KR20140072041A - 단백질을 포함하는 생체 시료의 전처리 방법 - Google Patents

Abstract

생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법을 제공한다. 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법으로서, 하기 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법: (1) 생체 시료를 -80℃보다 높은 온도 조건, 특히 -70℃ 이상의 온도 조건에서 동결 처리하고, (2) 동결한 생체 시료를 해동하고, (3) 생체 시료를 계면 활성제를 이용하여 가용화한다.

Description

단백질을 포함하는 생체 시료의 전처리 방법{METHOD FOR PRETREATING BIOLOGICAL SAMPLE CONTAINING PROTEIN}

본 발명은 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 해당 방법에 의해 전처리된 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 방법에 관한 것이다.

최근 각종 질환의 진단를 위해서 유익한 정보를 얻기 위한 방법의 하나로서 바이오 마커를 측정하는 방법이 이용되고 있다. 「바이오 마커」란 통상의 생물학적 과정, 병리학적 과정, 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 응답의 지표로서 객관적으로 측정되고 또한 평가되는 특성("a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention.")을 의미한다(BIOMARKERS DEFINITIONS WORKING GROUP: BIOMARKERS AND SURROGATE ENDPOINTS: PREFERRED DEFINITIONS AND CONCEPTUAL FRAMEWORK. CLIN PHARMACOL THER 2001; 69: 89-95.). 보다 구체적으로는 혈청이나 뇨 등의 체액 및 조직 등의 생체 시료에 포함되는 생체 유래의 물질로, 생체 내의 생물학적 변화를 정량적으로 파악하기 위한 지표가 되는 것이다. 바이오 마커의 측정에는 ELISA(효소 면역 측정법), RIA(라디오 면역 검정법), 및 면역 크로마토그래피법 등의 면역학적 방법이 이용되고 있고, 해당 면역학적 방법은 측정 키트를 사용함으로써 간편하게 실시할 수 있다.

한편, 바이오 마커를 측정할 때에는 유사양성 또는 유사음성이 문제가 되는 경우가 있다. 특히, 막단백질을 바이오 마커로서 측정하는 경우, 검출용 항체가 인식하는 부위가 막에 둘러싸여 있고, 항체와 충분히 반응하지 않는 경우가 있다. 이 때문에, 상기 측정 키트 등을 이용한 간편 방법에서는 정밀도 좋게 바이오 마커를 검출할 수 없고, 이것을 해소하는 방법이 요구되고 있었다.

본 발명의 목적은 생체 시료에 포함되는 단백질, 특히 상기 문제가 있는 막단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법을 제공하는 것이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 목적은 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우에 생길 수 있는 유사양성 또는 유사음성 등의 문제를 해소하고, 측정 정밀도 또는/및 측정 감도를 향상시키기 위한 생체 시료의 전처리 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 방법에 의해 전처리된 생체 시료에 포함되는 단백질, 특히 막단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

단백질 중에서도 불용성 단백질, 특히 막단백질을 포함하는 생체 시료를 예를 들면 바이오 마커로서 면역학적 측정 방법에 제공하기 위해서는, 대부분의 경우 그 전에 대상으로 하는 단백질을 계면 활성제를 이용하여 가용화하는 것이 행해진다. 본 발명자들은 해당 생체 시료의 면역학적 측정 방법에 있어서의 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 단백질, 특히 막단백질 등의 불용성 단백질을 포함하는 생체 시료를 일단 -80℃보다도 높은 온도 조건, 특히 -70℃ 이상의 온도 조건에서 동결하고, 그 후 해동 처리함으로써 면역학적 방법을 이용하여 단백질을 측정하는 경우에 생기는 상기 문제가 해소되고, 측정 정밀도 또는/및 측정 감도가 향상되는 것을 발견하였다.

본 발명은 이러한 지견에 기초하여 더 검토를 거듭하여 완성한 것으로, 하기의 실시 양태를 포함하는 것이다.

(Ⅰ) 단백질을 포함하는 생체 시료의 전처리 방법

(Ⅰ-1) 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법으로서, 하기 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

(1) 생체 시료를 -80℃보다도 높은 온도 조건, 특히-70℃ 이상의 온도 조건에서 동결 처리하고,

(2) 동결한 생체 시료를 해동하고,

(3) 생체 시료를 계면 활성제를 이용하여 가용화한다.

(Ⅰ-2) 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법으로서, 하기 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

(2') -80℃보다도 높은 온도 조건, 특히-70℃ 이상의 온도 조건에서 동결 처리된 생체 시료를 해동하고,

(3) 생체 시료를 계면 활성제를 이용하여 가용화한다.

(Ⅰ-3) 생체 시료가 인간을 포함하는 동물의 체액인 (Ⅰ-1) 또는 (Ⅰ-2)에 기재하는 전처리 방법.

(Ⅰ-4) 상기 체액이 뇨인 (Ⅰ-3)에 기재하는 전처리 방법.

(Ⅰ-5) (3)의 가용화 공정에서 사용하는 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제인 (Ⅰ-1) 내지 (Ⅰ-4) 중 어느 하나에 기재하는 전처리 방법.

(Ⅰ-6) 상기 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르인 (Ⅰ-5)에 기재하는 전처리 방법.

(Ⅰ-7) 면역학적 방법이 ELISA법인 (Ⅰ-1) 내지 (Ⅰ-6) 중 어느 하나에 기재하는 전처리 방법.

(Ⅰ-8) 단백질이 막단백질인 (Ⅰ-1) 내지 (Ⅰ-7) 중 어느 하나에 기재하는 전처리 방법.

(Ⅰ-9) 막단백질이 아쿠아포린인 (Ⅰ-8)에 기재하는 전처리 방법.

(Ⅱ) 생체 시료에 포함되는 단백질의 면역학적 방법

(Ⅱ-1) (Ⅰ-1) 내지 (Ⅰ-9) 중 어느 하나의 방법으로 전처리된 생체 시료를 이용하여 해당 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 방법.

(Ⅱ-2) 상기 단백질이 막단백질인 (Ⅱ-1)에 기재하는 방법.

(Ⅱ-3) 상기 단백질이 아쿠아포린인 (Ⅱ-1) 또는 (Ⅱ-2)에 기재하는 방법.

(Ⅱ-4) 상기 면역학적 방법이 ELISA법인 (Ⅱ-1) 내지 (Ⅱ-3) 중 어느 하나에 기재하는 방법.

본 발명에 따르면, 생체 시료에 포함되는 단백질, 특히 막단백질을 면역학적 방법에 의해 측정할 때에 충분한 면역 반응이 발생하도록 생체 시료를 전처리하는 방법을 제공할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 방법에 따르면, 종래의 방법에서는 면역학적 방법에 의해 충분한 측정 정밀도 또는/및 측정 감도가 얻어지지 않은 생체 시료에 포함되는 막단백질을 정밀도 좋게 또는 감도 좋게 측정하는 것이 가능해진다.

도 1은 인간 AQP2 유전자(hAQP2), 및 그것을 PCR하기 위해서 사용한 hAQP2/전반 부분의 프라이머(hAQP2N-F, hAQP2N-R)와 hAQP2/후반 부분의 프라이머(hAQP2C-F, hAQP2C-R)의 관계를 나타내는 도면이다(참고 제조예 1(2)).
도 2는 참고 제조예 1(2)에 있어서 클로닝된 hAQP2N(86-749) 플라스미드 1, 2, 3, 5, 6 및 hAQP2C(562-901) 플라스미드 1, 2, 3, 4, 6의 서열과, 와일드 타입(Wild type)의 인간 AQP2 유전자에 대하여 유전자의 길이와 영역을 대비한 도면이다.
도 3은 참고 제조예 1(4)에 있어서 2종의 대장균(2 및 8)에 대하여 IPTG 전(유발 전)과 IPTG 후(유발 후), 그리고 유발 후의 대장균을 가용화하여 불용성 분획과 가용성 분획으로 나누고, 인간 AQP2 합성 펩티드 항체(항인간 AQP2 토끼 혈청, PherMingen)를 이용하여 SDS-PAGE/CBB 염색(상단 도면)과 웨스턴 분석에 제공한 결과를 나타낸다.
도 4는 참고 제조예 2에 있어서 행한 곤충 세포 Sf-9에 발현한 His 태그 부착 인간 AQP2(hAQP2/His/Sf-9) 제조의 개략 (1)과, 그 결과 (2)를 나타낸다.
도 5는 참고 제조예 3에 있어서 3회 면역 후의 혈청(OPP21401-21404) 및 대조 혈청(NRS: 정상 토끼 혈청(Normal Rabbit Serum))에 대하여, (A) 면역 항원(hAQP2/Trx)에 대한 항체가, 및 (B) Sf-9 세포 발현 hAQP2(hAQP2/Trx/Sf-9)에 대한 항체가를 나타낸다.
도 6은 참고 제조예 3에 있어서 7회 면역 후의 혈청(OPP21401-OPP 21404) 및 대조 혈청(NRS: 정상 토끼 혈청)에 대하여, (A) 면역 항원(hAQP2/Trx)에 대한 항체가, 및 (B) Sf-9 세포 발현 hAQP2(hAQP2/Trx/Sf-9)에 대한 항체가를 나타낸다.
도 7은 참고 제조예 3에 있어서 얻어진 폴리클로날 항체(OPP21401-OPP 21404)와 대조 혈청(NRS: 정상 토끼 혈청)에 대하여, 웨스턴 블로팅법에 의해 각종 항원(hAQP2/Trx, hAQP2/Trx/Sf-9, Trx/His 대조군)과의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 8은 참고 제조예 4에 있어서 얻어진 모노클로날 항체(OPM21401, OPM21402)와 대조 혈청(NMS: 정상 마우스 혈청(Normal Mouse Serum))에 대하여, 웨스턴 블로팅법에 의해 각종 항원(hAQP2/Trx, hAQP2/Trx/Sf-9, Trx/His 대조군)과의 반응성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 9는 실험예 1(1)(1-1)에 있어서 여러 가지 가용화제(요소, 트리톤 X-100, NP-40, 트윈-20, 염산구아니딘(GuCl), SDS)를 이용하여 AQP2를 막으로부터 가용화하고, 또한 측정계에 영향이 없는 조건을 검토한 결과를 나타낸다.
도 10은 실험예 1(1)(1-2)에 있어서 제1 완충액(0.2% BSA/10 mM EDTA/0.2M Tris-HCl(pH 8.0))에 첨가하는 안정제(요소, 트리톤 X-100, NP-40, 트윈-20, 염산구아니딘(GuCl), SDS)의 검토를 행한 결과를 나타낸다.
도 11은 참고 제조예 1에 기재하는 방법으로 제조한 「Trx 융합 AQP2 단백(AQP2/Trx)」, 및 참고 제조예 2에 기재하는 방법으로 제조한 「AQP2/Sf9」를 표준 단백질로서 사용하여 모노클로날 항체(OPM21401)를 이용하여 ELISA 측정을 행하고, 표준 곡선을 제조한 결과를 나타낸다(실험예 1(1)(1-4)). 또한, 횡축 상단에 기재하는 희석 배율은 AQP2/Sf9를 PBS에 현탁하고, 등량의 가용화제로 가용화한 용액(AQP2/Sf9 용해물)을 원액으로 하고, 이 원액을 2 내지 1458K(2 내지 1458x1000배) 희석한 것을 의미한다.
도 12는 피검 시료로서 건상인 자원 봉사자의 뇨 시료 4검체(4, 5, 6, 및 9)를 단계적으로 희석한 것을 사용하고, ELISA 측정을 행한 결과를 표준 단백질(Trx 융합 AQP2 단백)에 의한 표준 곡선과 함께 나타낸 도면이다(실험예 1(1)(1-5)).
도 13은 (A) 건상인 자원 봉사자 10명의 뇨에 대하여 인간 AQP2에 대한 모노클로날 항체(OPM21401)(참고 제조예 3)를 이용하여 웨스턴 블로팅에 의해 뇨 중의 인간 AQP2량을 측정한 결과를 나타낸다. (B) 동일 건상인 자원 봉사자 10명의 뇨에 대하여 상기 ELISA 측정계로 측정한 뇨 중의 인간 AQP2량을 나타낸다(실험예 1(1)(1-6)).
도 14는 참고 제조예 2에 기재하는 방법으로 제조한 「AQP2/Sf9」를 표준 단백질로 하여 ELISA 측정을 행한 표준 검량선을 나타낸다.
도 15는 실험예 2에 있어서의 제1 시험, 제2 시험, 제3 시험, 제4 시험 및 제5 시험의 결과를 나타낸다.
도 16은 -20±5℃의 온도 조건으로 0 내지 56일 간에 걸쳐 동결 보존한 인간 뇨에 대하여 뇨 중의 AQP2량을 실험예 1에서 확립한 인간 AQP2 ELISA법을 이용하여 측정하고, 동결 보존 기간과 인간 뇨 중의 AQP2량의 관계를 조사한 결과를 나타낸다(실험예 3).
도 17은 2주간(14일간), 각 온도(-80℃, -30℃, -28℃, -26℃, -20℃, 4℃)에서 암소 보존한, 건상인 2명으로부터 채취한 뇨(1 및 2)에 대하여 뇨 중의 AQP2량을 실험예 1에서 확립한 인간 AQP2 ELISA법을 이용하여 측정하고, 동결 온도와 인간 뇨 중의 AQP2량의 관계를 조사한 결과를 나타낸다(실험예 3).

(Ⅰ) 단백질을 포함하는 생체 시료의 전처리 방법

본 발명의 방법은 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법이다.

여기서 면역학적 방법이란 항원과 항체의 반응을 이용하여 피검 시료에 있어서의 표적 물질(본 발명에서는 단백질)의 존재나 그 정도를 측정하는 생화학적 시험법이고, 예를 들면 효소 표지 면역학적 검정법(Enzyme Immunoassay, EIA), 방사 면역 측정(Radioimmunoassay, RIA), 효소 결합 면역 흡착법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA), 응집법, 비탁법, 혼탁도 측정법, 웨스턴 블롯법 등을 제한 없이 들 수 있다. 바람직하게는 ELISA이다.

본 발명이 대상으로 하는 생체 시료는 단백질을 포함하고, 면역학적 측정 방법에 제공되는 것이면 되며, 그 한도 내에서 유래나 종류는 특별히 제한되지 않다. 예를 들면, 동물 또는 식물로부터 얻어지는 생체 시료를 들 수 있다.

여기서 동물로서는 제한은 되지 않지만, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유 동물을 들 수 있다. 또한, 인간 이외의 포유 동물로서는 래트, 마우스, 몰모트, 토끼, 원숭이, 개, 소, 말 등을 예시할 수 있다. 동물로서 바람직하게는 인간이다. 이들 동물로부터 얻어지는 생체 시료로서는 구체적으로는 단백질, 바람직하게는 막단백질을 포함하는 뇨, 혈액, 타액, 땀, 점액, 림프액, 양수, 및 수액 등의 체액; 세포; 및 조직을 들 수 있다.

또한, 식물로서는 제한은 되지 않지만, 종자 식물 및 양치 식물 등의 고등 식물, 및 균류, 지의류 및 해초류의 하등 식물을 들 수 있다. 이들 식물로부터 얻어지는 생체 시료로서는 구체적으로는 단백질, 바람직하게는 막단백질을 포함하는 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 과실, 및 과피 등의 각종 식물 부위(추출물 등의 식물 부위의 가공 처리물을 포함함); 수액 등의 분비물; 세포; 및 조직을 들 수 있다.

생체 시료로서 바람직하게는 포유 동물, 특히 인간의 생체 시료이다. 보다 바람직하게는 채취의 간편성으로부터 포유 동물, 특히 인간의 뇨, 타액, 및 혈액이고, 특히 바람직하게는 뇨이다.

또한, 이들 생체 시료는 측정하는 대상의 단백질이 실활하는 등, 품질이 저하 또는 열화하지 않는 것인 한, 채취로부터 얼마 지나지 않은 것일 수도, 또한 채취로부터 일정 시간 경과한 것, 즉 채취하여 일정 기간 보존한 것일 수도 있다.

또한, 생체 시료의 채취 방법은 생체 시료에 포함되는 목적으로 하는 단백질, 바람직하게는 막단백질에 영향을 미치지 않는 방법이면 되며, 특별히 제한되지 않는다.

또한, 채취한 생체 시료는 그 대로의 상태로 본 발명의 방법에 제공할 수도 있고, 또한 채취한 생체 시료로부터 목적으로 하는 단백질을 포함하는 부분을 추출 또는 분획하여 해당 추출물 또는 분획물을 생체 시료로서 본 발명의 방법에 제공할 수도 있다.

본 발명이 대상으로 하는 단백질은 상기한 동물 또는 식물에 포함되어 있는 단백질이면 되며, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 막단백질이다. 막단백질은 세포막 또는 소포막 상에 존재하는 단백질이고, 막 수송 단백질, Na+-K+펌프, 이온 채널 등이 있지만, 그 한도 내에서 특별히 제한되지 않다. 바람직하게는 아쿠아포린(Aquaporin: AQP), 특히 인간이 갖는 13종류의 AQP의 하나인 AQP2를 예시할 수 있다(「세포막 물 채널, 아쿠아포린」일의대의회지 2009; 5(2) 참조).

AQP는 MIP(주요 고유 단백질(Major Intrinsic Proteins)) 패밀리에 속하는 주요 막단백질의 일종이다(Agre P (2006). "The aquaporin water channels". Proc Am Thorac Soc 3 (1): 5-13.; Agre P, et al., (1993). "Aquaporin CHIP: the archetypal molecular water channel" Am. J. Physiol. 265(4 Pt 2): F463-76.). 집합관 관강막에 분포하고, 세포막 표면과 세포내 소포막의 사이를 왕래하는 물의 통과 구멍(물 채널)이고, 물만을 선택적으로 통과시킬 수 있기 때문에, 세포에 대한 물의 저장에 관계하고 있다(Gonen T, Walz T (2006). "The structure of aquaporins". Q. Rev. Biophys. 39(4): 361-96). 그 아미노산 서열은 이미 공지이고, 예를 들면 인간 AQP2의 아미노산 서열은 유전자 은행 수탁번호(Gen Bank accession No): AAB319999.1(GI: 685001)에 등록되어 있고(서열 번호 1), 그것을 코드하는 염기 서열도 유전자 은행 수탁번호: AH007818.3(GI: 14190630)에 등록되어 있다.

본 발명의 방법은 하기 공정을 갖는 것을 특징으로 한다:

(1) 생체 시료를 -80℃보다도 높은 온도 조건, 특히 -70℃ 이상의 온도 조건에서 동결 처리한다(동결 공정),

(2) 동결한 생체 시료를 해동한다(해동 공정), 및

(3) 생체 시료를 계면 활성제를 이용하여 가용화한다(가용화 공정).

이하, 각 공정에 대하여 설명한다.

(1) 동결 공정

해당 공정은 생체 시료를 -80℃보다도 높은 온도 조건에서 동결 처리하는 공정이다.

동결 방법은 생체 시료 중에 포함되는 단백질에 악영향이 없고, 대상의 생체 시료를 -80℃보다도 높은 온도에서 동결시키는 방법이면, 특별히 제한되지 않다. 통상, 해당 온도에서 동결시킬 수 있는 냉동고(고내 온도: -80℃보다도 높은 온도)를 이용하여 생체 시료를 동결할 수 있다.

동결 처리의 온도는 상기한 바와 같이 -80℃보다도 높으면 되며, 특별히 제한은 되지 않지만, 바람직하게는 -70℃ 이상이다. 보다 바람직하게는 -50℃ 이상, 구체적으로는 -50℃ 내지 -10℃: 더욱 바람직하게는 -40℃ 이상, 구체적으로는 -40℃ 내지 -10℃이다. 또한, 보다 바람직하게는 -40℃보다도 높은 온도 조건, 구체적으로는 -40℃보다 높고 -10℃보다 낮은 온도 조건이고, 특히 -35℃ 내지 -15℃, 그 중에서도 -30℃ 내지 -20℃의 온도 조건이 바람직하다.

일단, 동결한 생체 시료는 즉시 다음 (2) 해동 공정에 제공할 수도 있지만, 일정 기간 동결 상태에 노출시켜 두어도 된다. 이 일정 기간은 제한되지 않지만, 바람직하게는 1시간 내지 1주간, 보다 바람직하게는 12시간 내지 24시간 정도를 들 수 있다.

후술하는 실험예의 결과에 따르면, 생체 시료를 일정 시간(기간) 이상 동결시켜 둠으로써, 해당 생체 시료로부터 구해지는 단백질의 면역학적 측정치가 안정된다. 이 때문에, 생체 시료 중에 포함되는 단백질을 보다 높은 정밀도로 정량하기 위해서는, 생체 시료를 일정 시간(기간) 이상, 바람직하게는 2주간 정도 이상, 동결 상태에 노출시켜 두는 것이 바람직하다. 생체 시료를 2주간 정도 이상, 동결 상태로 해 두는 경우의 동결 온도 조건으로서는 -30℃ 내지 -20℃의 범위를 바람직하게 예시할 수 있다.

(2) 해동 공정

이 공정은 상기 공정에서 동결한 생체 시료를 해동하는 공정이다.

해당 해동 방법은 생체 시료 중에 포함되는 단백질에 악영향 없이 동결한 생체 시료를 해동시키는 방법이면 특별히 제한되지 않다. 구체적으로는 동결한 생체 시료를 용기에 넣은 상태에서 실온 조건에 방치하는 방법, 유수를 가하는 방법, 물에 침지하는 방법, 빙상에 두면서 서서히 해동하는 방법 등을 제한 없이 예시할 수 있다.

상기 (1)과 (2)에 있어서의 동결과 해동의 처리는 1회 행할 수도, 또한 2회 이상의 복수회를 반복하여 행할 수도 있다. 통상은 처리 효율의 면에서 동결과 해동을 1회씩 행하면 되지만, 후술하는 실험예에서 나타내는 바와 같이 동결과 해동(용해)을 반복하더라도 면역학적 측정 결과에 유의한 저하는 보이지 않고, 측정하는 단백질에 악영향은 없다고 인정되기 때문에, 동결과 해동을 복수회 반복하여 행하는 것에 제한은 없다. 이 때문에, 예를 들면 면역학적 측정에 제공하는 생체 시료에 대하여 -80℃보다도 높은 온도 조건, 특히 -70℃ 이상에서의 동결의 유무를 확인할 수 없는 등, 동결 처리의 유무가 불분명할 때에는 다시 동결과 해동을 실시할 수 있다.

또한, 미리 (1)의 공정이 실시된 생체 시료를 입수할 수 있는 경우(예를 들면, 제삼자가 (1)의 공정을 행하고, 그것을 입수하는 경우 등), 본 발명은 (1)과 (2)의 공정을 대신하여 하기 (2')의 공정을 행함으로써 본 발명을 실시할 수 있다:

(2') -80℃보다도 높은 온도 조건, 특히 -70℃ 이상의 온도 조건에서 동결 처리된 생체 시료를 해동한다.

이 때문에, 별도의 측면으로부터 본 발명은 이러한 양태, 즉 상기 (2')의 해동 공정과 (3)의 가용화 공정을 갖는 단백질을 포함하는 생체 시료의 전처리 방법을 제공하는 것이기도 하다. 또한, 상기 (2')에 있어서의 동결 온도나 동결 시간의 조건으로서는 전술한 [0029] 및 [0030]에 기재하는 조건을 마찬가지로 들 수 있다.

(3) 가용화 공정

해당 공정은 면역학적 측정 방법에 제공하는 단백질을 포함하는 생체 시료를 계면 활성제를 이용하여 가용화하는 공정이다.

해당 공정에 있어서의 가용화는 생체 시료에 포함되어 있는 단백질, 특히 막단백질이 가용화되는 상태에 놓이면 되며, 그 한도 내에서 계면 활성제의 첨가 시기는 특별히 제한되지 않다. 예를 들면, 생체 시료를 해동하는 시점, 또는 해동 후에 첨가할 수 있다. 또한, 계면 활성제에 의한 가용화 작용이 동결 해동에 의해 영향을 받지 않고, 또한 동결 해동에 의한 처리 효과가 계면 활성제에 의해 영향을 받지 않으면, 계면 활성제를 동결 전에 미리 생체 시료에 첨가해 두어도 된다.

본 발명에 있어서 사용되는 계면 활성제는 일반적으로 단백질, 특히 막단백질의 가용화 처리에 사용되는 것이고, 바람직하게는 단백질의 가용화 작용이 우수하고, 또한 면역학 측정 결과에 영향을 미치지 않은 비이온성 계면 활성제를 들 수 있다. 비이온성 계면 활성제로서 바람직하게는 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르(Polyoxyethylene Octylphenyl Ether) 및 폴리옥시에틸렌소르비탄모노지방산에스테르(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate)를 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르로서 바람직하게는 폴리옥시에틸렌(8)옥틸페닐에테르(트리톤 X-114), 폴리옥시에틸렌(9)옥틸페닐에테르(NP-40), 및 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르(트리톤 X-100)이고, 보다 바람직하게는 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르(트리톤 X-100)이다.

또한, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노지방산에스테르로서 바람직하게는 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우르산에스테르(특히, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우르산에스테르[트윈 20]), 폴리옥시에틸렌소르비탄모노팔미트산에스테르(특히, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노팔미트산에스테르[트윈 40]), 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아르산에스테르(특히, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노스테아르산에스테르[트윈 60]), 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레산에스테르(특히 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노올레산에스테르[트윈 80])를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우르산에스테르, 특히 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우르산에스테르(트윈 20)이다.

이들 계면 활성제는 모두 상업적으로 입수할 수 있는 것으로, 예를 들면 와코준야쿠고교나 나카라이테스크(주) 등으로부터 구입할 수 있다.

가용화 공정에서 단백질을 함유하는 생체 시료에 배합하는 계면 활성제의 비율로서는 사용하는 계면 활성제의 종류에 따라서도 다르지만, 처리하는 생체 시료100중량% 중의 계면 활성제 농도가 통상 0.0001 내지 30중량%의 범위가 되도록 하는 비율을 예시할 수 있다. 바람직하게는 0.01 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2중량%이다. 또한, 이것을 생체 시료 중에 포함되는 단백질의 총량 100중량부에 대한 비율로 환산하면, 단백질의 총량 100중량부에 대하여 계면 활성제 0.01 내지 30000중량부, 바람직하게는 10 내지 10000중량부, 보다 바람직하게는 100 내지 2000중량부이다.

또한, 가용화 공정에 있어서의 조건으로서는 목적의 단백질, 특히 막단백질이 측정 대상으로 하는 면역학적 활성을 손상시키지 않고 가용화하는 조건이면 된다. 그 한도 내에서 특별히 제한되지 않지만, 통상 pH 4 내지 10의 범위, 바람직하게는 pH 6.5 내지 8.5의 범위; 온도 0 내지 50℃, 바람직하게는 4 내지 37℃의 조건을 들 수 있다.

이상, (1) 내지 (3)의 공정, 또는 (2') 및 (3)의 공정을 행하여 제조된 생체 시료는, 그대로 또는 필요에 따라 고액 분리나 임의의 분획 처리를 실시한 후에 후술하는 면역학적 측정 방법에 제공할 수 있다.

(Ⅱ) 생체 시료에 포함되는 단백질의 면역학적 측정 방법

본 발명은 상기 (Ⅰ)의 전처리가 실시된 생체 시료를 이용하여 해당 생체 시료에 포함되는 단백질, 특히 막단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 방법에 관한 것이다. 여기서 측정이란 생체 시료에 포함되는 단백질을 정성적으로 검출하는 방법, 및 생체 시료에 포함되는 단백질의 양을 정량적으로 측정하는 방법의 어느 하나가 포함된다.

여기서 사용되는 면역학적 방법으로서는 관용의 효소 표지 면역학적 검정법(Enzyme Immunoassay, EIA), 방사 면역 측정(Radioimmunoassay, RIA), 효소 결합 면역 흡착법(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA), 응집법, 비탁법, 혼탁도 측정법, 웨스턴 블롯법 등을 제한 없이 들 수 있고, 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 바람직하게는 ELISA이다.

이들 면역학적 측정 방법은 모두 공지된 관용 방법이고, 예를 들면 이시카와 에이지 저 「엔자임 이뮤노 에세이는 이렇게 개발한다」(생물 화학 실험법), 출판사: 학회 출판 센터(2003/07) 등의 교과서적인 서적이나 문헌에 따라(또는 준하여) 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 면역학적 측정 방법에 사용하는 항체(폴리클로날 항체, 모노클로날 항체)는 간편하게는 상업적으로 입수할 수 있는 것을 사용할 수도 있고, 상업적으로 입수할 수 없는 경우이어도 당업자이면 항체의 제작에 관한 예를 들면 「단백질 실험 핸드북-분리·정제, 질량 분석, 항체 제작, 분자 간 상호 작용 해석 등의 기본 원리와 최신 프로토콜 총집편!」 출판사: 요도사(2003/08) 등의 교과서적인 서적이나 문헌에 따라(또는 준하여) 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직하게는 전술한 본 발명의 전처리를 실시한 인간 유래의 생체 시료, 특히 뇨를 대상으로 하여 해당 생체 시료 중에 포함되는 단백질, 예를 들면 실험예에 나타내는 바와 같이 아쿠아포린(AQP), 바람직하게는 인간 AQP2 등의 막단백질의 양을 면역학적 방법으로 측정하는 방법이다.

면역학적 측정 방법으로서 바람직하게는 ELISA법이다. 예를 들면 ELISA법에 사용하는 AQP에 대한 항체는 정법에 따라 제조할 수 있고, 또한 후술하는 참고 제조예 2 및 3을 참조하여 제조할 수도 있다. 또한, 뇨를 피검 시료로 하는 ELISA법은 후술하는 실험예 1에 기재하는 프로토콜에 따라 실시할 수 있다. 실험예 2에 기재하는 바와 같이 본 발명의 전처리를 실시함으로써, 뇨 중에 포함되는 AQP 등의 막단백질의 양을 높은 정밀도로 또한 효율적으로 검출하는 것이 가능해진다.

<실시예>

이하, 본 발명의 구성과 그 효과를 참고 제조예 및 실험예에 기초하여 설명한다. 단, 본 발명은 이러한 실험예 등에 의해 전혀 제한되는 것이 아니다.

참고 제조예 1 대장균 발현 Trx/His 융합 인간 AQP2의 제조

인간 아쿠아포린 2(AQP2) 유전자를 클로닝하고, 대장균에 발현시켰다. 인간 AQP2 단백은 5회 막관통형 단백으로 271 아미노산을 포함하는 단백질 영역의 분자량이 약 30kD인 단백질이다(Sasaki S, et al., Cloning, characterization, and chromosomal mapping of human aquaporin of collecting duct. Clin. Invest.. 1994; 93(3): 1250-1256.). 또한, 여기서는 인간 AQP2 단백을 N 말단에 Trx 태그를 부가한 상태에서 대장균에 발현시켰다.

그 방법을 요약하면 이하와 같다.

우선 인간 AQP2(271 아미노산)에 상당하는 유전자를 2분할하여 전반 프라이머쌍과 후반 프라이머쌍을 이용하여 PCR 클로닝하였다. 각각의 PCR 산물을 플라스미드에 조립하고, 대장균에 트랜스포메이션하고, 그 핵산 서열을 결정하였다. 그 중에서 와일드 타입의 서열과 동일한 클론 1(전반 부분)과 클론 4(후반 부분)를 선택하고, 중복하는 공통의 제한 효소 사이트(BamHI)로 절단하고, 리가아제로 서로 연결하여 유전자 서열을 얻었다. 다음으로 His 태그 융합 단백 발현 벡터에 AQP2 유전자 서열을 삽입하여 목적의 His 태그 융합 AQP2 발현 벡터(클론 8)를 얻었지만, 충분량의 AQP2 단백을 발현하지 않았기 때문에, N단 부분을 결실한 NcoI-BamHI 핵산 단편을 잘라내고, 티오레독신(Trx) 융합 벡터에 조립하였다. 이 Trx 융합 AQP2 발현 벡터(클론 2와 8)를 대장균에 넣고, 배양하고, IPTG 유도한 결과, Trx 융합 AQP2 단백을 대량으로 발현시키는 것을 알았다.

이 인간 AQP 단백은 시판되고 있는 인간 C단 합성 펩티드로 제조된 항체로 확인하였다.

(1) 인간 AQP2 유전자의 PCR 증폭과 클론화에 대하여

인간 cDNA 라이브러리(QUICK-Clone cDNA Human cDNA, CLONTECH)로부터 인간 AQP2 유전자를 전반 부분(AQP2N: 86-749)과 후반 부분(AQP2C: 562-901)에 분할하여 각 영역에 특이적인 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

구체적으로는 인간 AQP2 유전자의 PCR은 도 1에 나타내는 바와 같이 인간 AQP2 단백(271 아미노산)을 코드하는 영역(86-901)을 BamHI 사이트(position 609)로 N단과 C단에 2분할하여 PCR을 행하였다. 인간 AQP2 유전자 N단 부분(hAQP2/전반 부분, 이하 「hAQP2N」이라 함)의 PCR 프라이머는 개시 코돈으로부터 22 염기(86-107)를 정방향(Forward) 프라이머에(hAQP2N-F: 서열 번호 2), 728-749의 22 염기를 역방향(Reverse) 프라이머에 이용하였다(hAQP2N-R: 서열 번호 3). 또한, 인간 AQP2 유전자 C단 부분(hAQP2/후반 부분, 이하 「hAQP2C」라 함)은 562-583의 22 염기를 정방향 프라이머에(hAQP2C-F: 서열 번호4), 스톱 코돈까지의 21 염기(881-901)를 역방향 프라이머에 이용하였다(hAQP2C-R: 서열 번호 5). hAQP2N-F 및 hAQP2C-R의 5' 말단에는 발현 벡터에 삽입할 때의 제한 효소 사이트를 각각 부가하였다(hAQP2N-F; SphI, hAQP2C-R; HindIII). AQP2 유전자와 전반 부분과 후반 부분에 나눈 프라이머의 설정을 도 1에 나타냈다. PCR의 결과, 추정되는 884bp(hAQP2N 부분)와 340bp(hAQP2C 부분)의 PCR 산물이 얻어졌다.

AQP2N(86-749)의 PCR 산물을 pT7 클로닝 벡터에 조립하고, 대장균에 트랜스폼하여 대장균의 콜로니 1, 2, 3, 5, 6을 얻었다. 이 대장균 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 특이적인 전반 프라이머(NF/NR)를 이용하여 PCR을 행하고, 대장균의 콜로니 1, 3, 5에 목적의 AQP2N(86-749)의 서열이 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 5종류의 플라스미드에 2종류의 제한 효소를 작용시켜 잘라내고, 핵산 단편이 AQP2 유전자 유래의 크기인 것을 확인하였다.

마찬가지로 AQP2C(562-901)도 특이적인 후반 프라이머를 이용하여 증폭하고, 대장균 콜로니 1 내지 6을 조사하고, 모든 콜로니에 유전자가 삽입되어 있는 것을 알았다. 그 중, 5를 제외한 1, 2, 3, 4, 6의 플라스미드를 추출하고, 2종류의 제한 효소도 이용하여 삽입 유전자의 크기를 조사하였다. 5종류의 플라스미드로부터 제한 효소로 추출된 핵산 단편의 크기가 추정되는 2200bp이었기 때문에, AQP22C(562-901)를 포함하는 유전자가 플라스미드에 조립되어 있다고 판단하였다.

베크만-쿨터(Beckman-Coulter)사의 CEQ2000을 이용하여 AQP2N(86-749) 플라스미드 1, 2, 3, 5, 6과 AQP2C(562-901) 플라스미드 1, 2, 3, 4, 6 합계 10종류의 핵산 서열을 결정하고, 각 플라스미드의 핵산 서열과 그에 대응하는 와일드 타입을 비교하였다(도 2). 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이 와일드 타입과 동일한 서열을 갖는 AQP2N(86-749) 플라스미드 1과 AQP2C(562-901) 플라스미드 4를 선택하고, 양 플라스미드를 연결하여 발현용 벡터를 제조하기로 하였다.

(2) His 태그 융합 인간 AQP2 발현 벡터의 구축에 대하여

AQP2N(86-749) 플라스미드 1로부터 SphI-BamHI 프래그먼트, AQP2C(562-901) 플라스미드 4로부터 BamHI-HindIII 프래그먼트를 잘라내고, 리가아제를 이용하여 SphI와 HindIII 부위에서 개환한 His 태그 융합 발현 벡터(pGL80L)에 조립하였다. F2/R 프라이머쌍을 이용하여 콜로니 PCR하여 대장균 콜로니 2, 8에 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

대장균 콜로니 2와 8로부터 플라스미드를 추출하여 AQP2 유전자에 특이적인 2종류의 제한 효소를 이용하여 소정 크기의 핵산 단편(SphI-HindIII: 664bp, SphI-BamHI: 514bp, BamHI-HindIII: 340bp)이 있는지의 여부를 검정하였다. 그 결과, 8에 동일한 핵산 단편이 있고, AQP2 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 재차 8을 베크만-쿨터사의 CEQ2000을 이용하여 핵산 서열을 조사하고, 서열의 치환이나 누락이 없는 것을 확인하였다.

(3) Trx 융합 N단 결손 AQP2 발현 벡터의 구축에 대하여

상기 (2)에서 목적의 His 태그 융합 AQP2 발현 벡터(클론 8)를 얻었지만, 충분량의 AQP2 단백을 발현하지 않았다. 따라서, His 태그 융합 AQP2 발현 플라스미드 8로부터 인간 AQP2 단백의 N단 부분을 결실한 NcoI-BamHI 프래그먼트를 잘라내고, 리가아제를 이용하여 NcoI와 HindIII 부위에서 개환한 Trx 융합 발현 벡터(pET32b)에 조립하였다. F2/R 프라이머쌍을 이용하여 콜로니 PCR하여 대장균 콜로니 2, 8에 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

대장균 콜로니 2와 8로부터 플라스미드를 추출하여 AQP2 유전자에 특이적인 2종류의 제한 효소를 이용하여 소정 크기의 핵산 단편(NcoI-HindIII: 686bp)이 있는지의 여부를 검정하였다. 2와 8에 686bp 핵산 단편이 있고, N단 부분을 결실한 AQP2 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

(4) 대장균으로 Trx 융합 N단 결손 AQP2 단백의 발현에 대하여

Trx 융합 N단 결손 AQP2 발현 벡터 2와 8의 서열에 오류가 없었기 때문에, 각 대장균을 전배양하고, 100mL의 LB 배지 중에 넣고, IPTG(이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드: b-갈락토시다아제의 유도 물질로 Lac 프로모터나 tac 프로모터를 갖는 발현 벡터의 발현 유도제로서 이용함)로 실온 하룻밤 유도하여 Trx 융합 N단 결손 AQP2 단백을 대장균 체내에서 생산시켰다.

대장균은 2종류(2와 8) 배양하고, IPTG 전(유발 전), IPTG 후(유발 후) 그리고 유발 후의 대장균을 가용화하여 불용성 분획과 가용성 분획에 나누고, SDS-PAGE/CBB 염색과 웨스턴용으로 조정하고, 검출은 시판되고 있는 인간 AQP2 합성 펩티드 항체(항인간 AQP2 토끼 혈청, PherMingen)를 이용하였다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이 IPTG 유발 전 2), 7)에는 발현을 확인할 수 없었지만, IPTG 유발 후 3), 8)에는 대량의 Trx 융합 N단 결손 AQP2 단백을 확인할 수 있었다. 이 융합 단백은 대장균의 가용성 분획 5), 10)보다 불용성 분획 4), 9)에 존재하고 있는 점으로부터 인크루젼 바디로서 존재하는 것을 알았다.

이상, 인간 AQP2 유전자를 인간 cDNA로부터 PCR법에 의해 클로닝하고, 얻어진 인간 AQP2 유전자는 와일드 타입과 완전히 일치하는 것을 확인하였다. 또한, 해당 인간 AQP2 유전자를 이용하여 인간 AQP2 단백의 N단의 약 30아미노산을 결손하는 Trx 융합 인간 AQP2 단백을 효율적으로 발현시킬 수 있었다.

이하, 이 단백질을 「대장균 발현 Trx/His 융합 인간 AQP2 단백」 또는 「Trx 융합 인간 AQP2 단백」이라고 한다.

참고 제조예 2 곤충 세포 Sf -9에 발현한 His 태그 부착 인간 AQP2(hAQP2/His/Sf-9)의 제조(도 4(1) 참조)

AQP2의 5' 말단에 His 태그 서열을 부가한 cDNA를 도너 플라스미드 pFastBac1의 멀티 클로닝 사이트에 인서트하였다(pFastBac1-AQP2). 대장균 DH10Bac 컴피턴트 세포를 pFastBac1-AQP2로 트랜스포메이션하였다. Bluo-gal 및 IPTG 첨가 평면 한천(agar plate) 상에서 백색을 나타내는 클론에 대하여 PCR로 AQP2의 Bacmid에 대한 인서트를 확인하였다(재조합 AQP2 Bacmid). 재조합 AQP2 Bacmid를 추출·정제하고, 셀펙틴(CELLFECTIN)(인비트로젠)을 이용하여 Sf-9세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후, 72시간의 배양 상청액을 회수하고, 재조합 바큘로바이러스(Baculovirus) (r바큘로바이러스-AQP2)로 하였다. 배양 상청액 중에 충분한 r바큘로바이러스-AQP2의 Titer가 얻어질 때까지 r바큘로바이러스-AQP2의 Sf-9 세포에 대한 감염·증폭·회수·재감염을 반복하였다. Sf-9 세포에 r바큘로바이러스-AQP2를 감염시키고, 2-4일간 배양한 후, 세포를 회수하였다. 세포를 SDS-PAGE하고, AQP2 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 4(2)에 나타낸다.

참고 제조예 3 인간 AQP2에 대한 토끼 폴리클로날 항체

참고 제조예 1에서 제조한 Trx 융합 인간 AQP2 단백을 정제하여 토끼(종/계통: 토끼/뉴질랜드 백색종, 성별: 암컷, 체중: 3-3.5kg, 입수처: 기타야마 라베스)에 면역하고, 폴리클로날 항체를 제작하였다.

(1) 면역 항원의 제조

면역 항원으로서 참고 제조예 1에 있어서 인간 AQP2 발현이 확인된 대장균으로부터, Ni-NTA 아가로스 겔로 정제한 Trx 융합 인간 AQP2 단백(hAQP2/Trx)을 사용하였다. 면역시에 해당 면역 항원(hAQP2/Trx)을 PBS(-)로 200μg/mL가 되도록 제조하였다. 이 면역 항원 2.5mL를 삼방 활전으로 연결한 2개의 유리 시린지를 이용하여 등량의 완전 프로이드 어주번트(Complete Freund adjuvant)(DIFCO, Cat No.263810)와 혼합하고, 에멀전을 제작하였다.

(2) 폴리클로날 항체의 제조

(2-1) 면역

상기에서 제조한 면역 항원(hAQP2/Trx)을 2주간마다 토끼의 등부 피내에 1mL/body로 다점 면역하였다. 3회째의 면역의 1주간 후에 귓불로부터 부분 채혈을 행하고, 하기 (2-2)에 기재하는 ELISA법으로 항체가를 체크하였다. 또한, 추가 면역을 행하고, 7회째의 면역의 1주간 후에 경동맥으로부터 전 채혈을 행하였다. 채취한 혈액을 3,000rpm, 10분간 실온에서 원심 분리하고, 혈청을 회수하였다. 이 항혈청의 항체가를 하기 (2-2)에 기재하는 ELISA법으로 체크하고, 웨스턴 블로팅에서의 반응성을 검토하였다.

(2-2) ELISA에 의한 항체가의 측정

PBS(-)로 1μg/mL로 제조한 면역 항원(hAQP2/Trx)을 96 웰 플레이트에 100μL/well 뿌리고, 실온에서 2시간 이상 정치한다. 한편, hAQP2/His 발현 Sf-9 세포(hAQP2/His/Sf-9)(참고 제조예 2)에 대해서는 8M 요소/50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 용해한 hAQP2/His 발현 Sf-9 세포(hAQP2/His/Sf-9)를 10μL/well, 96 웰 플레이트에 뿌리고, 100μL/well의 PBS(-)를 첨가하여 실온에서 2시간 이상 정치한다.

플레이트로부터 면역 항원 용액을 제거하고, 0.1% BSA/PBS(-)를 400μL/well 뿌려 실온에서 1시간 이상 블록킹한다(면역 항원 코팅 플레이트, hAQP2/His/Sf-9 코팅 플레이트).

부분 채혈 또는 전 채혈한 항혈청을 0.1% BSA/PBS(-)로 1,000배로 희석하고, 공비 3으로 8단계 희석한다(희석 계열: 1,000배 내지 2,187,000배). 대조 혈청으로서 정상 토끼 혈청(NRS)을 마찬가지로 희석·제조하였다(희석 계열: 1,000배 내지 2,187,000배).

96 웰 플레이트로부터 블록킹 용액을 제거하고, 상기 항혈청 또는 NRS의 희석 계열을 100μL/well 첨가하고, 실온에서 밤새 반응시킨다.

다음날, 96 웰 플레이트를 세정액(0.05% 트윈-20/0.9% NaCl)으로 3회 세정한 후, 0.05% 트윈-20/0.1% BSA/PBS(-)로 10,000배로 희석한 호스라디시 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase; HRP)-염소 항 토끼 IgG(Biosource, Cat. No.ALI3404)를 100μL/well 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시킨다. 다음으로, 플레이트를 세정액으로 5회 세정하고, 기질 희석용 용액(시트르산일수화물 7g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 23.89g/L, 0.015% H₂O₂)에 1mg/mL가 되도록 OPD 태블릿(Sigma, Cat. No.P8287)을 용해한 발색액을 100μL/well 첨가하여 실온에서 5-10분간 발색시킨다. 100μL/well의 2 N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지하고, iEMS Reader MF(Lab systems)로 492nm의 흡광도를 측정한다.

(2-3) 웨스턴 블로팅에서의 반응성의 검토

면역 항원(hAQP2/Trx) 및 Trx/His 대조군(AQP2 부분을 PKD2 단백의 C 단부 743-968에 교체한 것, 즉 PKD2에 Trx/His 태그가 부가된 것)을 2-머캅토에탄올 첨가 전기 영동용 용해 완충액(lysis buffer)으로 10μg/mL로 희석하고, 100℃, 5분간 가열 처리하였다. 이 항원 용액 및 분자량 마커(Bio-Rad, Cat. No.161-0373)를 15% 아크릴아미드 겔에 10μL/well 어플라이하고, 25mA/gel로 전기 영동하였다.

전기 영동 종료 후, 1겔은 CBB G-250 스테인(Bio-Rad, Cat. No.161-0786)으로 염색하고, 나머지 겔은 세미드라이 블로터를 이용하여 0.45㎛ 니트로셀룰로오스 막질(Bio-Rad, Cat. No.162-0115)에 200mA, 1시간으로 전사하였다. 전사 후, 막질을 5% 탈지 우유/50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 침지하여 실온에서 1시간 이상 블록킹하였다. 각 항혈청 및 NRS를 0.1% BSA/PBS(-)로 1,000배로 희석하고, 각각 막질과 실온에서 밤새 반응시켰다.

다음날, 막질을 세정액으로 세정하고, 0.05% 트윈-20/0.1% BSA/PBS(-)로 3,000배로 희석한 HRP-염소 항 토끼 IgG(Biosource, Cat. No.ALI3404)와 실온에서 2시간 반응시켰다. 막질을 세정액으로 세정하고, 발색액에 침지하여 발색시켰다. 발색액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 4.84g, 염화나트륨 5.84g, 농염산 3.36mL를 H₂O에 용해하여 전량을 1L로 하고, 용시, 이 발색액 100mL에 0.3% 4-클로로-1-나프톨/메탄올 20mL, 30% H₂O 260μL를 첨가하여 혼합하였다.

(2-4) 폴리클로날 항체 제조의 결과

도 5에 3회 면역 후에 부분 채혈을 행하고, 혈청의 희석 계열(1,000배-2,187,000배)을 hAQP2/Trx 또는 Sf-9 세포 발현 hAQP2(hAQP2/Trx/Sf-9)를 고상화한 96 웰 플레이트를 이용하여 ELISA를 행한 결과를 나타낸다. (A)는 면역 항원(hAQP2/Trx)에 대한 항체가를 나타내고, (B)는 Sf-9 세포 발현 hAQP2(hAQP2/Trx/Sf-9)에 대한 항체가를 나타낸다. 이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 토끼에 대한 3회의 면역으로 면역 항원에 대한 항체가가 충분히 상승하는 것이 확인되었다.

또한, 도 6에 7회째의 면역 후 전 채혈한 후에 마찬가지로 하여 ELISA 측정을 행한 결과를 나타낸다. (A)는 면역 항원(hAQP2/Trx)에 대한 항체가를 나타내고, (B)는 Sf-9 세포 발현 hAQP2(hAQP2/Trx/Sf-9)에 대한 항체가를 나타낸다. 이 때 얻어진 폴리클로날 항체를, 각각 OPP21401, OPP21402, OPP21403 및 OPP21404라고 명명하였다. 항혈청량은 각각 50mL, 52mL, 50mL, 및 68mL였다. 또한, 최종적인 항체가를 ELISA로 확인한 결과, OPP21403이 가장 높은 항체가를 나타냈다.

또한, 각 폴리클로날 항체에 대하여 웨스턴 블로팅법에 의해 각종 항원(hAQP2/Trx, hAQP2/Trx/Sf-9, Trx/His 대조군)과의 반응성을 검토하였다. 구체적으로는 니트로셀룰로오스 막질에 트랜스퍼한 각 항원(hAQP2/Trx, hAQP2/Trx/Sf-9, Trx/His 대조군)과 1,000배 희석한 항혈청을 반응시키고, 4-클로로-1-나프톨법으로 발색시켰다. 결과를 도 7에 나타낸다. 이것에 나타내는 바와 같이 어느 항체(OPP21401, OPP21402, OPP21403 및 OPP21404)나 hAQP2/Trx뿐만 아니라 hAQP2/His/Sf-9와도 반응하고 있었다. hAQP2/His/Sf-9와의 반응은 OPP21403이 가장 강하였다.

이 점으로부터 상기에서 얻어진 4종류의 폴리클로날 항체 중, Sf-9 세포에 발현시킨 hAQP2와의 반응이 가장 강했던 OPP21403이 생체 유래 검체로부터의 AQP2 검출에 적합하다고 생각된다.

참고 제조예 4 인간 AQP2에 대한 마우스 모노클로날 항체

참고 제조예 1에서 제조한 Trx 융합 인간 AQP2 단백(hAQP2/Trx)을 정제하여 마우스(종/계통: 마우스/Balb/c, 성별: 암컷 및 수컷, 입수처: SLC)의 복강 내에 면역하고, 마우스 골수종 세포(세포주명: P3U1, 입수처: ATCC)와 세포 융합하여 모노클로날 항체를 제작하였다.

(1) 모노클로날 항체의 제조

(1-1) 면역

참고 제조예 3(1)에서 제조한 면역 항원(hAQP2/Trx) 1mL를 2주간 간격으로 3회, 마우스(종/계통: 마우스/Balb/c, 성별: 암컷 및 수컷, 입수처: SLC) 10마리의 복강 내에 면역하였다. 세포 융합의 3일 전에 최종 면역으로서 아쥬반트를 사용하지 않고 약 20μg/body의 hAQP2를 투여하였다.

(1-2) 세포 융합

세포 융합의 1주간 이상 전에 마우스 골수종 세포(세포주명: P3U1, 입수처: ATCC)를 일으키고, 10% FCS/RPMI1640으로 배양하였다. 세포 융합의 당일, 충분한 생존력인 것을 현미경 하에 확인하였다.

상기 (1-1)에서 면역한 마우스(암컷) 1마리를 에테르 마취하고, 70% 에탄올로 소독한 후, 비장을 무균적으로 취출하였다. 이것을 가위로 잘게 썰고, 약 10mL의 RPMI1640 중에서 스틸 메쉬를 통과시켜 걸렀냈다. 이 현탁액을 15mL의 원심관에 옮기고, 원심한 후, 상청을 버리고, 침전물을 손가락으로 탭핑하여 잘 풀었다. 침전물에 0.747% NH₄Cl을 4mL 첨가하고, 가볍게 피펫팅하여 불필요한 적혈구를 용혈시킨 후, RPMI1640을 6-7mL 첨가하여 원심하였다. 또 한번 더 세포를 RPMI1640으로 세정하고, 약 10mL의 RPMI1640에 재부유시켰다.

한편, 50-100mL의 P3U1 배양액을 50mL의 원심관에 옮기고, 원심하여 세포를 모으고, RPMI1640으로 한번 세정한 후, RPMI1640에 재부유시켰다. 비장 세포의 부유액과 P3U1의 부유액을 함께 액량을 약 30mL로 하여 원심하였다. 상청을 버리고, 침전물을 손가락으로 탭핑하여 잘 풀었다. 침전물에 50% PEG 용액(Sigma, Cat. No.P7181) 2mL를 잘 교반하면서 30초에 걸쳐 첨가하고, 또한 30초간 피펫팅하였다. 그 후 2분에 걸쳐 5mL의 RPMI1640을 첨가하고, 또한 5mL의 RPMI1640을 첨가하여 3분간, 37℃에서 정치한 후, 원심하였다.

상청을 버리고, 세포를 약 100mL의 HAT(ICN, Cat. No.1680849) 첨가 10% FCS/RPMI1640에 재부유시키고, 24 웰 배양용 플레이트 4매에 전량을 뿌려 37℃, 5% CO₂(CO₂ 인큐베이터; SANYO, MCO-17AIC)로 배양하였다. 또한, 원심 조건은 전부 실온, 1200rpm, 5분간으로 행하였다.

(1-3) 항체의 스크리닝

세포 융합의 1주간 내지 10일 후, 형성된 콜로니가 플레이트의 바닥부로부터 눈으로 확인할 수 있게 된 시점에서 각 웰로부터 배양 상청의 일부를 얻어 항체의 스크리닝을 행하였다. 제1 스크리닝에서는 배양 상청의 원액을 사용하고, 제2 스크리닝 이후는 배양 상청을 0.1% BSA/PBS(-)로 2.5배로 희석하여 사용하였다.

참고 제조예 3(2)(2-2)에 기재하는 방법과 마찬가지로 하여 제작한 면역 항원 코팅 플레이트 및 hAQP2/His/Sf-9 코팅 플레이트로부터 블록킹 용액을 제거하고, 배양 상청을 100μL/well 첨가하여 실온에서 밤새 반응시켰다.

다음날, 플레이트를 세정액으로 3회 세정한 후, 0.05% 트윈-20/0.1% BSA/PBS(-)로 5,000배로 희석한 HRP-염소 항 마우스 IgG(Bio-Rad, Cat. No.170-6516)를 100μL/well 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 다음으로, 플레이트를 세정액으로 5회 세정하고, 참고 제조예 3(2)(2-2)에 기재하는 방법과 마찬가지의 방법으로 제조한 OPD 태블릿 용해 발색액을 100μL/well 첨가하여 실온에서 10-30분간 발색시켰다. 100μL/well의 2N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지하고, iEMS Reader MF(Lab systems)로 492nm의 흡광도를 측정하였다.

면역 항원 코팅 플레이트, hAQP2/His/Sf-9 코팅 플레이트 모두 양성인 웰을 선택하고, 클로닝을 행하였다.

(1-4) 하이브리도마의 클로닝

하이브리도마의 클로닝은 한계 희석법으로 행하였다.

에테르 마취한 면역 마우스(수컷)를 70% 에탄올로 소독한 후, 비장을 무균적으로 취출하였다. 상기 (1-2)에 기재하는 비장 세포 제조 방법과 마찬가지로 조작하여 피더 세포를 제조하였다. 마우스 1마리분의 비장 세포를 약 40mL의 10% FCS/RPMI1640에 재부유시키고, 96 웰 배양 플레이트 4매에 100μL/well 뿌렸다. 상기 (1-3)에서 양성이였던 웰의 세포를 세포수에 따라 단계 희석하고, 피더 세포를 뿌린 96 웰 배양용 플레이트에 100μL/well 파종하여 37℃, 5% CO₂로 배양하였다.

클로닝과 스크리닝을 수회 반복하고, 스크리닝이 양성이고 현미경으로의 관찰로 단일 클론인 웰을 선택하였다. 이 클론을 한번 더 한계 희석으로 클로닝하고, 다음 스크리닝에서 세포가 존재하는 모든 웰이 양성, 세포가 존재하지 않는 웰이 음성인 것을 확인하였다. 이 플레이트로부터 단일 클론을 선택하고, 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로 하였다.

확립된 하이브리도마를 10% FBS/RPMI1640으로 단계적으로 확대 배양하고, 약 50mL의 세포 배양액(하이브리도마 배양액)으로 하였다. 이 중 약 40mL를 50mL 원심관에 옮기고, 실온, 1200rpm, 5분간으로 원심하여 세포(하이브리도마)를 회수하였다. 이 세포를 셀 벵커(쥬지필드, Cat. No.BLC-1) 3mL에 현탁하고, 크라이오 튜브 3개에 1mL씩 분주하여 액체 질소 중에 보존하였다. 원심 후의 상청은 일부를 4℃에서 보존하고, 항체의 타이핑과 웨스턴 블로팅에 제공하였다.

(1-5) 복수 채취

ELISA 측정계를 제작하기 위해서 사용하는 정제 항체를 얻기 위해서 상기에서 취득한 하이브리도마를 마우스에 투여하여 항체를 대량으로 포함하는 복수를 채취하였다.

구체적으로는 (3-4)에서 제조한 세포 배양액(하이브리도마 배양액) 약 10mL를 실온, 1200rpm, 5분간으로 원심하여 세포(하이브리도마)를 회수하였다. PBS(-)로 한번 세정한 세포를 1.5mL의 PBS(-)에 재부유시키고, 수컷 마우스 3마리의 복강 내에 0.5mL씩 투여하였다. 마우스는 미리 세포 투여의 3일 이상 전에 0.5mL/body의 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸; Sigma, Cat. No.T7640)을 복강 내 투여해 두었다.

세포를 투여한 마우스의 복부가 가장 커졌을 때에 복수를 채취하였다. 1마리분은 무균적으로 채취하고, 실온에서 1200rpm, 5분간 원심하여 상청을 회수한 후, 피더 세포 제조시와 마찬가지로 0.747% NH₄Cl로 침전물의 적혈구를 용혈시켰다. 세포를 RPMI1640으로 세정 후, 셀 벵커 3mL에 현탁하고, 크라이오 튜브 3개에 1mL씩 분주하여 액체 질소 중에 보존하였다. 다른 2마리분의 복수는 실온에서 3000rpm, 10분간 원심하여 상청을 회수하고, 3마리분을 함께 4℃에서 보존하였다.

(1-6) 항체의 타이핑

얻어진 항체를 항마우스 Ig(IgG1, G2a, G2b, G3, M, k쇄, l쇄)(BIONETICS) 항혈청을 이용하여 서브 클래스 및 L쇄를 타이핑하였다.

참고 제조예 3(2)(2-2)와 마찬가지로 제작한 면역 항원 코팅 플레이트로부터 블록킹 용액을 제거하고, (1-4)에서 취득한 배양 상청을 100μL/well 첨가하여 실온에서 밤새 반응시켰다. 다음날, 플레이트를 세정액으로 3회 세정한 후, 0.1% BSA/PBS(-)로 각각 1,000배로 희석한 항마우스 Ig(IgG1, G2a, G2b, G3, M, k쇄, l쇄) 항혈청을 100μL씩 웰에 첨가하였다. 실온에서 2시간 반응 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, 0.05% 트윈-20/0.1% BSA/PBS(-)로 10,000배로 희석한 HRP-염소 항 토끼 IgG를 100μL/well 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 다음으로, 플레이트를 세정액으로 5회 세정하고, 참고 제조예 3(2)(2-2)와 마찬가지로 제조한 OPD 태블릿 용해 발색액을 100μL/well 첨가하여 실온에서 10분간 발색시켰다. 100μL/well의 2 N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지하고, iEMS Reader MF(Lab systems)로 492nm의 흡광도를 측정하였다.

가장 강하게 반응한 것을 이 항체의 서브 클래스 및 L쇄로 하였다.

(1-7) 웨스턴 블로팅에 의한 항체의 특이성의 검토

참고 제조예 3(2)(2-3)와 마찬가지로 웨스턴 블로팅을 행하고, 블록킹한 막질을 (1-4)에서 취득한 배양 상청과 실온에서 밤새 반응시켰다. 다음날, 막질을 세정액으로 세정하고, 0.05% 트윈-20/0.1% BSA/PBS(-)로 3,000배로 희석한 HRP-염소 항 마우스 IgG와 실온에서 2시간 반응시켰다. 막질을 세정액으로 세정하고, 참고 제조예 3(2)(2-2)에 기재되어 있는 방법과 마찬가지로 발색시켰다.

(2) 모노클로날 항체 제조의 결과

이상의 조작으로부터 hAQP2/Trx 면역 마우스 10마리로부터 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 2클론을 확립하였다. 이 하이브리도마를 OPH21401 및 OPH21402, 해당 하이브리도마로부터 생산되는 항체를 OPM21401 및 OPM21402라고 명명하였다. OPM21401, OPM21402 모두 서브 클래스는 IgG1, L쇄는 κ사슬이었다.

이들 항체의 특이성을 웨스턴 블로팅으로 검토한 결과, 도 8에 나타내는 바와 같이 모두 hAQP2/Trx와 hAQP2/His/Sf-9의 양쪽에 반응하고, Trx/His 대조군과는 반응하지 않았다. 이 점으로부터 상기에서 얻어진 2종의 모노클로날 항체는 인간 AQP2에 특이적인 항체라고 생각된다.

(3) 모노클로날 항체의 정제

상기 (1)(1-5)에서 채취한 마우스 복수 2mL에 대하여 결합 완충액(Binding Buffer)(3.3 M NaCl/1.5 M 글리신, NaOH 8.5g/L) 4mL를 첨가하고, 실온에서 2시간 방치한 후, 3,000rpm, 30분, 4℃의 조건으로 원심하고, 상청을 회수하였다. 이 상청을 0.45㎛의 필터로 여과하고, 미리 상기한 결합 완충액으로 평형화해 둔 단백질-A 세파로오스 칼럼에 어플라이하였다. 결합 완충액으로 칼럼을 세정 후, 용출 완충액(Elution Buffer)(Bio-Rad, Cat. No.153-6162)로 용출하고, 즉시 2 M Tris로 중화하였다. 용출액을 0.1 M NaHCO₃에 대하여 투석한 후, 파장 280nm에 있어서의 흡광도를 측정하여 하기 계산식으로 IgG 농도를 구하였다.

IgG 농도(mg/mL)=IgG 용액의 OD₂₈₀값×0.714.

실험예 1 아쿠아포린 2(AQP2) ELISA의 확립

다낭성 신장 질환(Polycystic kidney disease; PKD) 병태를 신속하게 모니터하기 위해서, 그 바이오 마커의 후보 단백의 하나로서 아쿠아포린 2(AQP2)를 이용하고, 그에 대한 항체를 이용한 측정계(ELISA)를 확립하고, 실제로 PKD 병태의 모니터가 가능한지를 검증하였다.

또한, ELISA에는 인간 AQP2 유전자를 클로닝하고, N 말단에 Trx 태그를 부가하여 대장균에 발현·생산시킨 「Trx 융합 AQP2 단백」(참고 제조예 1 참조)을 토끼와 마우스에 각각 면역하여 제작한 폴리클로날 항체(항체명: OPP21403)(참고 제조예 3 참조) 및 모노클로날 항체(항체명: OPM21401)(참고 제조예 4 참조)를 이용하였다.

또한, ELISA의 표준 단백질로서 대장균으로 발현시킨 「GST 융합 hAQP2 단백」을 사용하고, 컨트롤로서 곤충 세포 Sf-9로 발현시킨 His 태그 부착 인간 AQP2 단백 「hAQP2-His/Sf-9」(참고 제조예 2 참조)를 사용하였다.

(1) ELISA 확립을 위한 시험

(1-1) 피검 시료의 처리 조건의 검토

AQP2는 막에 파묻혀 있는 막단백질인 점으로부터 여러 가지 가용화제(요소, 트리톤 X-100, NP-40, 트윈-20, 염산구아니딘, SDS)를 이용하여 AQP2를 막으로부터 가용화하고, 또한 측정계에 영향이 없는 조건을 검토하였다.

구체적으로는 인간 AQP2 단백질이 곤충 세포의 막에 파묻혀 있는 「hAQP2-His/Sf-9」를 PBS에 현탁한 액(hAQP2-His/Sf-9 현탁액)을 각종 가용화제(요소, 트리톤 X-100, NP-40, 트윈-20, 염산구아니딘, SDS)와 등량 혼합하고, 또한 이것을 10% FBS/0.1% BSA/PBS로 10배 희석하여 ELISA를 행하고, 그 발색을 파장 492nm에 있어서의 흡광도로 측정하였다.

결과를 도 9에 나타낸다.

이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 가용화제로서 요소나 염산구아니딘을 사용하는 것보다도 계면 활성제인 트리톤 X-100, NP-40, 트윈-20(이상, 비이온성 계면 활성제), 또는 도데실황산나트륨(SDS, 음이온성 계면 활성제)을 사용하는 쪽이 막으로부터 AQP2를 효율적이고 또한 수율 높게 가용화할 수 있음을 확인할 수 있었다.

(1-2) ELISA 측정계에 있어서의 안정화제의 검토

가용화한 피검 단백질(AQP2)을 ELISA로 안정적으로 측정할 수 있도록 일차 항체와의 반응시에 사용하는 제1 완충액의 검토를 행하였다.

구체적으로는 제1 완충액(0.2% BSA/10 mM EDTA/0.2M Tris-HCl(pH 8.0))에 첨가하는 안정제가 ELISA 측정계의 발색에 악영향을 미치는지의 여부를, 상기 제1 완충액에 각종 안정화제(요소, 트리톤 X-100, NP-40, 트윈-20, 염산구아니딘, SDS)를 각종 농도(1% 농도에 대한 희석율 1배, 1/2배, 1/4배, 1/8배, 1/16배, 1/32배, 1/64배, 1/128배)로 첨가하고, 피검 단백질(AQP2)의 파장 492nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

또한, 피검 단백질로서는 인간 AQP2 단백질이 곤충 세포의 막에 파묻혀 있는 hAQP2/Sf-9의 현탁액을 전술하는 가용화제 SDS로 완전히 가용화하고, 이것을 0.1% BSA/PBS로 SDS의 영향이 없는 2,000배까지 희석한 것을 사용하였다.

결과를 도 10에 나타낸다. 도 10에 나타내는 바와 같이 제1 완충액에 첨가하는 안정화제로서 트리톤 X-100, NP-40, 및 트윈-20 등의 비이온성 계면 활성제는 0.063%(희석율 1/16) 이상의 농도로 측정 감도를 상승시켰지만, 요소, 염산구아니딘, 및 SDS는 발색을 저하시켰다. 이상의 점으로부터 제1 완충액에 첨가하는 안정화제로서 1% 트리톤 X-100이 바람직한 것, 즉 ELISA 측정에 사용하는 제1 완충액으로서 0.2% BSA/10 mM EDTA/2% 트리톤 X-100/0.2M Tris-HCl(pH 8.0)이 바람직하다고 판단되었다.

(1-3) 샌드위치 ELISA에 의한 인간 AQP2 측정계

후술하는 (1-4) 내지 (1-6)에 있어서 ELISA의 표준 단백질의 검토, 피검 시료의 검토, 웨스턴 블롯법과의 비교 검토를 할 때에 하기 ELISA 측정계를 사용하였다.

<인간 AQP2의 ELISA 측정계>

0.1 M NaHCO₃로 5μg/mL 농도가 되도록 제조한 모노클로날 항체(제1 항체; OPM21403)를 96 웰 마이크로 플레이트(NUNC)의 각 웰에 100μL 첨가하고, 뚜껑을 덮어 실온에서 2시간 방치한다. 제1 항체 용액을 플레이트로부터 제거하고, 블록킹 용액(0.1% BSA/PBS(-))을 400μL/well 뿌려 실온에서 1시간 이상 블록킹한다. 이어서, 블록킹 용액을 제1 항체를 고상화한 플레이트로부터 제거하고, 각 웰에 100μL의 제1 완충액(0.2% BSA/2% 트리톤(등록 상표) X-100/10 mM EDTA/200 mM Tris-HCl(pH8.0))을 첨가한 후, 0.1% BSA/PBS(-)로 각 농도로 제조한 표준 단백질 또는 피검 시료를 50μL 첨가하고, 시일로 밀봉하여 실온에서 밤새 진탕한다.

다음날, 플레이트를 세정액(0.05% 트윈-20/0.9% NaCl)으로 3회 세정한 후, 10% 포신 혈청(porcine serum)/0.05% 트윈-20/0.1 M Tris-HCl(pH8.0)로 5000배로 희석한 폴리클로날 항체(제2 항체; OPP21403)를 각 웰에 100μL 첨가하고, 뚜껑을 덮어 실온에서 진탕한다. 2시간 반응 후, 세정액으로 플레이트를 3회 세정한 후, 0.05% 트윈-20/0.1% BSA/PBS(-)로 10,000배에 희석한 호스라디시 퍼옥시다제(HRP)-염소 항 토끼 IgG(Biosource, Cat. No.ALI3404)를 플레이트의 각 웰에 100μL 첨가하고, 뚜껑을 덮어 실온에서 진탕한다. 2시간 후, 세정액으로 플레이트를 5회 세정한 후, TMB 발색액(ScyTek, Cat. No.TM4999)을 각 웰에 100μL 첨가하고, 실온에서 발색시킨다. 10분 후, 플레이트의 각 웰에 TMB 정지 완충액(Stop Buffer)(ScyTek, Cat. No.TSB999)를 100μL 첨가하고, 반응을 정지시킨다. 플레이트의 저면의 오염이나 수분을 유연한 페이퍼 타올로 깨끗히 닦아낸 후, 각 웰의 파장 450nm에 있어서의 흡광도를 마이크로 플레이트용 흡광 광도계(iEMS Reader MF, LABSYSTEMS)로 측정한다.

표준 단백질의 흡광도의 값으로부터 표준 곡선을 작성하고, 또한 해당 표준 곡선으로부터 피검 시료 중에 포함되는 AQP2의 농도를 구한다.

(1-4) 표준 단백질의 검토

표준 단백질로서 대장균 유래의 AQP2와 곤충 세포 유래의 AQP2의 어느 쪽이 ELISA 측정의 표준 단백질로서 적절한지의 여부를 상기 (1-3)의 ELISA 측정계를 이용하여 평가하였다. 또한, 대장균 유래의 AQP2로서 참고 제조예 1에 기재하는 방법으로 제조한 「Trx 융합 AQP2 단백」을 사용하고, 또한 곤충 세포 유래의 AQP2로서 참고 제조예 2에 기재하는 방법으로 제조한 「AQP2-His/Sf9」를 가용화제로 가용화한 가용화물을 사용하였다.

표준 단백질로서 상기한 각 단백질을 사용하여 상기 (1-3)에 기재하는 ELISA 측정을 행하고, 표준 곡선을 작성한 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11에 나타내는 바와 같이 표준 단백질로서 「Trx 융합 AQP2 단백」을 사용한 경우도, 또한 「AQP2/Sf9」의 가용화물을 사용한 경우도, 모두 농도(량) 의존적으로 측정 흡광도와 상관 관계가 인정되고, 양 곡선은 병행이 되는 점으로부터 어느 단백질이나 인간 AQP2의 ELISA 측정의 표준 단백질로서 사용할 수 있는 것이 판명되었다.

(1-5) 피검 시료의 검토

피검 시료로서 건상인 자원 봉사자의 뇨 시료 4검체(4, 5, 6, 및 9)를 단계적으로 희석한 것을 사용하고, 상기 (1-3)에 기재하는 ELISA 측정을 행하였다. 그 결과를, 표준 단백질로서 「Trx 융합 AQP2 단백」을 사용하여 작성한 표준 곡선과 함께 플롯한 결과를 도 12에 나타낸다.

도 12에 나타내는 바와 같이 피검 시료로서 사용한 뇨는 4검체 모두 희석 배율과 측정 흡광도의 사이에 표준 곡선과 마찬가지의 상관 관계가 인정되었다. 이 점으로부터 뇨를 피검 시료로 함으로써 해당 뇨 중에 포함되는 AQP2가 상기 ELISA 측정계에 의해 검출 및 정량 가능한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 건상인 자원 봉사자 10명의 뇨에 대하여 마찬가지로 인간 AQP2의 측정을 행한 결과, 뇨 중의 인간 AQP2 농도는 0.93-8.84ng/mL의 범위였다. 또한, 상기 ELISA 측정계에 있어서의 검출 한계는 0.01ng/mL인 것이 확인되었다.

또한, 도 13의 (A)에 건상인 자원 봉사자 10명의 뇨에 대하여 인간 AQP2에 대한 모노클로날 항체(OPM21401)(참고 제조예 3)를 이용하여 웨스턴 블로팅에 의해 뇨 중의 인간 AQP2량을 측정한 결과를 나타낸다. 또한, 도 13의 (B)에 동일 건상인 자원 봉사자 10명의 뇨에 대하여 상기 ELISA 측정계로 측정한 뇨 중의 인간 AQP2량을 나타낸다. 이들 결과로부터 본 발명의 ELISA 측정계로 측정된 뇨 중의 인간 AQP2량은 웨스턴 블로팅 결과와 거의 상관하고 있는 것이 확인되었다. 또한, 웨스턴 블로팅의 결과로부터 인간 유래의 AQP2에는 당쇄가 부가된 AQP2와 당쇄가 부가되어 있지 않은 AQP2가 존재하고 있는 것이 판명되었다.

(2) AQP2 ELISA의 프로토콜

이상의 검토로부터 각 프로토콜을 갖는 AQP2 ELISA법을 확립하였다.

1. 항AQP2 항체(모노클로날 항체: OPM21401)를 5μg/mL가 되도록 0.1 M NaHCO₃로 희석하고, 각 웰에 100μL씩 분주하여 실온에서 2시간 이상 방치한다.

2. 웰로부터 항AQP2 항체 용액을 제거하고, 350μL의 블로킹 용액(0.1% BSA/PBS(-))을 첨가하고, 사용시까지 4℃에서 보관한다.

3. 항체 고상화 플레이트의 블로킹 용액을 제거하고, 제1 완충액(0.2% BSA/10 mM EDTA/2% 트리톤 X-100/0.2M Tris-HCl(pH 8.0))를 각 웰에 100μL 첨가한다.

4. 8단계(0, 0.01, 0.04, 0.12, 0.37, 1.1, 3.3, 10ng/ml)의 인간 AQP2 표준품과, 측정하는 피검 시료(바람직하게는 뇨)를 소정의 웰에 각각 50μl 첨가하고, 실온에서 2시간 이상, 실온에서 플레이트를 진탕시킨다.

5. 플레이트를 세정하고, 각 웰에 항AQP2 항체(폴리클로날 항체: OPP21403) 용액(5000배 희석)을 100μl 첨가하고, 실온에서 2시간 진탕시킨다.

6. 플레이트를 세정하고, 각 웰에 HRP 표지 항토끼 IgG를 1만배로 희석한 용액을 100μl 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시킨다.

7. 플레이트를 세정하고, 각 웰에 TMB 용액을 100μl 첨가하고, 10분간 반응시킨 후, 2N 황산을 첨가하여 정지시킨다.

8. 흡광도계로 OD450의 값을 구하고, 인간 AQP2 표준품에 의해 제조한 표준 검량선(도 14 참조)으로부터 피검 시료 중의 AQP2 농도를 구한다.

실험예 2 피검 시료의 전처리 조건의 검토 (1)

실험예 1에서 확립한 인간 AQP2 단백의 면역학적 측정법(ELISA법)에 제공하는 피검 시료의 전처리 조건을 검토하기 위해서, 피검 시료로서 뇨를 사용하여 하기 실험을 행하였다. 또한, 뇨는 건상인 자원 봉사자 1명으로부터 채취한 신선 뇨를 사용하였다.

(1) 제1 시험과 그 결과

신선 뇨를 10mL 용량의 튜브 5개에 5ml씩 분주하고, 각각 37℃, 23℃, 4℃, -30℃, 및 -80℃의 조건하(암소)에서, 24시간, 보존하였다. 보존 후, 각 시료를 실온 조건하에 방치하여 실온에 복귀하였다.

이것을 피검 시료로 하여 실험예 1에서 확립한 AQP2 ELISA법을 행하고, 뇨 중의 인간 AQP2의 양을 측정하였다. 또한, 컨트롤로서 상기 신선 뇨의 일부를 이용하여 보존하지 않고 채취 후 빠르게 상기 AQP2 ELISA법을 행하고, 뇨 중의 인간 AQP2의 양을 측정하였다.

상기 대조 시료에 대하여 얻어진 인간 AQP2의 양을 100으로 하여 각 보존 시료에 대하여 얻어진 인간 AQP2의 양의 상대비를 구하였다.

그 결과, 도 15에 나타내는 바와 같이 37℃, 23℃, 4℃, 및 -80℃의 조건하(암소)에서 보존한 뇨 중의 인간 AQP2량은 대조 시료 중의 인간 AQP2량과 비교하여 현저하게 저하되어 있었던 것에 대하여 -30℃에서 보존하고 있던 뇨 중의 인간 AQP2량은 대조 시료 중의 인간 AQP2량과 동일하고, 양의 저하는 전혀 인정되지 않았다.

(2) 제2 시험과 그 결과

제1 시험에서 37℃, 23℃, 4℃, -30℃ 및 -80℃의 조건하(암소)에서 보존하고, 실온에 복귀한 각 뇨 시료를 각각 3개의 튜브에 나누고, 이것을 각각 4℃, -30℃, 및 -80℃의 조건하(암소)에서 24시간, 보존하였다. 보존 후, 각 시료를 실온 조건하에 방치하여 실온에 복귀하였다.

이것을 피검 시료로 하여 상기와 마찬가지로 하여 뇨 중의 인간 AQP2의 양을 측정하고, 제1 시험에서 -30℃에서 보존한 피검 시료로부터 얻어진 인간 AQP2의 양을 100으로 하여 보존 시료에 대하여 얻어진 인간 AQP2의 양의 상대비를 구하였다.

그 결과, 도 15에 나타내는 바와 같이 제1 시험에서 -30℃에서 보존한 피검 시료는 제2 시험에서 -30℃에서 보존하여도, 또한 -30℃ 이외의 온도 조건(4℃, -80℃)에서 보존하여도 뇨 중의 인간 AQP2량의 변화는 거의 보이지 않고 일정하였다. 또한, 제1 시험에서 -30℃ 이외의 온도 조건(37℃, 23℃, 4℃, -80℃)에서 보존한 피검 시료이어도, 제2 시험에서 -30℃에서 보존하면, 뇨 중의 인간 AQP2량이 거의 100이 되고, 한번 -30℃에서 보존하는 것이 AQP2 측정에 중요한 것을 알았다.

(3) 제3 시험, 제4 시험 및 제5 시험과 이들의 결과

제2 시험에서 4℃의 조건하(암소)에서 보존하고, 실온에 복귀한 각 뇨 시료를 각각 3개의 튜브에 나누고, 이것을 다시 4℃의 조건하(암소)에서 24시간 보존하였다. 보존 후, 각 시료를 실온 조건하에 방치하여 실온에 복귀하였다. 이어서, 각 시료로부터 일부를 취출하였다(제3 시험). 또한, 마찬가지로 하여 제4 시험 및 제5 시험을 행하였다.

이들 시험 후(제3 시험, 제4 시험, 제5 시험)의 뇨 시료를 피검 시료로 하여 상기와 마찬가지로 하여 뇨 중의 인간 AQP2의 양을 측정하고, 제1 시험에서 -30℃에서 보존한 피검 시료로부터 얻어진 인간 AQP2의 양을 100으로 하여 상기 피검 시료에 대하여 얻어진 인간 AQP2의 양의 상대비를 구하였다.

그 결과, 도 15에 나타내는 바와 같이 보존 조건이 37℃, 23℃, 4℃, -80℃이면 AQP2값은 상대비 5 이하이고, AQP2를 검출할 수 없고, -30℃의 조건을 1회라도 처치하면 AQP2는 검출할 수 있게 된다. 제1 시험에서 -30℃에서 보존한 피검 시료는 제2 시험 내지 제5 시험의 기간 중 -30℃에서 보존하더라도, 또한 -30℃ 이외의 온도 조건(4℃, -80℃)에서 보존하더라도 뇨 중의 인간 AQP2량의 저하는 거의 보이지 않고, 안정되어 있었다. 또한, 제1 시험이나 제2 시험에서 -30℃ 이외의 온도 조건(37℃, 23℃, 4℃, -80℃)에서 보존한 피검 시료이어도, 제2 시험 이후 또는 제3 시험 이후에 -30℃에서 보존하면 뇨 중의 인간 AQP2량의 저하를 현저하게 억제할 수 있는 것이 확인되었다.

이들 결과는 피검 시료, 특히 뇨를 인간 AQP2 단백의 면역학적 측정법(ELISA법)에 제공하는 경우, 적어도 1회는 해당 피검 시료를 -80℃보다도 높은 온도 조건, 구체적으로는 -70℃ 내지 0℃의 온도 조건, 특히 -30℃ 또는 그 부근(-35℃ 내지 -15℃)의 온도에 동결하는 처치를 실시함으로써 인간 AQP2를 높은 수율로 정밀도 높게 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.

실험예 3 피검 시료의 전처리 조건의 검토 (2)

실험예 1에서 확립한 인간 AQP2 단백의 면역학적 측정법(ELISA법)에 제공하는 피검 시료의 전처리 조건을 검토하기 위해서, 피검 시료로서 뇨를 사용하여 하기 실험을 행하였다. 또한, 뇨는 건상인 자원 봉사자로부터 채취한 신선 뇨를 사용하였다.

건상인 자원 봉사자로부터 채취한 신선 뇨를 7개의 에펜도르프 튜브에 0.5mL씩 분주하고, -20±5℃의 온도 조건하(암소)에서 각각 1일, 3일, 7일, 15일, 21일, 28일, 56일간 동결 보존하였다. 보존 후, 각 시료를 실온 조건하에 방치하여 실온에 복귀하고, 이것을 피검 시료로 하여 실험예 1에서 확립한 AQP2 ELISA법을 행하고, 뇨 중의 인간 AQP2 단백의 양을 측정하였다.

결과를 도 16에 나타낸다. 도 16에 나타내는 바와 같이 -20±5℃의 온도 조건하에서 3일, 7일, 15일, 21일, 28일, 56일간 동결 보존하고 있었던 뇨 중의 인간 AQP2량은 모두 ELISA법으로 측정할 수 있었다. 또한. 그 측정치는 뇨(생체 시료)를 2주간 정도의 일정 기간 이상 동결 상태에 둠으로써 일정한 값이 되어 안정되는 것이 확인되었다. 이들 결과는 피검 시료 특히 뇨를 인간 AQP2 단백의 면역학적 측정(ELISA법)에 제공하는 경우, 해당 생체 시료를 2주간 정도 이상 동결 상태에 노출시켜 둠으로써 생체 시료 중의 인간 AQP2 단백을 정밀도 높게 정량적으로 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다.

상기한 결과를 바탕으로 동결 기간을 2주간에 설정하고, 동결 온도(-80℃, -30℃, -28℃, -26℃, -20℃, 4℃)의 영향을 조사하였다.

구체적으로는 건상인 자원 봉사자 2명으로부터 채취한 신선 뇨(1 및 2)를 각각 6개의 에펜도르프 튜브에 0.5mL씩 분주하고, 각각 -80℃, -30℃, -28℃, -26℃, -20℃, 4℃의 조건하(암소)에서 2주간 보존하였다. 보존 후, 각 시료를 실온 조건하에 방치하여 실온에 복귀하였다. 이것을 피검 시료로 하여 실험예 1에서 확립한 AQP2 ELISA법을 행하고, 뇨 중의 인간 AQP2 단백의 양을 측정하였다.

결과를 도 17에 나타낸다. 도 17에 나타내는 바와 같이 -80℃ 및 4℃의 조건하(암소)에서 2주간 보존한 뇨 중의 AQP2량은 측정 한계 이하였던 것에 대하여 -30℃, -28℃, -26℃, 및 -20℃의 조건하(암소)에서 2주간 보존한 뇨 중의 AQP2량은 모두 ELISA법으로 측정할 수 있었다.

이들 결과로부터 뇨를 인간 AQP2 단백의 면역학적 측정(ELISA법)에 제공하는 경우의 뇨의 동결 처리 조건으로서 동결 기간을 2주간 정도 이상에 설정하고, 또한 동결 온도를 -30 내지 -20℃ 정도에 설정함으로써 뇨 중의 인간 AQP2 단백의 양을 높은 수율로 정밀도 좋게 측정할 수 있는 것이 확인되었다.

<서열표 프리텍스트>

서열 번호 2 및 3은 인간 AQP2 유전자 N단 부분(hAQP2/전반 부분, hAQP2N)을 PCR로 증폭하기 위해서 사용한 정방향 프라이머(hAQP2N-F) 및 역방향 프라이머(hAQP2N-R)의 염기 서열이다. 서열 번호 4 및 5는 인간 AQP2 유전자 C단 부분(hAQP2/후반 부분, hAQP2C)을 PCR로 증폭하기 위해서 사용한 정방향 프라이머(hAQP2C-F) 및 역방향 프라이머(hAQP2C-R)의 염기 서열이다.

SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO MEDICAL AND DENTAL UNIVERSITY <120> Method for pre-treating of biological sample cintaining a protein <130> P12-114 <150> JP 2011-176272 <151> 2011-08-11 <160> 5 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Glu Leu Arg Ser Ile Ala Phe Ser Arg Ala Val Phe Ala Glu 1 5 10 15 Phe Leu Ala Thr Leu Leu Phe Val Phe Phe Gly Leu Gly Ser Ala Leu 20 25 30 Asn Trp Pro Gln Ala Leu Pro Ser Val Leu Gln Ile Ala Met Ala Phe 35 40 45 Gly Leu Gly Ile Gly Thr Leu Val Gln Ala Leu Gly His Ile Ser Gly 50 55 60 Ala His Ile Asn Pro Ala Val Thr Val Ala Cys Leu Val Gly Cys His 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Arg Ala Ala Phe Tyr Val Ala Ala Gln Leu Leu Gly 85 90 95 Ala Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu His Glu Ile Thr Pro Ala Asp Ile 100 105 110 Arg Gly Asp Leu Ala Val Asn Ala Leu Ser Asn Ser Thr Thr Ala Gly 115 120 125 Gln Ala Val Thr Val Glu Leu Phe Leu Thr Leu Gln Leu Val Leu Cys 130 135 140 Ile Phe Ala Ser Thr Asp Glu Arg Arg Gly Glu Asn Pro Gly Thr Pro 145 150 155 160 Ala Leu Ser Ile Gly Phe Ser Val Ala Leu Gly His Leu Leu Gly Ile 165 170 175 His Tyr Thr Gly Cys Ser Met Asn Pro Ala Cys Ser Leu Ala Pro Ala 180 185 190 Val Val Thr Gly Lys Phe Asp Asp His Trp Val Phe Trp Ile Gly Pro 195 200 205 Leu Val Gly Ala Ile Leu Gly Ser Leu Leu Tyr Asn Tyr Val Leu Phe 210 215 220 Pro Pro Ala Lys Ser Leu Ser Glu Arg Leu Ala Val Leu Lys Gly Leu 225 230 235 240 Glu Pro Asp Thr Asp Trp Glu Glu Arg Glu Val Arg Arg Arg Gln Ser 245 250 255 Val Glu Leu His Ser Pro Gln Ser Leu Pro Arg Gly Thr Lys Ala 260 265 270 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer ?hAQP2N-F? <400> 2 gggcatgcat gtgggagctc cgctccatag 30 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer ?hAQP2N-R? <400> 3 cgtagttgta gaggagggag cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer ?hAQP2C-F? <400> 4 ccctgctctc tccataggct tc 22 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer ?hAQP2C-R? <400> 5 ccaagctttc aggccttggt accccgtgg 29

Claims (13)

1. 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법으로서, 하기 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
   (1) 생체 시료를 -80℃보다 높은 온도 조건에서 동결 처리하고,
   (2) 동결한 생체 시료를 해동하고,
   (3) 생체 시료를 계면 활성제를 이용하여 가용화한다.
2. 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 경우의 생체 시료의 전처리 방법으로서, 하기 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
   (2') -80℃보다 높은 온도 조건에서 동결 처리된 생체 시료를 해동하고,
   (3) 생체 시료를 계면 활성제를 이용하여 가용화한다.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체 시료가 인간을 포함하는 동물의 체액인 전처리 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 체액이 뇨인 전처리 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (3)의 가용화 공정에서 사용하는 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제인 전처리 방법.
6. 재5항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르인 전처리 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 면역학적 방법이 ELISA법인 전처리 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 막단백질인 전처리 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 전처리된 생체 시료를 이용하여 해당 생체 시료에 포함되는 단백질을 면역학적 방법을 이용하여 측정하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 면역학적 방법이 ELISA법인 측정 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 생체 시료가 뇨인 측정 방법.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 막단백질인 측정 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 단백질이 아쿠아포린인 측정 방법.

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