(blister pack)이다.

비내 투여를 포함한 기도 투여용 제형에서, 활성 화합물의 입자 크기는 일반적으로 작으며, 예를 들어 5 마이크론 정도 또는 그 이하이다. 이와 같은 입자 크기는 본 분야에 공지된 수단, 예를 들면 미립자화 방법(micronisation)에 의해 수득할 수 있다.

필요한 경우, 활성 화합물의 지속적인 방출이 이루어지도록 만든 제형을 사용할 수 있다.

활성 화합물은 "Diskhaler"(Glaxo Group Ltd의 상표) 또는 용량 계량 에어로졸 흡입기에 의해 자유 유동 분말로서 경구 흡입으로 투여할 수 있다.

또한, 활성 화합물은 직장 투여용 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 이들 조성물은 일상 온도에서 고체이지만 직장 온도에서 액체로 변하는 적합한 비자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제조할 수 있으며, 이러한 제제는 직장에서 녹아 약물을 방출한다. 그와 같은 물질로는 코코아 버터 및 폴리에티렌 글리콜이 있다.

질내 투여에 적합한 조성물은 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 포말(foam) 또는 스프레이로 제공될 수 있으며, 이 경우 활성 성분에 더하여 본 분야에서 적절한 것으로 알려져 있는 담체를 함유한다.

국소용의 경우 활성 화합물을 함유하는 크림, 연고, 젤리, 용액 또는 현탁액 등이 사용된다. 이와 같은 목적을 위한 국소 투여로는 구강세정액 및 가글액이 포함될 수 있다.

안구에 투여하는 경우 활성 화합물은 적합한 멸균 수성 또는 비수성 비히클중의 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 완충제, 보존제(페닐 머큐릭 아세테이트 또는 니트레이트, 벤즈알코늄 클로라이드 또는 클로로헥시딘과 같은 살균제 및 살진균제를 포함) 및 점증제(예, 하이프로멜로즈)와 같은 첨가제가 또한 함유될 수 있다.

또한, 활성 화합물은 리포좀의 형태로 투여될 수 있다. 본 분야에 알려져 있듯이 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유도된다. 리포좀은 수성 매질에 분산되는 단층상(monolamellar) 또는 다층상(multilamellar) 수화 액정으로 형성된다. 생리학적으로 허용되고 대사가능한 무독성 지질이 리포좀을 형성할 수 있다면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 리포좀 형태의 본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물에 더하여 안정화제, 보존제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜린이며, 천연 및 합성 어느 것도 가능하다. 리포좀을 형성하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명의 화합물은 또한 수의학적 조성물의 형태로 제공할 수 있으며, 이러한 조성물은 예를 들어 본 분야에 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 수의학적 조성물의 예로는 아래와 같이 제조한 것을 포함한다:

(a) 외용 경구 투여, 예를 들면 드렌치(drench)(예, 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액); 정제 또는 거환제; 사료와 혼합되는 산제, 과립제 또는 펠렛; 혀에 적용하기 위한 페이스트;

(b) 예를 들면 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의한 비경구 투여(예, 멸균 용액 또는 현탁액); 또는 적절한 경우, 착유(teat)를 통해 유방내로 현탁액 또는 용액을 주입하는 유방내 주사;

(c) 국소 투여(예, 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이); 또는

(d) 직장 또는 질내 투여(예, 페서리, 크림 또는 포말).

본 발명의 약제학적 조성물은 상기된 병리학적 증세의 치료에 보통 사용되는 본원에 언급된 다른 치료학적 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 본 분야의 전문가는 통상적인 약제학적 원칙에 따라 병용 요법에 사용하기에 적합한 치료제를 선택할 수 있다. 치료제의 병합은 상기된 여러 질병의 치료 또는 예방에 상승 효과를 일으킬 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 당업자는 각 치료제의 용량을 보다 낮추어 치료 효능을 달성할 수 있으며, 이에 따라 유해한 부작용의 잠재성을 줄일 수 있다.

다른 치료제의 예로는 다음의 것들이 포함된다: 엔도텔린 수용체 길항제(예, 암브리센탄, 보센탄, 시탁센탄), PDE-V 억제제(예, 실데나필, 타달라필, 바르데나필), 칼슘 채널 차단제(예, 암로디핀, 펠로디핀, 바레파밀, 딜티아젬, 멘톨), 프로스타사이클린, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 베라프로스트, 일산화질소, 산소, 헤파린, 와파린, 이뇨제, 디곡신, 사이클로스포린(예, 사이클로스포린 A), CTLA4 Ig, 항체(예, ICAM 3, 항-IL2 수용체(항 Tac), 항 CD45RB, 항 CD2, 항 CD3(OKT3), 항 CD4, 항 CD80, 항 CD86), CD40과 gp39간의 상호작용을 차단하는 물질(예, CD40 및/또는 gp39에 대해 특이적인 항체(즉, CD154), CD40과 gp39로부터 작제된 융합 단백질(CD401g 및 CD8gp39), 데옥시스퍼구알린(DSG)와 같은 NF 카파 B 기능의 억제제(예, 핵내 이동 억제제), HMG CoA 리덕타제 억제제와 같은 콜레스테롤 생합성 억제제(로바스타틴 및 심바스타틴), 비스테로이드 소염제(NSAID)(예, 이부프로펜, 아스피린, 아세타미노펜, 레플루노미드, 데옥시스퍼구알린), 사이클로옥시게나제 억제제(예, 셀레콕시브), 스테로이드(예, 프레드니솔론 또는 덱사메타손), 금 화합물, 베타-항진제(예, 살부타몰), LABA(살메테롤), 류코트리엔 길항제(예, 몬텔루카스트), 증식억제제(예, 메토트렉세이트, FK506(타크롤리무스, Prograf), 마이코페놀레이트 모페틸), 세포독성 약물(예, 아자티오프린, VP-16, 에토포시드, 플루다라빈, 독소루비신, 아드리아마이신, 암사크린, 캠프토테신, 사이타라빈, 젬시타빈, 플루오로데옥시우리딘, 멜팔란 및 사이클로포스파미드), 항대사물질(예, 메토트렉세이트), 토포이소머라제 억제제(예, 캠프토테신), DNA 알킬화제(예, 시스플라틴), 키나제 억제제(예, 소라페닙), 미세소관 독소(예, 파클리탁셀), TNF-α 억제제(예, 테니답), 항-TNF 항체 또는 가용성 TNA 수용체, 하이드록시 우레아 및 라파마이신(시롤리무스 또는 라파뮨) 또는 이들의 유도체.

한 가지 양태로서, MM 대상자는 CYT387 또는 관련 화합물과 멜팔란(melphalan)의 배합물로 치료한다.

다른 양태로서, MM 대상자는 CYT387 또는 관련 화합물과 보르테조밉의 배합물로 치료한다.

다른 치료제가 본 발명의 화합물과 배합하여 사용되는 경우, 이들은 예를 들어 Physician Desk Reference(PDR)에 기재된 양으로 사용할 수 있거나 본 분야의 전문가에 의해 다른 방법으로 결정된 양트로 사용할 수 있다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 방법은 CYT387을 멜팔란 및 보르테조밉중에서 선택된 화합물과 배합하여 사용한다.

본 발명은 또한 CYT387 또는 관련 화합물을 MM의 치료 유효량으로 포함한 용기를 포함하는 제품 및 키트 둘 다를 제공한다. 용기는 단순히 경구용량형으로 활성 화합물을 함유하는 병일 수 있으며, 상기 경구용량형 각각은 예를 들어 약 50 mg 내지 400 mg (예, 200 mg 또는 300 mg)의 양으로 활성 화합물의 단위 용량을 함유한다. 키트는 추가로 치료 대상자를 선정하는 본 발명의 방법에 관한 지침 인쇄물을 포함한다. 상기 제품은 본 발명의 방법에 따른 대상자의 치료를 표기한 라벨 등을 포함한다.

일반적으로, 용어 "치료"는 대상자, 조직 또는 세포에 작용하여 목적하는 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미하며 (a) 해당 질병에 취약할 수 있지만 해당 질병을 앓고 있지 않은 것으로 진단된 대상자로부터 해당 질병을 예방하거나; (b) 해당 질병을 억제하거나(즉, 해당 질병의 발전을 막아주거나); (c) 해당 질병의 영향을 완화 또는 경감시킴(즉, 해당 질병의 영향을 저하시킴)을 포함한다. 한 가지 양태로서, 치료는 수혜 대상자에서 CD45- 및/또는 IL-6 비반응성 MM 세포의 수를 감소시키는 결과를 달성한다.

용어 "대상자"는 본 발명의 방법에 의한 치료를 필요로 하는 질병을 가진 모든 동물을 가리킨다. 사람과 같은 영장류를 포함하여, 다양한 다른 포유동물을 본 발명의 방법으로 치료할 수 있다. 예를 들어, 이들로 한정되는 것은 아니고 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 기니아 피그, 랫트 또는 다른 소류(bovine), 양류(ovine), 말류(equine), 개류(canine), 고양이류(feline), 설치류(rodent) 또는 쥐류(murine) 종을 치료할 수 있다. 특히 개는 다발성골수종이 자주 발견되는 것으로 알려져 있다.

용어 "투여"는 치료를 필요로 하는 대상자에게 본 발명의 화합물을 제공함을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "치료학적 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 구하고자 하는 것으로 조직, 계, 동물 또는 사람의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 화합물의 양을 가리킨다.

다발성골수종의 치료 또는 예방에 적합한 화합물 용량 수준은 일반적으로 환자의 체중 kg당 일일 약 0.01 내지 500 mg이며 단일용량 또는 수회용량으로 투여될 수 있다. 바람직한 용량 수준은 일일 약 0.1 내지 약 250 mg/kg이고, 더 바람직한 용량 수준은 일일 약 0.5 내지 약 100 mg/kg이다. 적합한 용량 수준은 일일 약 0.01 내지 250 mg/kg, 일일 약 0.05 내지 100 mg/kg 또는 일일 약 0.1 내지 50 mg/kg일 수 있다. 이 범위내에서 용량은 일일 0.05 내지 0.5 mg/kg, 일일 0.5 내지 5 mg/kg 또는 일일 5 내지 50 mg/kg일 수 있다. 경구 투여의 경우 조성물은 바람직하게는 1.0 내지 1000 mg의 활성 성분, 특히 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0 및 1000.0 mg의 활성 성분을 함유한 정제의 형태로 제공된다. 용량은 예를 들어 치료 대상 환자에 대한 해당 용량의 치료 효능 및/또는 증상 조절을 위해 상기 범위내에서 임의로 선택될 수 있다. 활성 화합물은 바람직하게는 일일 1 내지 4회의 용법으로 투여되며, 더 바람직하게는 일일 1회 또는 2회의 용법으로 투여된다.

임의 특정 환자를 위한 특정 용량 수준 및 투여 횟수는 다양할 수 있고 사용된 특정 화합물의 활성, 특정 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식습관, 투여 방식 및 시간, 분비율, 약물 배합, 특정 증세의 중증도 및 치료 대상 숙주에 의해 좌우된다는 것은 당연하다.

본 발명을 더 명확히 이해할 수 있도록 본 발명의 특성을 예시하는 비한정적 실시예를 이하에 기술한다.

본원의 명세서에 언급된 모든 공개물의 내용은 본원에 참고로 인용된다. 본 분야의 전문가는 특정 양태로 제시된 본 발명을 광범위하게 기술된 본 발명의 성질 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 다양하게 변화 및/또는 변형시킬 수 있음을 마땅히 인정할 것이다. 따라서, 본 발명의 양태는 모든 관점에서 한정하는 것이 아니고 예시적인 것으로 고려되어야 한다.

실시예

CYT387은 골수섬유증을 포함하여 골수증식종양으로 알려진 한 부류의 혈액상태뿐만 아니라 혈액학, 종양학 및 염증 질환에서의 증상을 포함한 다수의 질환에 연루되어 있는 키나제 효소 JAK1 및 JAK2의 억제제이다. 골수섬유증은 환자의 골수가 반흔조직으로 대체되어 심신을 약화시키는 만성 질환으로 치료 방법은 제한적이거나 만족스럽지 못하다.

CYT387의 합성

4-에톡시카르보닐페닐 붕산(23.11 g, 119 mmol), 2,4-디클로로피리미딘(16.90 g, 113 mmol), 톨루엔(230 mL) 및 탄산나트륨 수용액(2 M, 56 mL)의 혼합물을 격렬하게 교반시키고 이 현탁액에 질소를 15분간 버블링하였다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐[0](2.61 g, 2.26 mmol)을 첨가하였다. 10분간 더 질소를 버블링하고, 혼합물을 100℃로 가열한 다음 75℃로 밤새 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 에틸 아세테이트(200 mL)로 희석한 다음, 물(100 mL)을 첨가하고 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(100 mL)로 추출하고 2가지 유기 추출물을 합쳤다. 유기물을 염수로 세정하고, 황산나트륨으로 여과한 다음, 농축하고, 생성된 고체를 메탄올(100 mL)로 배산시키고 여과하였다. 고체를 메탄올(2x30 mL)로 세정하고 대기 건조시켰다. 이 물질을 아세토니트릴(150 mL) 및 디클로로메탄(200 mL)중에 용해시키고, MP.TMT Pd-제거 수지(Agronaut part number 800471)(7.5 g)과 함께 2일간 교반하였다. 용액을 여과하고, 고체를 디클로로메탄(2x10 mL)으로 세정한 다음, 여액을 농축하여 에틸 4-(2-클로로피리미딘-4-일)벤조에이트를 회색 고체(17.73 g, 60%)로서 수득하였고, 추가로 디클로로메탄으로 세정하여 추가의 1.38 g 및 0.5 g의 생성물을 수득하였다.

에틸 4-(2-클로로피리미딘-4-일)벤조에이트(26.15 g, 99.7 mmol)과 4-모르폴리노아닐린(23.10 g, 129.6 mmol)의 혼합물을 1,4-디옥산(250 mL)중에 현탁시켰다. p-톨루엔설폰산 모노하이드레이트(17.07 g, 89.73 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 40시간 동안 환류로 가열하고, 주변 온도로 냉각시킨 다음, 농축시킨 후, 잔사(residue)를 에틸 아세테이트와 1:1 포화중탄산나트륨/물(총 1L)사이에 분배하였다. 유기상을 물(2x100 mL)로 세척하고 농축하였다. 수성상을 디클로로메탄(3x200 mL)로 추출하였다. 이러한 후처리과정에서 침전된 물질을 여과하여 모아 두었다. 액상 유기물을 합쳐 농축하고 메탄올(200 mL)로 배산시킨 다음 여과하여 추가의 황색 고체를 수득하였다. 고체를 합쳐 메탄올(500 mL)중에 현탁시키고 밤새 정체해 둔 다음 음파분쇄하고 여과하였다. 고체를 메탄올(2x50 mL)로 세정하고 건조시켜 에틸 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조에이트(35.39 g, 88%)를 수득하였다.

3:1 메탄올/테트라하이드로푸란(350 mL)중의 에틸 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조에이트(35.39 g, 87.6 mmol)의 용액을 물(90 mL)중의 수산화리튬(4.41 g, 183.9 mmol)과 혼합하였다. 혼합물을 2시간 동안 환류로 가열하고, 냉각시킨 다음, 농축시키고, 염산(2M, 92.5 mL, 185 mmol)으로 산성화하였다. 암색 침전물을 여과하고, 물로 세척한 다음, 진공 건조시켰다. 고체를 모르타르와 막자로 갈아 분말로 만들고, 메탄올(500 mL)로 배산시킨 다음, 다시 여과하여 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조산을 진흙같은 고체로서 수득하였다. 이 물질을 에테르로 세정하고, 밤새 대기 건조시킨 다음, 모르타르와 막자로 갈아 미세 분말을 만들었다. 질량 회수를 기준으로 수득량은 34.49 g으로 정량되었다.

DMF(400 mL)중의 4-(2-(4-모르폴리노페닐아미노)피리미딘-4-일)벤조산(이론상 32.59 g, 86.6 mmol)의 현탁액에 트리에틸아민(72.4 mL, 519.6 mmol, 6 당량)을 첨가하였다. 혼합물에 음파처리하여 용해가 완전히 이루어지도록 하였다. 아미노아세토니트릴 하이드로클로라이드(16.02 g, 173.2 mmol)을 첨가하고, 계속해서 N-하이드록시벤조트리아졸(무수, 14.04 g, 103.8 mmol) 및 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(19.92 g, 103.8 mmol)을 첨가하였다. 현탁액을 밤새 격렬하게 교반시켰다. 용매를 감압하에 증발시키고, 잔사를 5% 중탄산나트륨(400 mL) 및 물(300 mL)로 희석하여 황색 고체를 수득하고, 이를 파쇄하고 여과하였다. 고체를 100 mL 분량의 물로 서너 차례 세정하고, 뜨거운 메탄올/디클로로메탄(500 mL, 1:1)로 배산시킨 다음, 약 300 mL의 용량으로 농축하고, 냉각한 후 여과하였다. 고체를 차가운 메탄올(3x100 mL), 에테르(200 mL) 및 헥산(200 mL)으로 세정한 후 건조시켜 융점이 238 내지 243℃인 CYT387(31.69 g, 88%)을 수득하였다.

관련 화합물의 합성은 문헌[Burns et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19:5887] 및 WO2008/109943에 기술되어 있으며, 이들 두 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용된다.

재료 및 방법

시약

JAK1/2 억제제 CYT387을 DMSO에 용해시켰다. 프로테아좀 억제제 보르테조밉(Janssen-Cilag)은 염수에 용해시켰다. 알킬화제 멜팔란(Sigma)를 0.5% HCl.EtOH중에 용해시켰다. 모든 약물 원액을 완전 RPMI-1640 배지에 여러 실험 농도로 희석시켰다.

세포주 및 배양 조건

HMCL LP-1, NCI-H929, OPM2, RPMI-8226 및 U266 및 사람 간질 세포주 HS5는 American Type Culture Collection (미국)으로부터 입수하였다. ANBL6, OCI-MY1 및

XG-1은 Winthrop P Rockefeller Cancer Institute(알칸소)로부터 제공받았다. HMCL은 10% 열불활성화 소태아혈청(FBS, Lonza) 및 2 mM L-글루타민(Gibco, Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco, Invitrogen)에서 2.0 내지 5.0 x 10⁵ 세포/mL의 밀도로 성장시켰다. IL-6 의존 세포주는 필요에 따라 2 내지 5 ng/mL IL-6와 함께 배양하였다. 모든 세포는 37℃ 및 5% CO₂의 가습배양기에서 배양하였다. 모든 HMCL은 높은 생존율과 주기를 보장하기 위하여 실험 개시 24시간 전에 계대배양하였다.

일차 샘플

Alfred Hospital Research and Ethics Committee의 승인하에 서면으로 사전동의를 얻어 Bone Marrow Aspirates로부터 재발된 난치성 MM 환자의 일차 MM 샘플을 입수하였고 공지된 방법에서와 같이 분리하고 처리하였다[25]. 간략히 설명하면, Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences)로 골수 단핵세포(BMMC)를 분리하고 PBS에서 세정한 후, 적혈구를 NH₄Cl 용액(8.29 g/L 염화암모늄, 0.037 g/L EDTA, 1 g/L 중탄산칼륨)으로 용해시켰다. 이어서, 세포를 PBS에서 재차 세정하고 혈구계로 정량하였다. BMMC 샘플을 완전 RPMI-1640 배지에서 (HMCL에 대해 상기한 바와 같이) 24시간 동안 배양하였다. BMMC를 5 x 10⁵ 세포/ml로 도말하고 CYT387(5 내지 50 μM) 단독으로 또는 (세포수에 따라) 보르테조밉(5 내지 40 nM) 또는 멜팔란(50 내지 200 μM)과 배합하여 24 및/또는 48시간 동안 처리하였다. CD45 FITC(BD), CD38 PerCP-Cy5.5(BD) 및 Apo 2.7 PE(Immunotech)에 대해 염색하여 CD45-CD38+ MM 세포의 아폽토시스를 결정하여 약물-유도된 MM 특정 세포 아폽토시스를 비처리군 및 비히클 대조군과 비교하였다. 이어서, 샘플을 FACS로 분석하였다. 또한, 환자 BMMC로부터 일차 골수 간질 세포(BMSC)를 채취하고 최초 24시간 배양 후 플라스크에 부착한 세포를 서너 차례 계대 배양하면서 부착 세포를 연속 선별하였다. 일단 세포를 배양하여 증식한 후 이들 세포는 HS5 간질 세포를 이용하는 실험과 동시에 MM 세포를 자극하는 공동배양(CC)에 사용하였다.

웨스턴 블롯(WB)

HMCL을 CYT387(1 또는 2 μM)로 60분간 처리한 다음 10 ng/ml IL-6로 15분간 자극하였다. RIPA 완충액(50 mM Tris·HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 5 μg/ml 아프로티닌, 5 μg/ml 류펩틴, 1% 트리톤 X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트 및 0.1% SDS)로 CYT387 처리된 HMCL 및 비처리된 HMCL의 단백질 용해물을 만들었다. 간단히 설명하면, 세포를 빙상의 RIPA 완충액에서 30 내지 60분간 배양한 후 4℃에서 20분간 16,100 x g로 원심분리하고 상청액을 수거하였다. 제조사의 지침에 따라 DC Protein Assay(Bio-Rad)를 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 이어서, 10% SDS-PAGE에 의해 100 ㎍의 각 단백질 용해물을 분리하고 Bio-Rad 반건식 이송 시스템을 사용하여 니트로셀룰로즈(Hybond ECL, Amersham)상으로 블롯팅하였다. 막을 5% 탈지유 분말 0.1% 트윈-20/PBS로 60분간 차단한 후 마우스 모노클로날 항인-STAT3(pY705, Santa Cruz), 마우스 모노클로날 항-STAT3(Santa Cruz) 또는 마우스 모노클로날 항-α-튜불린(Sigma-Aldrich)와 함께 실온에서 1 내지 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양하였다. 블롯을 0.1% 트윈-20/PBS에서 15분간 3회 세척한 다음, 이차 HRP 태그 항체(돼지 항-토끼 Ig HRP(Dako) 또는 토끼 항-마우스 Ig HRP(Dako))와 함께 실온에서 1 내지 2시간 배양한 후 상기와 같이 세정하였다. 블롯을 육안으로 확인할 수 있도록 Supersignal west pico ECL 시약(Pierce)으로 처리하였다.

세포내 FACS

JAK/STAT, PI3K/AKT 및 Ras/MAPK 경로의 활성화를 연구하기 위해 세포내 유세포분석을 사용하여 STAT3의 티로신 705에서 인산화(p-STAT3), AKT의 세린 473에서 인산화(p-AKT) 및 ERK1/2의 쓰레오닌 202 및 티로신 204에서 인산화(p-ERK)를 측정하였다. HMCL을 10 ng/ml IL-6 ± 200 ng/ml IGF-1로 자극하거나 CYT387 처리된 또는 비처리된 HS5 간질 세포 또는 일차 BMSC와의 공동배양으로 자극하였다. 공동배양의 경우 HS5 및 일차 BMSC를 24웰 평판에 2 x 10⁵ 세포/ml로 식종하고 4시간 동안 확립되도록 둔 후 CD38 또는 CD138 FITC(BD)로 미리 염색된 HMCL을 첨가하였다. MM 세포를 단독으로 (10 ng/ml IL-6 또는 5 ng/ml IL-6 및 100 ng/ml IGF-1) 자극하거나 60분의 CYT387 사전처리 또는 15분의 CYT387 동시처리와 함께 또는 이러한 처리 없이 공동배양(간질세포와의 직접적인 공동배양 또는 간질세포와의 트랜스웰(TW) 공동배양)으로 자극하였다. 자극±처리 후, MM 세포를 수확하고 2% 파라포름알데하이드로 10 내지 30분간 고정한 후, 세척하고 메탄올로 밤새 투과성으로 만들었다. 메탄올을 제거하고 MM 세포를 p-STAT3 PE(BD), p-AKT PE(BD) 또는 p-ERK (BD)에 재현탁시키고 실온에서 45 내지 60분간 염색하였다. 비결합된 항체는 버리고 MM 세포를 2% FBS PBS중에 재현탁시키고 FACS로 분리하였다.

증식 및 생존률 검정

공지된 다양한 방법[26]을 사용하여 CYT387 처리된 HMCL 및 비처리/비히클 대조군의 생존률 및 증식을 결정하였다. 8종 HMCL의 패널에서 Celltiter 96 AQeous One Solution 세포 증식 검정 MTS 시약(Promega)을 사용하여 증식을 먼저 측정하였다. 세포를 96웰 평판내 100 ㎕ 신선 배지에서 2.0 x 10⁵ 세포/ml로 CYT387(0.1 내지 5 μM)과 함께 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 20 ㎕의 MTS 시약을 마지막 4시간의 처리 동안에 첨가하고 Fluostar Optima 평판 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 490 nm에서 평판을 판독하였다. 또한, IL-6와 동시에 또는 IL-6 없이 CYT387로 처리된 5종 HMCL의 패널에서 생존 세포 수를 트립판 블루 염색 및 혈구계로 계수하였다. 이어서, 추가 분석을 위해 HMCL NCI-H929, OCI-MY1 및 U266을 선별하였다. Annexin-V 및 프로피듐 요오다이드(PI) 염색과 함께 FACS로 CYT387 처리 세포의 아폽토시스를 측정하였다. HMCL을 1 또는 5 μM CYT387로 24 또는 72 시간 동안 처리하고 수확한 다음 Annexin 완충액(0.01 HEPES, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.4)에서 세정하고 Annexin 완충액에 조성된 Annexin-V FIFC(Biosource)로 30분간 실온에서 염색하였다. 비결합된 항체는 Annexin 완충액으로 씻어내고 세포를 62.5 ng/ml PI(Sigma-Aldrich)가 함유된 Annexin 완충액에 재현탁시키고 FACS로 분석하였다.

상승효과 실험을 위해 HMCL을 보르테조밉 또는 멜팔란과 배합한 CYT387로 24 및 48시간 동안 처리한 후 수확하고 62.5 ng/ml PI(Sigma-Aldrich)가 보충된 FACS 완충액(PBS중의 0.5% HI FBS)중에 재현탁시켰다. 즉시 FACS로 세포를 분석하였다. 비처리 세포의 배경 세포사를 공제하여 PI 양성 세포의 비율을 정량하였다. 단일 약물 처리 세포를 배합물 처리 세포와 비교하고 Calcusyn 소프트웨어(Biosoft)를 사용하여 상승효과를 계산하였다.

세포주기

CYT387 처리가 HMCL 세포주기에 미치는 효과를 24 및 72 시간 후에 측정하였다. CYT387(1 또는 5 μM) 처리 HMCL 및 비처리 HMCL을 수확하고 PBS에서 세정한 다음, 100 ㎕ PBS에 재현탁시켰다. 세포를 와동하면서 1 ml의 냉 70% 에탄올로 고정하였다. 튜브는 분석때까지 -20℃에 저장하였다. 모든 샘플이 수거되면 튜브를 500 x g로 10분간 원심분리하였고, 상청액은 조심스럽게 제거하고 세포는 5 ml PBS에서 세정하였다. 마지막 세정 후 세포를 250 내지 500 ㎕의 PI/RNase 염색 완충액(BD)에 재현탁시키고 실온의 암실에서 15분간 배양한 후 FACS로 분석하였다.

데이터 분석

모든 FACS 데이터는 BD FACScalibur로 수집하였고 데이터 분석은 Flowjo 7.6 소프트웨어(Treestar, USA)를 사용하여 수행하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 5.03 소프트웨어(미국)을 사용하여 수행하였다.

결과

JAK/STAT 신호전달은 CYT387에 의해 억제된다. JAK/STAT 경로를 통한 IL-6 신호전달은 MM 세포에서 특징적으로 잘 나타나는데 IL-6이 이의 수용체와 결합하여 JAK2가 STAT3을 인산화하도록 유도한다. 웨스턴 블롯팅 및 FACS에 의해 STAT3 인산화 수준을 측정함으로써 CYT387이 JAK2를 억제하는 능력이 처음 확인되었다. HMCL(NCI-H929, OCI-MY1 및 U266)을 CYT387과 1시간 동안 배양한 후 IL-6로 15분간 자극하여 p-STAT3을 유도하였다. FACS에 의해 증명되었고(도 1A) 웨스턴 블롯팅에 의해 검증된(도 1B) 바와 같이 CYT387(0.5 내지 2 μM)은 IL-6 자극된 샘플에서 STAT3의 인산화를 억제하였다. 전체 STAT3 단백질은 영향을 받지 않았다.

MM의 성장 및 생존에 BMME는 중요하기 때문에 CYT387이 BMSC와의 공동배양으로 MM 세포에서의 신호전달을 유사하게 조절할 수 있는지를 확립하는 것은 중요하였다. 이것은 불멸화 BMSC(HS5)와 일차 환자 BMSC 둘 다로 이루어졌다. 어느 경우든 BMSC와의 15분간 공동배양(접촉하거나 접촉하지 않고)은 MM 세포에서 STAT3의 인산화를 유도할 수 있는 반면 CYT387로의 동시 처리는 HMCL에서 p-STAT3의 양을 현저히 감소시켰다(도 1C). 따라서, MM-BMSC 미세환경내에서 용해 및 BMSC에 의해 MM에 제공되는 접촉 매개된 신호전달에 의해 CYT387이 MM 세포에서 STAT3 활성화를 억제할 수 있음을 증명한다.

CYT387은 PI3K/AKT 및 Ras/MAPK 신호전달을 억제한다

JAK 신호전달 키나제는 많은 세포 경로에 연루되어 있음에 따라, 본 발명자들은 NCI-H929, OCI-MY1 및 U266 세포에서의 IL-6 및 IGF-1 유도된 PI3K/AKT 및 Ras/MAPK 신호전달에 대한 CYT387의 효과를 연구하게 되었다(도 1D). OCI-MY1은 IL-6 및 IGF-1 자극 후 CYT387 동시처리에 의해 p-AKT 활성화의 유의적인 감소를 나타냈다. IL-6 및 IGF-1 자극에 의해 유도된 U266 세포에서의 p-ERK는 CYT387에 의해 유의적으로 억제되었다. p-AKT 및 p-ERK의 수준은 NCI-H929에서 IL-6 및 IGF-1 자극에 반응하여 불과 소량 증가한 것으로 나타났다.

CYT387은 HMCL의 증식을 억제한다

8종 HMCL의 패널(IL-6 비반응성 표현형 - LP-1, NCI-H929, OPM2, RPMI-8226 및IL-6 반응성 표현형 - ANBL-6, OCI-MY1, U266 및 XG-1)에서 CYT387(0.1 내지 5 μM)이 세포 증식에 미치는 효과를 24, 48 및 72시간에서 MTS 검정으로 측정하였다(도 2A). 8종 HMCL중 6종은 CYT387에 대해 시간 및 용량 의존적 반응을 나타내면서 일부 HMCL에서 24시간내에 억제가 나타났다. 72시간에서 NCI-H929 및 XG-1이 CYT387 처리에 가장 강한 반응을 보였다.

또한, 72시간에 걸쳐 CYT387과 함께 배양된 HMCL의 증식을 혈구계로 생존 세포 수를 정량하여 평가하였다(도 2B). IL-6 신호전달과 CYT387에 의한 JAK2의 억제사이에 관계가 뚜렷하기 때문에, IL-6 및/또는 CYT387의 첨가에 따른 3종 HMCL(NCI-H929, OCI-MY1 및 U266)의 증식을 측정하였다. 3종 HMCL은 10 ng/ml IL-6이 보충된 또는 보충되지 않은 완전 배지에서 잘 증식하였고 CYT387(0.5 내지 1 μM)은 심지어 IL-6 존재하의 배양에서 HMCL의 증식을 감소시킬 수 있었다. CYT387은 72시간 후에 세포증식을 NCI-H929 50%(1 μM), OCI-MY1 50%(0.5 μM), U266 44%(1 μM)까지 억제하였다.

CYT387로 HMCL의 처리 결과 세포주기중 G2/M 단계에서 세포 축적이 일어난다

CYT387의 증식억제 효과는 또한 CYT387이 처리된 HMCL의 세포주기를 평가함으로써 특징적으로 나타났다. CYT387(1 내지 5 μM)이 처리된 HMCL(NCI-H929, OCI-MY1 및 U266)은 세포주기중 G2/M 단계에서 뚜렷한 세포 축적을 보였다. 이러한 결과는 NCI-H929 세포에서 가장 확연히 나타났는데(도 2C), 약물 처리 샘플은 24 및 72 시간 처리 후에 G2/M에서의 세포가 비처리 또는 비히클 처리 대조군에 비하여 2배 이상 증가한 것으로 나타났다. CYT387 처리 샘플에서 추가적인 배수체 집단이 발견되었으며, 이 결과는 CYT387 처리가 MM 세포의 정상적인 세포주기로부터 추가적인 일탈을 일으킨다는 것을 증명한다.

CYT387은 HMCL 및 일차 MM 세포에서 아폽토시스를 유도한다

3종 HMCL(NCI-H929, OCI-MY1 및 U266)을 대상으로 Annexin-V/프로피듐 요오다이드 FACS 염색을 이용하여 CYT387 처리 세포의 아폽토시스를 연구하였다. 3종 HMCL 모두에서 아폽토시스 세포의 비율이 증가한 것으로 검출되었는데 NCI-H929에서 가장 뚜렷하였고(도 3A), 5 μM CYT387을 처리한 후 24 및 72 시간에서 생존 세포가 각각 21% 및 52% 감소한 것으로 검출되었다(도 3B). 병용 요법의 일부로서 CYT387을 평가하기 위해 NCI-H929, OCI-MY1 및 U266을 일정 범위 용량의 CYT387, 보르테조밉, 멜팔란으로 처리하여 각 약물에 대한 용량 효과 곡선을 설정한 후 CYT387과의 병용에 따른 상승효과를 Calcusyn^TM 소프트웨어로 측정하였다. 각 화합물에 대한 용량 효과 곡선(멜팔란 및 보르테조밉 데이터는 제시되지 않음)은 CYT387(0.5 내지 10 μM)이 3종 HMCL의 아폽토시스를 시간 및 용량 의존적 양상으로 유도하였음을 보여준다(도 4A). CYT387은 보르테조밉 및 멜팔란 모두와 함께 상승효과를 나타냈으나 다른 약물 용량 및 분석 시점에서 상승효과 수준이 다르게 나타났다(도 4B).

또한, CYT387이 단일 제제로서 및 병용 요법의 일부로서 생체외(ex-vivo) 일차 MM 세포에 미치는 효과를 연구하였다. MM 환자 BMA를 여러 용량의 CYT387(5 내지 50 μM)과 함께 24 및 48 시간 동안 배양한 후 CD38+CD45- MM 세포 집단을 유세포분석에 의해 아폽토시스에 대해 평가하였다. 6명 환자가 처리되었고, 아폽토시스는 20 μM CYT387로 처리 후 48시간에서 MM 세포중 5 내지 59%에서 나타났다(도 5A). 또한, 멜팔란 및 보르테조밉과 병용한 CYT387의 효과를 연구하였다. CYT387은 멜팔란과 함께 2/3 환자에서 상승효과를 나타냈고, 보르테조밉과는 일부 환자/용량에서 상승효과가 관찰되었다(도 5B).

논의

일부 MM 세포의 IL-6 의존, IL-6에 의한 MM 세포의 증식 상승조절, IL-6에 의한 약물 유도 아폽토시스의 억제 및 본 연구에서 가장 중요한 것으로 IL-6/JAK/STAT 경로의 억제에 의한 MM 세포의 직접적인 아폽토시스 유도를 증명하는 실험을 포함하여 일련의 증거들로부터 MM에서의 IL-6/JAK/STAT 신호전달의 역할이 확인되었다. 이들 데이터 및 BMME내 IL-6의 풍부는 JAK/STAT 신호전달을 새로운 화학요법으로 억제시킬 수 있는 타당한 표적으로 제시하며 JAK/STAT 경로의 siRNA 표적화를 통해 MM 세포 아폽토시스 유도를 증명하는 예비적인 시험관내 연구에 의해 지지된다[27]. 또한, 다른 중요한 경로에서 JAK의 신호 전달 역할[5에서 리뷰] 및 다른 혈액암에서 JAK 돌연변이의 생존촉진 효과[1-4]는 JAK 억제의 치료 잠재능을 이미 증명하였다. 그 후 치료 도전에 의해 IL-6 또는 BMSC의 존재하에서 MM 세포가 억제되고 있다. 본 발명에 이르러, 본 발명자들은 MM에서의 JAK 억제를 평가하는 종전의 연구를 확장하여 보다 광범위한 HMCL을 연구하였고, CYT387이 공동배양 모델에서 JAK-STAT 활성화를 억제할 수 있음을 증명하였으며, 일차 MM 종양 세포에 대한 CYT387의 효과를 입증하였다. MM의 초기 단계에서 악성 세포들은 주로 CD45+인 반면 보다 발전된 약물 내성 질환에서는 CD45- MM 세포가 주류인 것으로 가설되어 있었다[28]. 그러나, CD45- MM 세포는 CD45+ MM보다 IL-6에 대한 반응성이 떨어지는 것으로 고려되고 보다 적은 IL-6 수용체를 발현한다[29]. JAK 억제에 대한 다른 연구들은 주로 CD45+ IL-6 반응성 HMCL에 집중하였고, 이러한 집중은 논리상 예비 실험에 타당하나 그와 같은 표적 세포 집단들은 단지 MM 세포의 일부에 불과하다는 것을 명심해야 한다. 게다가, 환자들은 CD45- MM 세포와 CD45+ MM 세포의 혼합 집단을 증명할 수 있다[29]. 중요한 것으로 본 발명자들은 IL-6 비반응성 표현형인 것으로 판단되는 HMCL인 NCI-H929에 대한 CYT387의 효능을 증명하였으며, 이 결과는 CYT387이 일정 범위의 MM 표현형에 대해 효과적일 수 있음을 제시하는 반면에 다른 연구자들은[19] 다른 JAK 억제제를 사용하여 CD45- MM에 대해 단지 한정적인 성공만을 보고하였다. HMCL 및 일차 MM 종양 세포에 대한 CYT387과 보르테조밉 또는 멜팔란간의 상승효과를 증명하는 본 발명자들의 데이터는 종전의 연구[19]를 검증한다.

이용가능한 데이터들은 MM 세포에서 JAK의 억제가 JAK/STAT 경로의 직접적인 억제외에 다른 하위 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다. MM 세포 생존에서 IL-6의 중요성은 JAK/STAT 경로의 관점에서 그 특징이 잘 밝혀져 있으나 여러 HMCL에서 IL-6 유도된 PI3K/AKT 활성화[18,30] 및 Ras/MAPK 활성화[20,30-33]에 대한 증거가 점점 증가하고 있다. MM에서 JAK/STAT 경로에 더하여 PI3K/AKT와 Ras/MAPK 경로 모두의 중요성이 설정된 상황에서 이들 세가지 모두를 조절할 수 있는 소분자 억제제는 상당한 임상 잠재성을 가질 수 있다.

PI3K/AKT 및 Ras/MAPK 경로에 대한 JAK 억제의 효과를 연구한 결과 정반대의 결과가 나타났다. AZD1480 및 AG490은 Ras/MAPK의 IL-6 유도 활성화를 감소시키는 것으로 나타났으나[20, 22] 다른 한편으로 AG490은 IL-6 유도 Ras/MAPK 활성화를 감소시키지 못한 것으로 나타났다[31]. JAK 억제제 INCB20은 MM.1S 세포에서 IL-6 유도 Ras/MAPK 활성화를 억제할 수 있었으나 INA-6 세포에서 구성적인 Ras/MAPK 활성화에 영향을 주지 못했다[18]. 또한, AG490에 의한 JAK의 억제는 PTEN 돌연변이된 OPM2 MM 세포에서 AKT 활성화를 제거할 수도 있었다[30]. 유사하게, INCB20 또한 IL-6 유도 p-AKT를 억제할 수 있었으나 INA-6 세포에서 IGF-1 유도 p-AKT에 대해서는 효과를 나타내지 못했다[18]. 입수된 데이터들의 가변성은 억제제의 차이 및 공통적으로 연구되고 있는 HMCL간의 이질성(heterogeneity)의 결과일 수 있다. 본 발명의 연구에서 U266 세포에서 IL-6 및 IGF-1 유도 p-ERK의 유의적인 감소뿐만 아니라 OCIMY1 세포에서 IL-6 및 IGF-1 유도 p-AKT의 현저한 감소가 있었으며, 이 결과는 JAK 억제가 처음의 예상보다 광범위한 항-MM 활성을 나타낼 수 있음을 제시하는 다른 연구자들의 데이터를 지지한다. IL-6 유도 JAK/STAT 및 PI3K/AKT 신호전달의 억제는 또한 MM 세포의 표면에 IL-6R 발현을 감소시키는 결과를 제공할 수 있으며[30], 이 결과는 또한 IL-6의 생존촉진 효과를 감소시킬 수도 있다.

단일 용량의 CYT387이 다양한 HMCL에 미치는 상당한 증식억제 효과는 CYT387의 효능에 대한 중요한 증거이다. 게다가, 약물 내성의 매개체로서 여러번 제시된[11-13] 외인성 IL-6의 존재하에서조차 HMCL 성장을 억제할 수 있는 CYT387의 능력은 괄목할 만한 것이다. JAK 억제의 이러한 유의적인 효과는 증식 신호에 대해 JAK/STAT에 일부 의존하는 HMCL의 결과일 수 있거나 십중팔구 상기 언급된 다른 신호전달 경로의 연관성 및 후속적인 억제일 수 있다. 증식에 대한 효과는 또한 세포 주기 분석에서도 나타나며 이것은 CYT387이 세포 주기를 억제할 수 있음을 증명한다.

또 다른 관심 대상은 CYT387 처리에 의해 유도된 추가의 배수체 집단(8n)으로서 이것은 세포 주기 조절을 유도하는 JAK 신호전달의 역할을 제안할 수 있거나 Pardanai et al., 2009에 기술된 바와 같이 오로라 B, 오로라 C, 사이클린 A 또는 사이클린 B와 같이 세포 주기에 연관된 다른 키나제의 CYT387 억제 결과일 수 있다. 세포 주기 단백질에 대한 JAK억제제의 직접적인 또는 하위 효과는 다른 JAK 억제제에 대한 연구에 의해 지지된다; Scuto 등은 AZD1480이 2종 HMCL에서 사이클린 D2를 억제하였음을 발견하였다[22]. 일차 골수 공동배양에서 MM 세포의 아폽토시스 유도는 CYT387의 잠재성에 대한 중요한 증거이다. 대조적으로, IL-6 신호전달을 억제하는 다른 연구들은 BMSC의 존재하에 MM 세포를 처리하였을 때 아폽토시스의 명확한 증거를 증명하지 못했다[32]. 연구자들은 이것이 BMSC의 존재하에서 IL-6으로부터 MM 세포 독립성을 나타낼 수 있음을 제안하였다. CYT387을 이용한 본 발명자들의 발견은 후자를 반박하거나 다르게는 비-IL6 매개 생존 경로를 차단하는 JAK 신호전달 억제의 능력과 일치하는 것으로 해석될 수 있다. CYT387로 처리된 일차 MM 샘플이 처리 세포의 4 내지 67%를 차지하는 CD38+CD45- MM 세포와의 자가 전골수 공동배양물을 대표한다는 것은 후자와 일치하는 것이다. 따라서, CYT387이 심하게 처리된 MM 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있었다는 증거는 특히 고무적이다.

추가적인 화합물 평가

일반식(Ib)의 화합물은 문헌[Dalton, W. and Anderson, K.C., Clinical Cancer Research, 2006:12(22), 6603-6610]에 기술된 바와 같이 다발성골수종의 마우스 모델로 검정할 수 있다. 마우스 모델 5T2MM 및 5T33MM은 Dalton 등에 의해 보고된 바와 같이 골수내 다발성골수종 세포의 위치, 혈청중의 적당한 M-단백질, 용골성 골질환의 유도 및 골수내 신생혈관형성 증가를 포함하여 사람 질병과 유사한 임상 특징을 갖는다. 따라서, 양 모델은 일반식(Ib)의 화합물을 검정하는데 사용할 수 있으며 일반식(Ib)의 화합물이 다발성골수종 질병의 개시 전후에 다발성골수종 세포 귀환에 영향을 미치는 지를 검정하는 것이 가능하다. 이들 모델을 사용하여, 일반식(Ib)의 화합물이 혈청중 M-단백질 수준에 미치는 효과를 결정할 수 있고, 또한 일반식(Ib)의 화합물이 용골성 골질환의 감소, 종양 총량의 감소 및 생존의 향상과 같이 질병 발전의 억제에 미치는 효과도 결정할 수 있다.

사람 골수종에 대한 일반식(Ib)의 화합물의 효과를 검정하기 위하여 마우스내 사람 골수종의 이종이식 모델에 대해 화합물을 시험할 수 있다. 이들 검정을 위해 사람 골수종 종양 또는 세포주의 이종이식 모델을 예를 들어 SCID-Hu 또는 NOD/SCID 마우스에 이식할 수 있다. 이러한 SCID-Hu 모델을 이용하여 사람 미세환경에서의 골수종을 연구할 수 있고, 또한 일반식(Ib)의 화합물이 일차 골수종 세포의 재생성 성장에 미치는 영향도 연구할 수 있다. NOD/SCID 모델에서는 다발성골수종 세포가 녹색 형광 단백질로 표지된다. 이 모델은 질환의 발전을 추적하는데 사용할 수 있다.

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Claims

(1) IL-6 비반응성이고/이거나 (2) CD45- 표현형을 갖는 다발성골수종(multiple myeloma) 세포의 출현율 증가로 특징지어지는 단계의 다발성골수종을 보유한 대상자에게 상기 다발성골수종 세포의 생존율을 감소시키는데 효과적인 하기 일반식(Ib)의 화합물, 또는 이의 거울상이성질체, 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료 방법:

상기 식에서,
Z는 독립적으로 N 및 CH중에서 선택되고;
R¹은 독립적으로 H, 할로겐, OH, CONHR², CON(R²)₂, CF₃, R²OR², CN, 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노-1, 1-디옥사이드, 치환된 또는 비치환된 피페리디닐, 치환된 또는 비치환된 피페라지닐, 이미다졸릴, 치환된 또는 비치환된 피롤리디닐 및 C₁ _- ₄알킬렌 중에서 선택되고, 여기서, 탄소원자는 NR^Y로 임의로 치환되고/되거나 O는 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노-1,1-디옥사이드, 치환된 또는 비치환된 피페리디닐, 치환된 또는 비치환된 피페라지닐, 이미다졸릴 또는 치환된 또는 비치환된 피롤리디닐로 치환될 수 있고;
R²는 치환된 또는 비치환된 C_1-4알킬이고;
R^Y는 H 또는 치환된 또는 비치환된 C_1-4알킬이고;
R⁸은 R^XCN이고;
R^X는 치환된 또는 비치환된 C₁ _- ₄알킬렌이며, 여기서, 2개 이하의 탄소원자는 CO, NSO₂R¹, NR^Y, CONR^Y, SO, SO₂ 또는 O로 임의로 치환될 수 있고;
R¹¹은 H 또는 C₁ _- ₄알킬이다.
(1) IL-6 비반응성이고/이거나 (2) CD45- 표현형을 갖는 다발성골수종 세포의 출현율 증가로 진단된 자를 치료 대상자로 선정하는 단계; 및 상기 대상자에게 상기 다발성골수종 세포의 생존율을 감소시키는데 유효한 양의 제 1 항에 따른 일반식(Ib)의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료방법.
(1) 다발성골수종을 보유한 대상자로부터 다발성골수종 세포의 샘플을 수득하는 단계; (2) 상기 다발성골수종 세포를 IL-6 비반응성이고/이거나 CD45- 표현형을 갖는 세포의 출현율에 대해 분석하는 단계; (3) 상기 다발성골수종 세포의 출현율이 다발성골수종의 초기 단계에 있는 자에 비해 증가된 자를 치료 대상자로 선정하는 단계; 및 (4) 상기 다발성골수종 세포의 생존율을 감소시키는데 유효한 양의 제 1 항에 따른 일반식(Ib)의 화합물을 상기 선정된 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 하기 구조식을 가지는 N-(시아노메틸)-4-[2-[[4-(4-모르폴리닐)페닐]아미노]-4-피리미디닐]-벤즈아미드인 CYT387

, 또는 이의 거울상이성질체, 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 치료되는 것인, 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료방법.
제 4 항에 있어서, 상기 대상자가 처음 진단된 또는 재발된 다발성골수종을 앓고 있는 것인, 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상자가 다발성골수종 세포의 10% 이상이 CD45- 표현형인 다발성골수종 세포 집단을 보유하는 것인, 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료방법.
제 6 항에 있어서, 상기 대상자가 CYT387과, 제2 치료제로서 멜팔란 및 보르테조밉 중에서 선택된 것을 배합하여 치료되는 것인, 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료방법.
제 1 항에 따른 일반식(Ib)의 화합물을 포함하는 용기, 그리고 상기 용기와 함께, 다발성골수종 세포가 IL-6 비반응성이거나 CD45- 표현형을 갖는 처음 진단된 또는 재발된 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료를 표기한 라벨을 포함하는 제품.
제 1 항에 따른 일반식(Ib)의 화합물을 다발성골수종 세포가 IL-6 비반응성이거나 CD45- 표현형을 갖는 처음 진단된 또는 재발된 다발성골수종을 보유한 대상자의 치료에 유용한 양으로 포함한 용기, 그리고 상기 용기와 함께, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 교시한 지침 인쇄물을 포함하는 키트.