KR20110114368A - 녹내장의 분자 진단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VEGF-A(vascular endothelial growth factor-A)의 택일적 스플라이싱(alternative splicing) 이소폼(isoform)인 VEGF-A_165b에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 녹내장 (Glaucoma) 진단용 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 키트는 VCP(valosin-containing protein)에 대한 자가항체에 대한 항원을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 피검 대상의 체액 시료에서 VCP 항원을 이용하여 항-VCP 자가항체와 VEGF-A_165b 이소폼에 특이하게 반응하는 항체를 이용한 면역학적 검사법으로 검출함을 특징으로 한다. 본 발명은 녹내장의 분자진단을 가능하게 하며, 간편하면서도 신속하게 녹내장 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다.

Description

녹내장의 분자 진단{Molecular Diagnosis of Glaucoma}

본 발명은 녹내장 진단키트 및 녹내장 진단 방법에 관한 것이다.

녹내장(glaucoma)이란 안내압이 현저하게 상승하는 질병으로, 안구경화, 망막위축, 유두함몰, 실명 등의 증상이 나타나기도 한다. 눈 안에는 방수라는 액체가 생성되어 눈 밖으로 일정속도로 배출되어야 안압이 유지되는데 이러한 방수의 생성과 배출 경로에 이상이 있을 때 안압이 상승하게 되며, 안압이 높아지면 시신경유두가 뒤로 밀리게 되어 시신경이 손상받는 결과가 초래된다. 시신경의 손상 정도에 따라 시야에 암점이 발생하며 점차 병이 더 진행되면 실명에 이르게 된다. 이러한 녹내장은 개방성 녹내장(open angle glaucoma: OAG)이 가장 흔한 형태로 40대 이후에 주로 발생되고, 나이가 증가하면 더욱 그 발생 빈도가 높아진다. 녹내장은 초기에는 자각 증상이 없고 병 경과가 심해져서야 발견되어 회복이 불가능한 경우가 많다. 녹내장이 안구의 고혈압을 항상 동반하는 것은 아니지만, 많은 녹내장 환자들이 종종 21 mmHg를 넘는 안내압(intraocular pressure)를 보이며, 엑사이머로 근시교정 수술 후 장기적인 스테로이드제 안약투구는 일부환자에서 안압 상승과 함께 스테로이드 유도 녹내장을 유발하기도 한다.

녹내장은 일상 생활양식에서 기인되는 것이 아니며, 전염되지도 않고 생명을 위협받지도 않지만 당뇨병성 망막증과 더불어 가장 흔히 실명을 일으키는 무서운 안질환이다. 특히, 녹내장은 한번 발병되면 이미 손상된 시신경이 다시 복구되지 못하므로 조기 진단과 조기 치료가 중요하다. 현재도 많은 안과의사들이 원인 규명과 효율적인 치료를 위하여 연구하고 있으나, 녹내장에 대한 정확한 병인은 아직 알려져 있지 않고 있다. 다만, 최근 녹내장의 병원인에 유전적인 요소가 중요한 역할을 한다고 보고되어 있다. 또한, 녹내장의 자가면역과의 연계성에 관한 연구가 진행된 바 있으나, 특정 단백질을 이용한 진단이 아닌 자가항체 반응의 패턴의 진단을 보여주고 있을 뿐이다. 그리고 녹내장 병인의 하나로 알려져 있는 안구내 혈류 조절 이상과 혈관 경련 혹은 수축 (vasospasm)은 혈관 내피세포의 기능 이상과 관련되어 있으며, 자가면역 질환이 이 혈관 내피세포 기능이상을 유도할 수 있다고 알려져 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

상기 과제를 달성하기 위해, 본 발명에서는 녹내장 환자에서 특이적으로 나타나는 자가항체를 갖고 있으면서 혈관 기능 이상과 관련된 사이토카인 단백질 발현 패턴의 특이점을 이용하여 녹내장을 진단하는 방법을 제시함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 녹내장 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 녹내장 진단 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 VEGF-A(vascular endothelial growth factor-A)의 택일적 스플라이싱(alternative splicing) 이소폼(isoform)인 VEGF-A_165b에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 녹내장 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 녹내장 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 시료에 있는 녹내장 마커로서의 VEGF-A_165b의 발현을 검출하는 방법을 통해 녹내장 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 녹내장의 발병과 관련된 신규한 바이오 마커를 개발하고자 연구 노력하였고, 결국 녹내장-특이적으로 생성되는 자가항체 1종의 정량적으로 유의한 존재량 확인과 혈관기능과 관련된 사이토카인 이소폼(isoform) 단백질들의 존재비율을 결합시켜 녹내장의 진단방법을 규명하였다.

본 발명은 녹내장을 분자 진단(molecular diagnosis)할 수 있도록 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “녹내장”은 시신경이 손상되는 만성 질환을 의미한다. 보다 구체적으로는 눈 안의 방수의 생성과 배출 경로에 이상이 있을 때 안압이 상승하게 되며, 안압이 높아지면 시신경유두가 뒤로 밀리게 되어 시신경이 손상받는 결과가 초래되는데, 시신경의 손상 정도에 따라 시야에 암점이 발생하며 점차 병이 더 진행되면 실명에 이르게 된다. 또한 시신경유두변화, 시야 변화는 전형적인 개방각녹내장의 소견을 보이지만, 안압이 정상이거나 낮은 경우를 정상안압 녹내장이라 한다. 이 경우에서도 확실하게 알려지지 않은 병인에 의하여 시신경이 손상된다. 특히 정상안압 녹내장은 한국인과 일본인을 비롯한 동양인에게서 높은 빈도로 발생됨이 밝혀져 있다. 녹내장의 증상으로는 안구경화, 망막위축, 유두함몰 및 실명 등이 있다.

본 발명은 녹내장을 의사의 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다.

본 발명의 키트는 VEGF-A의 택일적 스플라이싱(alternative splicing) 이소폼(isoform)인 VEGF-A_165b에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 VEGF-A_165b 특이적 결합제는 항체 또는 앱타머를 포함한다. VEGF-A_165b의 구체적인 아미노산 서열은 서열목록 제2서열에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 VEGF-A_165b 특이적 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 녹내장을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 시료(예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청)를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, VEGF-A_165b에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 녹내장을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 녹내장으로 진단된다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 마커는 녹내장에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커들이 정상세포와 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 녹내장으로 판정한다.

본 발명에 의해 제시되는 녹내장-특이적 자가항체 바이오마커는 VCP(valosin-containing protein)에 대한 자가항체이며, 혈관기능 관련 사이토카인은 택일적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 발현되는 VEGF_165b(vascular endothelial growth factor) 이소폼(isoform) 단백질이다. 본 발명에 따르면, 녹내장이 발병된 경우 VCP에 대한 자가항체 및 VEGF_165b (vascular endothelial growth factor) 이소폼 단백질은 인체 내에 생성되며, 본 발명은 이러한 자가항체와 사이토카인을 검출하여 녹내장을 판별한다. 자가항체의 검출은 자가항체에 특이적으로 결합하는 항원, 즉 VCP 또는 이들의 항원결정기(antigenic determining site)를 이용하여 실시할 수 있으며, VEGF₁₆₅(vascular endothelial growth factor) 이소폼 단백질은 이소폼을 구별할 수 있는 아미노산 모티브에 대한 각각의 결합제(예컨대, 항체 또는 펩타이드 앱타머)를 이용하여 실시할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “항원결정기”는 에피토프에 동일한 의미로 사용되며, 특정 항체 의해 특이적으로 인식되는 항원의 일부분을 의미한다. 항원결정기는 통상적으로 3-30개의 아미노산 서열로 이루어져 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 VCP의 항원결정기는 이들 단백질에 결합하는 자가항체가 이 항원 단백질에 결합하는 위치를 연구함으로써 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 VCP는 바람직하게는 포유동물로부터 유래된 것이고, 보다 바람직하게는 인간, 소, 돼지, 말, 마우스, 래트 및 토끼로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 인간으로부터 유래된 것이다. 본 발명에서 이용되는 VCP는 서열목록 제1서열에 예시되어 있다.

본 발명에서 이용되는 VCP 항원을 유전자 재조합 방법을 통하여 얻는 방법을 예시하면 다음과 같다: VCP를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제조한다. 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 상기 벡터는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터는 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명에서 이용되는 벡터는 그로부터 발현되는 항원의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

상기 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 항원을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 키트는 다양한 녹내장에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 선천성 녹내장, 외상성 녹내장, 녹내장 의증, 고안압증, 원발성 개방우각 녹내장, 정상안압 녹내장,수정체의 가성낙설을 동반한 수정체낭성 녹내장, 만성 단순 녹내장, 저안압 녹내장, 색소성 녹내장, 원발성 폐쇄우각 녹내장, 급성 폐쇄우각 녹내장, 만성 폐쇄우각 녹내장, 간헐성 폐쇄우각 녹내장, 눈의 외상에 속발된 녹내장, 눈의 염증에 속발된 녹내장 또는 약물에 속발된 녹내장에 적용되며, 보다 바람직하게는 원발성 개방우각 녹내장 또는 정상안압 녹내장에 적용된다.

한편, 본 발명의 키트는 스트립 타입의 고체 기질을 이용하는 래피드 키트(rapid kit) 방식으로 개발될 수 있다. 래피드 키트는 일반적으로 고체기질(예컨대, 유리, 유리섬유, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미눔), 금속 옥사이드, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO₂ 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스) 내에서 액상 상태의 시료가 유동 또는 이동하여 작동된다. 통상적으로 래피드 키트는 크로마토그래피 분석 방식으로 불린다. 예를 들어, 검체의 혈청 중에 들어 있는 VEGF-A_165b이 금입자에 결합된 항체와 반응한 다음 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로스막의 미세구멍을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항체 (capture antibody)와 결합하여 발색띠를 형성함으로써 양성ㆍ음성을 육안으로 판별하는 것이다.

본 발명의 방법에 이용되는 시료는, 다양한 생물학적 시료를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 사용할 수 있는 생물학적 시료는 바람직하게는, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 흉선액, 복수 및 양막액 및 세포 조직액을 포함한다. 바람직하게는 본 발명에 적용되는 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 또는 혈청이며, 가장 바람직하게는 혈장이다.

본 발명에 따르면, 간편하면서도 신속하게 녹내장 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 나온 데이터를 근거로 하여 녹내장 관련 약물을 환자에게 처리할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 VEGF가 녹내장환자에서 높게 발현되고 VEGF₁₆₅ 이소폼 단백질 상대적 존재비율이 다름에 기초한다.

(b) 본 발명은 상기 VEGF 이소폼 단백질을 구별하여 특이적으로 결합하는 항체와 VEGF 이소폼 구분 단백질 항원결정기를 이용하여 녹내장의 조기진단 및 분자진단을 가능하게 한다.

(c) 본 발명에 있어서, VCP 자가항체에 대한 검출을 추가적으로 실시하면 녹내장을 보다 정확하게 진단할 수 있다.

(d) 본 발명은 간편하면서도 신속하게 녹내장 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다.

도 1은 정제된 재조합 사람 VCP 단백질에 대한 정상인, 개방각 녹내장환자, 정상 안압 녹내장환자 사람의 혈청에 대한 웨스턴 블롯팅의 결과를 보여준다. 도 1에서 화살표는 10% 아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 한 후 정제된 재조합 사람 VCP 단백질 위치를 보여주고 있으며, B-3은 정상인, B-4는 NTG, B-5는 POAG 환자 혈청과 반응한 사진이다. 정상인과 비교해서 녹내장 환자군에서만 항원-항체반응이 나타났다.
도 2는 항원인 정제된 재조합 사람 VCP 단백질을 96-웰 플레이트에 코팅 후에 정상인, POAG 환자, NTG 환자의 혈액 시료에 들어 있는 항 VCP 항체의 농도를 정량하였다. 정상인의 항 VCP 항체 농도 평균값에 2SD 값을 합친 82.4 ng/ml을 컷-오프 값으로 결정하였다.
도 3a-3b는 ELISA 정량방법을 이용하여 20명의 POAG, 20명의 NTG, 20명의 녹내장이 없는 정상인, 20명의 당뇨망막증 환자 혈청의 비특이적 VEGF-A₁₆₅ 단백질 정량 측정 (도 3a)과 특이적 VEGF-A_165b 정량 측정 (도 3b)을 한 결과 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 웨스턴 블롯팅을 이용한 녹내장 환자에서의 인간 재조합 VCP 단백질에 대한 자가 항체 존재 분석

인간 VCP 단백질 발현과 정제

인간 VCP cDNA 염기서열을 기초로 XhoI 제한효소 반응 자리가 포함된 센스 프라이머 5'-CTCGAGGCTTCTGGAGCCG-3' 와 BamHI 제한효소 반응자리가 포함된 안티센스 프라이머 5'-GGATCCTTAGCCATACAGGTCATCAT-3' 을 준비하였다. 이 두 primer와 인간 VCP cDNA 클론을 템플레이트로 사용하여 PCR 반응을 시킨 후 생산물은 pGEM-T easy 벡터(Invitrogen)에 라이게이션 시켰다. 이 후 이 벡터는 E. Coli DH5a 세포로 형질전환시켰다. TA 라이게이션된 플라스미드 DNA는 상용화된 DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였으며, 정제된 pGEM-T VCP 플라스미드 DNA는 Xho I 과 BamHI 제한효소로 잘라낸 후 상용화된 agarose gel extract kit를 이용하여 추출하였다. 추출된 VCP DNA는 T4 DNA 리가아제를 이용하여 pET15b 벡터(Novagen)에 라이게이션 시킨 후 E. Coli BL21(DE3) 세포에 형질전환 시켰다. pET15b VCP 플라스미드 DNA는 염기서열분석을 통해 확인하였다. 재조합 인간 VCP을 발현하기 위해 형질전환된 박테리아를 LB 배지에서 배양하고 1.0 mM IPTG 로 6시간동안 발현 유도 시켰다. 수확한 박테리아는 우레아 라이시스 완충용액 (8 M 우레아, 5 mM 이미다졸, 150 mM NaCl, 20 mM Tris HCl, pH 7.9)로 파쇄하고, 원심분리한 후 상층액만 Ni^{2 +}-nitrilotriacetic acid Sepharose 친화성 컬럼에 로딩 하고 20배 부피의 우레아 라이시스 완충용액으로 세척하고 10배 부피의 우레아 세척 완충용액 (8M 우레아, 20 mM 이미다졸, 150 mM NaCl, 20 mM Tris HCl, pH 7.9)으로 세척 하였다. 재조합 인간 VCP 단백질은 우레아 용출 완충용액 (8M 우레아, 250 mM 이미다졸, 150 mM NaCl, 20 mM Tris HCl, pH 7.9)으로 컬럼에서 추출해 냈다. 단백질 농도는 브래드포드 분석법으로 측정하였다.

정상인 및 환자의 혈청에 대한 단백질의 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅은 표준방법에 따라 실시하였다(참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 우선 상기에서 정제된 사람 재조합 VCP 단백질 1 ㎍을 10% 아크릴 아마이드 겔에서 전기영동을 한 후, 니트로-셀룰로오스 막으로 옮기고, 탈지분유를 이용하여 블로킹을 하였다. 1차 항체로 정상인 및 각 환자군의 말초혈액으로부터 얻은 혈청을 니트로-셀룰로오스 막에 부착시킨 다음, 2차 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다아제와 결합되어져 있는 사람의 면역글로빈 G를 사용하여 막에 부착한 후, 화학발광키트를(Chemiluminescence substrate kit, GenDEPOT, USA) 이용하여 자가 항체를 확인하였다. 그 결과는 도 1 및 표 1에 정리되어 있다.

정상인과 녹내장환자에서 항 VCP IgG 항체 양성 반응율

구분	POAG	NTG	녹내장 합계	정상인 대조군
환자수	50	30	80	20
양성반응을 보인 환자수	21	7	28	0
양성율 (%)	42.0	23.3	35.0	0

POAG: 개방각 녹내장(Primary open angle glaucoma) 환자

NTG: 정상 안압 녹내장(Normal tension glaucoma) 환자

실시예 2: 정제된 재조합 사람 VCP 를 이용한 ELISA 정량결과

ELISA 정량방법은 표준방법에 따라 실시하였다. 20명의 POAG, 20명의 NTG, 20명의 녹내장이 없는 정상인, 20명의 당뇨망막증 환자 혈청을 시료로 사용하였다. 우선 항원인 정제된 재조합 사람 VCP 단백질을 2 ㎍/ml 농도로 50 mM 소듐 카보네이트 pH 9.6 완충용액에 용해 후 96-웰 플레이트 각 웰에 100 ㎕씩 담고 상온에서 반응시켜 코팅시킨 후 0.1% 카제인으로 블로킹시켰다. 사람 혈액 시료는 블로킹 용액으로 1:10으로 희석하여 넣고 2시간동안 상온에서 반응시켰다. 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 이차항체(Sigma, USA)를 첨가하여 반응시킨 후 TMB(tetramethylbenzidine)을 기질로 발색반응 하였다. 그 결과는 도 2에 정리되어 있다.

실시예 3: 녹내장환자에서 혈액내 VEGF -A ₁₆₅ 와 VEGF -A _165b 존재비율

ELISA 정량방법은 아래 방법에 따라 실시하였다. 20명의 POAG, 20명의 NTG, 20명의 녹내장이 없는 정상인, 20명의 당뇨망막증(diabetic retinopathy: DMR) 환자 혈청을 시료로 사용하였다. ELISA는 비특이성 VEGF-A₁₆₅ 단백질 정량 측정(Human VEGF Immunoassay kit (DVE00), R&D Systems)과 특이한 VEGF-A_165b 정량 측정(Human VEGF₁₆₅b DuoSet kit (DY3045), R&D Systems) 두 가지를 수행하였다. 녹내장환자와 당뇨망막증 환자간의 혈액내 VEGF-A_{non - specific} 와 VEGF-A_165b 존재비율 차이를 계산하였다. 녹내장 환자 혈액 내는 전체 VEGF-A 의 농도가 정상인에 비해 높았으며, 신생혈관과 관련된 안과질환인 당뇨망막증 환자와 비교해서 전체 VEGF-A의 농도는 약간 높은 정도였으나, VEGF-A_165b 특정 이소폼(isoform) VEGF 단백질 농도는 3배 이상 높았다. 그 결과는 도 3 및 표 2에 정리되어 있다.

녹내장환자와 당뇨망막증 환자간의 혈액내 VEGF-A_{non - specific} 와 VEGF-A_165b존재비율

구분	VEGF- Anon - specific	VEGF-A165b
NTG vs. DMR	1.4	3.3
POAG vs. DMR	1.2	3.0

위의 실험 결과는, 녹내장에서 많이 발현되는 VEGF가 암 및 당뇨망막증과 같이 저산소 스트레스에 의한 신생혈관 생성과 관련되어 있지 않고, 안압 상승과 같은 다른 스트레스를 통한 신경세포 손상으로부터 신경세포를 방어하기 위한 기전으로 택일적 스플라이싱(alternative splicing) 이소폼인 VEGF-A_165b가 과발현되어 신경세포 보호역할을 하는 것으로 판단된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

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Claims (7)

1. VEGF-A(vascular endothelial growth factor-A)의 택일적 스플라이싱(alternative splicing) 이소폼(isoform)인 VEGF-A_165b에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하는 녹내장 진단용 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 결합제는 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 VCP(valosin-containing protein)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
   
4. 녹내장 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 시료에 있는 녹내장 마커로서의 VEGF-A_165b의 발현을 검출하는 방법을 통해 녹내장 마커를 검출하는 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 VEGF-A_165b의 발현 검출은 VEGF-A_165b에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 시료는 인간의 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 VCP(valosin-containing protein)에 대한 자가항체의 검출을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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