KR20140054570A - 중금속에 오염된 토양으로부터 분리한 비소에 내성을 가지고 식물 생장을 촉진하는 박테리아 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주(KACC91746P), 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주(KACC91747P) 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주(KACC91748P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 비소 내성 증진 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제 및 생물비료 및 상기 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 비소에 대한 내성을 증진시키고 식물 생장을 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 상기 균주를 이용하여 식물의 비소 내성 증진, 생장 촉진 및 생산량 증대 효과를 가져올 수 있어, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

중금속에 오염된 토양으로부터 분리한 비소에 내성을 가지고 식물 생장을 촉진하는 박테리아 균주 및 이의 용도{Bacteria strain having arsenic-resistance and promoting plant growth isolated from heavy metal-contaminated soil and uses thereof}
본 발명은 중금속에 오염된 토양으로부터 분리한 비소에 내성을 가지고 식물 생장을 촉진하는 박테리아 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주(KACC91746P), 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주(KACC91747P) 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주(KACC91748P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 비소 내성 증진 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제 및 생물비료, 상기 생물비료를 제조하는 방법 및 상기 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 비소에 대한 내성을 증진시키고 식물 생장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
비소(Arsenic, As)는 환경에 가장 해로운 물질 중 하나이다. 비소에 오염된 물질에 노출되고 영향받는 수많은 사람들로 인해 지난 20년간 비소에 대한 관심이 증가하였다. 자연적으로 발생하는 비소 외에 추가적으로 인간에 의해 생산된 모든 비소의 80% 이상이 자연 환경으로 유입되는 것으로 추정된다. 비소 오염에 원인을 제공하는 인간 활동으로는 채굴, 제련 및 제강 가공, 비소-포함 비료 및 살충제의 사용 및 크롬산 구리 비산염(chromated copper arsenate, CCA)을 이용한 목재 방부처리이다. 비소에 오염된 토양에서 발견되는 대부분의 우점 종들은 비산염(arsenate, As V) 및 아비산염(arsenite, As Ⅲ)이며, 아비산염이 더욱 독성이 강한 것으로 알려져 있다. 미생물은 아비산염을 비산염으로(아비산염 산화) 또는 비산염을 아비산염으로(비산염 환원) 생물변환(biotransform)할 수 있기 때문에, 환경의 비소 순환에서 중요한 역할을 한다.
고농도 비소의 존재 하에 박테리아를 생장할 수 있게 하는 3가지 메커니즘이 알려져 있다. 그 중 하나는 광범위한 염색체 및 플라스미드 Ars 시스템으로서, 비산염을 세포 내로 전달시켜 비산염을 아비산염으로 환원시키고, ATP-의존성 유출 펌프를 통해 아비산염을 내보내는 것이다. 또 다른 메커니즘은 더욱 독성이 강한 아비산염이 비산염으로 변환되는 아비산염 산화이다. 혐기성 주변세포질의 비산염 환원효소(reductase) 또한 박테리아로 하여금 비산염을 최종 전자 공여자로 이용하게 할 수 있는 소수의 박테리아에서 나타난다. 상기 메커니즘들은 종 분화 및 비소의 이동에 영향을 주며, 따라서 비소의 생물학적 이용 가능성 및 독성에 영향을 줄 수 있다(Borch et al., 2010 Environ. Sci. Technol. 44, 15-23).
비소 노출의 해로운 영향 때문에, 오염된 토양 및 물을 청정화시키려는 노력이 필요하며, 유기 공해 물질과 달리 비소는 분해되지 않기 때문에 비소의 적절한 제거 방법이 필요하다. 물리적 및 화학적 기법과 같은 토양 복원 기법은 많은 비용이 발생할 뿐만 아니라, 토양 물리적, 생물학적 및 화학적 특성과 절충해야 한다. 상기 토양 복원에 대한 대안 기법으로, 최근 발전된 식물환경복원(phytoremediation) 방법이 있다. 중금속을 대량 흡수할 수 있는 식물의 발견은 오염된 대지의 복원에 적절한 방법을 제공하였다. 그러나, 중금속 내성 식물들도 높은 수준의 중금속에 노출될 시에는 생장이 제한될 수 있다. 식물과 연관된 미생물의 생물공학적 이용은 금속(loid) 흡수 또는 제거에 더 큰 장점을 제공한다. 중금속에 오염된 토양은 중금속 내성 미생물을 보유하는 것으로 알려져 있다. 상기 토양으로부터 분리된 박테리아 중 일부는 식물 생장 촉진(plant growth promoting, PGP) 형질을 특징으로 가지고 있다.
인돌-3-아세트산(indole-3-acetic acid, IAA) 생산, 포스페이트(P) 가용화, 금속친화성 입자(siderophore) 생산, 질소 고정 및 1-아미노시클로프로판-1-카르복실레이트(1-aminocyclopropane-1-carboxylate, ACC) 디아미나제(deaminase) 생산과 같은 특징은 가장 연구가 많이 된 PGP 형질이다. 본 발명에서는 비소에 오염된 토양의 식물환경복원을 강화하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있는 다양한 식물 생장 촉진 형질을 보유한 비소 내성 박테리아를 분리하고 특징을 분석하였다.
한편, 한국등록특허 제0830703호에는 '메틸로박테리움 속 미생물, 이를 이용한 유기산 생산방법, 중금속 오염 토양 정화 방법 및 식물 생장 촉진 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0850373호에는 '세라티아 속 미생물 및 이를 이용한 식물 생장촉진 및 토양정화 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 중금속에 오염된 토양으로부터 분리한 비소에 내성을 가지고 식물 생장을 촉진하는 박테리아 균주 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 중금속에 오염된 토양으로부터 식물 생장 촉진 세균(plant growth promoting bacteria, PGP)을 분리하였는데, 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물의 생장을 촉진시키는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 분류학적으로 동정하였다. 상기 균주를 비소에 오염된 식물체에 처리한 경우 식물의 뿌리 생장이 촉진되는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주(KACC91746P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS1215 균주(KACC91747P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주(KACC91748P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 비소(Arsenic, As) 내성 증진 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 비소(Arsenic, As) 내성 증진 및 식물 생장 촉진용 생물비료를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 생물비료를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 비소(Arsenic, As)에 대한 내성을 증진시키고 식물 생장을 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 중금속에 오염된 토양에서 분리한 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주가 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지고, 식물 생장 촉진 세균(plant growth promoting bacetria, PGP)의 특성을 가지며, 비소에 오염된 식물체의 뿌리 생장을 촉진시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 이용하여 식물의 비소 내성 증진, 생장 촉진 및 생산량 증대 효과를 가져올 수 있어, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 비소 내성 박테리아 분리 균주 및 관련 속들 사이의 관계를 보여주는 16S rRNA 유전자 서열의 계통수를 나타낸다. 부트스트랩 값은 1,000회의 반복을 근거로 하고, 50%를 초과하는 값들만 제시하였다.
도 2는 발아된 옥수수에 상이한 농도의 비산염(As V)을 처리한 후, 뿌리 길이에 대한 비소 내성 박테리아의 접종 효과를 나타낸다. (A) 0μM, (B) 100μM 및 (C) 200μM의 비소 처리 후, 박테리아 분리 균주 접종에 의한 옥수수 뿌리 신장 정도를 나타낸다. 값들은 4회 반복의 평균±SE를 나타낸다(n=10). 별표(*)는 LSD 시험에 의한 그룹 당 대조구의 평균값의 유의차를 나타낸다(*P≤0.05, **P≤0.001).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주(KACC91746P)를 제공한다.
본 발명은 또한, 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주(KACC91747P)를 제공한다.
본 발명은 또한, 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주(KACC91748P)를 제공한다.
상기 식물 생장 촉진 세균은 중금속에 오염된 토양으로부터 분리하였다. 이렇게 분리된 분리 균주 중에서, 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지며 식물체의 뿌리 길이를 신장시키는 식물 생장 촉진 균주를 선발하였으며, 이는 주로 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 패니바실러스(Paenibacillus) 속, 라넬라(Rahnella) 속, 로도코커스(Rhodococcus) 속 및 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주였다. 이 중에서, 비소에 강한 내성을 갖고, 식물 생장을 촉진시키는 호르몬인 IAA(indole-3-acetic acid)를 분비하고, 비소에 오염된 옥수수 뿌리의 길이를 현저하게 증가시키는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 선발하였다. 상기 균주들을 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2012년 10월 16일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC91746P, KACC91747P 및 KACC91748P).
상기 균주를 비소에 오염된 옥수수 종자에 처리하였을 때, 상기 균주가 접종된 옥수수 종자의 뿌리 길이는 상기 균주가 접종되지 않은 대조구보다 2배 이상 증가하였다(도 2 참고).
본 발명은 또한, 본 발명의 비소에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 비소 내성 증진 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제 및 생물비료를 제공한다.
상기 미생물 제제는 중금속에 오염된 토양으로부터 분리된 비소에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 박테리아 균주인 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있으나, 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다. 또한, 중금속에 오염된 토양으로부터 분리된 비소에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 박테리아 균주인 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 이용하여 식물의 비소에 대한 내성을 증진시키고, 식물의 생장을 촉진시키는 생물비료로서의 이용법을 제공한다. 상기 균주를 배양한 배양액을 이용하여 이를 액체 상태로 그대로 관주하거나 식물의 종자에 침지 또는 분무하거나 종자에 코팅하여 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 배양하는 단계를 포함하는 생물비료를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주의 배양 방법 및 생물비료의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본 발명의 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 비소에 대한 내성을 증진시키고 식물의 생장을 촉진시키는 방법을 제공한다. 상기 식물의 비소에 대한 내성을 증진시키고 식물의 생장을 촉진시키는 방법으로는 상기 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주, 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주 및 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주를 배양한 배양액 및 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 종자나 식물에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 비소에 대한 내성을 증진시키고 생장을 촉진할 수 있는 식물로는 대부분의 식물이 포함될 수 있으며, 특히 옥수수 등에 효과적이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물의 생장 촉진은 바람직하게는 식물의 뿌리 생장을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1) 채집 장소 및 토양 채집
토양은 대한민국 충남 청원군의 장항 제련소 부근에서 채집하였다. 장항 제련소는 1936년부터 가동을 시작했으나, 용융로(smelting furnace)는 공해 문제로 인해 1989년에 가동을 중단하였다. 채집 위치 중 두 곳은 제련소에서 각각 260m 및 240m 떨어진 곳에 위치하였고, 나머지 두 곳은 제련소로부터 3.5km 떨어진 농장이었다. 토양 시료는 공기 중에서 건조시키고, 체로 걸러내고, HNO3-로 분해시킨 후, 중금속 농도 측정을 위해 유도결합 플라즈마 발광분광계(Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometer, ICP-OES)에 적용시켰다. 본 발명에 사용한 토양의 특성을 표 1에 나타내었다. 위치 A 및 B에서 채집한 토양 시료의 비소 함량은 농지에 대한 표준 한계를 초과하였으며, 위치 C 및 D에서 채집한 토양의 비소 함량은 표준 한계 미만이었다.
Figure pat00001
* HNO3-H2SO4 용액으로 분해
** 0.1N HCl로 추출
2) 비소 내성 박테리아 분리
채집한 각 위치의 토양 10g을 순차적으로 희석하여 플레이팅하였다. 종속영양(heterotrophic) 박테리아를 영양 배지(Nutrient agar)를 이용하여 나열하고, 비소-내성 박테리아를 1mM As Ⅲ(NaAsO2, Sigma)를 이용하여 보정한 TLP(Tris-buffered low phosphate) 배지 상에서 분리하였다. 저농도 포스페이트 배지는 금속 석출을 방지하기 위해 이용하였다. TLP 배지는(g/ℓ 기준) 트리즈마 염기: 6.06, NaCl: 4.68, KCl: 1.49, NH4Cl: 1.07, Na2SO4: 0.43, MgCl2·6H2O: 0.2, CaCl2·2H2O: 0.03, Na2HPO4·12H2O: 0.23 및 Fe(Ⅲ)(NH4) 시트레이트: 0.005로 구성되었고, 미량 금속(리터 당 1㎖의 미량 금속 원액 용액, 상기 원액 용액은 g 기준으로 FeSO4·7H2O: 0.2, ZnSO4·7H2O: 0.01, MnCl2·4H2O: 0.003, CoCl2·6H2O: 0.02, CuCl2·6H2O: 0.001, NiCl2·6H2O: 0.5, Na2MoO4·2H2O: 0.5 및 H3BO3: 0.03으로 구성됨) 및 0.2%(w/v) 소듐 글루코네이트(sodium gluconate)로 보충하였다. 고체 배지에는 1.8%(w/v) 아가를 추가하였다. 아비산나트륨(NaAsO2, Sigma)의 원액 용액을 제조하고, 막 필터(0.20㎛)를 이용하여 여과 후 멸균하였다. 그 후, 플레이트를 28±2℃에서 3 내지 5일간 배양하였다. 1mM As Ⅲ TLP 플레이트 상에서 생장하는 상이한 단일 콜로니를 선별하여, 다시 도말하고 정제하였다. 순수한 배양액에 50% 글리세롤을 첨가하여 -80℃에 보관하였다.
3) 토양 분리 균주의 특징 분석
토양에서 분리한 균주들을 첫 번째로 그람(Gram) 반응에 대해 확인하고, 표준 방법에 따라 옥시다제 및 카탈라제 활성 및 질산염 환원에 대해 특징 분석하였다. 각 박테리아 분리 균주의 탄소원 사용은 선행 문헌(Verma et al. 2001 J. Biotechnol. 91, 127-141)의 과정에 의해, 그람 음성 분리 균주들에 대해서는 BioLog GN2 마이크로플레이트를, 그람 양성 분리 균주들에 대해서는 GP2 마이크로플레이트를 이용하여 결정하였다.
4) 16S rRNA 유전자 분석
토양에서 분리한 균주들을 영양 아가 플레이트에서 생장시켰다. 게놈 DNA를 분리하고, 정방향 프라이머 27F; 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머 1492R; 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'(서열번호 2)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 형광 염료 종결자 방법(ABI prism 설비 및 BigdyeTM Terminator cycle sequencing ready reaction kit V.3.1)을 이용하여 PCR-direct 서열분석으로 동정하고, PCR 산물을 Millipore-Montage 염료 제거 키트를 이용하여 정제하였다. 최종적으로, PCR 산물을 ABI 3730XL 모세관 DNA 서열분석기(50㎝ 모세관)에서 전개시켰다. 획득한 16S rRNA 유전자 서열을 정렬시키고, EzTaxon 서버(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)를 이용한 BLAST 분석을 이용하여 균주의 계통을 유추하였다. CLUSTAL W에 의해 데이터 다중 정렬 후, MEGA V.5.03을 이용하여 계통 분석을 실시하였다. Juke 및 Cantor 모델에 따라 DNA 치환을 수행하고, 근연접합법(neighbor-joining)을 이용하여 클러스터링을 수행하였다. 1,000회의 반복을 이용한 부트스트랩(bootstrap) 방법으로 노드(node)의 통계적 신뢰도를 산출하고, GenBank® 데이터베이스에 등록 번호 JQ014171 내지 JQ014191로 분리 균주의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 등록하였다.
5) As Ⅲ 및 As V의 최소 저해 농도( MIC ) 결정
MIC(minimum inhibitory concentration)는 균의 생장 억제를 유도하는 항생물질의 최저 농도로 정의된다. 96웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 각 웰을 멸균 TLP 배지 130㎕로 채우고, 상이한 농도의 As Ⅲ의 NaAsO2(0 내지 20 mM) 및 As V의 Na2HAsO4·7H2O(0 내지 340 mM)로 보충하였다. As의 부재 하에 균주들을 48 내지 72시간 동안 28±2℃의 회전 쉐이커(150rpm) 상에서 5mM TLP 액체 배지로 생장시킨 후에 박테리아 접종액(OD620=0.1) 20㎕를 각 웰에 넣어주었다. 그 후, 초기 세포 밀도 및 24시간 후의 박테리아 생장을 EZ Read 400 Microplate Reader(Biochrom)를 이용하여 620nm에서 측정하였다. 플레이트는 28±2℃에서 보관하였다.
6) 식물 생장 촉진 형질 스크리닝
박테리아 균주를 식물 생장 촉진 형질에 대해 스크리닝하였다. 플레이트 상에서 인돌-3-아세트산(IAA) 생산을 선행 문헌(Bric et al. 1991 Appl. Environ. Microbiol. 57, 535-538)의 방법에 따라 5mM L-트립토판을 보충한 LB(Luria Bertani) 아가 배지를 이용하여 수행하였다. 생산된 IAA 양의 정량적인 산출을 선행 문헌(Bano and Musarrat 2003 Curr. Microbiol. 46, 324-328)에 따라 500㎍·㎖-1 L-트립토판의 존재 및 부재 하에 영양 배지를 이용하여 수행하였다. ACC 디아미나제 활성은 질소 공급원으로 3mM ACC를 보충한 질소가 없는 배지 상에 박테리아 분리 균주들을 생장시켜 측정하였고, ACC의 효소 가수분해에 의해 생산된 α-케토부티레이트(ketobutyrate)의 양은 선행 문헌(Honma and Shimomura Agri. Biol. Chem. 42, 1825-1831)에 따라 산출하였다. 플레이트 상의 포스페이트(트리칼슘 포스페이트)를 용해시키는 분리 균주들의 활성은 브로모페놀 블루가 존재하는 NBRIP(National botanical research institute's phosphate growth) 배지를 이용하여 평가하였다. 생장하는 박테리아 주변에는 포스페이트(P) 가용화를 나타내는 할로 존(halo zone)이 생성되었다. 포스페이트 가용화의 정량적인 산출은 NBRIP 액체 배지를 이용하여 실시하였고, 포스페이트 결정은 선행 문헌(Murphy and Riley 1962 Anal. Chim. Acta 27, 31-36)의 방법에 따라 실시하였다. 금속친화성 입자(siderophore) 생산량은 금속친화성 입자 생산에 의해 생장하는 박테리아 부근에 오렌지색 할로 존이 나타나는 변형된 CAS 아가 플레이트를 이용하여 측정하였다.
7) 비소 산화 및 환원 검정
박테리아 균주들을 1mM NaAsO2 또는 NaH2AsO4·7H2O로 보정한 CDM(Chemically Defined Medium) 아가 상에 도말하거나 또는 스팟 접종시키고, 30℃에서 3일간 반응시켰다. CDM은 다음과 같이 선행 문헌(Weeger et al. 1999 Biometals 12, 141-149)에 따라 제조하였다; 리터 당 기준으로, 용액 A(100㎖)는 81.2mM MgSO4·7H2O, 70mM Na2SO4, 187mM NH4Cl, 0.574mM K2HPO4, 4.57mM CaCl2·2H2O, 446mM 소듐 락테이트로 제조하였고, 용액 B(2.5㎖)는 4.8mM Fe2SO4·7H2O, 용액 C(10㎖)는 950mM NaHCO3로 제조하였다. 배지의 pH는 약 7.2로 조절하였다. 그 후, 배지에 아가를 1.8%(w/v)로 첨가하였다. 비소를 변환시키는 분리 균주들의 활성은 AgNO3를 이용하여 측정하였다. As Ⅲ 산화 시험을 위해, 한국 유전자 은행(Korea Collection of Type Cultures, KCTC)에서 받은 헤르미니모나스 아르세니콕시단스(Herminiimonas Arsenicoxydans)를 표준 균주로 이용하였다. 플레이트를 28±2℃에서 3일간 배양한 후, 0.1M AgNO3 10㎖을 각 플레이트에 첨가하였다. As Ⅲ 플레이트 상의 갈색 석출물 형성은 As Ⅲ 산화를 나타내었고, As V 플레이트 상의 연황색 석출물 형성은 As V 환원을 나타내었다.
8) 식물 뿌리 신장 촉진( plant root elongation promotion , PREP ) 검정
옥수수(Zea mays L.) 종자들을 70% 에탄올로 1분 및 6% NaHClO로 5분간 표면 멸균시킨 후, 멸균수로 5 내지 7회 세척하였다. 박테리아 분리 균주들을 영양 배지에서 24 내지 48시간 동안 생장시켰다. 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 수득하고, 멸균수를 이용하여 2회 세척한 후, 멸균수를 첨가하여 OD600=1.0(약 1x108 cfu/㎖)이 될 때까지 펠렛을 재현탁시켰다. 멸균된 종자들을 암 조건 하에서 4 내지 6시간 동안 박테리아 현탁액 또는 증류수에 현탁시켰다. 그 후, 10개의 종자를 페트리 디쉬 내의 10㎖ 멸균수 또는 As 용액(100 또는 200μM NaH2AsO4·7H2O)으로 적신 멸균 여과지에 놓아두었다. 처리군마다 4회씩 반복 수행하였다. 종자를 25±2℃에서 3일간 배양한 후, 뿌리 길이를 측정하였다. 내성 지수(tolerance index, TI)를 선행 문헌(Wilkins 1978 New Phytol. 80, 623-633)의 하기 식을 이용하여 결정하였다;
Figure pat00002
상기 식에서, RL m 은 비소의 존재 하에 생장한 식물의 뿌리 길이를 나타내고, RL c 는 비소의 부재 하에서 생장한 식물의 뿌리 길이를 나타낸다. 박테리아 접종의 효과는 박테리아를 접종하고 비소 존재 하에 생장한 식물의 뿌리 길이 및 박테리아를 접종하지 않고 비소 부재 하에 생장한 식물의 뿌리 길이의 비율을 취해 산출하였다.
9) 통계적 분석
옥수수의 생장 파라미터에 대한 데이터를 변량 분석(ANOVA)에 적용하였다. P≤0.05 및 P≤0.001의 유의성 수준에서 평균 분리는 SAS 패키지(V.9.1.3)를 이용하여 Fisher's LSD로 분석하였다.
실시예 1. 비소 내성 박테리아 분리 및 특징 분석
총 21가지의 비소 내성 박테리아를 비소 오염 및 비오염 토양으로부터 분리하였다. 그 중 11가지는 위치 A로부터 분리하고, 9가지는 위치 B로부터, 그리고 1가지 박테리아는 위치 D로부터 분리하였다(표 2). 분리한 박테리아의 특징 분석 결과, 16가지 분리 균주들은 그람 음성균이었고, 5가지는 그람 양성균을 나타내었다. 대부분의 박테리아는 옥시다제 양성 및 카탈라제 양성을 나타내었고, 질산염을 감소시킬 수 있는 특징을 나타내었다. 상기 박테리아는 상이한 탄소 공급원을 이용할 수 있으며, 모든 분리 균주들은 종속영양성이고 호기성인 것을 확인하였다.
분리 균주의 채집 위치 및 As Ⅲ 및 As V에 대한 최소 저해농도(MIC) 분석
Isolate Source MIC (mM)
As Ⅲ As V
JS111 Site A 14 150
JS112 Site A >20 300
JS119 Site A 10 300
JS122 Site A 3 310
JS123 Site A 7 310
JS126 Site A 7 310
JS128 Site A 3 310
JS1210 Site A 5 260
JS1211 Site A 3 310
JS1213 Site A 3 310
JS1215 Site A 7 310
JS211 Site B 6 280
JS217 Site B 8 310
JS2210 Site B 18 280
JS2211 Site B 16 310
JS2212 Site B 8 310
JS2214 Site B 4 230
JS234 Site B 18 290
JS238 Site B 10 310
JS2312 Site B 9 310
JS424 Site D 17 140
실시예 2. 16S rRNA 유전자 서열 분석
분리된 비소 내성 박테리아 균주들을 16S rRNA 유전자 서열 분석으로 동정하여 분류학적 위치를 결정하였다. 상기 박테리아 균주의 뉴클레오티드 서열을 통해 상기 균주들이 3개의 문(phyla) 및 6개의 상이한 속(genera)에 속하는 것을 확인하였다(도 1). 동정된 분리 균주들 대부분은 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 상이한 종들이었고, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 패니바실러스(Paenibacillus) 속, 라넬라(Rahnella) 속, 로도코커스(Rhodococcus) 속 및 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주인 것으로 나타났다.
실시예 3. 박테리아 균주의 비소 내성 분석
박테리아 균주들의 비소에 대한 최소 저해 농도(MIC) 분석 결과, 분리 균주들은 As Ⅲ 및 As V에 대해 비교적 높은 내성을 나타내는 것을 확인하였다(표 2). 대부분의 분리 균주들은 5mM As Ⅲ에서 보다 더 많이 생장하는 것으로 나타났다. 균주 JS112, JS2210, JS2211, JS234 및 JS424는 15mM을 초과하는 As Ⅲ에 대해 내성을 지니고 있었다. As V에 대해서는 모든 분리 균주들이 300mM을 초과하는 As V에서도 여전히 생장 가능한 것을 확인하였다.
실시예 4. 박테리아 균주의 비소 형질전환 활성 분석
박테리아 균주의 비소 형질전환 활성을 위한 플레이트 분석 결과, 생장하는 박테리아 주변에 비산염 감소를 나타내는 밝은 황색 침전물이 나타나는 것을 확인하였다. 반면, 분리 균주들에서는 상기 기재된 방법을 이용한 아비산염 산화는 검출되지 않았다(데이터 미제시).
실시예 5. 박테리아 균주의 식물 생장 촉진 형질 분석
박테리아 균주의 식물 생장 촉진 형질을 확인하기 위하여 As 내성 분리 균주들에서 4가지의 중요한 PGP(plant growth promoting) 형질을 스크리닝하였다. 그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 대부분의 분리 균주들이 생산량의 차이는 있지만 IAA를 생산하는 것을 확인하였다. 분리 균주 중 JS119(65.3㎍/㎖) 및 JS1210(57.2㎍/㎖)는 L-트립토판의 존재 하에 높은 수준의 IAA를 생산하는 것으로 나타났다. 슈도모나스 중에서도, 10가지의 균주가 5㎍/㎖을 초과하여 IAA를 생산하는 것을 확인하였고, JS424 또한 눈에 띄게 많은 양의 IAA를 생산하였다. 질소(N)가 없는 배지에서 생장할 수 있는 13가지의 분리 균주들은 질소 고정 능력을 나타내었다. 또 다른 중요한 PGP 형질인 ACC 디아미나제 활성이 13가지의 분리 균주에서 검출되었다(39.6~3379.6nmol α-KB/mg 단백질/h). 또한, 플레이트 분석 결과 17가지 분리 균주들이 트리칼슘 포스페이트를 용해할 수 있는 것으로 확인되었다(4.1~10.5g/ℓ).
비소 내성 분리 균주의 식물 생장 촉진 형질 분석
Isolate IAA productiona ACCD activityb Soluble Pc Siderophore production
Without tryptophan With
tryptophan
JS111 4.4±0.4 4.2±0.3 374.7±142.4 - -
JS112 2.5±0.4 5.0±0.2 389.9±41.5 4.1±0.0 -
JS119 12.2±0.3 65.3±0.8 39.6±32.8 8.9±0.0 -
JS122 1.9±0.2 4.4±0.0 2847.4±116.7 5.8±0.1 +
JS123 3.2±0.1 7.7±0.2 - 10.5±0.0 +
JS126 3.8±0.2 5.4±0.5 3379.6±649.5 6.7±0.1 +
JS128 1.6±0.0 4.4±0.3 2685.6±96.4 5.4±0.1 +
JS1210 0.8±0.1 57.2±0.8 - 5.2±0.1 +
JS1211 3.4±0.6 8.3±0.8 3256.6±283.6 9.3±0.4 +
JS1213 1.8±0.1 3.8±0.3 2990.2±236.7 5.5±0.0 +
JS1215 2.2±0.1 5.7±0.1 1823.1±306.8 8.6±0.0 +
JS211 2.8±0.1 3.1±0.1 - 8.4±0.2 +
JS217 3.8±0.2 8.6±0.1 - 8.4±0.2 +
JS2210 0.5±0.1 4.8±0.2 - - -
JS2211 7.6±0.3 15.4±0.6 - 7.0±0.4 -
JS2212 2.9±0.1 10.2±0.0 - 7.2±0.1 +
JS2214 5.4±0.1 6.5±0.1 41.1±11.4 7.1±0.2 +
JS234 0.8±0.1 0.8±0.0 602.8±330.0 - -
JS238 4.0±0.2 9.9±0.2 127.1±45.8 7.2±0.1 -
JS2312 5.3±0.0 7.0±0.2 - 8.9±0.0 -
JS424 2.4±0.0 8.3±0.4 152.6±82.0 - -
a: IAA 생산량(㎍/㎖)
b: ACC 디아미나제 활성(nmole α-케토뷰티레이트/㎎ 단백질/h)
c: 포스페이트(P) 가용성(g/ℓ)
-: 검출되지 않음
상기 값들은 3회 반복한 평균 ± SE를 나타낸다.
실시예 6. 박테리아 균주의 식물 뿌리 신장 촉진 활성 분석
분리 균주들이 옥수수의 생장을 촉진할 수 있는지 확인하기 위해 PREP(plant root elongation promotion) 분석을 실시하였다. 비소의 존재 하에 옥수수 뿌리 길이가 감소되는 현상이 나타났다. 박테리아 균주를 접종한 옥수수에서는 처리한 모든 수준의 비소 농도 하에서 옥수수 뿌리의 길이가 뚜렷히 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 가장 높은 농도(200μM)의 비소를 처리하고 박테리아를 접종한 옥수수 뿌리의 길이는 심지어 정상 상태 하에서 박테리아를 접종하지 않은 대조구 옥수수보다도 훨씬 더 신장된 것으로 나타났다. 100μM As V를 처리한 경우 박테리아를 접종한 옥수수 종자의 뿌리 길이는 비접종 옥수수에 비해 43~200% 정도의 뿌리 길이 증가를 보였고, 200μM As V를 처리한 경우에는 17~156% 정도의 뿌리 길이 증가를 나타내었다(도 2). 특히, 더 높은 As V 농도에서 JS2210 균주를 접종한 옥수수 종자에서 가장 뚜렷한 뿌리 신장을 관찰할 수 있었다. As V에 대한 옥수수의 내성 지수(TI)는 비소 내성 박테리아의 접종에 의해 매우 증가된 것을 확인하였다(표 4).
As V의 독성을 처리한 옥수수 뿌리에 대한 박테리아 접종 효과
Treatment TI(tolerance index)
100 μM 200 μM
Control 0.85 0.79
JS111 2.39 0.79
JS112 2.24 1.29
JS119 2.21 1.35
JS122 1.87 1.49
JS123 1.62 1.08
JS126 1.74 0.93
JS128 2.14 0.78
JS1210 2.45 1.46
JS1211 1.19 1.27
JS1213 2.24 1.04
JS1215 1.90 1.05
JS211 1.55 0.98
JS217 1.90 1.10
JS2210 2.59 1.39
JS2211 2.35 2.02
JS2212 1.44 0.98
JS2214 1.81 0.85
JS234 2.29 1.52
JS238 2.24 0.93
JS2312 1.27 1.33
JS424 2.02 1.16
농업생명공학연구원 KACC91746P 20121016 농업생명공학연구원 KACC91747P 20121016 농업생명공학연구원 KACC91748P 20121016
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Bacteria strain having arsenic-resistance and promoting plant growth isolated from heavy metal-contaminated soil and uses thereof <130> PN12011 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

  1. 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) JS128 균주(KACC91746P).
  2. 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii) JS1215 균주(KACC91747P).
  3. 비소(Arsenic, As)에 내성을 가지면서 식물 생장을 촉진하는 로도코커스 에테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JS2210 균주(KACC91748P).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물의 생장 촉진은 식물의 뿌리 생장 촉진인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 비소(Arsenic, As) 내성 증진 및 식물 생장 촉진용 미생물 제제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 비소(Arsenic, As) 내성 증진 및 식물 생장 촉진용 생물비료.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 생물비료를 제조하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물의 비소(Arsenic, As)에 대한 내성을 증진시키고 식물 생장을 촉진시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물의 생장 촉진은 식물의 뿌리 생장 촉진인 것을 특징으로 하는 방법.
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