KR20140049757A - 골 재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골 재생용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고가의 BMP-2를 적은 양을 사용하면서도 골 재생 효과가 현저하게 개선된 골 재생용 조성물에 관한 것이다.

Description

골 재생용 조성물{Bone-repair composition}

본 발명은 골 재생용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고가의 BMP-2를 적은 양을 사용하면서도 골 재생 효과가 현저하게 개선된 골 재생용 조성물에 관한 것이다.

외상, 종양 적출에 의한 골 손상 및 발치 및 골 결손 부위의 회복을 위한 기존 치료법은 자신의 뼈를 이용하는 자가골(autogenous) 이식술, 다른 사람의 뼈를 이식하는 동종골(allograft) 이식술, 다른 종의 뼈를 이용하는 이종골(xenograft) 이식술, 합성골(alloplast) 및 골 대체물질 등이 사용되어 왔다. 과거 몇 년 동안은 자가골 이식술이 골 재생에 있어 가장 이상적인 방법 및 물질로 각광받아 왔지만 자가골 이식술은 환자 자신의 신체 부위에서 뼈를 얻어야 하므로 공여부 합병증과 함께 골 결손 부위가 클 경우 충분한 양의 뼈를 얻을 수 없는 문제점이 있으며, 동종골, 이종골 이식술은 잠재적인 면역반응을 유발 할 수 있고, 질환 및 인수 공통병을 전염 시킬 가능성이 문제가 되어 왔다.

그리고 합성 골이나 골 대체물만을 이용했을 때는 골형성 및 재생 능력이 떨어져 넓은 범위의 골결손과 신체능력이 떨어지는 환자의 경우 치료기간이 길어져 이에 따른 부작용 및 추가 비용이 발생하는 경우가 있다.

이를 해결하기 위한 방법으로, 합성골이나 골 대체물질에 골형성을 촉진하기 위한 생물학적 인자로서 혈소판 풍부혈장(platelet rich plasma, PRP), 골 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP) 및 혈관생성인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등을 혼합하여 사용되어 왔다. 하지만, PRP를 이용한 방법은 환자 자신의 혈액을 채취하는 과정이 선행되어야 함에 따라 환자가 꺼려하는 경향이 있고, TGF-B superfamily에 속하는 골형성 단백질인 BMP-2 단백질은 골 재생 및 형성을 자극 촉진하는데 효과적이지만 최근 임상에 있어 골절 부위의 융합을 위해 재조합 BMP 단백질을 사용 시 융합 실패가 일어날 수 있음이 보고되고 있다.

현재 BMP를 사용하는 방법이 많은 연구와 동물실험이 진행되고 있지만 생체 내에서 BMP 단백질을 적절히 유지하고 조절하는 적당한 기질이 없고 안정도가 낮아 생체 내에 빠르게 흡수, 분해되어 버리는 근본적인 문제점으로 아직 임상적으로 많이 사용되지 못하는 한계가 있는 것이 현실이다.

KR 10-2011-0000485 A, 2011년 01월 03일

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 기존의 조성물들의 문제점을 해결한 새로운 골 재생용 조성물에 관하여 지속적인 연구를 수행하던 중, 고가의 골 형태형성 단백질-2(Bone morphogenetic protein-2, 이하 ‘BMP-2’라 한다.)를 적은 양을 사용하면서도 인체에 무해할 뿐 아니라 골 재생에 있어 현저한 상승효과(synergy)를 가지는 골 재생용 조성물을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 두개골의 결함 부위에 대하여 세포 침투 및 골 형성을 가능케 하는 골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 골 재생용 조성물을 포함하는 조직 재생용 임플란트 소재를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 특정비율의 골 형태형성 단백질-2(Bone morphogenetic protein-2, 이하 ‘BMP-2’라 한다.)와 연골 저중합체 세포간질 단백질-Ang1(cartilage oligomeric matrix protein: 이하 ‘COMP-Ang1’라 한다.)을 혼합하여 사용하는 골 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 골 재생용 조성물을 포함하는 조직 재생용 임플란트 소재를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 골 형태형성 단백질-2(Bone morphogenetic protein-2, 이하 ‘BMP-2’라 한다.)를 단독으로 사용한 경우보다 연골 저중합체 세포간질 단백질-Ang1(cartilage oligomeric matrix protein: 이하 ‘COMP-Ang1’라 한다.)을 혼합하여 사용하는 경우 비용절감과 더불어 우수한 골 재생 효과를 나타냄을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서 사용되는 “골 재생(osteanagenesis)”은 뼈 재생과 동일한 의미로 해석되며, 결함 부위에 대하여 세포 침투 및 골 형성, 골 대체 또는 증대의 의미를 포함하는 것이다.

본 발명은 유효성분으로 골 형태형성 단백질-2(Bone morphogenetic protein-2, BMP-2) 및 연골 저중합체 매트릭스 단백질 안지오포이틴-1(Cartilage oligomeric matrix protein-angiopoietin-1, COMP-Ang 1)을 1: 0.5 내지 5의 중량비로 함유하는 골 재생(bone regeneration)용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 'BMP-2(Bone-Morphogenic Protein-2)'는 골 조직의 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 단백질이다. 본 발명에서, 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 유래된 것일 수 있다. BMP-2로 처리될 개체와 동종의 개체로부터 유래된 것이 바람직하다.

본 발명에서, BMP-2는 재조합 DNA 기술에 기초하여 생산하는 것이 바람직하다. 한 양태로서, (a) BMP-2를 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절서열을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양물로부터 BMP-2를 분리하는 단계를 거쳐 생산할 수 있다.

상기 '벡터'로는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다.

상기 '조절서열'은 BMP-2의 발현에 필수적이거나 이로운 핵산 서열들을 의미한다. 상기 조절서열에는 프로모터, 업스트림(upstream) 활성화 서열 또는 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다.

상기 '숙주세포'로는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물세포, 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포 등이 포함된다.

상기된 형질전환 또는 형질감염은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 예로는 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection) 등이 포함된다.

숙주세포들은 적절한 배지와 BMP-2 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건하에서, 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양배지에서 진행한다. 적합한 배지는 상업적적으로 입수 가능하고, 예를 들면 American Type Culture Collection 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 조성비에 따라 제조할 수도 있다.

배양물로부터 BMP-2는 당업계에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, BMP-2는 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 의해 배양물로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 BMP-2는 크로마토그래피 또는 전기영동을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 ‘COMP-Ang 1(Cartilage oligomeric matrix protein-angiopoietin-1)’은 강력한 안지오포이틴-1의 변형체인 연골 저중합체 세포간질 단백질-Ang1로 혈관생성에 있어 내피 세포 및 혈관지지세포와 기질사이의 상호작용을 극대화시키면서 혈관생성을 촉진하고 안정시키는 한편 혈관주변세포(pericyte)를 끌어들이는 역할을 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 COMP-Ang 1은 다음과 같이 제조할 수 있다.

COMP-Ang 1에 대한 재조합 단백질은 기존의 네이티브 안지오포이틴-1(native angiopoietin-1)에 존재하는 코일드 코일 도메인(coilded coil domain)을 연골 저중합체 매트릭스 단백질(cartilege oligomeric matrix protein)로 대치한 다음 COMP-Ang1을 발현하는 재조합 CHO 세포주(Chinese hamster ovary cell)(CA1-2; 생산율, 30㎎/ℓ)를 이용하여 제조할 수 있다(참고문헌: Cho CH et al. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 5547-5552 & 2004; 101: 5553-5558).

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 유효성분으로 BMP-2와 COMP-Ang 1이 1 : 1 내지 3의 중량비로 혼합되어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 두개골의 용적을 증가시킴으로써 골을 재생시키는 효과가 있다.

본 발명에서 사용되는 “두개골의 용적”은 두개골에서 재생된 뼈 부피(bone volume)를 의미하는 것으로, 조직공학용 스캐폴드(scaffold)에 의해 점유된 뼈의 퍼센트를 의미한다. 조직공학용 스캐폴드(scaffold) 부피의 측정 또는 추정은 조직형태측정법, 컴퓨터화 단층 X선 사진법, 또는 자기 공명 영상화법을 사용하여 성취될 수 있다. 2차원적 측정법을 사용하여 3차원 부피를 추정할 수 있다. 다른 조직형태측정 기술이 Eriksen 등의 문헌 [Bone Histomorphometry, 1994, Raven Press]에 상세히 기술되어 있다.

특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 BMP-2와 COMP-Ang 1이 1 : 3의 중량비로 혼합될 경우 1 : 4의 중량비의 혼합될 경우 보다 골 재생에 있어 현저한 상승효과(synergy)를 가지며, 상기 골 재생은 CD31 및 NG2 유전자의 발현 증가의 특성을 가진다. 이는 뼈 재생과 혈관 형성과의 관계 뿐 아니라 두개골의 결함 부위에 대하여 세포 침투 및 골 형성에 BMP-2와 COMP-Ang 1의 1 : 3의 중량비가 본 발명의 목적 달성에 중요한 의미를 가짐을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 에멀전, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 제형은 1회용 투약 형태가 편리할 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 골 이식재와는 별도로 이식하거나, 골 이식재에 포함된 형태로 골 이식재와 동시에 이식할 수도 있다. 이에, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 조직 재생용 임플란트 소재에 관한 것이다.

본 발명은 유효성분으로 골 형태형성 단백질-2(Bone morphogenetic protein-2, BMP-2) 및 연골 저중합체 매트릭스 단백질 안지오포이틴-1(Cartilage oligomeric matrix protein-angiopoietin-1, COMP-Ang 1)을 1: 0.5 내지 5의 중량비로 함유하는 골 재생(bone regeneration)용 조성물을 포함하는 조직 재생용 임플란트 소재를 제공한다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 골 형태형성 단백질-2(Bone morphogenetic protein-2, BMP-2) 및 연골 저중합체 매트릭스 단백질 안지오포이틴-1(Cartilage oligomeric matrix protein-angiopoietin-1, COMP-Ang 1)을 1: 1 내지 3의 중량비로 함유하는 골 재생(bone regeneration)용 조성물을 포함하는 조직 재생용 임플란트 소재를 제공한다.

본 발명에 따른 조직 재생용 임플란트 소재는 조직공학용 스캐폴드(scaffold)로서의 인공 세포외 매트릭스로 사용될 수 있다. 이때, 임플란트 소재의 분해 속도는 소재 내부에 있는 세포의 분화 및 성장에 매우 중요한 역할을 하므로, 적절한 분해 속도 조절이 필수적이다.

일반적으로 조직이 재생되기 위해서는 먼저 조직재생을 직접 담당하는 세포(cell)와 이 세포를 생체로부터 유도하고 분화시키는 신호분자(signalling molecules), 그리고 이들이 성장하고 유지되는 매개인 스캐폴드(scaffold)이 있어야 한다. 골조직 재생을 위한 조직공학에서는 이들 3가지 요소를 인공적으로 생산하고 이들을 적절히 조합시킴으로써 자가골 보다 훨씬 뛰어난 골형성 능력과 골스캐폴드를 만드는 것이 목표이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration) 또는 골 재생(bone regeneration)에 적용될 수 있다.

상기 스캐폴드는 당업계에 공지된 임의의 골 재생용 스캐폴드를 포함한다. 그러한 뼈 재생용 스캐폴드는 자가골, 동종골, 이종골 또는 합성골일 수 있다. 상기 합성골로는 HA(hydroxyapatite), 콜라겐, 세라믹 스캐폴드, 다공성 인산칼슘 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 골 재생에 있어, 골 성장촉진을 위한 인자로는 상기 유효성분 뿐만 아니라 공지된 다른 골 성장을 촉진하는 다양한 인자를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 호르몬, 안지오제닌 이외의 사이토카인, 줄기세포 등을 포함한다.

본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 구체적인 증상으로는, 골의 성장 또는 발생이 비정상적인 이형성증(dysplasia), 및 골감소증, 골다공증 및 골 손실의 각종 원인이 포함된다. 이러한 증상의 대표적인 예로는 연골무형성증, 쇄골 두개골 이골증, 불완전골생성증, 체중 감소-유발 골 손실, 남성 골다공증, 폐경후 골 손실, 골관절염, 신성 골이영양증, 침윤성 골 장애, 경구 골 손실, 턱의 골괴사, 유선상 과골증, 대사성 골 질환, 장기 이식-관련 골 손실, 신장 이식-관련 골 손실, 허혈성 골 질환 (예, 레그-칼베-페르테스(Legg-Calve-Perthes) 질환, 국부 이동성 골다공증), 글루코코르티코이드-유발 골 손실, 헤파린-유발 골 손실, 특발성 골감소증 또는 골다공증, 선천성 골감소증 또는 골다공증, 국부 골다공증, 골연화증, 인공 관절과 관련된 골 손실, HIV-관련 골 손실, 성장 호르몬의 손실과 관련된 골 손실, 낭성 섬유증과 관련된 골 손실, 화학요법-관련 골 손실, 종양-유발 골손실, 암-관련 골 손실, 호르몬 절제 골 손실, 다발성 골수종, 약물-유발 골 손실, 신경성 거식증, 질환-관련 안면골 손실, 질환-관련 악골 손실, 질환-관련 두개골(skull bone)손실이 포함된다. 추가적인 증상으로는 노화와 관련된 골 손실, 예를 들어 노화와 관련된 안면골 손실, 노화와 관련된 머리뼈 손실, 노화와 관련된 악골 손실, 및 노화와 관련된 두개골 손실이 포함된다.

또한, 본 발명의 조성물은 정형외과 시술, 이식 수술, 관절 대체, 골 이식, 골 미용 수술 및 골 복구, 예를 들어 골절 치유, 불유합 치유, 지연 유합 치유 및 안면 재건술의 결과를 개선하는 데 유용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 고가의 BMP-2를 적은 양을 사용하면서도 골의 재생효과를 발휘할 수 있는 특정 혼합비율을 찾은 것으로, 상기 조성물은 골 재생에 있어 현저한 상승효과(synergy) 뿐 아니라 생체 부작용이 또한 없어 종전의 치료제를 대체하여 효과적인 골 재생을 위한 치료제로서 사용될 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예로 골 재생용 조성물의 처리에 따른 골 재생 효과를 x-ray 및 micro CT(촬영 후 3D 재구성)를 이용하여 확인한 사진이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예로 골 재생용 조성물의 처리에 따른 골 재생 효과를 골 용적량(bone volume)으로 확인한 결과이며,
도 3은 본 발명의 일 실시예로 골 재생용 조성물의 처리에 따른 골 재생 효과를 H&E 염색법으로 확인한 결과이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예로 골 재생용 조성물의 처리에 따른 골 재생 효과를 면역형광 염색법으로 확인한 결과이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예] 골 재생용 조성물 제조

(1) 골 재생용 조성물 준비

제조사의 지시에 따라 멸균된 상태로 동결 건조된 BMP-2(Cowellmedi, Busan, Korea) 0.25 mg이 들어있는 튜브에 멸균된 증류수 250 ㎕를 첨가하여 1 ㎍/㎕의 용액으로 만들었다. COMP-Ang 1((주)이노테라피)은 제조사 제조 1 ㎍/3.33 ㎕를 사용하였다.

골 재생용 조성물은 상기 준비된 BMP-2와 COMP-Ang 1을 혼합하여 제조하였다.

1.5 ㎖ 튜브에 무처리(PBS), BMP-2(7 ㎍), 골 재생용 조성물로 BMP-2 + COMP-Ang 1 (혼합비=1:1)(7 ㎍:7 ㎍), 및 BMP2 + COMP-Ang 1 (혼합비=1:3)(7 ㎍:21 ㎍)로 분주 한 후 상기 sponge에 골고루 퍼져 흡수되게 클린 벤치 내에서 약 5 분 정도 침지시켜 두었다.

(2) 골 재생을 위한 실험

가. 실험 동물

본 실험에서는 체중 20 g 내지 25 g 수컷 생쥐(C57BL/6)를 각 구당 3마리씩 15 마리를 사용하였고, 실험부위로는 두개골을 이용하였다.

나. Sponge 스캐폴드

본 실험에서는 직경 5 ㎜ sponge가 스캐폴드로 사용되었으며, sponge는 생쥐 두개골에 이식하기 전 EO (Ethylene Oxide)가스 소독하여 멸균 처리되었다.

다. 생쥐 두개골 결손부 형성 및 외과적 처치

6주령의 수컷 생쥐 15 마리를 복강주사마취(500 mg/kg, chloral hydrate) 후 두부 절개부위에 면도날로 털을 제거한 다음 무균 적으로 소독하여 수술준비를 하였다. 정중선을 따라 절개를 한 후, 피부 및 골막을 박리하여 두개골을 노출시켰다. 직경 5 mm trephine bur(Fine Science Tools, Foster City, CA, USA)를 이용하여 완전히 개통하여 골 결손부를 형성하였다.

상기 (1)에서 준비한 조성물 즉, 무 처리(PBS), BMP-2, BMP-2 + COMP-Ang 1 (1:1) 및 BMP-2 + COMP-Ang 1(1:3)을 sponge에 흡수 시킨 Sponge 스캐폴드를 천공 부위에 식립한 후, 4-0 수술용 실크를 이용하여 피부를 봉합하였다.

마취에서 회복된 후 사육실로 옮겼으며 사육 실은 실내 온도 22 ± 2℃, 상대습도 60±5%, 12시간 간격 자동 점등 및 소등하였으며, 3 일간 시술 부위에 포타딘을 이용해 소독하였고, 사료와 물은 매일 섭취할 만큼 충분히 공급하였다.

수술 3주 후, x-ray촬영을 통해 뼈 재생 유무를 확인한 다음, CO₂ 가스를 이용 안락사 시킨 후 피부를 절개하고, 두개골을 척출한 다음 조직(골) 시편 제작을 위해 4% formaldehyde 용액에 샘플을 즉시 고정하였다.

상기 제작된 조직(골) 시편을 마이크로 CT(Skyscan-1172, SKYSCAN, Antwerpen, Belgium) 촬영을 시행하였다. 촬영 중에 조직(골) 시편들은 포르말린 용액에 의해 습한 상태로 유지되었으며, 촬영 조건은 하기와 같다.

관전압은 80 kVp, 관전류는 120 μA, 0.5 mm 알루미늄 여과(filtration)를 이용하였고, 화소 크기(pixel size)는 17.09 μm였다. NRecon(SKYSCAN, Antwerpen, Belgium) 프로그램을 이용하여 단면을 재 생성하였다. 재구성한 자료는 2차원 및 3차원의 구조지수가 자동 계산되는 Mimics(version 14.0) 분석 프로그램을 이용하여 3차원 영상을 만들었다.

또한, 뼈 용적량의 측정값은 실험에서 얻어진 자료들의 평균값 및 표준편차를 구하였으며, 일원배치분산분석(one way ANOVA)으로 유의성 검증하였다.

실험 3주 후 뼈의 용적량을 조사한 결과, 도 1 및 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 무처리(control)에서는 뼈 재생이 전혀 되지 않았고, 이에 비해 BMP-2, BMP-2 + COMP-Ang 1 (1:1), 및 BMP-2 + COMP-Ang 1 (1:3)을 처리한 모든 처리구에서는 뼈가 재생되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, BMP-2 + COMP-Ang 1을 처리한 처리구 중 특히, BMP-2 + COMP-Ang 1 (1:3)을 처리한 특정 처리구에서는 BMP-2 처리구에 비해 뼈 재생이 증가율이 약 2배 이상 현저한 뼈 재생효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

라. 조직학적 관찰

절제된 조직(골) 시편을 Calciclear solution(Calci-Clear Rapid, National Diagnostics, Atlanta, GA)에 넣은 다음 4℃ 냉장고에서 탈회를 시행하였다. 4 μm 박절을 통해 표본으로 만들고 골결손부의 골 재생 회복 정도를 파악하기 위해 H&E (hematoxylin&eosin) 염색을 시행하였다.

그 결과, 도 3에서도 확인할 수 있듯이, 상기 도 1 및 도 2의 결과와 같이 BMP-2, BMP-2 + COMP-Ang 1 (1:1), 및 BMP-2 + COMP-Ang 1 (1:3)을 처리한 모든 처리구에서 뼈가 재생되는 것을 확인할 수 있었고, 특히, BMP-2 + COMP-Ang 1 (1:3)을 처리한 특정 처리구에서 가장 많은 뼈 재생을 확인할 수 있었다.

또한, 골 재생과 혈관 형성과의 관계를 확인하고자 내피세포 마커(Endothelial cell marker)인 CD31(PECAM-1, Platelet Endothelial Cell Anhesion Molecule-1), 혈관주위세포 마커(pericyte marker)인 NG2 그리고 BMP-2 작용의 하위단계인 phospho-Smad를 IHC(immunohistochemistry)법을 이용하여 확인하였고, 이는 공 초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰부위의 영상을 확인하였다.

그 결과 도 4에서도 확인할 수 있듯이, 무처리구에서는 혈관 형성 인자는 CD31 및 NG2의 발현이 거의 되지 않는 것을 확인할 수 있었고, 반해 BMP2, BMP2 + COMP-Ang 1 (1:1), 및 BMP2 + COMP-Ang 1 (1:3)을 처리한 처리구에서는 CD31 및 NG2의 발현이 모두 높은 것을 확인할 수 있다.

또한 BMP2 + COMP-Ang 1의 처리구 중 특히, BMP2 + COMP-Ang 1 (1:3)의 처리구에서 CD31 및 NG2이 가장 많이 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었고. phospho-Smad 역시 BMP2 + COMP-Ang 1 (1:3)을 처리한 처리구에서 발현이 높게 증가되어 있음을 확인할 수 있었다.

상기 실험 결과들로부터 본 발명에 따른 조성물은 골 형태형성 단백질-2(BMP-2) 및 연골 저중합체 매트릭스 단백질 안지오포이틴-1(COMP-Ang 1)이 가장 우수한 골 재생 효과를 발휘할 수 있는 특정 비율로 혼합함으로써 고가의 골 형태형성 단백질-2를 적은 양을 사용하면서도 뼈 재생에 있어 현저한 상승효과(synergy)를 확인한 결과로, 이는 종전의 치료제를 대체하여 효과적인 골 재생을 위한 치료제로서 사용될 수 있음을 확인한 결과이다.

Claims (6)

1. 유효성분으로 골 형태형성 단백질-2(Bone morphogenetic protein-2, BMP-2) 및 연골 저중합체 매트릭스 단백질 안지오포이틴-1(Cartilage oligomeric matrix protein-angiopoietin-1, COMP-Ang 1)을 1: 0.5 내지 5의 중량비로 함유하는 골 재생(bone regeneration)용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 유효성분으로 BMP-2와 COMP-Ang 1이 1 : 1 내지 3의 중량비로 혼합되어진 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 두개골의 용적을 증가시킴으로써 골을 재생시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 4항에 있어서,
   상기 골 재생은 CD31 및 NG2 유전자의 발현 증가의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 조직 재생용 임플란트 소재.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration) 또는 골 재생(bone regeneration)에 적용되는 것을 특징으로 소재.

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