JP2012237647A - Multifocal confocal raman spectroscopic microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、レーザ観察光学系を用いて試料からのラマン散乱光を観察する多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡に関する。 The present invention relates to a multifocal confocal Raman spectroscopic microscope that observes Raman scattered light from a sample using a laser observation optical system.
従来、特許文献１に記載されているように、ラマン散乱光や蛍光などの散乱光と、試料の光学像（共焦点光学顕微鏡像）とを同時に測定することができる共焦点ラマン分光顕微鏡が提案されている。 Conventionally, as described in Patent Document 1, a confocal Raman spectroscopic microscope capable of simultaneously measuring scattered light such as Raman scattered light and fluorescence and an optical image (confocal optical microscope image) of a sample has been proposed. Has been.
この共焦点ラマン分光顕微鏡は、試料にレーザ光を照射し、試料からの反射光と散乱光とをノッチフィルタにより分離させ、反射光の光量を光検出器により測定するとともに、ラマン散乱光または蛍光スペクトルを光電子増倍管またはＣＣＤにより同時に測定するものである。 This confocal Raman spectroscopic microscope irradiates a sample with laser light, separates reflected light and scattered light from the sample with a notch filter, measures the amount of reflected light with a photodetector, and detects Raman scattered light or fluorescent light. The spectrum is measured simultaneously with a photomultiplier tube or CCD.
このような共焦点ラマン分光顕微鏡は、試料の一箇所のスペクトルを測定するものであるので、生細胞などに対して使用する場合には、試料内での物質の移動、変化が生ずるため、測定が困難であった。しかし、測定時間の短縮のために一箇所に照射するレーザ光の強度を増強すると、特に試料が生細胞である場合等には、試料のダメージが大きくなってしまう。 Since such a confocal Raman spectroscopic microscope measures the spectrum of one part of the sample, the movement and change of the substance in the sample occurs when it is used on live cells. It was difficult. However, if the intensity of the laser beam applied to one place is increased in order to shorten the measurement time, particularly when the sample is a living cell, the sample is greatly damaged.
このような場合には、試料の一箇所のみのスペクトルではなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得する必要がある。従来の共焦点ラマン分光顕微鏡においては、イメージ取得には長時間を要するため、イメージングの高速化が要請される。 In such a case, it is necessary to acquire a planar spectral image at a high speed instead of the spectrum of only one part of the sample. In the conventional confocal Raman spectroscopic microscope, since it takes a long time to acquire an image, it is required to increase the imaging speed.
ここで、面照射を用いた直接ラマンイメージング法が提案されている。これは、試料に対して面照射を行い、数１０μｍ２の領域を同時にラマン励起し、フィルター（誘電体膜によるフィルターやＡＯＴＦ）により、イメージをそのまま分光し、望むラマンバンドのラマンイメージを得るものである。 Here, a direct Raman imaging method using surface irradiation has been proposed. In this method, surface irradiation is performed on a sample, a region of several tens of μm 2 is simultaneously Raman-excited, and the image is spectrally separated as it is with a filter (a filter using a dielectric film or AOTF) to obtain a Raman image of a desired Raman band. It is.
ところで、上述のような直接ラマンイメージング法においては、フィルターの透過波長を走査すればスペクトルを得ることができるが、複数のバンドのイメージを同時に取得することは不可能である。また、試料からの弱いラマン散乱光に対して、培地や試料を担持するガラスからの発光が背景光として検出されてしまい、コントラストの大幅な低下が生ずる。 By the way, in the direct Raman imaging method as described above, a spectrum can be obtained by scanning the transmission wavelength of a filter, but it is impossible to simultaneously acquire images of a plurality of bands. Further, in contrast to weak Raman scattered light from the sample, light emission from the medium or the glass carrying the sample is detected as background light, resulting in a significant reduction in contrast.
そこで、本発明は、上述の実情に鑑みて提案されるものであって、試料が生細胞である場合においても、試料にダメージを与えることなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得することができ、また、複数のバンドのイメージを同時に取得することができる多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention is proposed in view of the above circumstances, and even when the sample is a living cell, a planar spectral image can be acquired at high speed without damaging the sample. An object of the present invention is to provide a multifocal confocal Raman spectroscopic microscope capable of simultaneously acquiring images of a plurality of bands.
上述の課題を解決するため、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、回折限界程度の大きさで多焦点照射を行い、かつ、共焦点効果を用いることにより、空間分解能を向上させ、また、背景光を除去して、多点からのスペクトルの同時取得を可能とし、背景光からの分離及びスペクトル処理を可能とし、コントラストを大幅に向上させるものである。 In order to solve the above-mentioned problems, the multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention performs multifocal irradiation with a size of the diffraction limit, and improves the spatial resolution by using the confocal effect, In addition, the background light is removed to enable simultaneous acquisition of spectra from multiple points, separation from the background light and spectrum processing are enabled, and the contrast is greatly improved.
すなわち、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、励起光を発するレーザ光源と、レーザ光源からの励起光を複数の細い光束にマトリクス状に分割してそれぞれを集光させるマイクロレンズアレイと、マイクロレンズアレイを経てリレーレンズを経た複数の光束を反射するエッジフィルタと、エッジフィルタを経た複数の光束のそれぞれを集光点において通過させる複数のピンホールを有するピンホールアレイと、ピンホールアレイを経た複数の光束のがリレーレンズを経て入射されこれら複数の光束のそれぞれを試料に集光させる対物レンズと、試料からの励起光の反射光及びラマン散乱光が対物レンズ、リレーレンズ及びピンホールアレイを経てエッジフィルタに戻り、このエッジフィルタを透過したラマン散乱光のそれぞれを集光させる共焦点光学系と、共焦点光学系により集光された複数のラマン散乱光の光束のそれぞれが入射端より入射され出射端が一列に配列された複数の光ファイバからなるファイババンドルと、ファイババンドルをなす複数の光ファイバの出射端からの光束が入射される分光手段と、分光手段を経た光束を受光する受光手段とを備えたことを特徴とするものである。 That is, a multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention includes a laser light source that emits excitation light, a microlens array that divides the excitation light from the laser light source into a plurality of thin light beams and collects each of them in a matrix form, An edge filter that reflects a plurality of light fluxes that have passed through a relay lens via a microlens array, a pinhole array that has a plurality of pinholes that allow each of the plurality of light fluxes that have passed through the edge filter to pass at a condensing point, and a pinhole array A plurality of luminous fluxes having passed through the relay lens, the objective lens for condensing each of the plurality of luminous fluxes on the sample, the reflected light of the excitation light and the Raman scattered light from the specimen are the objective lens, the relay lens, and the pinhole Return to the edge filter through the array, and each of the Raman scattered light that has passed through this edge filter. A confocal optical system for light, and a fiber bundle composed of a plurality of optical fibers in which light beams of a plurality of Raman scattered lights collected by the confocal optical system are incident from the incident end and the output ends are arranged in a line; The light-emitting device includes a spectroscopic unit that receives light beams from the emission ends of a plurality of optical fibers forming a fiber bundle, and a light-receiving unit that receives the light beams that have passed through the spectroscopic unit.
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、回折限界程度の大きさで多焦点照射を行い、かつ、共焦点効果を用いることにより、空間分解能を向上させ、また、背景光を除去して、多点からのスペクトルの同時取得を可能とし、背景光からの分離及びスペクトル処理を可能とし、コントラストを大幅に向上させることができる。多焦点照射は、励起光を分割した光束によって行うので、各焦点ごとにおける試料のダメージを軽減することができる。 In the multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention, the multifocal irradiation is performed with a size of the diffraction limit and the confocal effect is used to improve the spatial resolution and remove the background light. Thus, simultaneous acquisition of spectra from multiple points is possible, separation from background light and spectral processing are possible, and contrast can be greatly improved. Since multifocal irradiation is performed by a light beam obtained by dividing excitation light, damage to the sample at each focal point can be reduced.
すなわち、本発明は、試料が生細胞である場合においても、試料にダメージを与えることなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得することができ、また、複数のバンドのイメージを同時に取得することができる多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡を提供することができるものである。 That is, the present invention can acquire a planar spectral image at high speed without damaging the sample even when the sample is a living cell, and can simultaneously acquire images of a plurality of bands. It is possible to provide a multifocal confocal Raman spectroscopic microscope.
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
〔本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の構成〕
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、試料に対して複数に分割した励起光をそれぞれ集光して照射することにより、励起光が照射された試料の複数箇所を同時に測定する装置である。
[Configuration of Multifocal Confocal Raman Spectroscopic Microscope According to the Present Invention]
The multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention is an apparatus that simultaneously measures a plurality of portions of a sample irradiated with excitation light by condensing and irradiating the sample with excitation light divided into a plurality of portions. is there.
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、特に、組織、器官、または、細胞の生体及び生体関連物質を試料とする場合に好適に使用することができる。 The multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention can be suitably used particularly when a living body of a tissue, an organ, or a cell and a biological material are used as a sample.
図１は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の構成を示す平面図及び側面図である。 FIG. 1 is a plan view and a side view showing a configuration of a multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention.
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、図１に示すように、励起光を発するレーザ光源１と、レーザ光源１からの励起光が入射されるマイクロレンズアレイ２とを備えている。マイクロレンズアレイ２は、励起光を複数の細い光束にマトリクス状に分割して、それぞれを集光させる。 As shown in FIG. 1, the multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention includes a laser light source 1 that emits excitation light and a microlens array 2 on which the excitation light from the laser light source 1 is incident. The microlens array 2 divides the excitation light into a plurality of thin light beams in a matrix and collects each of them.
マイクロレンズアレイを経た複数の光束は、リレーレンズ３，４を経て、エッジフィルタ５に入射し、このエッジフィルタ５によって反射される。エッジフィルタ５を経た複数の光束は、それぞれを集光点において、ピンホールアレイ６の複数のピンホールを通過する。ピンホールアレイ６の各ピンホールを経た複数の光束は、リレーレンズ７及びダイクロイックミラー８を経て、対物レンズ９入射される。対物レンズ９は、複数の光束のそれぞれを、図示しない試料に集光させる。 A plurality of light fluxes that have passed through the microlens array enter the edge filter 5 through the relay lenses 3 and 4 and are reflected by the edge filter 5. The plurality of light fluxes that have passed through the edge filter 5 pass through the plurality of pinholes of the pinhole array 6 at the respective focal points. A plurality of light beams that have passed through each pinhole of the pinhole array 6 are incident on the objective lens 9 via the relay lens 7 and the dichroic mirror 8. The objective lens 9 condenses each of the plurality of light beams on a sample (not shown).
試料における各励起光の集光点は、例えば２μｍ間隔で、マトリクス状（２次元状）に配列された状態となっている。これら集光点のなす平面が、測定対象となる被測定平面となる。そして、試料は、ピエゾステージにより、各集光点の間隔（例えば２μｍ）に亘って光束に直交する２方向に、被測定平面に沿って走査できるようにしてもよい。また、試料をピエゾステージにより光軸方向に移動（走査）させることにより、資料の深さ方向に被測定平面を移動させることができる。 The condensing points of each excitation light in the sample are arranged in a matrix (two-dimensional) at intervals of 2 μm, for example. A plane formed by these condensing points is a plane to be measured which is a measurement target. Then, the sample may be scanned along the plane to be measured in two directions orthogonal to the light beam over the interval (for example, 2 μm) of each condensing point by a piezo stage. Further, the plane to be measured can be moved in the depth direction of the material by moving (scanning) the sample in the optical axis direction by the piezo stage.
試料からの励起光の反射光及びラマン散乱光は、対物レンズ９、リレーレンズ７及びピンホールアレイ６を経てエッジフィルタ５に戻り、ラマン散乱光がエッジフィルタ５を透過する。 The excitation light reflected from the sample and the Raman scattered light return to the edge filter 5 through the objective lens 9, the relay lens 7 and the pinhole array 6, and the Raman scattered light passes through the edge filter 5.
ラマン散乱光のそれぞれは、共焦点光学系１０に入射される。共焦点光学系１０は、第１及び第２のレンズ１０ａ，１０ｂからなる。ピンホールアレイ６の各ピンホールにおいて集光していたラマン散乱光は、これらピンホールから拡散しながらエッジフィルタ５を透過し、第１のレンズ１０ａに入射する。第１のレンズ１０ａは、入射した各光束をそれぞれ集光させる。第１のレンズ１０ａにより集光された各光束は、再び拡散しながら、第２の第２のレンズ１０ｂに入射する。第２のレンズ１０ｂは、入射した各光束をそれぞれ集光させる。第２のレンズ１０ｂによる各光束の集光点は、試料における励起光の集光点及びピンホールアレイ６の各ピンホールにおける集光点と共焦点の関係となっている。 Each of the Raman scattered light is incident on the confocal optical system 10. The confocal optical system 10 includes first and second lenses 10a and 10b. The Raman scattered light collected in each pinhole of the pinhole array 6 passes through the edge filter 5 while being diffused from these pinholes, and enters the first lens 10a. The first lens 10a condenses each incident light beam. Each light beam collected by the first lens 10a enters the second second lens 10b while diffusing again. The second lens 10b condenses each incident light beam. The condensing point of each light beam by the second lens 10 b has a confocal relationship with the condensing point of the excitation light in the sample and the condensing point in each pinhole of the pinhole array 6.
共焦点光学系１０により集光された複数のラマン散乱光の光束のそれぞれは、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの入射端に入射される。このファイババンドル１１をなす複数の光ファイバは、出射端が一列に配列されている。 Each of the plurality of Raman scattered light beams collected by the confocal optical system 10 enters the incident ends of the plurality of optical fibers forming the fiber bundle 11. The plurality of optical fibers forming the fiber bundle 11 have their emission ends arranged in a line.
ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの出射端から出射された光束は、グレーティングなどの分光手段に入射して分光され、ＣＣＤカメラなどの受光手段１２により受光される。 The light beams emitted from the emission ends of the plurality of optical fibers forming the fiber bundle 11 are incident on a spectroscopic unit such as a grating to be dispersed, and are received by a light receiving unit 12 such as a CCD camera.
〔本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の動作〕
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、試料に対して、回折限界程度の大きさで多焦点照射を行い、かつ、共焦点効果を用いることによって、空間分解能を向上させ、多点からのスペクトルの同時取得が可能である。多焦点照射は、励起光を分割した光束によって行うので、各焦点ごとにおける試料のダメージを軽減することができる。したがって、試料が生細胞である場合においても、試料にダメージを与えることなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得することができ、また、複数のバンドのイメージを同時に取得することができる。コントラストを大幅に向上させることができる。
[Operation of Multifocal Confocal Raman Spectroscopic Microscope According to the Present Invention]
In this multifocal confocal Raman spectroscopic microscope, the sample is irradiated with multifocal light at a diffraction limit size and the confocal effect is used to improve the spatial resolution, and the spectrum from multiple points. Can be acquired simultaneously. Since multifocal irradiation is performed by a light beam obtained by dividing excitation light, damage to the sample at each focal point can be reduced. Therefore, even when the sample is a living cell, a planar spectral image can be acquired at high speed without damaging the sample, and images of a plurality of bands can be acquired simultaneously. Contrast can be greatly improved.
図２は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られたラマン散乱光の強度を示すグラフである。 FIG. 2 is a graph showing the intensity of Raman scattered light obtained by the multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention.
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により、試料をφ５４８ｎｍのポリスチレン（polystyrene）球として、１６０３ｃｍ−１のラマン散乱光を測定した。図２（ａ）に示すように、被測定面内（Ｘ軸方向）及び、図２（ｂ）に示すように、光軸方向（Ｚ軸方向）について、それぞれ良好な測定を行うことができた。 Using this multifocal confocal Raman spectroscopic microscope, a sample was used as a polystyrene sphere having a diameter of 548 nm, and Raman scattered light of 1603 cm −1 was measured. As shown in FIG. 2 (a), good measurement can be performed in the measurement surface (X-axis direction) and in the optical axis direction (Z-axis direction) as shown in FIG. 2 (b). It was.
図３は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られたラマン散乱光の強度と受光手段における受光イメージとの関係を示すグラフである。 FIG. 3 is a graph showing the relationship between the intensity of Raman scattered light obtained by the multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention and the received light image in the light receiving means.
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、図３に示すように、被測定面内の複数箇所（例えば４８点）におけるラマンスペクトルを同時に測定することができる。受光手段の受光素子（ＣＣＤ）においては、被測定面上の一点からのスペクトルが一本の線状に領域に受光される。図３においては、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの出射端が縦に並んでおり（１〜４８）、これら出射端からの光束がそれぞれ分光されて横方向にスペクトルとして広がって撮像される。 In this multifocal confocal Raman spectroscopic microscope, as shown in FIG. 3, Raman spectra at a plurality of locations (for example, 48 points) in the measurement surface can be measured simultaneously. In the light receiving element (CCD) of the light receiving means, the spectrum from one point on the surface to be measured is received by the region in a single line shape. In FIG. 3, the output ends of a plurality of optical fibers forming the fiber bundle 11 are arranged vertically (1 to 48), and light beams from these output ends are respectively dispersed and imaged as a spectrum in the lateral direction. .
図４は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られるラマン散乱光の情報と被測定面との関係を示すグラフである。 FIG. 4 is a graph showing the relationship between the information of the Raman scattered light obtained by the multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention and the surface to be measured.
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、図４に示すように、被測定面（図４中のＸ−Ｙ平面）上の複数の点について、それぞれからスペクトル情報が得られるので、３次元的な情報を得ている。この３次元的な情報が、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの出射端が一列に並んでいることにより、受光手段の受光素子においては、２次元的な情報として取得される。 In this multifocal confocal Raman spectroscopic microscope, as shown in FIG. 4, spectral information can be obtained from each of a plurality of points on the surface to be measured (the XY plane in FIG. 4). I get a lot of information. This three-dimensional information is acquired as two-dimensional information in the light receiving element of the light receiving means by arranging the emission ends of the plurality of optical fibers forming the fiber bundle 11 in a line.
受光手段の受光素子において取得された情報を、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの入射端の位置、すなわち、被測定面上の位置に応じて並べ替えることにより、元の３次元的な情報を再現することができる。このようにして、被測定面上の複数の点についてのスペクトル情報を、被測定面上の位置に応じて再現すれば、イメージングを行うことができる。 By rearranging the information acquired in the light receiving element of the light receiving means according to the positions of the incident ends of the plurality of optical fibers forming the fiber bundle 11, that is, the positions on the surface to be measured, the original three-dimensional information Can be reproduced. In this way, imaging can be performed if the spectral information about a plurality of points on the surface to be measured is reproduced according to the position on the surface to be measured.
図５は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られるラマン散乱光のイメージング画像及びラマン散乱光の３次元イメージング画像である。 FIG. 5 shows an imaging image of Raman scattered light and a three-dimensional imaging image of Raman scattered light obtained by the multifocal confocal Raman spectroscopic microscope according to the present invention.
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、図５（ａ）に示すように、被測定面上の複数の点についてのスペクトル情報を、被測定面上の位置に応じて再現したイメージング画像を、極めて高速に取得することができる。さらに、図５（ｂ）に示すように、資料の奥行方向（光軸方向）の情報を加えて処理することにより、資料の３次元的なスペクトル情報を画像化することができる。 In this multifocal confocal Raman spectroscopic microscope, as shown in FIG. 5A, an imaging image in which spectral information about a plurality of points on the measurement surface is reproduced according to the position on the measurement surface, It can be acquired very quickly. Furthermore, as shown in FIG. 5 (b), by processing by adding information in the depth direction (optical axis direction) of the material, the three-dimensional spectrum information of the material can be imaged.
本発明は、レーザ観察光学系を用いて試料からのラマン散乱光を観察する多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡に適用される。 The present invention is applied to a multifocal confocal Raman spectroscopic microscope that observes Raman scattered light from a sample using a laser observation optical system.
１ レーザ光源
２ マイクロレンズアレイ
５ エッジフィルタ
６ ピンホールアレイ
９ 対物レンズ
１０ 共焦点光学系
１１ ファイババンドル
１２ 受光手段
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Laser light source 2 Micro lens array 5 Edge filter 6 Pinhole array 9 Objective lens 10 Confocal optical system 11 Fiber bundle 12 Light receiving means
Claims (1)
前記レーザ光源からの励起光を複数の細い光束にマトリクス状に分割してそれぞれを集光させるマイクロレンズアレイと、
前記マイクロレンズアレイを経て、リレーレンズを経た複数の光束を反射するエッジフィルタと、
前記エッジフィルタを経た複数の光束のそれぞれを集光点において通過させる複数のピンホールを有するピンホールアレイと、
前記ピンホールアレイを経た複数の光束のがリレーレンズを経て入射され、これら複数の光束のそれぞれを試料に集光させる対物レンズと、
前記試料からの励起光の反射光及びラマン散乱光が、前記対物レンズ、前記リレーレンズ及び前記ピンホールアレイを経て前記エッジフィルタに戻り、このエッジフィルタを透過したラマン散乱光のそれぞれを集光させる共焦点光学系と、
前記共焦点光学系により集光された複数のラマン散乱光の光束のそれぞれが入射端より入射され、出射端が一列に配列された複数の光ファイバからなるファイババンドルと、
前記ファイババンドルをなす複数の光ファイバの出射端からの光束が入射される分光手段と、
前記分光手段を経た光束を受光する受光手段と
を備えたことを特徴とする多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡。 A laser light source that emits excitation light;
A microlens array for condensing each of the excitation light from the laser light source into a plurality of thin luminous fluxes in a matrix, and
An edge filter that reflects a plurality of light fluxes that have passed through the relay lens via the microlens array;
A pinhole array having a plurality of pinholes that allow each of the plurality of light beams that have passed through the edge filter to pass through at a condensing point;
A plurality of light beams that have passed through the pinhole array are incident through a relay lens, and an objective lens that focuses each of the plurality of light beams on a sample;
Reflected light and Raman scattered light of the excitation light from the sample return to the edge filter through the objective lens, the relay lens, and the pinhole array, and collect each of the Raman scattered light that has passed through the edge filter. Confocal optics,
Each of a plurality of Raman scattered light beams collected by the confocal optical system is incident from an incident end, and a fiber bundle composed of a plurality of optical fibers in which an output end is arranged in a line;
Spectroscopic means on which light beams from the output ends of a plurality of optical fibers forming the fiber bundle are incident,
A multifocal confocal Raman spectroscopic microscope, comprising: a light receiving means for receiving a light beam that has passed through the spectroscopic means.
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