KR20140068359A - Dual detection confocal fluorescence microscopy apparatus and method of capturing image - Google Patents

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Abstract

An embodiment of the present invention relates to a microscope device and, more specifically, to a dual detection fluorescence confocal microscope device and a method of obtaining an image using the device. In a microscope device to obtain a three-dimensional image of a fluorescent material, provided is a confocal microscope device comprising: a specimen part with a specimen including a fluorescent material and an object lens to observe the specimen; and a detection part with a first pin hole and a second pin hole in different sizes and a first photomultiplier tube (PMT) and a second photomultiplier tube (PMT) to measure a fluorescent signal passing through the first pin hole and the second pin hole, respectively. The detection part finds the height of the specimen through the intensity of each fluorescent signal measured in the first photomultiplier tube and the second photomultiplier tube and obtains the three-dimensional image.

Description

이중 검출 형광 공초점 현미경 장치 및 그 영상을 획득하는 방법{DUAL DETECTION CONFOCAL FLUORESCENCE MICROSCOPY APPARATUS AND METHOD OF CAPTURING IMAGE}[0001] DUAL DETECTION CONFOCAL FLUORESCENCE MICROSCOPY APPARATUS AND METHOD OF CAPTURING IMAGE [0002]

본 발명의 실시 예는 현미경에 관한 것으로, 자세하게는 이중 검출 형광 공초점 현미경 장치와 장치를 이용하여 영상을 획득하는 방법에 관한 것이다.An embodiment of the present invention relates to a microscope, and more particularly, to a method for acquiring an image using a dual detection fluorescence confocal microscope apparatus and an apparatus.

기존의 공초점 현미경은 보통 하나의 핀홀을 사용하여 신호의 강도를 측정한다. 이때 Axial Response Curve(축방향 응답 곡선)가 intensity와 축방향 거리로 나타나는데, 초점 평면에서 가장 강한 강도의 신호가 측정되고 초점 평면에서 벗어날수록 측정되는 빛의 세기는 감소한다. 공초점 현미경은 NA(Numerical Aperture)가 높은 대물렌즈를 사용하여 Axial Response Curve의 반치폭을 축방향 분해능으로 사용한다. 따라서 3차원 영상을 측정하기 위해서 초점평면을 이동시키며 축적된 평면 영상을 쌓아서 복원한다. 여기서 초점 평면을 이동시키는 기계적인 구동기가 필요하다.Conventional confocal microscopes usually measure the intensity of a signal using a single pinhole. At this time, the Axial Response Curve is shown as the intensity and axial distance. The strongest signal in the focal plane is measured and the intensity of the measured light decreases as it goes out of the focal plane. The confocal microscope uses the half-width of the axial response curve as the axial resolution using an objective lens with a high NA (Numerical Aperture). Therefore, in order to measure the 3D image, the focus plane is moved and the accumulated plane image is accumulated and restored. There is a need for a mechanical actuator to move the focus plane here.

하나의 핀홀을 사용하여 구한 Axial Response Curve가 나타내는 신호의 세기와 축방향 거리의 관계를 이용하여 깊이 분별력을 갖기 위해서는 측정 대상이 항상 일정한 빛을 방출할 때만 가능하다. 하지만 형광 신호는 그 신호의 세기가 일정하지 않다. 따라서 측정 대상의 깊이와 상관없이 방출되는 형광 빛이 강할 경우 강한 강도의 신호가 측정되므로, 형광물질이 같은 깊이에 있더라도 강한 빛을 방출하면 신호 세기가 크게 측정되어 초점평면에 가까이 있는 것으로 인식되며 약한 형광 빛을 방출하면 초점평면에서 멀리 벗어난 것으로 인식되는 문제가 있다.In order to obtain the depth discrimination power by using the relationship between the intensity of the signal and the axial distance represented by the axial response curve obtained by using one pinhole, it is possible only when the measurement object always emits a constant light. However, the intensity of the signal is not constant. Therefore, even if the fluorescent material is at the same depth, if the emitted fluorescent light is strong regardless of the depth of the object to be measured, if the fluorescent material emits strong light, the signal intensity is measured to be close to the focus plane, There is a problem that emitting fluorescence light is perceived as being far from the focus plane.

본 발명의 실시예를 설명하기에 앞서, 관련도가 높은 기존의 현미경에 대해서 설명하고자 한다.Before describing an embodiment of the present invention, a conventional microscope having high relevance will be described.

공초점 주사 현미경: 공초점 현미경은 광 검출기 앞에 핀홀을 위치시켜 대물렌즈의 초점 평면에서 방출된 빛은 핀홀을 통과하고 초점에서 벗어난 평면에서 방출된 빛은 핀홀에 차단되어 초점 영역의 신호만을 받아들일 수 있다. 따라서, 시편의 손상 없이 광학적 절편 영상을 획득할 수 있고 대물렌즈를 광축 방향으로 이송시키거나 시편을 광축 방향으로 이송시키면서 광학적 절편 영상을 연속적으로 획득하면 시편의 3차원 영상을 획득할 수 있다. 하지만 3차원 영상을 얻기 위해서는 일반적으로 수 십장 이상의 광학적 절편 영상을 획득해야 하기 때문에 영상 획득 시간이 오래 걸리고 과도한 레이저 빛을 조사하여 광 탈색(photo bleaching) 현상이 발생할 위험이 높으며, 기계적 이송을 위해 시스템의 크기가 커지고 복잡해 지는 문제점이 존재한다.Confocal Scanning Microscope: A confocal microscope places a pinhole in front of a photodetector so that light emitted from the focal plane of the objective lens passes through the pinhole and light emitted from the plane out of focus is blocked by the pinhole, . Therefore, it is possible to acquire an optical slice image without damaging the specimen, and acquire a three-dimensional image of the specimen by successively acquiring the optical slice image while transferring the objective lens in the optical axis direction or transferring the specimen in the optical axis direction. However, in order to acquire three-dimensional images, it is generally necessary to acquire optical slice images of several tens or more, so that it takes a long time to acquire images, and there is a high risk of photo bleaching due to excessive laser light irradiation. There is a problem in that the size of the antenna becomes large and complicated.

미분 공초점 현미경: 미분 공초점 현미경은 시편에서 반사되어 광 검출기를 향하는 빛을 광 분리기로 나눈다. 한 광 검출기 앞의 핀홀은 대물렌즈의 공액초점 위치 보다 멀리 위치하며, 다른 핀홀은 대물렌즈의 공액초점 위치 보다 가까이 위치한다. 핀홀이 대물렌즈 공액초점에서 벗어난 거리만큼 축방향 응답곡선도 이동하므로 두 개의 축방향 응답곡선의 차로 새로운 곡선을 얻으며, 이 곡선이 빛의 세기와 빛이 반사되는 시편의 높이의 관계를 나타내므로 두 광 검출기로 검출한 빛의 세기의 차를 측정하여 빛이 반사되는 시편의 높이를 직접 측정할 수 있다. 하지만 반사형 현미경으로만 사용되는 반면 형광 신호의 양자 수율(Quantum Yield)의 특성이 있기 때문에 시편 내의 형광 입자의 깊이 측정이 어렵다.Differential confocal microscope: The diffractive microscope is divided by the light separator into the light that is reflected from the specimen and directed to the photodetector. The pinhole in front of one photodetector is located farther away from the conjugate focus position of the objective lens and the other pinhole is located closer to the conjugate focus position of the objective lens. Since the axial response curve is shifted by the distance that the pinhole deviates from the conjugate focus of the objective lens, a new curve is obtained by the difference between the two axial response curves. This curve shows the relationship between the intensity of light and the height of the specimen The height of the specimen reflected by the light can be measured directly by measuring the difference in intensity of the light detected by the photodetector. However, it is difficult to measure the depth of fluorescent particles in a specimen because it has a characteristic of quantum yield of fluorescent signal, while it is used only as a reflection type microscope.

스펙트럼 영역의 형광 간섭 단층촬영기: 형광신호의 자가간섭을 측정하여 형광물질의 깊이를 측정하는 방식이다. 투과형 시편을 조명하여 발생한 형광 신호를 다른 두 경로로 진행시키는데, 다른 경로로 진행한 두 형광 빛을 간섭시킨 빛의 스펙트럼을 관찰하고, 스펙트럼의 위상 변화로 형광 입자의 위치 측정 가능하나 시스템의 구성이 복잡하고, 시편의 샘플링이 요구되며 생체 내에서(In-vivo) 이미징이 힘들다.Fluorescence coherence tomography in the spectral region: Measures the depth of the fluorescent material by measuring the self interference of the fluorescence signal. The fluorescence signal generated by illuminating the transmission type specimen is propagated to the other two paths. It is possible to observe the spectrum of the light interfering with the fluorescence light proceeding to the other path, and to measure the position of the fluorescent particle by the phase change of the spectrum. It is complicated, requiring sampling of the specimen and in-vivo imaging is difficult.

본 발명의 일실시예는 형광물질로부터 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 형광 신호 영상을 고속 측정할 수 있는 광학 측정 시스템을 개발하고자 한다.One embodiment of the present invention is to develop an optical measurement system capable of measuring a three-dimensional fluorescent signal image at high speed using a fluorescence signal emitted from a fluorescent material.

자세하게는, 공초점 현미경 장치를 개발하여 기계적인 이송 없이 깊이 분별력을 가지며, 고속으로 3차원 영상의 획득이 가능하도록 하며, 이에 현미경의 시편으로 입사된 빛의 광축 위에 위치한 형광물질의 깊이의 측정이 가능하도록 하는데 본 발명의 목적이 있다.In detail, a confocal microscope device was developed to enable the acquisition of three-dimensional images at high speed with depth discrimination power without mechanical transfer, and the measurement of the depth of the fluorescent material located on the optical axis of the light incident on the specimen of the microscope The present invention has been made to solve the above problems.

형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서, 형광물질을 포함하는 시편과 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및 크기가 다른 제1 핀홀과 제2 핀홀을 구비하고 있으며, 제1 핀홀과 제2 핀홀을 각각 통과한 형광 신호의 세기를 측정하는 제1 검출기(Photomultiplier tube, PMT)와 제2 검출기를 구비한 검출부를 포함하고, 검출부는 제1 검출기와 제2 검출기에서 측정한 각 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치가 제공될 수 있다.A microscope apparatus for obtaining a three-dimensional image of a fluorescent material, comprising: a specimen unit including a specimen including a fluorescent material and an objective lens for observing the specimen; And a second detector (PMT) having a first pinhole and a second pinhole different in size from each other and measuring the intensity of the fluorescence signal passed through the first pinhole and the second pinhole, respectively, and a second detector Wherein the detection unit obtains the height of the specimen through the intensity of each fluorescence signal measured by the first detector and the second detector, and acquires a three-dimensional image.

일측에 있어서, 검출부는 시편에서 방출하는 형광 신호를 나누어 제1 핀홀과 제2 핀홀로 전달하는 빔 스플리터(Beam Splitter)를 포함하고, 빔 스플리터는 형광 신호의 크기를 나누어 전달할 수 있다.In one aspect, the detection unit includes a beam splitter that divides the fluorescence signal emitted from the specimen and transfers the separated fluorescence signal to the first pinhole and the second pinhole, and the beam splitter can divide and transmit the magnitude of the fluorescence signal.

또 다른 측면에 있어서, 검출부는 제1 검출기로부터 측정한 신호의 세기와 제2 검출기로부터 측정한 신호 세기 비율을 측정하고, 반치폭이 다른 두 개의 축방향 응답 곡선을 획득하며, 축방향 응답 곡선에 신호 세기 비율을 대입하여 시편의 높이를 측정할 수 있다.In another aspect of the present invention, the detector measures the intensity of the signal measured from the first detector and the signal intensity ratio measured from the second detector, acquires two axial response curves with different half widths, The height of the specimen can be measured by substituting the intensity ratio.

또 다른 측면에 있어서, 축방향 응답 곡선은 실험 또는 수식을 통해서 획득하며, 교정 과정을 거쳐 미리 획득할 수 있다.In another aspect, the axial response curve is obtained through experiments or formulas and can be obtained in advance through a calibration procedure.

또 다른 측면에 있어서, 축방향 응답 곡선은 반치폭을 축방향 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하면, 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 신호의 세기가 달라질 수 있다.In another aspect, if the axial response curve is regarded as an axial measurement range without considering the half width as an axial resolution, the intensity of the signal measured may vary depending on the distance between the specimen and the focal plane.

또 다른 측면에 있어서, 검출부는 각 형광 신호의 세기를 측정할 때엔 형광 신호가 방출되는 위치와 제1 핀홀, 제2 핀홀의 크기, 그리고 양자 수율이 고려될 수 있다.In another aspect of the present invention, when the intensity of each fluorescence signal is measured, the detection unit can consider the position where the fluorescence signal is emitted, the size of the first pinhole, the size of the second pinhole, and the quantum yield.

또 다른 측면에 있어서, 검출부는 시편을 초점 평면의 이동 없이 횡방향으로 스캔함으로써 3차원 시편의 영상을 복원할 수 있다.In yet another aspect, the detector can reconstruct the image of the three-dimensional specimen by scanning the specimen in the lateral direction without movement of the focal plane.

또 다른 측면에 있어서, 형광 신호는 레이저의 평행광이 시편부의 시편에서 방출되어 생성되며, 공초점 현미경 장치는 공진형 스캐너 또는 갈바노 거울을 포함하여 레이저의 평행광을 시편에 입사시켜 2차원 평면 스캐닝을 할 수 있다.In another aspect, a fluorescence signal is generated by emitting a parallel light of a laser from a specimen of a specimen portion, wherein the confocal microscope device includes a resonant scanner or a galvano mirror to cause parallel light of the laser to enter the specimen, Scanning can be performed.

또 다른 측면에 있어서, 공초점 현미경 장치는 특정 파장 기준으로 빛을 반사하고 통과시키는 반투과 거울로 구성되는 다이크로익 미러와 에미션 필터(Emission Filter)를 포함하고, 다이크로익 미러와 에미션 필터를 통해 형광 신호를 검출부로 전달 할 수 있다.In yet another aspect, a confocal microscope apparatus includes a dichroic mirror and an emission filter, which are composed of a semi-transmissive mirror that reflects and passes light at a specific wavelength reference, and includes a dichroic mirror and an emission The fluorescence signal can be transmitted to the detector through the filter.

형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서, 형광물질을 포함하는 시편과 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및 크기가 다른 복수 개의 지점에 대한 형광 신호의 세기를 측정하는 측정 장치를 포함하고, 측정 장치는 측정한 형광 신호의 세기를 이용하여 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치가 제공될 수 있다.A microscope apparatus for obtaining a three-dimensional image of a fluorescent material, comprising: a specimen unit including a specimen including a fluorescent material and an objective lens for observing the specimen; And a measuring device for measuring the intensity of the fluorescent signal with respect to a plurality of points having different sizes, wherein the measuring device obtains the height of the specimen using the intensity of the measured fluorescence signal and acquires a three-dimensional image A confocal microscope device may be provided.

일측에 있어서, 크기가 다른 복수 개의 지점은 제1 지점과 제2 지점으로 구분되는데, 제1 지점은 크기가 작은 핀홀 역할을 하고, 제2 지점은 제1 지점을 포함하고 있으며, 크기가 큰 핀홀의 역할을 할 수 있다.In one side, a plurality of points having different sizes are divided into a first point and a second point, the first point serving as a small pinhole, the second point including a first point, It can serve as a hall.

또 다른 측면에 있어서, 측정 장치는 CCD(Charge Coupled Device)에 해당하고 제1 지점과 제2 지점은 픽셀 단위로 구성되는데, 측정 장치는 제1 지점의 픽셀에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 제1 지점의 주변 픽셀을 포함하는 제2 지점의 픽셀에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분할 수 있다.In another aspect, the measuring device corresponds to a CCD (Charge Coupled Device), and the first point and the second point are configured in pixel units. The measuring device measures the intensity of the fluorescent signal at the pixel at the first point, It is possible to integrate the intensity of the fluorescence signal measured at the pixel at the second point including the surrounding pixels at one point.

또 다른 측면에 있어서, 측정 장치는 Detector array(배열 검출기)에 해당하고, 상기 제1 지점과 제2 지점은 센서 단위로 구성되는데, 측정 장치는 제1 지점의 센서에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 제1 지점의 주변 센서를 포함하는 상기 제2 지점의 센서에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분할 수 있다.In yet another aspect, the measuring device corresponds to a detector array, wherein the first point and the second point are configured in a sensor unit, wherein the measuring device measures the intensity of the fluorescent signal at a sensor at the first point , The intensity of the fluorescence signal measured by the sensor at the second point including the peripheral sensor at the first point can be integrated.

현미경 장치에서 형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 방법에 있어서, 형광물질을 포함하는 시편에서 방출되는 형광 신호를 검출부로 전달하는 단계; 및 검출부 내의 제1 핀홀과 제2 핀홀에 전달된 형광 신호를 각각 통과시켜 각각의 형광 신호의 세기를 측정하는 단계; 및 검출부에서 측정한 각각의 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고 3차원 영상을 획득하는 단계를 포함하는 3차원 영상 획득 방법이 제공될 수 있다.A method for obtaining a three-dimensional image of a fluorescent material in a microscope apparatus, comprising: transmitting a fluorescent signal emitted from a specimen containing a fluorescent material to a detection unit; And measuring the intensity of each fluorescence signal by passing the fluorescence signal transmitted to the first pinhole and the second pinhole in the detection unit, respectively; And obtaining a height of the specimen through the intensity of each fluorescence signal measured by the detector and acquiring a three-dimensional image.

본 발명의 일실시예를 통해, 형광물질로부터 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 형광 신호 영상을 고속 측정할 수 있는 광학 측정 시스템을 개발할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, an optical measurement system capable of measuring a three-dimensional fluorescent signal image at high speed using a fluorescence signal emitted from a fluorescent material can be developed.

또한, 공초점 현미경 장치를 개발하여 기계적인 이송 없이 깊이 분별력을 가지며, 고속으로 3차원 영상의 획득이 가능한 현미경 장치를 제공할 수 있고, 이에 현미경의 시편으로 입사된 빛의 광축 위에 위치한 형광물질의 깊이의 측정이 가능하게 될 수 있다.In addition, it is possible to provide a microscope apparatus capable of obtaining a three-dimensional image at high speed with a depth discriminating power without mechanical transfer by developing a confocal microscope apparatus, and it is possible to provide a microscope apparatus capable of obtaining a three- Depth measurement can be made possible.

더불어, 본 발명의 실시예를 통해 영상 기기의 활용도를 더욱 높일 수 있으며, 장치의 구조가 단순하기 때문에 살아있는 생체 내에서 관찰이 가능하다.In addition, through the embodiments of the present invention, utilization of the video apparatus can be further enhanced, and since the structure of the apparatus is simple, it can be observed in living living bodies.

그리고, 제안하는 현미경 장치에 큰 핀홀을 추가적으로 사용하여 형광 영상의 효율을 향상시키는 효과를 가져올 수 있다.In addition, a large pinhole is additionally used in the proposed microscope apparatus, thereby improving the efficiency of the fluorescence image.

도 1은 본 발명의 일실시예에 있어서, 3차원 형광 영상을 획득하는 공초점 현미경 장치의 구성을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 있어서, 두 개의 핀홀을 통해 획득할 수 있는 축방향 응답 곡선의 비율을 설명하기 위한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 있어서, 축방향 응답 곡선의 비율을 이용하여 형광 신호의 강도에 따른 시편의 높이를 구하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치의 다른 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치의 또 다른 구성의 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치에서 3차원 영상을 획득하기 위한 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.1 is a view for explaining a configuration of a confocal microscope apparatus for acquiring a three-dimensional fluorescence image, according to an embodiment of the present invention.
2 is a graph for explaining the ratio of the axial response curve that can be obtained through two pinholes in one embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a view for explaining a method of obtaining a height of a specimen according to the intensity of a fluorescence signal using a ratio of an axial response curve in an embodiment of the present invention. FIG.
4 is a view for explaining another embodiment of the confocal microscope apparatus according to an embodiment of the present invention.
5 is a view for explaining another embodiment of the confocal microscope apparatus according to the embodiment of the present invention.
6 is a flow chart for explaining a method for acquiring a three-dimensional image in a confocal microscope apparatus, according to an embodiment of the present invention.

이하, 3차원 영상을 획득하기 위한 공초점 현미경 장치와 3차원 영상을 획득하는 방법에 대해서 첨부된 도면을 참조하여 자세히 설명한다.Hereinafter, a confocal microscope apparatus for acquiring a three-dimensional image and a method for acquiring a three-dimensional image will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

도 1은 본 발명의 일실시예에 있어서, 형광물질의 3차원 영상을 획득할 수 있는 공초점 현미경 장치의 구성을 나타낸 것이다. 실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치(100)는 형광물질을 포함하는 시편(111)과 시편(111)을 관찰하기 위한 대물렌즈(112)를 포함하고 있는 시편부(110)와 시편(111)에서 방출된 형광 신호를 이용하여 시편(111)의 3차원 영상을 검출해내는 검출부(120)가 포함되어 구성될 수 있다.FIG. 1 illustrates a configuration of a confocal microscope apparatus capable of obtaining a three-dimensional image of a fluorescent material, according to an embodiment of the present invention. The confocal microscope apparatus 100 includes a specimen portion 110 including a specimen 111 including a fluorescent material and an objective lens 112 for observing the specimen 111 and a specimen 111, And a detection unit 120 for detecting a three-dimensional image of the test piece 111 by using the fluorescence signal emitted from the sample.

그리고 검출부(120)는 전달된 형광 신호를 크기가 다른 두 개의 핀홀인 제1 핀홀(121)과 제2 핀홀(123)로 분할하여 전달하는 빔 스플리터(Beam Splitter)(125)가 포함되어 있으며, 제1 핀홀(121)과 제2 핀홀(123)을 통과한 형광 신호는 제1 검출기(122)와 제2 검출기(124)에서 측정되어 형광 신호의 세기를 추출할 수 있다. 이에 두 개의 검출기(122, 124)에서는 서로 다른 광축 방향 신호를 동시에 획득할 수 있는데, 이 신호를 이용하여 두 개의 축방향 응답 곡선을 도출해낼 수 있으며, 두 개의 축방향 응답 곡선을 나눈 새로운 응답 곡선(126)을 획득할 수 있다.The detection unit 120 includes a beam splitter 125 for dividing the transmitted fluorescence signal into a first pinhole 121 and a second pinhole 123 which are two pinholes of different sizes, The fluorescence signal having passed through the first pinhole 121 and the second pinhole 123 can be measured by the first detector 122 and the second detector 124 to extract the intensity of the fluorescence signal. The two detectors 122 and 124 can simultaneously acquire different optical axis direction signals, which can be used to derive two axial response curves, and a new response curve divided by two axial response curves (126).

본 발명의 이중 검출 형광 공초점 현미경 장치(100)에서 빛이 어떻게 이동하는지, 실시예에 대해서 더 자세히 설명한다.The embodiment will be described in more detail as to how light travels in the dual detection fluorescence confocal microscope apparatus 100 of the present invention.

현미경 장치(100)의 광원(101)으로는 488nm 파장의 레이저를 선택적으로 사용할 수 있다. 광원(101)의 레이저는 먼저 시편(111)으로 입사되는데, 레이저에서 발생한 빛은 콜리메이터(Collimator)에서 평행광으로 만들어지는데, 만들어진 평행광은 여기 필터(Excitation Filter)를 거치는데, 여기 필터는 입사하는데 적합한 파장을 선택적으로 통과시키고, 노이즈를 억제하여 감소하도록 하는 필터이다. 여기 필터를 통과한 평행광은 다이크로익 미러(Dichroic Mirror)(103)에 반사되어 진행방향이 변경된다.As the light source 101 of the microscope apparatus 100, a laser having a wavelength of 488 nm can be selectively used. The laser beam from the light source 101 is first incident on the specimen 111. The light emitted from the laser beam is collimated by a collimator. The collimated light is passed through an excitation filter, And selectively suppressing the wavelength to suppress the noise. The parallel light having passed through the excitation filter is reflected by the dichroic mirror 103, and the traveling direction is changed.

본 발명의 광학 시스템, 즉 현미경 장치(100)에서 2차원 스캐닝은 공진형 스캐너(CRS) 또는 갈바노 거울(Galvano Mirror)(102)로써 구현할 수 있다. 여기서, 공진형 스캐너는 정해진 구간에서 공진 주파수로 진동하면서 갈바노 거울(102)은 전기적 신호로 받게 되고 이 신호에 의해서 거울이 회전되는데, 다이크로익 미러(103)와 갈바노 거울(102)의 회전축이 직각이 되도록 위치시켜서 입사되는 평행광이 두 거울에 순서대로 반사되면, 시편을 X 방향과 Y 방향으로 커버하는 2차원적 스캐닝을 수행할 수 있다.The two-dimensional scanning in the optical system of the present invention, that is, the microscope apparatus 100, can be implemented with a resonant scanner (CRS) or a Galvano mirror (102). In this case, the resonance type scanner vibrates at a resonance frequency in a predetermined section, and the galvano mirror 102 is received as an electrical signal. The mirror rotates by the signal, and the dichroic mirror 103 and the galvano mirror 102 When the incident light is sequentially reflected on the two mirrors, the two-dimensional scanning can be performed to cover the specimen in the X and Y directions.

한편, 공진형 스캐너와 갈바노 거울(102)에 반사되어 진행 경로가 변경된 평행광은 중계 렌즈에 입사되어 평행광의 중심이 대물렌즈(112)에 맺히게 된다. 실시예에 있어서, 중계렌즈는 대물렌즈의 구경 중심을 향하도록 빛의 방향을 조절하는 렌즈이며, 이때 중계렌즈의 배율은 대물렌즈의 구경에 적합하도록 조절 될 수 있다. 또한, 평행광은 대물렌즈(112)를 통과하여 형광물질을 포함하는 시편(111)에 입사된다.On the other hand, the collimated light reflected by the resonance type scanner and the galvanometer mirror 102 and having a changed travel path is incident on the relay lens, and the center of the parallel light is converged on the objective lens 112. In the embodiment, the relay lens is a lens that adjusts the direction of light so as to face the center of the aperture of the objective lens, wherein the magnification of the relay lens can be adjusted to fit the aperture of the objective lens. The parallel light passes through the objective lens 112 and is incident on the specimen 111 containing the fluorescent material.

여기서, 시편(111)에 입사된 빛의 일부는 시편(111)에 포함되어 있는 형광물질에 의해 흡수되었다가 다시 방출되는데, 이때 방출되는 신호는 형광 신호가 될 수 있다. 형광 신호는 시편(111)에 포함되어 있는 형광물질에서 방출된 신호로, 주파수가 낮은 긴 파장의 신호가 된다.Here, a part of the light incident on the specimen 111 is absorbed by the fluorescent material contained in the specimen 111, and is then released again. The emitted signal may be a fluorescence signal. The fluorescence signal is a signal emitted from the fluorescent substance contained in the specimen 111, and has a long wavelength with a low frequency.

시편(111)에서 방출된 형광 신호는 평행광이 입사한 방향을 거슬러 반대 방향으로 진행하여 갈바노 거울(102)과 다이크로익 미러(103)로 이동하는데, 다이크로익 미러(103)에서 반사되지 않고 통과한다. 다이크로익 미러(103)는 특정 파장을 기준으로 원하는 파장의 신호만 통과시키고 다른 파장의 신호는 반사시키는 특징을 가지고 있는 거울이며, 이에 따라 주파수가 변한 형광 신호를 통과시킬 수 있는 것이다.The fluorescent signal emitted from the specimen 111 travels in the opposite direction against the direction in which the parallel light is incident and travels to the Galvano mirror 102 and the dichroic mirror 103. In the dichroic mirror 103, Without passing through. The dichroic mirror 103 is a mirror having a characteristic of passing only a signal of a desired wavelength based on a specific wavelength and reflecting signals of other wavelengths, thereby allowing a fluorescence signal having a changed frequency to pass therethrough.

다이크로익 미러(103)를 통과한 형광 신호는 에미션 필터(Emission Filter)(104)를 통과하여 시편(111)에 의한 형광 신호만 검출부(120)로 전달될 수 있다. 전달되는 형광 신호는 광축 위의 형광물질을 포함하는 시편(111)에 대한 위치를 측정하기 위한 실시예로서, 빔 스플리터(Beam Splitter)(125)에 의해서 나누어지고 각 신호는 집광렌즈를 통해 각각이 신호에 대해 핀홀(121, 123)에 초점을 맺을 수 있다. 이때 핀홀(121, 123)은 각각 크기가 다르다.The fluorescence signal having passed through the dichroic mirror 103 passes through the emission filter 104 and only the fluorescence signal of the test piece 111 can be transmitted to the detection unit 120. The transmitted fluorescence signal is an embodiment for measuring the position of the specimen 111 including the fluorescent material on the optical axis, and is divided by a beam splitter 125, and each signal is transmitted through a condenser lens The pinholes 121 and 123 can be focused on the signal. At this time, the pinholes 121 and 123 have different sizes.

실시예에 있어서, 제1 핀홀(121)은 크기가 큰 핀홀, 제2 핀홀(123)은 크기가 작은 핀홀을 의미할 수 있으며, 그 반대에 대해서도 설명할 수 있다. 각 핀홀에 맺힌 초점에 대해서 제1 검출기(122)와 제2 검출기(124)를 통해서 각 신호를 측정할 수 있다. 여기서, 제1 핀홀과 제2 핀홀의 크기가 다르기 때문에, 각 신호에 대한 축방향 응답 곡선(Axial Response Curve)(126)은 반치폭(Full Width Half Maximum)이 다르게 나타난다.In the embodiment, the first pinhole 121 may mean a pinhole having a large size, and the second pinhole 123 may mean a pinhole having a small size, and vice versa. Each signal can be measured through the first detector 122 and the second detector 124 with respect to the focus formed on each pinhole. Since the sizes of the first pinhole and the second pinhole are different from each other, the axial response curve 126 for each signal has a different Full Width Half Maximum.

축방향 응답 곡선(126)은 도 2에 도시된 축방향 응답 곡선에 상응하는 것이 될 수 있으며, 도 2의 그래프는 미리 계측되어 있는 것으로, 수식에 의한 것이거나 또는 실험적으로 도출될 수 있는 것이다. 도 2의 축방향 응답 곡선은 신호의 세기에 대해 정규화된 것으로 측정된 신호 세기에 대한 축방향 응답 곡선을 비교하기에 적합하다. 그래프가 나타내고자 하는 바는 시편 내 형광물질의 깊이(z)에 따라 형광 신호 세기의 강도가 어떻게 나타나는지에 대한 것이다.The axial response curve 126 may correspond to the axial response curve shown in FIG. 2, and the graph of FIG. 2 may be pre-measured, and may be formulated or experimentally derived. The axial response curve of Figure 2 is adapted to compare the axial response curve for the signal strength measured as being normalized to the intensity of the signal. What the graph shows is how the intensity of the fluorescence signal intensity depends on the depth (z) of the fluorescent material in the specimen.

이에, 도 2의 축방향 응답 곡선, 제1 검출기(122)와 제2 검출기(124)로 검출된 신호의 세기에 대해 도출된 축방향 응답 곡선에 대해서 자세히 설명한다.The axial response curve derived from the axial response curve of FIG. 2, the intensity of the signal detected by the first detector 122 and the second detector 124 will be described in detail.

Figure pat00001
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수학식 1은 도 2의 그래프와 연결될 수 있는 것으로, 여기서 I(Φ)는 형광물질의 특성에 따라, 예컨대 농도, Ph, 온도 등의 환경 조건 특성에 따라 변할 수 있는 형광 신호의 세기를 의미하며, I(z, rp)은 형광물질의 깊이, 즉 초점과 시편 사이의 거리와 핀홀의 지름에 따라 변할 수 있는 형광 신호의 세기를 의미한다. 또한, IR은 제1 핀홀과 제2 핀홀에서 구한 형광 신호의 세기의 비율에 대한 것이다.(I) denotes intensity of a fluorescent signal that can be changed according to the characteristics of the environmental condition such as concentration, Ph, temperature and the like depending on the characteristics of the fluorescent material , I (z, r p ) means the intensity of the fluorescent signal which can vary according to the depth of the fluorescent material, that is, the distance between the focus and the specimen, and the diameter of the pinhole. I R is the ratio of the intensity of the fluorescence signal obtained from the first pinhole and the second pinhole.

실시예에 있어서, 도 1에 도시된 제1 핀홀과 제2 핀홀을 비교하면, 제1 핀홀의 크기가 더 크며, 핀홀의 크기가 클수록 같은 형광 신호가 유입되더라도 더 많은 범위에서 신호를 수신하기 때문에, 이에 따라 측정되는 신호의 세기가 더 크게 나타날 수 있다.In the embodiment, when the first pinhole shown in FIG. 1 is compared with the second pinhole, the size of the first pinhole is larger, and as the size of the pinhole is larger, the same signal is received even if the same fluorescence signal is introduced , So that the intensity of the signal being measured may be greater.

도 2의 그래프는 실험적, 이론적으로 미리 도출되어 있는 그래프에 수학식 1에 의한 값을 통해 구할 수 있다. 실시예에 있어서, IL은 큰 핀홀의 검출기에서 측정된 신호에 세기에 대한 것이며, IS은 작은 핀홀의 검출기에서 측정된 형광 신호에 대한 것이다. 상기에 설명한 바와 같이, 핀홀이 클 때에 신호의 세기 또한 크게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 두 개의 핀홀에서 측정되는 신호의 세기에 대한 그래프는 점선으로 표시되어 있으며, 실선으로 표시된 그래프 IR은 두 개의 축방향 응답 곡선을 나누어 새로운 응답 곡선을 얻은 것이다.The graph of FIG. 2 can be obtained from the values of Equation (1) on a graph which is previously derived experimentally and theoretically. In an embodiment, I L is for the intensity of the signal measured at the detector of the large pinhole and I S is for the fluorescence signal measured at the detector of the small pinhole. As described above, it can be seen that the intensity of the signal is also increased when the pinhole is large. The graph of the intensity of the signal measured at the two pinholes is shown in dashed lines, and the graph I R indicated by solid lines is obtained by dividing the two axial response curves to obtain a new response curve.

또한, 당연한 것일 수 있으나 도 2의 그래프에 따르면, 시편 내의 형광물질의 깊이가 커짐에 따라, 다시 말하면, 초점과 시편 사이의 거리가 멀어짐에 따라 측정되는 신호의 세기는 약해질 수 있다.Also, although it may be natural, according to the graph of Fig. 2, as the depth of the fluorescent material in the specimen increases, that is, the intensity of the signal measured as the distance between the focus and the specimen becomes farther away.

이렇게 구한 새로운 축방향 응답 곡선을 이용하여, 각 핀홀로 측정된 형광 신호의 세기를 나눈 값으로 시편의 형광물질의 깊이를 측정할 수 있다. 여기서, 축방향 응답 곡선의 반치폭을 축방향의 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하게 되면, 형광물질의 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 빛의 세기가 달라질 수 있으며, 축방향 응답 곡선의 특성을 통해 이를 확인할 수 있다.Using this new axial response curve, the depth of the fluorescent material of the specimen can be measured by dividing the intensity of the fluorescent signal measured at each pinhole. If the half width of the axial response curve is regarded as the axial measurement range without considering the axial resolution, the intensity of the light measured according to the distance between the specimen and the focal plane of the fluorescent material may be varied, This can be confirmed by the characteristics of the curve.

뿐만 아니라, 형광 신호는 양자 수율(Quantum Yield)이 고려되어 형광이 방출되는 양에 비례하여 그 강도가 측정될 수 있다. 따라서, 제1 검출기와 제2 검출기를 통해 측정된 신호의 세기는 형광 신호가 방출되는 위치와 핀홀의 크기, 양자 수율이 고려되어 결정될 수 있다. 두 개의 핀홀의 크기가 결정되었을 때, 핀홀에서 각각 측정된 두 신호 세기의 비율은 수학식 1에 나타난 바와 같이, 형광 신호가 방출되는 위치에 대한 값을 나타날 수 있다.In addition, the intensity of the fluorescence signal can be measured in proportion to the amount of fluorescence emitted in consideration of the quantum yield. Therefore, the intensity of the signal measured through the first detector and the second detector can be determined in consideration of the position at which the fluorescence signal is emitted, the size of the pinhole, and the quantum yield. When the size of the two pinholes is determined, the ratio of the two signal intensities measured at the pinhole may be a value for the position at which the fluorescence signal is emitted, as shown in equation (1).

도 3의 실시예를 이용하여, 도 2의 그래프에서 시편 내 형광물질의 깊이를 어떻게 유추해내는지 설명할 수 있다. 도 3의 오른쪽에 도시되어 있는 그래프는 도 2에 도시된 그래프 X축과 Y축을 이동시킨 것이다. 광축에 수직인 초점 평면(Focal Plane)에 대해서 도시된 바와 같이 X 방향으로 스캔할 수 있다. 도 3의 실시예는 상기에 설명한 바와 같이 측정되는 신호 세기의 비율은 형광 신호가 방출된 위치에 대한 값으로 정해진다는 특성을 이용하는 것이다.Using the embodiment of Fig. 3, it can be explained how the depth of the fluorescent substance in the specimen is deduced from the graph of Fig. The graph shown on the right side of FIG. 3 is obtained by moving the graph X axis and the Y axis shown in FIG. And scan in the X direction as shown for a focal plane perpendicular to the optical axis. The embodiment of FIG. 3 utilizes the property that the ratio of the signal intensity measured as described above is set to a value for the position where the fluorescence signal is emitted.

도 3에 나타낸 바와 같이, 그래프의 값에 측정된 값을 대입함으로써, 실시예로, 측정된 신호의 세기로 시편 내의 형광물질에 대한 높이를 직접 구할 수 있으므로, 시편을 초점 평면의 이동 없이 횡방향, 도시된 바와 같이 X-, Y-방향으로 스캔하여 3차원 형광 시편의 영상을 복원할 수 있다.As shown in Fig. 3, by assigning the measured value to the value of the graph, as an embodiment, the height of the fluorescent substance in the sample can be obtained directly by the intensity of the measured signal. Therefore, , The image of the three-dimensional fluorescent specimen can be reconstructed by scanning in the X- and Y-directions as shown in FIG.

본 발명의 실시예는 두 개의 핀홀과 두 개의 검출기를 통해 검출부가 구성될 수 있는데, 또 다른 실시예로서 도 4와 같이 Area CCD(Charge Coupled Device)를 이용하여 검출부(420)가 구성될 수 있다. 실시예에 있어서, 도 4는 도 1의 현미경 장치와 유사한 것으로, 검출부(120, 420)의 구성이 상이하게 나타나며, 시편부(410)는 도 1에 나타낸 바와 같이, 형광물질을 포함하는 시편과 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 포함하여 구성할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the detection unit may be configured through two pinholes and two detectors. In another embodiment, the detection unit 420 may be configured using an area CCD (Charge Coupled Device) as shown in FIG. 4 . In the embodiment, Fig. 4 is similar to the microscope apparatus of Fig. 1, in which the configurations of the detection units 120 and 420 are different, and the specimen unit 410 includes a specimen including a fluorescent material And an objective lens for observing the specimen.

도 4의 실시예에 있어서, 광원으로부터 신호의 진행방향은 도 1의 실시예와 같다. 레이저 광원에서 방출된 빛은 콜리메이터를 통해 평행광으로 형성되고, 이 평행광은 여기 필터를 통과한 후 다이크로익 미러에 반사되어 공진형 스캐너와 갈바노 거울로 이동할 수 있다. 공진형 스캐너와 갈바노 거울에 반사되어 진행경로가 변경된 평행광은 중계렌즈에 입사되어 시편부(410)로 이동하는데, 평행광의 중심이 대물렌즈의 중심에 맺히게 되고, 평행광은 대물렌즈를 통과하여 시편에 입사되었다가 방출될 수 있다.In the embodiment of FIG. 4, the traveling direction of the signal from the light source is the same as in the embodiment of FIG. The light emitted from the laser light source is formed into parallel light through a collimator. The parallel light passes through an excitation filter and is then reflected on a dichroic mirror to move to a resonance type scanner and a galvano mirror. The parallel light that is reflected by the resonance type scanner and the Galvano mirror and changed in the progress path is incident on the relay lens and moves to the specimen part 410. The center of the parallel light is focused on the center of the objective lens, And may enter the specimen and be released.

여기서, 시편으로부터 방출된 신호는 형광 신호로 입사된 평행광과 같은 경로를 반대 방향으로 진행하여 다이크로익 미러로 이동하는데, 여기서 반사되지 않고 통과되고, 에미션 필터를 함께 통과함으로서 시편에 대한 형광 신호만 남아있게 되며, 이 형광 신호를 검출부(420)로 이동할 수 있다.Here, the signal emitted from the specimen travels in the same direction as the parallel light incident on the fluorescence signal in the opposite direction to the dichroic mirror, where it is passed without being reflected and passes through the emissive filter, Only the signal remains, and the fluorescence signal can be moved to the detection unit 420.

검출부(420)의 CCD는 대물렌즈의 결합 초점면(Conjugate Focal Plane)에서 영상을 측정할 수 있다. 본 발명의 실시예를 통해 측정된 영상(422)은 픽셀 구조로 되어 있으며, 중심에서 에어리 디스크(Airy disc)와 비슷한 크기에 해당하는 하나 이상의 픽셀들이 도 1의 작은 핀홀의 역할을 하며, 주변의 픽셀은 큰 핀홀의 역할을 하는데, 형광 신호가 입사되는 픽셀에서 각각 측정되는 신호의 세기를 적분할 수 있다. CCD는 초점을 변경하여 형광 신호가 조사되는 픽셀의 범위도 함께 변하며, 포함되는 픽셀의 수는 실시예에 한정하지 않는다. The CCD of the detection unit 420 can measure an image in a conjugate focal plane of the objective lens. The image 422 measured through the embodiment of the present invention has a pixel structure, and one or more pixels corresponding to the size of an airy disc at the center serve as a small pinhole of FIG. 1, The pixel serves as a large pinhole, and it is possible to integrate the intensity of the signal measured at the pixel where the fluorescence signal is incident, respectively. The CCD changes the focus so that the range of the pixels to which the fluorescent signal is irradiated also varies, and the number of included pixels is not limited to the embodiment.

도 5는 본 발명의 실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치의 또 다른 실시예로서, CCD의 측정 장치 대신 배열 검출기(Detector array)(521)를 사용하여 CCD의 사용과 비슷한 실시예를 획득할 수 있다. 실시예에 있어서, CCD의 속도보다 더 빠르게 측정할 수 있으며, 고감도의 결과를 획득할 수 있다. 마찬가지로, 검출부(520)를 제외한 나머지 구성은 도 1에 상응하므로, 빛이 입사되어 시편부(510)에서 반사되어 형광 신호를 방출하고 검출부(520)로 전달되는 과정에 대해서는 설명을 생략하도록 한다.5 shows an embodiment similar to the use of a CCD by using a detector array 521 instead of the measuring device of the CCD as another embodiment of the confocal microscope device in the embodiment of the present invention have. In an embodiment, it is possible to measure faster than the speed of the CCD and obtain high sensitivity results. 1 except for the detection unit 520, the description of the process in which light is incident and reflected by the specimen unit 510 to release the fluorescence signal and is transmitted to the detection unit 520 will be omitted.

배열 검출기(521)는 광 센서를 포함하고 있는 것으로, 측정 영상(522)은 센서 단위로 구성되는데, 도시된 하나의 픽셀은 하나의 센서를 의미한다. 가운데 있는 중심 디텍터는 도 1에서의 작은 핀홀의 역할을 하며, 주변에 배열되어 있는 센서는 큰 핀홀의 역할을 한다. 각 센서는 도달하는 신호의 세기를 측정할 수 있으며, 주변 센서에서 측정한 신호의 세기는 전체 신호의 세기로 적분되어 결과 값으로 나타날 수 있다. The array detector 521 includes an optical sensor, and the measured image 522 is constituted by a sensor unit, which means one sensor is one sensor. The center detector in the middle functions as a small pinhole in FIG. 1, and the sensors arranged in the periphery serve as a large pinhole. Each sensor can measure the intensity of the arriving signal, and the intensity of the signal measured by the peripheral sensor can be integrated with the intensity of the whole signal and can be expressed as a result.

도 6은 본 발명의 일실시예에 있어서, 공초점 현미경 장치에서 3차원 영상을 획득할 수 있는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다. 실시예에 있어서, 도 1을 통해 설명한 공초점 현미경 장치(100)에서 실시될 수 있다.6 is a flowchart illustrating a method of acquiring a three-dimensional image in a confocal microscope apparatus according to an embodiment of the present invention. In an embodiment, it may be implemented in the confocal microscope apparatus 100 described with reference to FIG.

단계(610)에서 공초점 현미경 장치(100)는 형광물질을 포함하는 시편에서 방출되는 형광 신호를 검출부로 전달할 수 있다. 여기서, 형광 신호는 평행광이 시편에 입사되었다가 에너지를 잃고 방출되는 것으로 이 형광 신호를 이용하여 시편의 3차원 영상을 획득할 수 있다.In step 610, the confocal microscope apparatus 100 may transmit the fluorescence signal emitted from the specimen containing the fluorescent substance to the detection unit. In this case, the fluorescence signal can be obtained by using the fluorescence signal, in which the parallel light is incident on the specimen and then the energy is lost.

단계(620)에서 공초점 현미경 장치(100)는 검출부 내의 제1 핀홀과 제2 핀홀에 전달된 형광 신호를 각각 통과시켜 각각에 대한 형광 신호의 세기를 측정할 수 있다. 실질적으로 형광 신호의 세기를 측정할 때 형광 신호의 크기를 나누어 제1 핀홀과 제2 핀홀에 전달하여 측정할 수 있으며, 각 핀홀의 뒤에 배치되는 것으로 제1 검출기와 제2 검출기를 통해 신호의 세기를 측정할 수 있다.In step 620, the confocal microscope apparatus 100 may pass the fluorescence signal transmitted to the first pinhole and the second pinhole in the detection unit, respectively, to measure the intensity of the fluorescence signal for each of them. The intensity of the fluorescence signal can be measured by measuring the intensity of the fluorescence signal and transmitting it to the first pinhole and the second pinhole. The intensity of the signal is measured through the first detector and the second detector, Can be measured.

단계(630)에서 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고 3차원 영상을 획득할 수 있다. 측정된 신호의 세기를 3차원 영상을 획득하기 위해 각각의 형광 신호의 세기에 대한 축방향 응답 곡선을 구하고, 두 개의 축방향 응답 곡선을 나누어 새로운 축방향 응답 곡선을 획득할 수 있는데, 새롭게 획득한 축방향 응답 곡선을 이용하여 시편 내의 형광물질의 깊이 정보를 확인할 수 있다.In step 630, the height of the specimen can be obtained through the intensity of the fluorescence signal, and a three-dimensional image can be acquired. In order to obtain a three-dimensional image of the intensity of the measured signal, a new axial response curve can be obtained by obtaining an axial response curve with respect to the intensity of each fluorescence signal and dividing the two axial response curves. An axial response curve can be used to confirm the depth information of the fluorescent material in the specimen.

여기서, 축방향 응답 곡선의 반치폭을 축방향의 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하게 되면, 형광물질의 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 빛의 세기가 달라질 수 있으며, 축방향 응답 곡선의 특성을 통해 이를 확인할 수 있다.If the half width of the axial response curve is regarded as the axial measurement range without considering the axial resolution, the intensity of the light measured according to the distance between the specimen and the focal plane of the fluorescent material may be varied, This can be confirmed by the characteristics of the curve.

더불어, 형광 신호는 양자 수율(Quantum Yield)이 고려되어 형광이 방출되는 양에 비례하여 그 강도가 측정될 수 있다. 따라서, 제1 검출기와 제2 검출기를 통해 측정된 신호의 세기는 형광 신호가 방출되는 위치와 제1 핀홀, 제2 핀홀의 크기, 그리고 양자 수율이 고려되어 결정될 수 있다. 두 개의 핀홀의 크기가 결정되었을 때, 핀홀에서 각각 측정된 두 신호 세기의 비율은 형광 신호가 방출되는 위치에 대한 값을 나타낼 수 있다.In addition, the intensity of the fluorescence signal can be measured in proportion to the amount of fluorescence emitted considering the quantum yield. Therefore, the intensity of the signal measured through the first detector and the second detector can be determined in consideration of the position where the fluorescence signal is emitted, the size of the first pinhole, the size of the second pinhole, and the quantum yield. When the size of the two pinholes is determined, the ratio of the two signal intensities measured at the pinhole may represent a value for the position at which the fluorescence signal is emitted.

이와 같이, 공초점 현미경 장치를 통해서 형광물질로부터 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 형광 신호 영상을 고속 측정할 수 있는 광학 측정 시스템을 개발할 수 있으며, 이와 같은 공초점 현미경 장치를 개발하여 기계적인 이송 없이 깊이 분별력을 가지고, 고속으로 3차원 영상의 획득이 가능한 현미경 장치를 제공할 수 있고, 이에 현미경의 시편으로 입사된 빛의 광축 위에 위치한 형광물질의 깊이의 측정이 가능하게 될 수 있다.As described above, an optical measurement system capable of measuring a three-dimensional fluorescent signal image at high speed using a fluorescence signal emitted from a fluorescent material through a confocal microscope apparatus can be developed. Such a confocal microscope apparatus is developed, It is possible to provide a microscope apparatus capable of obtaining a three-dimensional image at a high speed with a good discriminating power without being able to measure the depth of the fluorescent material placed on the optical axis of the light incident on the specimen of the microscope.

더불어, 본 발명의 실시예를 통해 영상 기기의 활용도를 더욱 높일 수 있으며, 장치의 구조가 단순하기 때문에 살아있는 생체 내에서 관찰이 가능하고, 제안하는 현미경 장치에 큰 핀홀을 추가적으로 사용하여 형광 영상의 효율을 향상시키는 효과를 가져올 수 있다.In addition, the utilization of the imaging device can be further enhanced through the embodiment of the present invention. Since the structure of the imaging device is simple, it is possible to observe the living body in vivo, and a large pinhole is additionally used in the proposed microscope device, Can be improved.

실시예에 따른 3차원 영상 획득 방법은 다양한 컴퓨터 수단을 통하여 수행될 수 있는 프로그램 명령 형태로 구현되어 컴퓨터 판독 가능 매체에 기록될 수 있다. 상기 컴퓨터 판독 가능 매체는 프로그램 명령, 데이터 파일, 데이터 구조 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 상기 매체에 기록되는 프로그램 명령은 실시예를 위하여 특별히 설계되고 구성된 것들이거나 컴퓨터 소프트웨어 당업자에게 공지되어 사용 가능한 것일 수도 있다. 컴퓨터 판독 가능 기록 매체의 예에는 하드 디스크, 플로피 디스크 및 자기 테이프와 같은 자기 매체(magnetic media), CD-ROM, DVD와 같은 광기록 매체(optical media), 플롭티컬 디스크(floptical disk)와 같은 자기-광 매체(magneto-optical media), 및 롬(ROM), 램(RAM), 플래시 메모리 등과 같은 프로그램 명령을 저장하고 수행하도록 특별히 구성된 하드웨어 장치가 포함된다. 프로그램 명령의 예에는 컴파일러에 의해 만들어지는 것과 같은 기계어 코드뿐만 아니라 인터프리터 등을 사용해서 컴퓨터에 의해서 실행될 수 있는 고급 언어 코드를 포함한다. 상기된 하드웨어 장치는 실시예의 동작을 수행하기 위해 하나 이상의 소프트웨어 모듈로서 작동하도록 구성될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다.The 3D image acquisition method according to the embodiment may be implemented in the form of a program command which can be executed through various computer means and recorded in a computer-readable medium. The computer-readable medium may include program instructions, data files, data structures, and the like, alone or in combination. The program instructions to be recorded on the medium may be those specially designed and configured for the embodiments or may be available to those skilled in the art of computer software. Examples of computer-readable media include magnetic media such as hard disks, floppy disks and magnetic tape; optical media such as CD-ROMs and DVDs; magnetic media such as floppy disks; Magneto-optical media, and hardware devices specifically configured to store and execute program instructions such as ROM, RAM, flash memory, and the like. Examples of program instructions include machine language code such as those produced by a compiler, as well as high-level language code that can be executed by a computer using an interpreter or the like. The hardware devices described above may be configured to operate as one or more software modules to perform the operations of the embodiments, and vice versa.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. For example, it is to be understood that the techniques described may be performed in a different order than the described methods, and / or that components of the described systems, structures, devices, circuits, Lt; / RTI > or equivalents, even if it is replaced or replaced.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.Therefore, other implementations, other embodiments, and equivalents to the claims are also within the scope of the following claims.

100, 400, 500: 공초점 현미경 장치
110, 410, 510: 시편부
120, 420, 520: 검출부100, 400, 500: confocal microscope device
110, 410, 510: specimen part
120, 420, 520:

Claims (18)

형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서,
형광물질을 포함하는 시편과 상기 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및
크기가 다른 제1 핀홀과 제2 핀홀을 구비하고 있으며, 상기 제1 핀홀과 제2 핀홀을 각각 통과한 형광 신호의 세기를 측정하는 제1 검출기(Photomultiplier tube, PMT)와 제2 검출기를 구비한 검출부
를 포함하고,
상기 검출부는 상기 제1 검출기와 제2 검출기에서 측정한 각 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.A microscope apparatus for obtaining a three-dimensional image of a fluorescent material,
A specimen portion including a specimen including a fluorescent material and an objective lens for observing the specimen; And
And a second detector (PMT) having a first pinhole and a second pinhole of different sizes and measuring the intensity of the fluorescence signal having passed through the first pinhole and the second pinhole, respectively, and a second detector The detection unit
Lt; / RTI >
The detection unit obtains the height of the specimen through the intensity of each fluorescence signal measured by the first detector and the second detector, and acquires a three-dimensional image
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제1항에 있어서,
상기 검출부는 상기 시편에서 방출하는 형광 신호를 나누어 제1 핀홀과 제2 핀홀로 전달하는 빔 스플리터(Beam Splitter)를 포함하고,
상기 빔 스플리터는 상기 형광 신호의 크기를 나누어 전달하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method according to claim 1,
Wherein the detector includes a beam splitter for dividing the fluorescence signal emitted from the specimen and transmitting the divided fluorescence signal to the first pinhole and the second pinhole,
The beam splitter divides the size of the fluorescence signal and transmits it
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제1항에 있어서,
상기 검출부는 상기 제1 검출기로부터 측정한 신호의 세기와 상기 제2 검출기로부터 측정한 신호 세기 비율을 측정하고, 반치폭이 다른 두 개의 축방향 응답 곡선을 획득하며,
상기 축방향 응답 곡선에 상기 신호 세기 비율을 대입하여 상기 시편의 높이를 측정하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method according to claim 1,
Wherein the detector measures the intensity of the signal measured from the first detector and the signal intensity ratio measured from the second detector, acquires two axial response curves having different half-widths,
And the height of the specimen is measured by substituting the signal intensity ratio into the axial response curve
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제3항에 있어서,
상기 축방향 응답 곡선은 실험 또는 수식을 통해서 획득하며, 교정 과정을 거쳐 미리 획득하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method of claim 3,
The axial response curve is acquired through experiments or equations, and is obtained by preliminarily acquiring the calibration curve
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제3항에 있어서,
상기 축방향 응답 곡선은 반치폭을 축방향 분해능으로 고려하지 않고 축방향 측정 범위로 간주하면, 상기 시편과 초점 평면 간의 거리에 따라 측정되는 신호의 세기가 달라지는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method of claim 3,
When the axial response curve is regarded as an axial measurement range without considering the half width of the axial resolution, the intensity of the signal measured according to the distance between the specimen and the focal plane varies
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제1항에 있어서,
상기 검출부는 상기 각 형광 신호의 세기를 측정할 때엔 상기 형광 신호가 방출되는 위치와 상기 제1 핀홀, 제2 핀홀의 크기, 그리고 양자 수율이 고려되는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method according to claim 1,
When the intensity of each fluorescence signal is measured, the detection unit considers the position where the fluorescence signal is emitted, the size of the first pinhole, the size of the second pinhole, and the quantum yield
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제6항에 있어서,
상기 검출부는 상기 시편을 초점 평면의 이동 없이 횡방향으로 스캔함으로써 3차원 시편의 영상을 복원하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method according to claim 6,
Wherein the detecting unit scans the specimen in the horizontal direction without moving the focal plane to restore the image of the three-dimensional specimen
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제1항에 있어서,
상기 형광 신호는 레이저의 평행광이 상기 시편부의 상기 시편에서 방출되어 생성되며,
상기 공초점 현미경 장치는 공진형 스캐너 혹은 갈바노 거울을 포함하여 상기 레이저의 평행광을 상기 시편에 입사시켜 2차원 평면 스캐닝이 가능한 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method according to claim 1,
Wherein the fluorescence signal is generated by emitting parallel light of the laser from the specimen of the specimen part,
The confocal microscope apparatus includes a resonance type scanner or a galvano mirror, and the parallel light of the laser is incident on the specimen and is capable of two-dimensional plane scanning
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제1항에 있어서,
상기 공초점 현미경 장치는 특정 파장 기준으로 빛을 반사하고 통과시키는 반투과 거울로 구성되는 다이크로익 미러와 에미션 필터(Emission Filter)를 포함하고,
상기 다이크로익 미러와 에미션 필터를 통해 상기 형광 신호를 상기 검출부로 전달하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.The method according to claim 1,
The confocal microscope apparatus includes a dichroic mirror and an emission filter, which are composed of a semitransparent mirror for reflecting and passing light at a specific wavelength reference,
And transmitting the fluorescence signal to the detection unit through the dichroic mirror and the emission filter
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 현미경 장치에 있어서,
형광물질을 포함하는 시편과 상기 시편을 관찰하기 위한 대물렌즈를 구비한 시편부; 및
크기가 다른 복수 개의 지점에 대한 형광 신호의 세기를 측정하는 측정 장치
를 포함하고,
상기 측정 장치는 상기 측정한 형광 신호의 세기를 이용하여 상기 시편의 높이를 구하고, 3차원 영상을 획득하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.A microscope apparatus for obtaining a three-dimensional image of a fluorescent material,
A specimen portion including a specimen including a fluorescent material and an objective lens for observing the specimen; And
A measuring device for measuring the intensity of a fluorescent signal for a plurality of points having different sizes
Lt; / RTI >
The measuring device obtains the height of the specimen using the intensity of the measured fluorescence signal and acquires a three-dimensional image
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제10항에 있어서,
상기 크기가 다른 복수 개의 지점은 제1 지점과 제2 지점으로 구분되는데,
상기 제1 지점은 크기가 작은 핀홀 역할을 하고,
상기 제2 지점은 상기 제1 지점을 포함하고 있으며, 크기가 큰 핀홀의 역할을 하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.11. The method of claim 10,
The plurality of points having different sizes are divided into a first point and a second point,
The first point serves as a small pinhole,
The second point includes the first point and serves as a pin hole having a large size
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제11항에 있어서,
상기 측정 장치는 CCD(Charge Coupled Device)에 해당하고
상기 제1 지점과 제2 지점은 픽셀 단위로 구성되는데,
상기 측정 장치는 상기 제1 지점의 픽셀에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 상기 제1 지점의 주변 픽셀을 포함하는 상기 제2 지점의 픽셀에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.12. The method of claim 11,
The measuring apparatus corresponds to a CCD (Charge Coupled Device)
The first point and the second point are configured in pixel units,
Wherein the measuring device measures the intensity of the fluorescence signal at the pixel at the first point and integrates the intensity of the fluorescence signal measured at the pixel at the second point including the surrounding pixels at the first point
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 제11항에 있어서,
상기 측정 장치는 Detector array(배열 검출기)에 해당하고,
상기 제1 지점과 제2 지점은 센서 단위로 구성되는데
상기 측정 장치는 상기 제1 지점의 센서에서 형광 신호의 세기를 측정하고, 상기 제1 지점의 주변 센서를 포함하는 상기 제2 지점의 센서에서 측정한 형광 신호의 세기를 적분하는 것
을 특징으로 하는 공초점 현미경 장치.12. The method of claim 11,
The measuring device corresponds to a detector array,
The first point and the second point are configured in units of sensors
Wherein the measuring device measures the intensity of the fluorescent signal at the sensor at the first point and integrates the intensity of the fluorescent signal measured at the sensor at the second point including the peripheral sensor at the first point
/ RTI > wherein the confocal microscope device is a microscope. 현미경 장치에서 형광물질의 3차원 영상을 얻기 위한 방법에 있어서,
형광물질을 포함하는 시편에서 방출되는 형광 신호를 검출부로 전달하는 단계; 및
상기 검출부 내의 제1 핀홀과 제2 핀홀에 상기 전달된 형광 신호를 각각 통과시켜 각각의 형광 신호 세기를 측정하는 단계; 및
상기 검출부에서 측정한 각각의 형광 신호의 세기를 통해 시편의 높이를 구하고 3차원 영상을 획득하는 단계
를 포함하는 3차원 영상 획득 방법.A method for obtaining a three-dimensional image of a fluorescent material in a microscope apparatus,
Transmitting a fluorescence signal emitted from a specimen containing a fluorescent material to a detector; And
Passing each of the transmitted fluorescence signals through the first pinhole and the second pinhole in the detection unit, respectively, and measuring intensity of each fluorescence signal; And
Obtaining a height of the specimen through the intensity of each of the fluorescence signals measured by the detector, and obtaining a three-dimensional image
Dimensional image. 제14항에 있어서,
상기 형광 신호의 세기를 측정하는 단계는 상기 시편에서 방출하는 형광 신호를 나누어 상기 제1 핀홀과 제2 핀홀로 전달하는 단계를 포함하고,
상기 제1 핀홀과 제2 핀홀로 전달하는 단계는 상기 형광 신호의 크기를 나누어 전달하는 것
을 특징으로 하는 3차원 영상 획득 방법.15. The method of claim 14,
Wherein the step of measuring the intensity of the fluorescence signal includes dividing a fluorescence signal emitted from the specimen and transferring the fluorescence signal to the first pin hole and the second pin hole,
Wherein the step of transmitting the fluorescence signal to the first pinhole and the second pinhole is performed by dividing the size of the fluorescence signal
Dimensional image. 제14항에 있어서,
상기 형광 신호의 세기를 측정하는 단계에서,
상기 제1 핀홀의 형광 신호 세기를 측정하는 제1 검출기와 상기 제2 핀홀의 형광 신호 세기를 측정하는 제2 검출기로부터 각각 측정한 신호 세기 비율을 측정하고, 반치폭이 다른 두 개의 축방향 응답 곡선을 획득하며,
상기 3차원 영상을 획득하는 단계에서 축방향 응답 곡선에 상기 신호 세기 비율을 대입하여 상기 시편의 높이를 측정하는 것
을 특징으로 하는 3차원 영상 획득 방법.15. The method of claim 14,
In the step of measuring the intensity of the fluorescent signal,
A signal intensity ratio measured from a first detector for measuring the intensity of the fluorescent signal of the first pinhole and a second detector for measuring the intensity of the fluorescent signal of the second pinhole are measured and two axial response curves having different half widths are measured Acquire,
And the height of the specimen is measured by substituting the signal intensity ratio into the axial response curve in the step of acquiring the three-dimensional image
Dimensional image. 제14항에 있어서,
상기 형광 신호의 세기를 측정하는 단계에서 상기 각 형광 신호의 세기를 측정할 때엔 상기 형광 신호가 방출되는 위치와 상기 제1 핀홀, 제2 핀홀의 크기, 그리고 양자 수율이 고려되는 것
을 특징으로 하는 3차원 영상 획득 방법.15. The method of claim 14,
In measuring the intensity of the fluorescence signal, the position where the fluorescence signal is emitted, the size of the first pinhole, the size of the second pinhole, and the quantum yield are taken into account when measuring the intensity of each fluorescence signal
Dimensional image. 제17항에 있어서,
상기 3차원 영상을 획득하는 단계는 상기 시편을 초점 평면의 이동 없이 횡방향으로 스캔함으로써 3차원 시편의 영상을 복원하는 것
을 특징으로 하는 3차원 영상 획득 방법.18. The method of claim 17,
The obtaining of the three-dimensional image may include restoring the image of the three-dimensional specimen by scanning the specimen in the lateral direction without moving the focal plane
Dimensional image.
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