KR20140045075A - Antibacterial and antiviral composition comprising cis??cyclo (l??leu??l??pro) or cis??cyclo (l??phe??pro) and methods of preparation thereof - Google Patents

Antibacterial and antiviral composition comprising cis??cyclo (l??leu??l??pro) or cis??cyclo (l??phe??pro) and methods of preparation thereof Download PDF

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Abstract

The present invention provides an antibacterial composition containing <i>cis</i>-cyclo(L-Leu-L-Pro) as an active ingredient and having specific antibacterial activity against the <i>Streptococcus</i> bacteria or the <i>Shigella</i> bacteria, and also provides a pesticide composition, and a method for producing an antibacterial agent. The antibacterial composition of the present invention exhibits excellent antibacterial activity against the <i>Streptococcus</i> or the <i>Shigella</i> bacteria and thereby can be applied to various industrial fields in which the removal and prevention of the <i>Streptococcus</i> or <i>Shigella</i> bacteria are needed. In particular, the use of the antibacterial composition of the present invention is economically advantageous because even a small amount thereof exhibits antibacterial activity. Moreover, the present invention provides an antiviral composition containing <i>cis</i>-cyclo(L-Leu-L-Pro) or <i>cis</i>-cyclo(L-Phe-L-Pro).

Description

시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린) 를 포함하는 항균 및 항바이러스제용 조성물 및 이의 제조 방법{Antibacterial and antiviral composition comprising cis―cyclo（L―Leu―L―Pro）or cis―cyclo（L―Phe―Pro）and methods of preparation thereof}Antimicrobial and antiviral compositions comprising cis-cyclo (L-leucine-L-proline) or cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline) and preparation method thereof Leu-L-Pro or cis-cyclo (L-Phe-Pro) and methods of preparation

본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to novel uses of cis - cyclo (L-leucine-L-proline). More specifically, the present invention includes cis- cyclo (L-leucine-L-proline) as an active ingredient, and relates to a specific antimicrobial composition against Streptococcus or Shigella genus.

본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 및 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하는 항바이러스제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to novel uses of cis - cyclo (L-leucine-L-proline) and cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline). More specifically, the present invention relates to an antiviral composition comprising cis- cyclo (L-leucine-L-proline) or cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) as an active ingredient.

일반적으로, 젖산 발효 효능은 주로 유기산 축적과 기질 산화에 의존을 받는다.[1,2,3] 아세트알데히드, 디아세틸 화합물, 과산화수소 및 이산화탄소와 같은 대사산물은 박테리아균, 병원균 및 부패균의 성장을 억제하는데 중요하다.[1,2,3] 또한, 비-프로테인 기질이 그람 양성균과 곰팡이균 뿐만 아니라 그람 음상균을 억제시키는 것으로 보고되었다.[4] Generally, lactic acid fermentation efficiency is mainly dependent on organic acid accumulation and substrate oxidation. [1,2,3] Metabolites such as acetaldehyde, diacetyl compounds, hydrogen peroxide and carbon dioxide are important in inhibiting the growth of bacterial, pathogenic and rot fungi. [1,2,3] Non-protein substrates have also been reported to inhibit Gram-positive bacteria as well as Gram-positive and fungal bacteria. [4]

최초 저분자량 항생제인 류테리사이클린(Reutericyclin)은 발효빵으로부터 분리된 락토바실러스 류테리 LTH2584(Lactobacillus reuteri LTH2584)로부터 정제되었다. 류테리사이클린은 그람양성균, 그람음성균, 효모균 및 곰팡이와 같은 미생물에 다소 민감하다.[5] 젖산균 또는 유산균(Lactic acid bacteria: LAB)은 오랜 시간 동안 인류 및 동물에 있어 다양한 식량으로 이용되어 왔으며, 효모처럼 음식 발효, 보관및 저장에 있어서 유용하였다.[1,2,3] The first low molecular weight antibiotic, Reutericyclin, was purified from Lactobacillus reuteri LTH2584, isolated from fermented bread. Lytericycin is somewhat susceptible to microorganisms such as gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, yeast bacteria and fungi. [5] Lactic acid bacteria (LAB) have been used for a long time in various foods for humans and animals, and they are useful for fermenting, storing and storing food like yeast. [1,2,3]

LAB는 일반적으로 세포외 길항제 화합물을 분비하여 많은 미생물과 대항하며, 내재성 대사 부산물에 의하여 세포외 환경을 변화시킨다.[6] LAB에 의하여 배설되는 화합물 중에서 다양한 종류의 항균 대사산물은 1000이하의 저분자량 화합물과 1000이하로 평가된 분자량을 가진 박테리오신(bacteriocins)으로 분류될 수 있다.[7] LAB에 의한 항균활성에 대한 많은 연구들은 박테리오신에 초점을 맞추어졌다. LAB가 생산하는 박테리오신은 활성, 작용 모드, 분자량, 유전적 기원 및 생화학적 특성 측면에서 폭 넓은 스펙트럼에 따라 차이를 나타내는 항균 펩타이드와 단백질의 이종(heterogeneous) 그룹 중 한 종류이며,[8,9] 이러한 부류의 펩타이드와 단백질은 성숙 펩타이드(peptide) 및 프리펩타이드(prepeptide)의 서열을 기초로 3개로 분류되었다.[10,11,12,13] 페디오신은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)에 의하여 생산된 것으로 알려져 있는 박테리오신의 한 종류이다.[14] 대부분의 이와 같은 화합물들은 양이온성 분자와 작은 크기의 기질들이 포함된다.[15] 그리고 이런 화합물들은 일반적으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 종(Listeria species) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 그람 양성 몇몇 병원성 균주를 죽일 수 있다.[16,17,18] 또한, 어떤 박테리오신은 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 속과 같은 식품 병원성 균주들을 죽일 수 있다.[19] 지금까지는 사이클릭 다이펩타이드인 프롤린-함유 2,5-디케토피페라진(Proline-containing 2,5-diketopiperazine)가 집중적으로 연구 조사되어져 왔다.[6,20,22,23,24,25,26,27] 이러한 많은 사이클릭 또는 사이클로 다이펩타이드들은 많은 생물학적 이벤트와 현상 측면에서 기질로서 작용하는 것으로 여겨져 왔다.[22,23,24,25,26] 특히, 이와 같은 사이클릭 다이펩타이드의 잠재적인 치료 및 예방 효능은 박테리아균, 곰팡이균, 바이러스 및 암에 대하여 다양한 항생 활성들을 가지는 것으로 판명되었다.[6,23,26,27,28] 또한, 이러한 항균성 사이클릭 다이펩타이드들은 효모, 지의류 및 곰팡이 배양에서 확인되었다.[20,29] 스트렙토마이세스 종으로부터 사이클로(1-류실-1-프로필)과 사이클로(1-페닐알라닐-1-프롤릴)의 분리는 이미 보고되었다.[20,24,25,29] 항균 활성 사이클릭 펩타이드들은 자연계 어디에서나 존재하며 인간을 위한 폭 넓은 다양한 생물학적 타겟에 영향을 미친다.[22,23,25] LAB generally secretes extracellular antagonist compounds to counteract many microorganisms and changes the extracellular environment by endogenous metabolic by-products. [6] Among the compounds excreted by LAB, various kinds of antimicrobial metabolites can be classified into bacteriocins having low molecular weight of less than 1000 and molecular weights of less than 1000. [7] Many studies of antimicrobial activity by LAB have focused on bacteriocins. The bacteriocin produced by LAB is one of the heterogeneous groups of antimicrobial peptides and proteins that differ according to the broad spectrum in terms of activity, mode of action, molecular weight, genetic origin and biochemical properties [8,9] This class of peptides and proteins has been classified into three based on the sequence of mature peptides and prepeptides. [10,11,12,13] Pediosin is a type of bacteriocin known to be produced by Pediococcus pentosaceus . [14] Most such compounds include cationic molecules and small sized substrates. [15], and these compounds may generally kill several gram positive pathogenic strains, such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Listeria species (Listeria species) and Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus). [16,17,18] In addition, some bacteriocins can kill food pathogenic strains such as Escherichia coli and Salmonella spp. [19] Proline-containing 2,5-diketopiperazine, a cyclic dipeptide, has been intensively investigated. [6,20,22,23,24,25,26,27] Many of these cyclic or cyclodipeptides have been considered to act as substrates in many biological events and phenomena. [22,23,24,25,26] In particular, the potential therapeutic and prophylactic efficacy of such cyclic dipeptides has been shown to have a variety of antibiotic activities against bacteria, fungi, viruses and cancer. [6,23,26,27,28] These antimicrobial cyclic di-peptides were also found in yeast, lichens and mold cultures. [20,29] Separation of cyclo (1-leusil-1-propyl) and cyclo (1-phenylalanyl-1-prolyl) from Streptomyces species has already been reported. [20,24,25,29] Antimicrobially active cyclic peptides exist everywhere in nature and affect a wide variety of biological targets for humans. [22,23,25]

따라서, 다양한 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 신규한 물질의 필요성이 요구되고 있다.Therefore, there is a need for novel materials that have a variety of bacteria, in particular Streptococcus (Streptococcus) or a break in Gela (Shigella) Species specific and excellent antimicrobial activity has been desired for.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 다양한 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 신규한 물질을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 다이펩타이드 중 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))이 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타냄을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors have tried to find a novel substance having a variety of bacteria, in particular Streptococcus (Streptococcus) or in specific and excellent antibacterial activity against the rest Gela (Shigella) spp. A cycloalkyl (L- leucine -L- proline) (cis -cyclo (L-Leu -L-Pro)) This shows excellent antibacterial activity against the genus Streptococcus or a break Gela Species - As a result, the dipeptide of cis By clarifying, this invention was completed.

따라서, 본 발명의 목적은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, it is an object of the present invention to include cis- cyclo (L-leucine-L-proline) as an active ingredient, and to provide a specific antimicrobial composition against the genus Streptococcus or Shigella genus.

본 발명의 또 다른 목적은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 농약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a pesticide composition comprising cis- cyclo (L-leucine-L-proline) as an active ingredient and having specific antimicrobial activity against Streptococcus or Shigella genus. It is done.

본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 항균제 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a method for producing an antimicrobial agent against Streptococcus genus or Shigella genus.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 항균용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention comprises cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Leu-L-Pro)) as an active ingredient, Streptococcus genus or Scheu It provides an antimicrobial composition having a specific antimicrobial activity against the genus Gella.

본 발명자들은 다양한 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 신규한 물질을 찾고자 노력하였으며, 그 결과, 다이펩타이드 중 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))이 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 속 균에 대하여 특이적인 항균 활성을 나타냄을 규명하였다.The present inventors have found that a variety of bacteria, in particular Streptococcus (Streptococcus) in or made efforts to find a novel substance having specific and excellent anti-bacterial activity for the rest Gela (Shigella) in bacteria, as a result, the sheath of the dipeptide -cycloalkyl (L -Lucine-L-proline) ( cis -cyclo (L-Leu-L-Pro)) was found to exhibit specific antimicrobial activity against Streptococcus or Shigella genus.

본 발명은 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적이고 우수한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized by having a specific and excellent antibacterial activity against the Streptococcus genus or Shigella genus.

본 발명의 명세서에서 용어 “항균”은 박테리아의 성장 억제, 증식 억제 및 사멸 작용을 의미하며, 본 명세서에서는 용어 “항박테리아”와 혼용되어 사용된다.As used herein, the term "antibacterial" means a growth inhibitory, proliferative and killing action of bacteria, and is used interchangeably with the term "antibacterial" in the present specification.

본 발명에서 유효성분으로 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)은 자연계에 존재하는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)를 포함하며, 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)에 대한 화학구조식은 본 발명의 명세서에서의 도 21에 나타내었다. Cis contained as an effective ingredient in the present invention -cycloalkyl (L- leucine -L- proline) are cis in nature - including a cycloalkyl (L- leucine -L- proline), cis-bicyclo (L- leucine -L Chemical formula for proline) is shown in FIG. 21 in the context of the present invention.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)은 류코노스톡 속(Leuconostoc) 균으로부터 분리된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)이다.According to a preferred embodiment, the sheath contained as an active ingredient of the present invention -cycloalkyl (L- leucine -L- proline), are separated from the sheath flow in the Pocono stock (Leuconostoc) bacteria -cycloalkyl (L- leucine- L-proline).

본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 류코노스톡 속 균으로부터 분리하는 경우, 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), , 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 및 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 균을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 류코노스톡 속 균으로부터 분리하는 경우 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스이다.When the cis- cyclo (L-leucine-L-proline) included as an active ingredient in the present invention is isolated from the genus Leukonstock, the genus Leukonostok is Leuconostoc mesenteroides,, Leuconostoc lactis , and Leuconostoc gelidum is one or more of the genus Leuconost Stock selected from the group consisting of. Preferably, when separating cis- cyclo (L-leucine-L-proline) included as an active ingredient in the present invention from the genus Leukonostock, the genus Leukonostock is leukonostock mesenteroides.

본 발명의 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)은 스트렙토코쿠스 속 균에 대하여 특이적인 항균 활성을 나타낸다. Cis- cyclo (L-leucine-L-proline) of the present invention exhibits specific antimicrobial activity against Streptococcus spp.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 스트렙토코쿠스 속 균은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes) 및 스트렙토코쿠스 비리단스(Streptococcus viridans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 스트렙토코쿠스 속 균이며, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 스트렙토코쿠스 파이오제네스 및 스트렙토코쿠스 아갈락티애로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 스트렙토코쿠스 속 균이고, 가장 바람직하게는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균이다.According to a preferred embodiment of the present invention, Streptococcus spp. In the present invention are Streptococcus pneumoniae , Streptococcus agalactiae , Streptococcus bovis , Streptococcus bovis , Streptococcus oralis , Streptococcus pyogenes and Streptococcus viridans are one or more Streptococcus genus selected from the group consisting of Streptococcus , more preferably Streptococcus Pneumoniae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactia are one or more Streptococcus genus selected from the group consisting of Streptococcus pneumoniae.

또한, 본 발명은 쉬겔라 속 균에 대하여 특이적인 항균 활성을 나타낸다.In addition, the present invention exhibits specific antimicrobial activity against Shigella spp.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 쉬겔라 속 균은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae) 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 쉬겔라 속 균이며, 보다 더 바람직하게는 쉬겔라 디센테리애, 쉬겔라 소네이 또는 이의 모두를 포함하고, 가장 바람직하게는 쉬겔라 디센테리애이다.According to a preferred embodiment of the present invention, Shigella genus in the present invention Shigella sonnei ( Shigella sonnei ), Shigella boydii ( Shigella boydii ), Shigella dysenteriae and Shigella flexneri ( Shigella flexneri ), at least one Shigella genus selected from the group consisting of, even more preferably Shigella decenteria , Shigella sonei or both, and most preferably Shigella descenteri.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 농약 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Leu-L-Pro)) as an active ingredient, Streptococcus ( Streptococcus ) It provides a pesticide composition having a specific antimicrobial activity against the genus or Shigella genus bacteria.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 농약학적 유효량을 포함하는 농약 조성물을 제공한다.The composition of the present invention also provides an agrochemical composition comprising an agrochemically effective amount of cis- cyclo (L-leucine-L-proline) of the present invention as described above.

보다 바람직하게는, 본 발명의 농약 조성물은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 농약학적 유효량; 및 (b) 농약학적으로 허용되는 용매, 담체, 유화제 및 분산제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분 또는 첨가물을 추가적으로 포함하는 농약 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “농약학적 유효량”은 상술한 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)의 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대하여 항균 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.More preferably, the pesticide composition of the present invention comprises an agrochemically effective amount of cis- cyclo (L-leucine-L-proline); And (b) at least one ingredient or additive selected from the group consisting of pesticidally acceptable solvents, carriers, emulsifiers and dispersants. As used herein, the term “agrochemically effective amount” refers to achieving the antimicrobial efficacy or activity against the Streptococcus or Shigella genus of cis- cyclo (L-leucine-L-proline) described above. Means a sufficient amount.

본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 용매를 포함한다. 상기 용매로는 물, 방향족 용매 (예를 들어 솔베소(Solvesso) 제품, 크실렌, 파라핀(예를 들어 광유분획물), 알코올(예를 들어 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알코올), 케톤(예를 들어 시클로헥사논, 감마-부티로락톤), 피롤리돈(NMP, NOP), 아세테이트(글리콜 디아세테이트), 글리콜, 지방산 디메틸아미드, 지방산 및 지방산 에스테르(원칙적으로, 용매 혼합물을 사용할 수도 있음) 등이 포함된다.When the composition of the present invention is produced with an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes a pesticide acceptable solvent. Such solvents include water, aromatic solvents (e.g. Solvesso products, xylenes, paraffins (e.g. mineral oil fractions)), alcohols (e.g. methanol, butanol, pentanol, benzyl alcohol), ketones (e.g. Cyclohexanone, gamma-butyrolactone), pyrrolidone (NMP, NOP), acetates (glycol diacetate), glycols, fatty acid dimethylamides, fatty acids and fatty acid esters (in principle, solvent mixtures may be used), etc. This includes.

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예컨대, 상기 담체로는 예컨대 분쇄된 천연 광물(예를 들어 카올린, 점토, 활석, 백악) 및 분쇄된 합성 광물(예를 들어 고도로 분산된 실리카, 실리케이트)을 포함한다.In addition, when the composition of the present invention is manufactured from an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes a pesticide acceptable carrier. For example, the carrier includes, for example, ground natural minerals (e.g., kaolin, clay, talc, chalk) and ground synthetic minerals (e.g., highly dispersed silica, silicates).

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 유화제를 포함한다. 예컨대, 상기 유화제로는 비이온성 및 음이온성 유화제(예컨대, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 알킬술포네이트 및 아릴술포네이트)를 포함한다.In addition, when the composition of the present invention is manufactured from an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes an agriculturally acceptable emulsifier. For example, the emulsifier includes nonionic and anionic emulsifiers (e.g., polyoxyethylene fatty alcohol ethers, alkyl sulfonates, and aryl sulfonates).

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 분산제를 포함한다. 예컨대, 상기 분산제는 리그닌-술파이트 폐액 및 메틸셀룰로오스를 포함한다.In addition, when the composition of the present invention is manufactured from an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes a pesticide acceptable dispersant. For example, the dispersing agent includes lignin-sulfite waste liquid and methylcellulose.

본 발명은 상기 항균용 조성물에 포함된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))유효성분으로 포함하는 농약조성물이므로, 이 둘과 공통적인 사항은 본 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.The present invention is a pesticide composition containing as an active ingredient cis- cyclo (L- leucine-L-proline) ( cis -cyclo (L-Leu-L-Pro)) contained in the antimicrobial composition, common to both Matters are omitted to avoid undue description herein.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 항균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 항균제 생산 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing lactic acid bacteria, comprising the steps of: (a) culturing lactic acid bacteria to produce a lactic acid bacteria culture; And (b) concentrating the cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Leu-L-Pro)) in the culture medium to a concentration effective to antibacterial. Provided are methods for producing antimicrobial agents against the strains of the genus Streptococcus or Shigella .

바람직하게는, 본 발명의 단계 (a)에서 젖산균으로 류코노스톡 속 균을 이용하는 경우, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 젖산균을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스이다.Preferably, in the case of using the bacteria of the genus Leukonostok as lactic acid bacteria in step (a) of the present invention, the genus Leukonostok is Leuconostoc mesenteroides ( Leuconostoc mesenteroides ), Leuconostoc lactis ( Leuconostoc lactis ) , Leuconostoc gelidum , Leuconostoc paramesenteroides , Leuconostoc citreum , Leuconostoc pseudomesenteroides ( Leuconostoc pseudomesenteroides ) And Leuconostoc holzapfelii. &Lt; Desc / Clms Page number 2 &gt; More preferably, the Leuconostoc bacterium is Leuconostoc mesenteroides.

본 발명에서 단계 (a)에서의 젖산균 배양액을 제조하는 단계는 당업계에서 이용할 수 있는 배지 조성 및 첨가물을 이용하여 실시할 수 있다.In the present invention, the step of producing the lactic acid bacteria culture solution in step (a) can be carried out using the medium composition and the additives available in the art.

본 발명에서 단계 (b)에서의 농축시키는 단계는 배양액으로부터 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 분리 및 정제하여 농축시키는 단계 또는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)이 포함된 배양액을 농축시키는 단계를 포함한다.In the present invention, the step of concentrating in step (b) includes separating and purifying the cis- cyclo (L-leucine-L-proline) from the culture solution or the cis- cyclo (L-leucine-L-proline). Concentrating the cultured solution.

본 발명의 단계 (b)에서 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)를 분리 및 정제는 공지된 다양한 방법을 통하여 실시된다.Separation and purification of cis- cyclo (L-leucine-L-proline) in step (b) of the present invention is carried out through various known methods.

예컨대, 상기 물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻는 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 실시된다.For example, fractions obtained by passing the water through an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. It is carried out through the purification method.

본 발명에서의 표현 “효과적인 농도로 농축”은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)를 포함하는 젖산균 배양액이 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대하여 항균 활성을 나타내는 농도로 농축시키는 것을 의미한다.The expression “concentrated to an effective concentration” in the present invention means that the lactic acid bacteria culture medium comprising cis- cyclo (L-leucine-L-proline) or cis- cyclo (L-leucine-L-proline) is in the Streptococcus genus. Or Shigella ( Shigella ) means that the concentration to the concentration showing the antimicrobial activity against the bacteria.

예컨대, 상기 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 배양액에 포함된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)가 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대하여 효과적인 항균 활성을 나타내는 최소 농도는 2.65 mg(37.86 mM)농도를 의미한다. For example, the cis-bicyclo included in the (L- leucine -L- proline) or culture solution of the cis-bicyclo (L- leucine -L- proline) the streptococcus (Streptococcus) or a break in Gela (Shigella) against Species The minimum concentration that shows effective antimicrobial activity means a 2.65 mg (37.86 mM) concentration.

본 발명은 상기 항균용 조성물에 포함된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)을 포함하는 항균제 생산방법이므로, 이 둘과 공통적인 사항은 본 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.Since the present invention is a method for producing an antimicrobial agent including cis- cyclo (L-leucine-L-proline) included in the antimicrobial composition, the common items between the two are omitted to avoid excessive description of the present specification.

본 발명의 또다른 형태는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro)) 또는 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro)) 을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다. 상기 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)은 이에 제한되는 것은 아니지만 류코노스톡 속(Leuconostoc)으로 균으로부터 분리되어질 수 있다. 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)로 이루어진 군으로부터 선택되어 질 수 있다. 상기 바이러스는 이에 제한되는 것은 아니지만 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 조성물이다.Another aspect of the present invention cis-bicyclo (L- phenylalanine -L- proline) (cis -cyclo (L-Phe -L-Pro)) or cis-bicyclo (L- leucine -L- proline) (cis -cyclo (L-Leu-L-Pro)) relates to an antiviral composition comprising as an active ingredient. The cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) may be isolated from the bacteria as Leuconostoc but not limited to. The Leukonstock stock bacteria are Leuconostoc mesenteroides , Leuconostoc lactis , Leuconostoc gelidum , Leuconostoc paramesenteroides , and Leuconostoc paramesenteroides . Leuconostoc citreum , Leuconostoc pseudomesenteroides ( Leuconostoc pseudomesenteroides ) And Leuconostoc holzapfelii can be selected from the group consisting of. The virus is an antiviral composition, which is not limited thereto, but is influenza A virus (H3N2).

본 발명의 또다른 형태는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro)) 또는 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 의약 조성물이다.Another aspect of the present invention cis-bicyclo (L- phenylalanine -L- proline) (cis -cyclo (L-Phe -L-Pro)) or cis-bicyclo (L- leucine -L- proline) (cis -cyclo (L-Leu-L-Pro)) as an active ingredient and has a specific antimicrobial activity against influenza A virus (H3N2).

본 발명의 또다른 형태는 (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro)) 또는 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 항균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 항바이러스제 생산 방법이다.
Another embodiment of the present invention comprises the steps of (a) culturing the lactic acid bacteria to prepare a lactic acid bacteria culture medium; And (b) cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Phe-L-Pro)) or cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo) in the culture. (L-Leu-L-Pro)) is a method for producing an antiviral agent against influenza A virus (H3N2), characterized in that it comprises the step of concentrating to an effective antimicrobial concentration.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))를 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 항균용 조성물, 농약 조성물 및 항균제 생산방법을 제공한다.(Iii) The present invention comprises cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Leu-L-Pro)) as an active ingredient, Streptococcus genus or Shigella ( Shigella ) provides an antimicrobial composition, pesticide composition and antimicrobial production method having a specific antimicrobial activity against the genus.

(ⅱ) 본 발명은 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라에 대하여 우수한 항균 활성을 나타냄에 따라 스트렙토코쿠스 속 또는 쉬겔라 균을 제거 또는 예방을 필요로 하는 다양한 산업분야에 적용될 수 있으며, 특히 적은 양으로도 항균 활성을 나타내기 때문에 이용면에 있어서 경제적인 장점을 가진다.(Ii) The present invention shows excellent antimicrobial activity against the genus Streptococcus or Shigella, so that the present invention can be applied to various industrial fields requiring the elimination or prevention of Streptococcus or Shigella, especially in small amounts. Since it also exhibits antimicrobial activity, it has economic advantages in terms of use.

(ⅲ) 또한, 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 포함하는 항바이러스제 조성물로서 다양한 바이러스의 치료에 사용가능하다.(Iii) It is also an antiviral composition comprising cis- cyclo (L-leucine-L-proline) or cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline), which can be used for the treatment of various viruses.

(iv) 또한, 본 발명은 다이펩타이드를 이용하는 농약업계 및 의약업계에 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린) 또는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 농약 및 의약으로서의 기초적인 자료를 제공한다.(iv) In addition, the present invention is directed to agrochemical and pharmaceutical industries utilizing dipeptides, which are essential as pesticides and medicines of cis- cyclo (L-leucine-L-proline) or cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline). Provide data.

도 1은 식물 추출물에서의 항균 활성을 비교한 결과이다. 배양액이 포함된 디스크를 다음과 같이 준비하였다. 1번 디스크는 웨이셀라 시바리아(W. cibaria) LBP-B06 배양액이 포함된 디스크이며, 2번 디스크는 락토바실러스 사케이(L. sakei) LBP-S02 배양액이 포함된 디스크이고, 3번 디스크는 락토바실러스 김치아이(L. kimchii) LBP-B02 배양액이 포함된 디스크이며, 4번 디스크는 락토바실러스 플란타룸(Lb. plantarum) LBP-K10 배양액이 포함된 디스크이고, 5번 디스크는 락토바실러스 시트레움 LBP-K11(L. citreum LBP-K11) 배양액이 포함된 디스크이며, 6번 디스크는 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06(L. mesenteroides LBP-K06) 배양이 포함된 디스크이다. 왼쪽 패널은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 지표 균주를 이용한 결과이며, 오른쪽 패널이 대장균(Escherichia coli) 지표 균주를 이용한 결과이다. 모든 실험은 독립적으로 세 번 실행되었다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 정상적인 생장을 600 nm에서의 흡광도와 pH 변화를 나타낸 그래프이다. 28 시간 후, pH(closed circle)와 OD600(open circle)를 2주 동안 유지시켰으며, pH를 pH 3.8 정도로 계속 유지시켰다(왼쪽 패널). 또한, 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 정상 생장 중 항균 활성의 변화를 디스크 확산법(disk diffusion assay)으로 수행하여 관찰하였으며(오른쪽 패널), 하루 동안 배양시킨 후 pH(closed circle)와 항균 활성(open circle)을 일주일 동안 유지시켰다.
도 3은 병원성균들의 생장 저지능력에 대한 결과이다. 배양액을 이용하여 그람 양성균(B. subtilis, L. monocytogens 및 S. aureus), 그람 음성균(S. typhimurium, S. sonnei 및 E. coli)과 기회성 진균으로 병원성을 가진 칸디다 알비칸스(C. albicans)를 한천 플레이트에서 저지환을 관찰하였다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액에서 유도된 비단백성 항균 물질의 열 안정성에 대한 결과이다. 그람 양성균(B. subtilis)과 그람 음성균(E. coli)에서 비단백성 물질의 항균 활성은 여러 조건의 열처리한 배양액과 비교해 볼 때 대조군에 비해 큰 차이가 없이 유사하였고, 이를 디스크 확산법을 통한 생육저지환의 직경을 통해 관찰하였다.
도 5는 단백분해 효소를 처리했을 때 비단백성 항균 물질의 효과를 가지는 배양액의 특징을 나타낸 것이다. 여러 가지 다양한 단백분해 효소를 처리하여 항균 활성을 관찰하였다. 프로테이나아제 K와 키모트립신을 배양액에 처리하였고, 이때 배양액은 분자량 1,000을 기준으로 하기 실시예에서 설명한 바와 같이 YM-1 컷-오프(YM1C)와 YM-1 상청액(YM1S), 그리고 대조군으로 나누어 실험하였다.
도 6은 CH2Cl2를 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10 배양액을 추출한 결과이다. a는 CH2Cl2(methylene chloride)을 이용하여 추출한 후의 상청액의 항균활성을 나타낸 것이며, b는 CH2Cl2없는 배양 상청액의 항균활성을 나타낸 것이고, c는 CH2Cl2(methylene chloride)을 이용하여 추출한 하층액의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 ZORBAX C18 옥타데도실 실리카 하이드로포빅 레진을 이용한 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 세미-프렙 HPLC 분석을 나타낸 결과이다. 각 분획은 액체-액체 추출법에 의해 수집하였다. 이러한 분석 내용은 자외선 파장 210, 260 그리고 280 nm에서 각각 기록하였다. 모든 분획된 물질은 10여개로 각각 나눌 수 있었다. 이렇게 모인 10개의 분획 물질을 하기 실시예에서 기술한 대로 수집하고 농축하였다.
도 8은 최소농도배지법을 활용하여 페디오코쿠스 펜토사세우스(P. pentosaceus)로부터 분획된 시료의 항균활성에 대한 결과이다. 모든 배양액은 CH2Cl2를 이용하여 추출하였고 각 시료는 6-웰 플레이트에 희석법을 이용하여 지표 균주를 놓은 후에 로딩하였다. 최소농도배지법을 수행한 결과 일부 유의적인 항균 활성이 그람 양성균과 그람 음성균에서 동시에 관찰되었다. 최소농도배지법의 수행과정을 위해 분리되지 않은 배양액의 CH2Cl2 하층액을 대조군으로 사용하였다. 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로부터 분획된 시료의 항균 활성은 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)에 대해 적용하여 나타내었다. 분획된 6a, 6b, 7a, 7b, 8, 9, 10에 대한 항균 활성은 7b와 8번 및 10번째 분획된 시료에서 가장 유의적으로 나타났는데, 최소농도배지법에서의 최소농도는 7b와 8번 및 10번에서 각각 1.45 mg (20.71 mM), 1.37 mg (19.6 mM) 그리고 2.35 mg (33.57 mM)이었다.
도 9는 최소농도배지법을 활용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10로부터 분획된 시료의 항균활성에 대한 결과이다. 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10으로부터 분획된 시료의 항균 활성은 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)에 대해 적용하여 나타내었다. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)는 6-웰당 각각 3.0 x 106 CFU (colony forming unit) 을 분주하여 분획된 물질에 대해 테스트하였다. 분획된 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10에 대한 항균 활성은 7b와 8번 및 10번째 분획된 시료에서 가장 유의적으로 나타났는데, 최소농도배지법에서의 최소농도는 7b와 8번 및 10번에서 각각 1.30 mg (20.62 mM), 1.25 mg (17.86 mM) 그리고 2.35 mg (33.57 mM) 이었다.
도 10은 최소농도배지법을 활용하여 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06로부터 분획된 시료의 항균활성에 대한 결과이다.류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06에서 분획된 시료의 항균 활성은 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtils)에 대해 적용하여 나타내었다. 분획된 3, 4, 5, 6a, 6b, 7a, 7b, 8, 9, 10에 대한 항균 활성은 7b와 10번째 분획된 시료에서 가장 유의적으로 나타났는데, 최소농도배지법에서의 최소농도는 7b와 10번에서 각각 1.43 mg (20.43 mM) 그리고 5.50 mg (78.6 mM)이었다.
도 11은 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10 및 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06 균주에서 분획된 물질들의 크로마토그램에 대한 결과이다. 모든 균주는 CH2Cl2 추출법을 이용하여 분획하였다.
도 12는 분리하여 동정한 여러 유산균에 대한 크로마토그램에 대한 결과이다. CH2Cl2 추출 방법을 이용하여 동정된 다양한 유산균 균주들의 세미-프렙 HPLC 크로마토그램을 관찰하였다. 이 실험에서는 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP(Pediococcus pentosaceus MCPP), 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06(Leuconostoc mesenteroides LBP-K06), 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10(Lactobacillus plantarum LBP-K10), 웨이셀라 시바리아 LBP-K15(Weissella cibaria LBP-K15), 웨이셀라 콘푸사 LBP-K16(Weissella confusa LBP-K16), 락토바실러스 사케이 LBP-S01(L. sakei LBP-S01), 락토바실러스 플란타룸/펜토스 LBP-S02(Lactobacillus plantarum/pentos LBP-S02), 락토코쿠스 락티스 LBP-S03(Lactococcus lactis LBP-S03), 락토코쿠스 락티스 LBP-S06(Lactococcus lactis LBP-S06) 및 스타필로코쿠스 시우리 LBP-S07 (Staphylococcus sciuri LBP-S07) 균주들을 이용하였다.
도 13은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 전자충격이온화법(electron ionization, EI)을 이용한 분석 결과이다.
도 14는 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 화학이온화법(chemical ionization, CI)을 이용한 분석 결과이다.
도 15는 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 1H-핵자기공명(500 MHz, 100% DMSO)에 대한 결과이다.
도 16은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 1H-핵자기공명(500 MHz, 10% D2O가 함유된 DMSO)에 대한 결과이다.
도 17은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 13C-핵자기공명(500 MHz, 100% DMSO)에 대한 결과이다.
도 18은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 13C-핵자기공명(500 MHz, 10% D2O가 함유된 DMSO)에 대한 결과이다.
도 19는 X-선 회절법을 이용하여 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 예상 구조식을 나타낸 것이다.
도 20은 X-선 회절법을 이용하여 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 구조식을 나타낸 것이다.
도 21은 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP로부터 분리된 P8의 구조를 최종적으로 나타낸 것이다. 분리된 항균 물질은 C11H18O2N2 분자식을 가진 시스-사이클로(L-Leu-L-Pro)(cis-cyclo (L-Leu-L-Pro)로 확인되었다.
도 22은 분획된 화합물의 항바이러스 효과를 보인다. 항바이러스 활성의 경우 성견 코카스파니엘의 신장(Madin-Darby, canine kidney)에서 수립한 상피유사세포를 이용하였으며 이를 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 3일간 감염시켰다. 실험에 사용된 락토바실러스 플랜타룸 LBP-K10의 세미-프렙 HPLC 분석에서 나온 각각의 분획물을 0.7% 완전 최소 필수배지(complete minimal essential medium, MEM agarose)에 섞어 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 감염시킨 성견 상피세포(MDCK)에 적용하였다. 모든 항바이러스 활성 실험군은 플라크(plaque) 분석을 사용하였다. (A) 대조구; (B) 바이러스 대조구; (C) 8번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (D) 8번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (E) 10번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린); (F) 10번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)
도 23은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 전자충격이온화법(electron ionization, EI)을 이용한 분석 결과이다.
도 24는 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 화학이온화법(chemical ionization, CI)을 이용한 분석 결과이다.
도 25는 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 1H-핵자기공명(600 MHz, 100% DMSO)에 대한 결과이다.
도 26은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 2D HSQC from 1H/13C NMR (600MHz, in 100 % MeOD) 에 대한 결과이다.
도 27은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 2D COSY from 1H/1H NMR (600MHz, in 100 % DMSO (왼쪽) 및 10 % D2O contained DMSO (오른쪽)) 스펙트라에 대한 결과이다.
도 28는 X-선 회절법을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 예상 구조식을 나타낸 것이다.
도 29은 X-선 회절법을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 구조식을 나타낸 것이다.
도 30은 락토바실러스 플란타룸 LBP K-10로부터 분리된 N10의 구조를 최종적으로 나타낸 것이다. 분리된 항균 물질은 C14H16O2N2, 의 분자식을 가진 시스-사이클로(L-Phe-L-Pro)로 확인되었다. 1 is a result of comparing the antimicrobial activity in the plant extract. The disk containing the culture was prepared as follows. The first disk is a W. cibaria , A disc containing LBP-B06 culture medium, and disc 2 is L. sakei Disc containing LBP-S02 culture medium, disc 3 is L. kimchii disc containing LBP-B02 culture medium, disc 4 is Lactobacillus plantarum ( Lb. plantarum ) A disk containing the LBP-K10 culture medium, a disk 5 containing the L. citreum LBP-K11 culture medium, and the disk 6 is a leukonostock mesenteroides LBP-K06 ( L. mesenteroides LBP-K06). The left panel is the result using the Bacillus subtilis indicator strain, and the right panel is the result using the Escherichia coli indicator strain. All experiments were run independently three times.
2 is Lactobacillus plantarum The graph shows absorbance and pH change at 600 nm of normal growth of LBP-K10. After 28 hours, the pH (closed circle) and OD 600 (open circle) were maintained for 2 weeks and the pH was maintained at pH 3.8 (left panel). In addition, Lactobacillus planta Changes in antimicrobial activity during normal growth of LBP-K10 were observed by disk diffusion assay (right panel). After culturing for one day, pH (closed circle) and antibacterial activity (open circle) were maintained for one week .
3 is a result of the growth inhibition ability of pathogenic bacteria. Using the culture medium, Gram-positive bacteria ( B. subtilis, L. monocytogens and S. aureus ), Gram-negative bacteria ( S. typhimurium, S. sonnei and E. coli ) and pathogenic Candida albicans ( C. albicans) ) Was observed in the agar plate.
4 shows the Lactobacillus plantarum This is the result of the thermal stability of the non-mycobacterial antimicrobial material derived from the culture medium of LBP-K10. The antimicrobial activity of non-proteins in Gram-positive bacteria ( B. subtilis ) and Gram-negative bacteria ( E. coli ) were similar to those of heat-treated medium under various conditions without any significant difference. Observation was made through the diameter of the ring.
Figure 5 shows the characteristics of the culture medium having the effect of a non-protein antimicrobial agent when treated with proteolytic enzymes. Antimicrobial activity was observed by treating various proteolytic enzymes. Proteinase K and chymotrypsin were cultured in the culture medium. The culture medium contained YM-1 cut-off (YM1C), YM-1 supernatant (YM1S) and control Respectively.
FIG. 6 shows Lactobacillus plantarum with CH 2 Cl 2 ; LBP-K10 culture medium. a represents the antimicrobial activity of the supernatant after extraction with CH 2 Cl 2 (methylene chloride), b represents the antimicrobial activity of the culture supernatant without CH 2 Cl 2 , c represents CH 2 Cl 2 (methylene chloride) And the antimicrobial activity of the lower layer extracted by using the same.
FIG. 7 shows the results of semi-prep HPLC analysis of Lactobacillus plantarum LBP-K10 using ZORBAX C18 octadedosil silica hydrophobic resin. Each fraction was collected by liquid-liquid extraction. These analyzes were recorded at ultraviolet wavelengths of 210, 260 and 280 nm, respectively. All the fractioned substances were divided into 10 groups. The ten collected fractions were collected and concentrated as described in the following examples.
8 is a result of the antimicrobial activity of the sample fractionated from P. pentosaceus using the minimum concentration medium method. All cultures were extracted using CH 2 Cl 2 and each sample was loaded after placing indicator strains using dilution in 6-well plates. Some significant antimicrobial activity was observed in Gram-positive and Gram-negative bacteria at the same time. For the execution of the minimum concentration method, the undiluted CH 2 Cl 2 sublayer was used as a control. The antimicrobial activity of the sample fractionated from Pediococcus pentosaceus was shown by application to Bacillus subtils , a Gram-positive bacterium . The antimicrobial activity of the fractions 6a, 6b, 7a, 7b, 8, 9, and 10 was most significant in the 7b, 8th and 10th fractions, and the minimum concentration in the minimum concentration was 7b and 8 At times 10 and 1.45 mg (20.71 mM), 1.37 mg (19.6 mM) and 2.35 mg (33.57 mM), respectively.
9 is a Lactobacillus plantarum utilizing the minimum concentration method. Results for antimicrobial activity of samples fractionated from LBP-K10. The antimicrobial activity of the samples fractionated from Lactobacillus plantarum LBP-K10 was shown by application to Bacillus subtils, a Gram-positive bacterium. Bacillus subtils were tested for fractionated material by dispensing 3.0 x 10 6 CFU (colony forming units) per 6 -well each. The antimicrobial activity of the fractions 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, and 10 was most significant in the 7b, 8th and 10th fractions, and the minimum concentration in the minimum concentration was 7b. And at 8. and 10, 1.30 mg (20.62 mM), 1.25 mg (17.86 mM) and 2.35 mg (33.57 mM), respectively.
Figure 10 shows the results of the antimicrobial activity of the samples fractionated from Leukonostock mesenteroides LBP-K06 using the minimum concentration method. Applicable to the Bacillus subtils (Bacillus subtils) is shown. Antimicrobial activity against the fractions 3, 4, 5, 6a, 6b, 7a, 7b, 8, 9, and 10 was most significant in the 7b and 10th fractions. At 7b and 10, they were 1.43 mg (20.43 mM) and 5.50 mg (78.6 mM), respectively.
FIG. 11 is the result of the chromatogram of the substances fractionated from Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum LBP-K10 and Leukonostock Mesenteroides LBP-K06 strains. All strains were fractionated using CH 2 Cl 2 extraction.
12 is a result of chromatograms of various lactic acid bacteria identified separately. Semi-prep HPLC chromatograms of various lactic acid bacteria strains identified using the CH 2 Cl 2 extraction method were observed. In this experiment, Pediococcus pentosaceus MCPP , Leukonostoc mesenteroides LBP-K06, and Lactobacillus plantarum LBP-K10, Lactobacillus plantarum LBP-K10 Weissella cibaria LBP-K15 ( Weissella cibaria LBP-K15), Weissella confusa LBP-K16 ( L. sakei LBP-S01), Lactobacillus planta Lactobacillus plantarum / pentos LBP-S02, Lactococcus lactis LBP-S03, Lactococcus lactis LBP-S06 and Lactococcus lactis LBP-S06 Staphylococcus sciuri LBP-S07 strains were used.
FIG. 13 shows the results of analysis using electron ionization (EI) of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP.
FIG. 14 shows analysis results of chemical ionization (CI) of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP.
FIG. 15 shows the results for 1 H-nuclear magnetic resonance (500 MHz, 100% DMSO) of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP.
FIG. 16 is the result of 1 H-nuclear magnetic resonance (500 MHz, DMSO with 10% D 2 O) of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP.
FIG. 17 shows the results for 13 C-nuclear magnetic resonance (500 MHz, 100% DMSO) of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP.
FIG. 18 shows the results for 13 C-nuclear magnetic resonance (500 MHz, DMSO with 10% D 2 O) of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP.
FIG. 19 shows the expected structural formula of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP using X-ray diffraction.
FIG. 20 shows the structural formula of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP using X-ray diffraction.
FIG. 21 finally shows the structure of P8 isolated from Pediococcus pentosaceus MCPP. Separate the antimicrobial material is cis with N 2 molecular formula C 11 H 18 O 2 - was confirmed by cyclo (L-Leu-L-Pro ) (cis -cyclo (L-Leu-L-Pro).
Figure 22 The antiviral effect of the fractionated compound is shown. In the case of antiviral activity, epithelial-like cells established in the dog's kidney (Madin-Darby, canine kidney) were used and infected with influenza A virus (H3N2) for 3 days. Each fraction from the semi-prep HPLC analysis of Lactobacillus Plantarum LBP-K10 used in the experiment was mixed with 0.7% complete minimal essential medium (MEM agarose) and infected with influenza A virus (H3N2). Applied to epithelial cells (MDCK). All antiviral activity groups used plaque assay. (A) control; (B) virus control; (C) 8th fraction, 5.0 mM cis-cyclo (L-leucine-L-proline); (D) 8th fraction, 10.0 mM cis-cyclo (L-leucine-L-proline); (E) 10th fraction, 5.0 mM cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline); (F) 10th fraction, 10.0 mM cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline)
FIG. 23 shows the results of analysis using electron ionization (EI) of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10.
FIG. 24 shows the results of analysis using chemical ionization (CI) of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10.
FIG. 25 shows the results for 1 H-nuclear magnetic resonance (600 MHz, 100% DMSO) of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10.
FIG. 26 is the result for 2D HSQC from 1 H / 13 C NMR (600MHz, in 100% MeOD) of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10.
27 is a 2D COSY from 1 H / 1 H NMR (600 MHz, in 100% DMSO (left) and 10% D 2 O contained DMSO (right)) spectra of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10 Is the result.
FIG. 28 shows the expected structural formula of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10 using X-ray diffraction.
FIG. 29 shows the structural formula of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10 using X-ray diffraction.
30 finally shows the structure of N10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP K-10. The isolated antimicrobial material was identified as cis -cyclo (L-Phe-L-Pro) with a molecular formula of C 14 H 16 O 2 N 2 .

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for describing the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

<실시예 1> 식물 물질로부터 LAB(lactic acid bacteria)의 분리 및 동정 Example 1 Isolation and Identification of LAB (Lactic Acid Bacteria) from Plant Material

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.Throughout this specification, unless otherwise indicated, “%” used to indicate the concentration of a particular substance is solid / solid (weight / weight)%, solid / liquid (weight / volume)%, and Liquid / liquid is (volume / volume)%.

재료 및 방법Materials and methods

실험 균주 및 유산균 분리Isolation of experimental strains and lactic acid bacteria

갓 김치와 돌나물 김치 및 배추 김치로부터 다양한 유산균들을 분리하였다. 준비된 각각의 재료를 믹서기로 갈아서, 갓 김치와 돌나물 김치의 경우에는 5% NaCl을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것으로 나누었고, 각각 4℃, 22℃ 및 30℃에서 보관하였다. 모든 식물 실험군은 1달 동안 24시간 간격으로 시료를 검체하였고, 각 실험군의 농도를 멸균한 증류수에 적당하게 희석하여 유산균 분리 배지인 MRS(de Mann Rogosa Sharpe) 고체 배지에 도말한 후, 30℃에서 2-3일 정도 배양하였다. 배양 후 잘 분리된 균체를 선별하여 16s rDNA 염기서열법을 수행하였으며, 유전체 정보와 비교하기 위해 액체 MRS 배지에 재배양하였다.
Various lactic acid bacteria were isolated from fresh kimchi, sedum kimchi and Chinese cabbage kimchi. Each of the prepared materials was grinded with a blender, and in the case of freshly prepared kimchi and garlic kimchi, it was divided into those with and without 5% NaCl, and stored at 4 ° C, 22 ° C and 30 ° C, respectively. All plant experimental groups were sampled at 24 hour intervals for one month, and the concentration of each experimental group was appropriately diluted in sterile distilled water and plated on MRS (de Mann Rogosa Sharpe) solid medium, which is a lactic acid bacteria separation medium, at 30 ° C. Incubate for 2-3 days. 16s rDNA sequencing was performed by selecting well - isolated microorganisms and cultured in liquid MRS medium for comparison with genome information.

분리된 유산균의 동정Identification of isolated lactic acid bacteria

본 실험에서는 발효된 식물에서 분리된 유산균을 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 결정법을 통해 유산균들을 동정하였다. PCR(중합효소연쇄반응)을 위한 프라이머로는 일반적인 진정세균을 대상으로 하는 프라이머로서 27F(5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’(서열번호 1))와 1492R(5’-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’(서열번호 2))을 이용하였다. PCR반응은 94℃에서 5분간 프리-디네이쳐레이션(pre-denaturation) 과정을 거친 후, 94℃에서 1분간 디네이쳐레이션(denaturation), 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 익스텐션(extention) 과정을 30회 거쳐 최종적으로 72℃에서 7분간 엑스트라-익스텐션(extra-extention)을 해주었으며, 4℃에서 보관하였다. 중합효소연쇄반응 후 0.7% 아가로오스 젤 전기영동으로 증폭된 16S rDNA를 확인하고 DNA를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 선별된 균주의 16S rDNA 염기서열의 상동관계는 NCBI의 뉴클레오타이드 BLAST 프로그램을 이용하여 비교하였다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
In this experiment, lactic acid bacteria were identified by 16S rDNA sequencing method for identification of lactic acid bacteria isolated from fermented plants. As primers for PCR (polymerase chain reaction), 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '(SEQ ID NO: 1)) and 1492R (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3 '(SEQ ID NO: 2)) was used. PCR was performed by pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 1 minute, annealing at 72 ° C for 1 minute The extensions were extruded for 30 minutes at 72 ° C for 7 minutes, and stored at 4 ° C. After PCR, 16S rDNA amplified by 0.7% agarose gel electrophoresis was identified and DNA was isolated and sequenced. The homology of the 16S rDNA sequences of the selected strains was compared using the NCBI nucleotide BLAST program ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).

항균 활성 시험 및 배양 조건을 위한 표준 세균 균주, 다제내성 그람-양성 및 그람-음성 세균 균주Standard bacterial strains, multidrug resistant Gram-positive and Gram-negative bacterial strains for antimicrobial activity testing and culture conditions

분리된 젖산균 균주들중에서, Lb. plantarum LBP-K10을 본 발명에서 주로 사용하였다. Lb. plantarum LBP-K10를 포함하는 모든 분리된 젖산균 균주는 변형된 MRS(mMRS) 브로스 또는 1.7% 고형 아가 배지(Difco laboratory, Detroit, MI)를 사용하였다. 본 발명에서는 LAB에 의해 생성되는 항균 물질을 찾아내기 위해 한국의 전통적인 발효 식물 물질로부터의 Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum 및 Leuconostoc mesenteroides 같은 분리된 젖산균주를 사용하였다. 그리고 항균 활성을 관찰하기 위해 그람 양성 세균 대조 균주로서 B. subtilis, S. areus, L. innocua, S. pneumoniae 및 그람 음성 대조 균주로서 E. coli, S. typhimurium, S. sonnei를 항균 지표 균주로 사용하였다. 더욱이 한국의 국립보건원의 인간의 시로타입 19A의 뇌척수액으로부터 분리되고, 페니실린, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 클린다마이신에서 저항성을 보이는 Streptococcus pneumonia 14596, 대한민국 국립보건원의 인간 시로타입 B의 대변으로부터 분리되고, ACSSuT, H1: 1 및 H2:1.2에 저항성을 보이는 Salmonella typhimurium 12219 및 옥사실린 (MEC A+)에 저항성을 보이는 메티실린-저항성 Staphylococcus aureus(methicillin-resistant Staphylococcus aureus ; MRSA) 11471, 이들 모든 세 개의 다제내성 세균을 분리된 항세균 화합물의 최소 저해 농도(MIC)에 사용하였다. 리스테리아 속(Listeria spp.)을 제외한 대부분의 병원성 균주들을 루리아-베르타니(Luria-Bertani: LB) 브로스(1 % tryptone, 0.5 % yeast extract, 1 % NaCl)에서 배양하였고, 리스테리아속은 브레인 하트 인퓨젼(Brain Heart infusion) 배양액(Difco, Laboratories, Detroit, MI)에서 따로 배양하였다. 그리고 모든 세균 세포를 MRS에서 배양하였다. 약 0.1 ~ 0.2%의 시딩 이노큘럼(seeding inoculum)을 교반 또는 흔들어줌이 없이 3일 동안 30 ℃에서 배양하였다. 생장된 세포를 두번 15분 동안 8000 rpm에서 원심분리하여 수확하였다. 배양 상등물(Culture supernatant; CS)는 항균활성 분석을 위해 사용되었고, 추가로 정제하였다.
Among the lactic acid bacteria strains isolated, Lb. plantarum LBP-K10 was mainly used in the present invention. Lb. All isolated lactic acid bacteria strains including plantarum LBP-K10 used modified MRS (mMRS) broth or 1.7% solid agar medium (Difco laboratory, Detroit, MI). In the present invention, isolated lactic acid strains such as Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and Leuconostoc mesenteroides from Korean traditional fermented plant material were used to find antimicrobial substances produced by LAB. In order to observe the antimicrobial activity, B. subtilis, S. areus, L. innocua, S. pneumoniae as Gram-positive bacterial control strains and E. coli, S. typhimurium and S. sonnei as Gram-negative control strains Used. Furthermore, it is isolated from the cerebrospinal fluid of human Serotype 19A of the National Institutes of Health, and isolated from the stool of Streptococcus pneumonia 14596, which is resistant to penicillin, erythromycin, tetracycline, and clindamycin, from the stool of human sirotype B of the National Institutes of Health, H1: 1 and H2: 1.2 methicillin showing visible resistance to Salmonella typhimurium 12219 and published oxazole (MEC a +) are resistant to-resistant Staphylococcus aureus (methicillin-resistant Staphylococcus aureus ; MRSA) 11471, all of these three multidrug resistant bacteria The minimum inhibitory concentration (MIC) of the isolated antibacterial compound was used. Most of the pathogenic strains except Listeria spp. Were cultured in Luria-Bertani (LB) broth (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl), and Listeria spp. (Brain Heart infusion) Cultures (Difco, Laboratories, Detroit, MI) were incubated separately. And all bacterial cells were incubated in MRS. Seeding inoculum of about 0.1-0.2% was incubated at 30 ° C. for 3 days without agitation or shaking. The grown cells were harvested twice by centrifugation at 8000 rpm for 15 minutes. Culture supernatants (CS) were used for antimicrobial activity analysis and further purified.

항균 활성 평가Evaluation of antimicrobial activity

항균 활성을 알아보기 위하여 배지희석법(broth microdilution test), 디스크 확산법(disk diffusion assay) 및 길항작용법(antagonism test)을 실시하였다. Broth microdilution test, disk diffusion assay and antagonism test were performed to investigate antimicrobial activity.

각각의 실험 방법은 다음과 같다.Each experimental method is as follows.

배지희석법은 농축된 배양상등액을 연속 희석하여 수행하였고, 미생물 지표 균주에 활성이 있는지를 살펴 보았다. 항균 활성을 관찰하기 위해 길항작용법의 경우에는 24 시간 배양된 LAB 세포가 OD600 = 1.0 으로 최적화 하였고 1 ㎕로 MRS 아가 플레이트에 점적 되었고 30℃에서 24시간 동안 배양되었다. 그 이후 3 ~5시간 미리 배양해 둔 지표 균주를 MRS 아가 플레이트가 점적된 LAB위에 올려졌다. 30℃에서 1일 배양한 후 성장제한영역은 지름(mm)으로 계산하였다. Medium dilution was performed by serial dilution of the concentrated culture supernatant, and examined whether the microbial indicator strain was active. In the case of antagonism in order to observe the antimicrobial activity, LAB cells cultured for 24 hours were optimized to OD 600 = 1.0, 1 μl was deposited on MRS agar plate and incubated for 24 hours at 30 ℃. Since then, the indicator strains incubated for 3 to 5 hours were placed on the LAB in which MRS agar plates were dipped. After incubation at 30 ° C. for one day, the growth restriction area was calculated as the diameter (mm).

디스크 확산법은 배양상등액(CS)이나 항균물질이 사용되었고 6 ㎜의 종이 디스크(Toyo Roshi kaisha, ltd)에 점적시키고, 3-5시간 배양시킨 지표 균주가 1%의 적절한 몰튼 아가에 접종하였다. 아가 플레이트를 굳힌 후, 스팟팅한 디스크 페이퍼(disk paper)를 아가 플레이트 상에 놓았고 적절한 온도에서 24시간 동안 배양했다. 항균활성은 지름(mm)으로 생육 저지환을 측정하였다.
As the disk diffusion method, culture supernatant (CS) or antimicrobial material was used and dipped onto 6 mm paper disk (Toyo Roshi kaisha, ltd), and the indicator strain incubated for 3-5 hours was inoculated into 1% of the appropriate Morton agar. After the agar plate was hardened, the spotted disk paper was placed on the agar plate and incubated for 24 hours at the appropriate temperature. The antimicrobial activity was measured for growth inhibition ring by diameter (mm).

LAB 생장에 따른 pH와 항균 활성의 변화Changes in pH and Antimicrobial Activity According to LAB Growth

밤사이에 배양해 놓은 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10를 변형 MRS 브로스에 1.0%로 접종하여 30℃에서 정치 배양하였다. 접종 후 휴지기(stationary phase)로 진입할 때까지 4시간 마다 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 원심분리 후 상층액을 얻어 pH와 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 상기 설명한 배지희석법(broth microdilution test), 디스크 확산법(disk diffusion assay) 및 길항작용법(antagonism test)을 사용하여 접종 후 일주일 동안 24시간마다 수행하였다.
Lactobacillus planta room incubated during the night LBP-K10 was inoculated in a modified MRS broth at 1.0% and was subjected to stationary culture at 30 占 폚. After inoculation, the absorbance was measured at 600 nm every 4 hours until entering the stationary phase. After centrifugation, the supernatant was collected and the pH and antimicrobial activity were measured. Antibacterial activity was performed every 24 hours for one week after inoculation using the broth microdilution test, disk diffusion assay and antagonism test described above.

단백질 분해 효소의 효과에 대한 분석Analysis of the effects of proteolytic enzymes

세포외 단백질성 및 비-단백질성 물질이 병원성 미생물에 활성이 있는지 없는지, CS(아세테이트 막 YM-1을 이용하여 여과됨, 분자량 1,000 미만 및 1,000 초과)의 단백질 분해효소에 대한 민감도를 프로테이나아제 K(proteinase K, Sigma-Aldrich, Inc., USA), 키모트립신(chymotrypsin, Boehringer Mannheim GmbH., Germany) 및 트립신(trypsin, Sigma-Aldrich, Inc., USA)을 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션한 프로테이나아제 K를 제외한 나머지는 실온(25℃)에서 최종 농도 1 ㎎/㎖로 맞추어 처리하여 관찰하였다. 적절한 시간을 항온반응한뒤 혼합물을 변성시키고 이들 단백질 효소를 불활성화 시키기 위하여 5분 동안 95℃에서 열처하였다. 그리고 항균 활성은 상기 설명한 바와 같이 디스크 확산법을 사용하여 결정하였다.
Whether the extracellular proteinaceous and non-proteinaceous material is active against pathogenic microorganisms, proteinases of CS (filtered using acetate membrane YM-1, molecular weight less than 1,000 and greater than 1,000) for proteinases Incubate agent K (proteinase K, Sigma-Aldrich, Inc., USA), chymotrypsin (Boehringer Mannheim GmbH., Germany) and trypsin (trypsin, Sigma-Aldrich, Inc., USA) at 37 ° C. for one hour The remainder except for one proteinase K was observed by treatment at a final concentration of 1 mg / ml at room temperature (25 ° C). After incubating the appropriate time, the mixture was denatured and incubated at 95 ° C. for 5 minutes to inactivate these protein enzymes. And antimicrobial activity was determined using the disk diffusion method as described above.

항세균 물질에 대한 열처리Heat treatment for antibacterial material

항균성 물질의 활성에 대한 온도의 영향을 연구하기 위해서, CS를 100℃ 워터 배스(water bath)에서 60분, 120분, 그리고 121℃에서 오토클레이브(autoclave)를 사용하여 15분 동안 열처리에 노출시켰다. 샘플을 활성 분석을 수행하기 전에는 상온에 두었다. CS를 대조군으로 이용했다. 고온으로 처리후 남아있는 항균 활성을 디스크 확산 분석법을 이용하여 측정했다.
To study the effect of temperature on the activity of the antimicrobial material, CS was exposed to heat treatment for 60 minutes, 120 minutes in a 100 ° C. water bath, and 15 minutes using an autoclave at 121 ° C. . Samples were left at room temperature before activity analysis was performed. CS was used as a control. Antimicrobial activity remaining after treatment at high temperature was measured using a disk diffusion assay.

항세균 물질의 분리 준비Separation preparation of antibacterial material

분리된 Lb. plantarum LBP-K10로부터, 항균성 화합물을 변형된 MRS(mCS)를 이용하여 CS로부터 정제하고 특성을 규명하기 위해서 지정했다. mMRS는 하기와 같은 구성요소를 포함했다:Isolated Lb. From plantarum LBP-K10, antimicrobial compounds were designated for purification and characterization from CS using modified MRS (mCS). mMRS included the following components:

1 리터 당 10g의 펩톤, 2g의 암모늄 시트레이트, 5g의 나트륨 아세테이트, 0.1g의 마그네슘 설페이트, 0.05g의 망간 설페이트, 2g의 다이포타슘 포스페이트, 5g의 이스트 추출물 및 20g의 포도당.10 g peptone, 2 g ammonium citrate, 5 g sodium acetate, 0.1 g magnesium sulfate, 0.05 g manganese sulfate, 2 g dipotassium phosphate, 5 g yeast extract and 20 g glucose per liter.

D-포도당을 기타 공급원과 혼합 전에 각각 멸균했다. CS를 3일 동안 mMRS에서 배양된 Lb . plantarum LBPK-10로부터 수득하고(P. pentosaceus 및 Lc.Mesenteroides에도 동일) 상술한 바와 같이 8000rpm에서 30분 동안 원심분리를 하였다. Lb.plantarum LBPK-10 균주를 10배로 농축한 후 동결건조(freeze-drying)하였고 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2)로 액체-액체 추출법에 의해 분별 깔때기(separating funnel)를 이용하여 약 1일 동안 추출하고 55℃에서 증발기로 탈수했다. 획득된 분리 유기상(organic phase)을 수득하고 유기 용매를 증기로 제거했다. 또한, 수성상(aqueous phase)만을 그것의 활성을 유기상 및 CS와 비교하기 위해서 수득했다. 이 용리제(eluent)를 C18 SPE 카트리지(Waters Sep-pak C18 plus cartridge, Millipore Corp., Marlborou, MA)를 통과시켰다. 용출된 샘플을 SPE 카트리지 상에 로딩했고, 100% 메탄올의 등용매(isocratic flow)를 이용함으로써 운용했다. SPE 상에 샘플을 로딩하기 전에, 카트리지를 활성화했고 15ml MeOH 및 연속되는 15ml의 물 100%로 세척했다. 그 후, 샘플 로딩을 수행했고 100% 물로 세척했다. 최종 용출을 SPE 카트리지를 통해 100% MeOH에 의해 수행했다. 용출된 샘플을 수집하고 남아있는 유기용매를 제거하기 위해서 증발시켰다. 각각의 농축된 샘플을 하기의 HPLC 단계를 위해 적절한 양의 멸균된 TDW로 용해했다.
D-glucose was sterilized before mixing with other sources, respectively. The Lb mMRS cultured in the CS for three days. plantarum Obtained from LBPK-10 ( P. pentosaceus) And Lc . Mesenteroides )) As described above, centrifugation was performed at 8000 rpm for 30 minutes. Lb.plantarum LBPK-10 strains were concentrated 10-fold and then freeze-dried and extracted with methylene chloride (CH 2 Cl 2 ) for about 1 day using a separating funnel by liquid-liquid extraction. And dehydrated by an evaporator at 55 ° C. The obtained separated organic phase was obtained and the organic solvent was removed by steam. In addition, only the aqueous phase was obtained to compare its activity with the organic phase and CS. This eluent was passed through a C18 SPE cartridge (Waters Sep-pak C18 plus cartridge, Millipore Corp., Marlborou, Mass.). The eluted sample was loaded onto an SPE cartridge and operated by using an isocratic flow of 100% methanol. Prior to loading the sample onto the SPE, the cartridge was activated and washed with 15 ml MeOH and successive 15 ml of water 100%. Thereafter, sample loading was performed and washed with 100% water. Final elution was performed with 100% MeOH through SPE cartridge. Eluted samples were collected and evaporated to remove remaining organic solvent. Each concentrated sample was dissolved in the appropriate amount of sterile TDW for the following HPLC steps.

고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 통한 항균 물질의 분리Isolation of Antimicrobial Agents by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Analysis

추출된 물질을 적절한 양의 증류수로 용해시키고 0.22μm 아세테이트 셀룰로오스 막으로 여과했다. 여과된 샘플을 ODS C-18 칼럼(octadedosyl-C18 hydrophobic semi-preparative column)(9.4 × 250mm, Agilent, USA)을 이용한 HPLC(High Performance Liquid Chromatography(semi-prep HPLC system, Agilent 1200 series, USA)) 시스템에 의해 분석하고 분리했다. 칼럼 온도를 40℃로 고정하고, 이동상은 35분 동안 67% 물, 3% 아세토나이트릴(ACN) 및 30% 메탄올이었다. 유속은 1.5ml/분이고 파장은 210nm, 260nm 및 280nm에서 UV 다중파장 감지 시스템(UV multi-wavelength detector system)을 이용하여 각각 관찰하였다. 각각의 분말 샘플을 수득하기 위해서, 분리된 각각의 피크 프랙션(fraction)을 증발 및 동결건조에 의해 수집하고, 농축했다.
The extracted material was dissolved in an appropriate amount of distilled water and filtered through a 0.22 μm acetate cellulose membrane. Filtered samples were subjected to HPLC (High Performance Liquid Chromatography (semi-prep HPLC system, Agilent 1200 series, USA)) using an ODS C-18 column (octadedosyl-C18 hydrophobic semi-preparative column) (9.4 × 250 mm, Agilent, USA). Analyze and isolate by system. The column temperature was fixed at 40 ° C. and the mobile phase was 67% water, 3% acetonitrile (ACN) and 30% methanol for 35 minutes. The flow rate was 1.5 ml / min and the wavelengths were observed using an UV multi-wavelength detector system at 210 nm, 260 nm and 280 nm, respectively. In order to obtain each powder sample, each of the separated peak fractions were collected by evaporation and lyophilization and concentrated.

최소배지농도법(MIC)을 이용한 항균 활성의 측정Determination of Antimicrobial Activity by Minimum Medium Concentration Method (MIC)

분획 물질(fractionation)들을 HPLC를 이용하여 각각 수집한 후, 각각의 획득되어진 샘플을 최소 억제적 농도(minimum inhibitory concentration; MIC) 시험에 의해서 그 활성을 인용문헌에서처럼[Mathur et al., 2005; Messens et al., 2002] 체크했다. 이렇게 분획된 샘플들 중에서, 최고의 활성을 갖는 적절한 피크의 분획(fraction)을 동일 절차에 의해 추가 정제하고 이후 단일 화합물을 수득했다. 이것은 GC/MS, 원소 분석(elemental analysis), NMR 분광법 및 X-선 결정법(X-ray crystallography)등의 다양한 분석법에 의해 추가 분석될 수 있었다.
After each fractionation was collected using HPLC, each obtained sample was tested for its activity by a minimum inhibitory concentration (MIC) test as in the literature [Mathur et al., 2005; Messens et al., 2002]. Of the so fractioned samples, the fraction of the appropriate peak with the highest activity was further purified by the same procedure to afford a single compound. It could be further analyzed by various analytical methods such as GC / MS, elemental analysis, NMR spectroscopy and X-ray crystallography.

세포 배양 및 바이러스 균주, 배지 및 배양 조건Cell Culture and Virus Strains, Media and Culture Conditions

DMEM(v/v)의 완전 조성은 다음과 같다. 76.5% DMEM(높은 포도당, Hyclone Laboratories, USA), 1.0% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, USA), 2.5% 1.0 M HEPES 완충용액, 둘베코의 인산-완충된 생리식염수(7.5% DPBS)내의 우혈청으로부터의 멸균된, BioXtra, 세포배양에 적합한 2.5% 알부민 용액(Sigma, USA) 및 10.0% 우태아 혈청 (FBS) (NOVA, USA).
The complete composition of DMEM (v / v) is as follows. Bovine serum in 76.5% DMEM (high glucose, Hyclone Laboratories, USA), 1.0% penicillin / streptomycin (Gibco, USA), 2.5% 1.0 M HEPES buffer, Dulbecco's phosphate-buffered saline (7.5% DPBS) Sterilized, BioXtra, 2.5% albumin solution (Sigma, USA) and 10.0% fetal bovine serum (FBS) (NOVA, USA) suitable for cell culture.

또한 VIM은 94.0% DMEM(높은 포도당)(Hyclone Laboratories, USA), 1.0% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, USA), 2.5% 1.0 M HEPES 완충용액(Gibco, USA), 둘베코의 인산-완충된 생리식염수(7.5% DPBS)내의 우혈청으로부터의 멸균된, BioXtra, 세포배양에 적합한 2.5% 알부민 용액(Sigma, USA) 및 10.0% 우태아 혈청 (FBS) (NOVA, USA) 및 0.1% 토실 페닐알라닌 클로로메틸 케톤-처리된 트립신( tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin (TPCK-treated trypsin) (2㎍/ml). VIM 아가로스는 플라크 분석을 위해 2X VIM에 부가하여 1.4% 아가로스SEG(TNT research, Korea)로부터 최종 0.7% VIM 아가로스로 사용하였다.
VIM also contains 94.0% DMEM (high glucose) (Hyclone Laboratories, USA), 1.0% penicillin / streptomycin (Gibco, USA), 2.5% 1.0 M HEPES buffer (Gibco, USA), Dulbecco's phosphate-buffered physiology Sterilized from bovine serum in saline (7.5% DPBS), BioXtra, 2.5% albumin solution (Sigma, USA) and 10.0% fetal bovine serum (FBS) (NOVA, USA) and 0.1% tosyl phenylalanine chloromethyl suitable for cell culture Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin (TPCK-treated trypsin) (2 μg / ml) .VIM agarose was added to 2X VIM for plaque analysis by adding 1.4% agarose SEG (TNT research, Korea) From the final 0.7% VIM agarose.

항바이러스 활성 테스트-플라크 분석 방법Antiviral Activity Test-Plaque Assay

a. MDCK 세포 배양 조건a. MDCK Cell Culture Conditions

항바이러스 테스트를 이전 연구와 같이 플라크(plaque)을 계수하여 수행했다[Gaush et al., 1968; Huprikar et al., 1980; Chapel et al., 2006; Chapel et al., 2007;Furuta et al., 2009]. 항바이러스 활성을 관찰하기 위하여, 개의 신장의 마딘 다비 케인 신장(Madin Darby canine kidney; MDCK)의 상피세포를 본 발명의 실시예에서 항바이러스 지표로 이용했다. 플라크-정제된 야생형 인플루엔자 바이러스 세포당 5 pfu의 세미콘플루언트 모노레이어의 5 x 105 세포내의 MDCK 세포을 이용했다[Gaush et al., 1968; Huprikar et al., 1980; Chapel et al., 2006; Chapel et al., 2007;Furuta et al., 2009]. MDCK 세포를 상기 기술한 완전 DMEM에서 배양하였다. 처음에는 MDCK 세포 스톡을 천천히 37℃의 수조에서 녹였고, 세포 스톡내에 포함된 디메틸설폭사이드(DMSO)를 제거하기 위해 10배 이상의 완전 DMEM으로 부드럽게 혼합하였고, 3분동안 12,000 rpm에서 원심분리하였고, MDCK 세포가 부유되지 않도록 하며 상등액을 버렸고, 이를 연속하여 세번 반복하였다. DMEM 배지로 MDCK 세포를 세척한 후 MDCK 세포를 10ml 완전 DMEM 배지에 현탁하였고, 세포 배양 접시에 퍼지도록 여러번 부드럽게 흔들어주면서 100 Π 세포 배양 접시로 옮겨주었다. 옮겨준 MDCK 세포를 72시간동안 5% CO2 인큐베이터, 37 ℃에서 배양하였다. 잘 자란 MDCK 세포(세포 배양 접시의 90 ~ 95%)의 생산을 계속하였다. 성장된 MDCK 세포(2 x 105)를 DMEM 배지를 버린 후에 1.5ml TPCK-처리 트립신으로 처리했고, 10-15분 동안 5% CO2 인큐베이터, 37 ℃에서 배양하였다. 떨어져나온 MDCK 세포를 10배의 DMEM 배지로 혼합하였고, 성장된 세포가 남아 있지 않도록 멸균된 50ml 콘니칼 튜브로 옮겼고, 3분 동안 원심분리를 하고, 인산 완충 생리식염수(PBS)로 세번 세척하였다. PBS로 세척 단계를 완료한 후 10 ml 완전 DMEM 배지를 첨가하고, 현탁한 후 추가의 30ml 완전 DMEM 배지를 추가했다. 각 10ml의 MDCK 세포를 100 Π 세포 배양 접시로 놓고, 48시간 동안 5% CO2 인큐베이터, 37 ℃에서 배양하였다.
Antiviral tests were performed by counting plaques as in previous studies [Gaush et al ., 1968; Huprikar et al ., 1980; Chapel et al ., 2006; Chapel et al ., 2007; Furuta et al . al ., 2009]. In order to observe antiviral activity, epithelial cells of Madin Darby canine kidney (MDCK) in the kidney of the dog were used as antiviral indicators in the examples of the present invention. MDCK cells in 5 x 10 5 cells of 5 pfu semiconfluent monolayer per plaque-purified wild-type influenza virus cell were used [Gaush et. al ., 1968; Huprikar et al ., 1980; Chapel et al ., 2006; Chapel et al ., 2007; Furuta et al ., 2009]. MDCK cells were cultured in complete DMEM as described above. Initially, the MDCK cell stock was slowly dissolved in a 37 ° C. water bath, gently mixed with 10 times more complete DMEM to remove dimethylsulfoxide (DMSO) contained in the cell stock, centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes, The supernatant was discarded without allowing MDCK cells to float, which was repeated three times in succession. After washing MDCK cells with DMEM medium, MDCK cells were suspended in 10 ml complete DMEM medium and transferred to a 100 Π cell culture dish with gentle shaking several times to spread over the cell culture dish. The transferred MDCK cells were incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 72 hours. The production of well grown MDCK cells (90-95% of cell culture dish) was continued. Grown MDCK cells (2 × 10 5 ) were treated with 1.5 ml TPCK-treated trypsin after discarding DMEM medium and incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 10-15 minutes. The detached MDCK cells were mixed with 10-fold DMEM medium and transferred to sterile 50 ml conical tubes to ensure no grown cells remained, centrifuged for 3 minutes, and washed three times with phosphate buffered saline (PBS). 10 ml complete DMEM medium was added after completing the wash step with PBS, and additional 30 ml complete DMEM medium was added after suspension. Each 10 ml of MDCK cells were placed in a 100 Π cell culture dish and incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 48 hours.

b. 항바이러스 활성을 위한 플라크 분석 방법b. Plaque assay method for antiviral activity

플라크 분석을 상기에 설명한 바와 같이(Gaush et al., 1968; Huprikar et al., 1980; Chapel et al., 2006; Chapel et al., 2007;Furuta et al., 2009) 준비하였다. 세포 배양 접시의 90 ~ 95%까지 잘 자란 MDCK 세포의 6-웰 세포 접시로 이동하였다. 세포 배양 접시의 80%로 덮혀진 성장된 MDCK 세포을 준비하여 PBS로 2번 세척하였다. 200㎕ 바이러스 감염 배지(virus infection media; VIM)을 포함하는 분리 정제된 여러 종류의 단일 화합물을 자란 MDCK 세포에 처리하였다.90분 동안 34 ℃에서의 추가의 항온배양 동안에 바이러스 감염 6-웰 접시를 매 15분마다 부드럽게 흔들어 주었다. 그 이후 바이러스 감염 배지를 제거하고 0.7 % DMEM 아가로스(1:1)을 플라크 생성을 관찰하기 위하여 72시간 동안 5% CO2 인큐베이터, 34 ℃에서 각각의 웰(well)에 놓여졌다.
Plaque assays were prepared as described above (Gaush et al ., 1968; Huprikar et al ., 1980; Chapel et al ., 2006; Chapel et al ., 2007; Furuta et al ., 2009). Transfer to 6-well cell plates of well grown MDCK cells up to 90-95% of cell culture dishes. Grown MDCK cells covered with 80% of the cell culture dish were prepared and washed twice with PBS. Multiple purified single compound containing 200 μl virus infection media (VIM) were treated with grown MDCK cells. Virus infected 6-well plates were subjected to further incubation at 34 ° C. for 90 minutes. Shake gently every 15 minutes. The virus infection medium was then removed and 0.7% DMEM agarose (1: 1) was placed in each well in a 5% CO 2 incubator, 34 ° C. for 72 hours to observe plaque formation.

GSGS -- MSMS 를 이용한 전자충격이온화법(Electron Impact Ionization Using electronelectron ionizationionization : : EIEI )과 화학이온화법() And chemical ionization chemicalchemical ionizationionization : : CICI )에 의한 분석Analysis by

Lb.plantarum에서 정제된 물질의 전자 이온화 및 화합물 이온화 연구를 위해서, 본 발명에서는 7679 시리즈 자동 액체 샘플러를 갖춘 Agilent 6890 시리즈 GC(AgilentTechnologies, Waldron, Germany)로 구성되어 있는 크로마토그래피 시스템을 이용했다. 질량 분석법을 고해상도 질량분석기(JEOLJMS-700, Tokyo, Japan)을 이용하여 수행했다. 가스 크로마토그래피 시스템 및 고해상도 질량분석기를 JMS-700 M Station software(JEOLJMS-700, Tokyo, Japan)[T, 2006; Ahietal., 2008]을 사용하여 모두 조절했다.
 For electron ionization and compound ionization studies of materials purified from Lb.plantarum , the present invention used a chromatography system consisting of Agilent 6890 series GC (Agilent Technologies, Waldron, Germany) equipped with a 7679 series automated liquid sampler. Mass spectrometry was performed using a high resolution mass spectrometer (JEOLJMS-700, Tokyo, Japan). Gas chromatography systems and high resolution mass spectrometers were used in the JMS-700 M Station software (JEOLJMS-700, Tokyo, Japan) [T, 2006; Ahietal., 2008].

1One H, H, 1313 C, HSQC 과 2D-COSY 핵자기공명 분석C, HSQC and 2D-COSY Nuclear Magnetic Resonance Analysis

Lb.plantarum에서 D2O 및 DMSO에서 정제된 샘플(1.0mg)을 NMR 분광법을 사용하여 수소 이온 및 탄소 배치, 결합 및 서열의 결정을 위해 이용했다. NMR 스펙트럼을 300K에서 XWIN-NMR 3.5 소프트웨어[Reynoldsetal.,2002; Luetal., 2004; Baranovskiietal., 2007] CryoProbe16을 갖는 Bruker AVANCE-500 분광기로 기록했다. 모든 2-D NMR 실험을 Bruker에 의해 제공된 표준 펄스 시퀀스(standard pulse sequence)를 이용하여 수행했다. NMR 데이터를 PC(Windows Professional 2000, Microsoft) 상에서 XWIN-NMR 3.5 software packages(Karlsruhe, Germany)를 이용하여 처리했다. 1H 및 13C에 대한 NMR 스펙트럼을 AVANCE 500 분광기(Bruker-Biospin) 상에서 사용 주파수 500.13 및 125.77MHz를 이용하여 기록했고, Z축 기울기(Z gradient)를 갖는 인버스 감지기(broadband inverse detector; BBI)를 이용했다. 스펙트럼을 D2O 및 D2O가 포함된 DMSO 용액에서[Pateletal.,2010] 293K의 샘플 온도에 대해서 기록했다.
Purified samples (1.0 mg) in D 2 O and DMSO in Lb.plantarum were used for determination of hydrogen ions and carbon placement, binding and sequence using NMR spectroscopy. NMR spectra were measured at 300K in XWIN-NMR 3.5 software [Reynoldsetal., 2002; Lu et al., 2004; Baranovskiietal., 2007] recorded with Bruker AVANCE-500 spectrometer with CryoProbe16. All 2-D NMR experiments were performed using the standard pulse sequence provided by Bruker. NMR data were processed using XWIN-NMR 3.5 software packages (Karlsruhe, Germany) on a PC (Windows Professional 2000, Microsoft). NMR spectra for 1 H and 13 C were recorded on AVANCE 500 spectrometer (Bruker-Biospin) using frequencies 500.13 and 125.77 MHz, and a broadband inverse detector (BBI) with a Z-axis gradient was recorded. Used. Spectra were recorded for a sample temperature of 293K in DMSO solution containing D 2 O and D 2 O [Pateletal., 2010].

분리돤 단일 화합물의 원소 분석(Elemental analysis; EA)Elemental analysis (EA) of a single compound

Lt, plantarum LBp-K10 내의 분리된 물질의 원소 성분을 결정하기 위하여, 원소분석기를 사용하였다. C, H, N 및 O에 대한 원소분석을 원소분석기에서 수행했다(CE Instruments EA1110, EA1112) [Yu et al., 2008; Okada et al., 2009]. 산소 밸러스(Oxygen balance; OB)를 폭발물의 평가에 일반적으로 사용했다. C/H/O/N의 원소 비율을 이용하여 OB를 계산하였다.
Lt, plantarum LBp-K10, elemental analyzer was used to determine the elemental components of the isolated material. Elemental analyzes for C, H, N, and O were performed in elemental analyzers (CE Instruments EA1110, EA1112) [Yu et al., 2008; Okada et al., 2009]. Oxygen balance (OB) was commonly used for the evaluation of explosives. OB was calculated using the element ratio of C / H / O / N.

X선 회절을 이용한 분리된 물질의 구조 결정Determination of the Structure of Isolated Material Using X-ray Diffraction

Lt. plantarum LBP-K10으로 부터 분리된 단일 화합물의 구조를 결정하기 위하여 X-선 결정 구조 분석을 이용하였다. 단일화합물의 결정은 35% 에탄올 및 65% 메틸렌클로라이드(CH2Cl2) 혼탁액 혼합물에서 성장시켰고, 1.6Å(Angstrom) 데이터 세트(data set)를 Pohang Light Source(Kim et al.,2005)에서 빔라인(beamline) 6B에서 Bruker Proteum 300 CCD를 이용하여 얻었다.
Lt. X-ray crystal structure analysis was used to determine the structure of a single compound separated from plantarum LBP-K10. Crystals of a single compound were grown in 35% ethanol and 65% methylene chloride (CH 2 Cl 2 ) turbid mixtures, and an 1.6 ng data set was obtained from Pohang Light Source (Kim et al., 2005). Obtained using a Bruker Proteum 300 CCD at beamline 6B.

실험 결과Experiment result

식물에서의 유산균 동정Identification of lactic acid bacteria in plants

다양한 한국의 식물 재료인 갓김치, 돌나물 김치 및 배추 김치로부터 많은 종류의 유산균을 분리하였다. 이 3가지 식물 공급원으로부터, 400개 이상의 LAB을 분리하여, 길항작용 시험을 이용하여 대부분 항균 활성의 원인이 되는 200개의 LAB을 선별했다. 선별된 LAB을 PCR 증폭 및 비교를 통한 16s DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 동정했다. 결과적으로, 본 발명에서는 Leuconostoc spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp. 및 Weisella spp.를 동정했다(표 1). 3가지 식물물질 모두에서, Leuconostoc spp. 및 Lactobacillus spp.를 주로 분리했다. 또한, 특히 돌나물 김치의 Lactococcus lactis를 분리하고 동정했다. 이러한 발효 식물 물질의 배양을 위해서, 배양 시간에 따라 Leuconostoc spp.를 초기 발효 단계(1 내지 2일)에서 자주 관찰했고, Lactobacillus spp.가 배양 후기(2 내지 3일)에서 주요한 박테리아 균주이었다. Many kinds of lactic acid bacteria were isolated from various Korean plant materials, gat kimchi, sedum kimchi and cabbage kimchi. From these three plant sources, over 400 LABs were isolated and 200 LABs, mostly responsible for antimicrobial activity, were selected using an antagonistic test. Selected LABs were identified using 16s DNA sequencing method through PCR amplification and comparison. As a result, in the present invention, Leuconostoc spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp. And Weisella spp. Were identified ( Table 1) . In all three plant substances, Leuconostoc spp. And Lactobacillus spp. In addition, Lactococcus lactis was isolated and identified. For the cultivation of these fermented plant materials, Leuconostoc spp. Was frequently observed in the initial fermentation stage (1-2 days) depending on the incubation time, and Lactobacillus spp. Was the major bacterial strain in the later stages of culture (2-3 days).

균주Strain 식물 재료에서의 균주 수Number of strains in plant material 갓 김치Freshly made kimchi 돌나물 김치Sedum kimchi 배추 김치Kimchi 류코노스톡 속
(Leuconostoc spp.) Ryukono Stock
( Leuconostoc spp.) 9393 1010 2828 락토바실러스 속
(Lactobacillus spp.) Lactobacillus sp.
Lactobacillus spp. 1414 88 1717 락토코쿠스 속
(Lactococcus spp.) Lactococcus genus
Lactococcus spp. -- 1One -- 웨이젤라 속
(Weisella spp.) Genus Weissella
( Weisella spp.) 22 1414 1818

분리 및 동정된 유산균의 항균 활성 비교Comparison of Antimicrobial Activity of Lactobacillus Isolated and Identified

LAB의 일반적인 성장 동안, 세포들은 그들 스스로의 필요에 따라 많은 2차 대사물질을 생산한다. 따라서, LAB 및 항균성 작용에 대한 추가 연구 목적을 위해서, 분리 및 동정된 LAB의 항균 활성을 길항작용 시험 및 브로스 마이크로딜루션 방법을 계속적으로 이용해서 광범위하게 관찰하고 비교했다. 분리된 균주의 항균 활성을 표 2에서 나타냈다. 또한, 이러한 젖산 박테리아 균주 중에서, 다른 분리된 LAB과 비교해서 강한 항균 활성을 갖는 W.cibaria LBP-B06, L.sakei LBP-S01, L.kimchii LBP-B02, Lb.plantarum LBP-K10, L.citreum LBP-K11 및 L.mesenteroides LBP-K06를 디스크 확산법을 사용함으로써 관찰했다. 본 발명에서는 지표 균주(indicator)로서 B. subtilis(그람 양성) 및 E.coli(그람 음성)를 이용했다. 도 1에서 나타낸 것처럼, 시험된 LAB 중에서 Lb. plantarum LBP-K10의 항균 활성이 다른 다수의 박테리아 균주보다 의미있게 더 높다는 것을 나타냈다. 이러한 결과로부터, 본 발명에서는 식물물질로부터의 항균성 물질은 이 균주 Lb.plantarum LBP-K10에 초점을 맞췄다.During the normal growth of LABs, cells produce many secondary metabolites according to their own needs. Thus, for further study purposes for LAB and antimicrobial action, the antimicrobial activity of the isolated and identified LABs was extensively observed and compared using antagonistic testing and broth microdilution methods continuously. The antimicrobial activity of the isolated strains is shown in Table 2 . Further, among these lactic acid bacteria strains, and other separation and the LAB to W.cibaria LBP-B06, L.sakei LBP- S01, L.kimchii LBP-B02, Lb.plantarum LBP-K10, having a strong antibacterial activity compared to L. citreum LBP-K11 and L.mesenteroides LBP-K06 were observed by using the disk diffusion method. In the present invention, B. subtilis (gram positive) and E. coli (gram negative) were used as indicator strains. As shown in FIG . 1 , Lb. It was shown that the antibacterial activity of plantarum LBP-K10 was significantly higher than many other bacterial strains. From these results, in the present invention, the antimicrobial material from the plant material focused on this strain Lb.plantarum LBP-K10.

식물 재료 Plant material 균주 Strain 길항 작용 테스트a Antagonism test a MICb,c MIC b, c 염기서열로 확인한 균체 분류군The bacterial strains identified as the base sequence 갓 김치Freshly made kimchi LBP-B01 LBP-B01 ++ ++ +++ +++ Lb. sakeiLb. sakei LBP-B02 LBP-B02 ++ ++ ++ ++ L. kimchii L. kimchii LBP-B03 LBP-B03 ++ ++ ++ ++ L. mesenteroides L. mesenteroides LBP-B04 LBP-B04 ++ ++ ++ ++ L. mesenteroides L. mesenteroides LBP-B05 LBP-B05 +++ +++ ++ ++ L. paramesenteroides L. paramesenteroides LBP-B06 LBP-B06 +++ +++ ++ ++ W. cibaria W. cibaria 돌나물 김치Sedum kimchi LBP-S01 LBP-S01 ++ ++ +++ +++ Lb. sakei Lb. sakei LBP-S02 LBP-S02 +++ +++ +++ +++ Lb. plantarumLb. plantarum LBP-S03 LBP-S03 ++ ++ ++ ++ Lc. lactis Lc. lactis LBP-S04 LBP-S04 ++ ++ ++ ++ L. citreumL. citreum LBP-S05 LBP-S05 ++ ++ ++ ++ L. citreumL. citreum LBP-S06 LBP-S06 + + ++ ++ L. lactisL. lactis LBP-S08 LBP-S08 ++ ++ ++ ++ W. hellenicaW. hellenica 배추 김치Kimchi LBP-K01 LBP-K01 ++ ++ +++ +++ Lb. plantarumLb. plantarum LBP-K03 LBP-K03 ++ ++ ++ ++ L. citreumL. citreum LBP-K04 LBP-K04 ++ ++ - - L. citreumL. citreum LBP-K05 LBP-K05 ++ ++ ++ ++ L. holzapfeliiL. holzapfelii LBP-K06 LBP-K06 +++ +++ ++ ++ L. mesenteroidesL. mesenteroides LBP-K07 LBP-K07 ++ ++ ++ ++ L. pseudomesenteroidesL. pseudomesenteroides LBP-K08 LBP-K08 ++ ++ + + L. mesenteroides L. mesenteroides LBP-K09 LBP-K09 ++ ++ ++ ++ Lb. brevisLb. brevis LBP-K10 LBP-K10 +++ +++ +++ +++ Lb. plantarumLb. plantarum LBP-K11 LBP-K11 ++ ++ ++ ++ L. citreumL. citreum LBP-K12 LBP-K12 +++ +++ ++ ++ L. mesenteroidesL. mesenteroides LBP-K13 LBP-K13 ++ ++ ++ ++ L. mesenteroidesL. mesenteroides LBP-K14 LBP-K14 ++ ++ ++ ++ L. pseudomesenteroidesL. pseudomesenteroides LBP-K15 LBP-K15 +++ +++ ++ ++ W. cibaria W. cibaria LBP-K16 LBP-K16 ++ ++ ++ ++ W. confusa W. confusa

a는 항균 활성 범위를 나타내는 지름을 의미한다(지표 균주: 바실러스 서브틸리스). +는 지름이 ＜ 15 ㎜를 의미하고, ++는 지름이 ＜ 22 ㎜를 의미하며, +++는 지름이 ≥ 22 ㎜를 의미한다.a means the diameter indicating the range of antibacterial activity (indicator strain: Bacillus subtilis). + Means diameter <15 mm, ++ means diameter <22 mm and +++ diameter means ≥ 22 mm.

b는 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration: MIC)를 의미한다. b is the minimum inhibitory concentration (MIC).

c는 최소억제농도의 배율을 의미한다. +는 1배를 의미하고, ++는 0.5배를 의미하며, +++는 0.25배를 의미한다(지표 균주: 바실러스 서브틸리스).
c means the magnification of the minimum inhibitory concentration. + Means 1-fold, ++ means 0.5-fold, and +++ means 0.25-fold (indicator strain: Bacillus subtilis).

<실시예 3>&Lt; Example 3 > Lb.plantarum  Lb.plantarum LBP-K10의 항균 활성의 특성 분석Characterization of the Antimicrobial Activity of LBP-K10

Lb.plantarum LBP-K10의 16S rDNA 서열을 NCBI의 뉴클레오타이드 BLAST 프로그램과 비교했고 Lb.plantarum 균주IMAU10173과 100% 동일한 상동성을 나타냈다. 동정된 Lb.plantarum LBP-K10을 실시예에서 설명된 것처럼 배양했다. 600nm에서의 흡광도 및 배양된 세포 사이에서의 이에 상응하는 pH 프로파일 및 Lb.plantarum의 정상 성장 동안의 pH의 주목할만한 변화가 28 시간 동안 각각 관찰되었다(도 2A,왼쪽패널). LAB 세포의 성장 및 이에 상응하는 CS의 pH 분석 결과를 보면 흡광도 및 pH가 정확히 서로 반비례 관계에 있고, 8 시간으로부터 지수성장기(logarithmic phase)에 진입하고, 28시간 후 정체기에 도달했다는 것을 보인다. 정체기인 28 시간 후에는 흡광도 및 pH는 거의 고정되었고 변화되지 않았다(도 2A, 왼쪽 패널). 시간에 따른 항균 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 하루 단위씩 3일간 배양액을 채취하여 실험을 하였다. 그 결과, 1일째부터는 활성이 나타나기 시작하였고, 2일째도 계속 증가하다가 3일째의 항균 활성이 가장 높은 것으로 관찰되었으며, 약 2주간 이 활성이 유지되었다(도 2의 오른쪽 패널). pH의 경우는 정상적인 생장 동안에는 계속 감소하다가 생장이 정체기 전후에 pH 4.1 정도로 나타나며 이후 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. 또한, 항균 활성은 2일 배양 후 증가했고, 3일 째에 최고치에 도달했다는 것을 나타냈다(도 2A, 오른쪽). 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10이 병원성균에 대한 항균 활성이 있는지를 살펴보기 위하여 여러 균주에 대하여 위에서 설명한 방법대로 디스크 확산법을 통해 항균 활성을 확인해 보았다(도 2B). 여기서 수행한 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액은 총 3회의 독립적인 디스크 확산법을 수행하여 각 균주에 대한 활성을 생장 저지환(mm)을 계산하여 측정하였다. 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia)와 같은 그람 양성균 뿐만 아니라 살모넬라 티피무루이움(Salmonella typhimuruium) 및 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)와 같은 그람 음성균, 그리고 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 같은 기회 감염 병원성 진균류에서도 항균활성이 관찰되었다(도 2B).The 16S rDNA sequence of Lb.plantarum LBP-K10 was compared with the nucleotide BLAST program of NCBI and showed 100% homology with the Lb.plantarum strain IMAU10173. The identified Lb.plantarum LBP-K10 was incubated as described in the examples. Absorbance at 600 nm and corresponding pH profile between cultured cells and notable changes in pH during normal growth of Lb.plantarum were observed for 28 hours, respectively ( FIG. 2A , left panel). The growth of LAB cells and the corresponding pH analysis of CS show that the absorbance and pH are exactly inversely related to each other, entering the logarithmic phase from 8 hours and reaching plateau after 28 hours. After 28 hours of plateau, the absorbance and pH were almost fixed and unchanged ( FIG. 2A , left panel). In order to determine the effect on the antimicrobial activity over time, the experiment was carried out by taking the culture solution for 3 days each day. As a result, activity began to appear from day 1, and continued to increase on day 2, and the highest antimicrobial activity was observed on day 3, and this activity was maintained for about 2 weeks (right panel in FIG. 2). In the case of pH, it was decreased continuously during normal growth, and the growth appeared to be around pH 4.1 before and after the stagnation period and then remained constant. In addition, the antimicrobial activity increased after 2 days of culture, indicating that the peak was reached on day 3 ( FIG. 2A , right). Lactobacillus Florata Room In order to examine whether LBP-K10 has an antimicrobial activity against pathogenic bacteria, the antimicrobial activity was confirmed through the disk diffusion method as described above for the various strains (Fig. 2B). The Lactobacillus plantarum The LBP-K10 culture broth was subjected to three independent disk diffusion methods, and the activity of each strain was determined by calculating the growth inhibition ratio (mm). Lactobacillus Florata Room Cultures of LBP-K10 include Gram-positive bacteria such as Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus , and Listeria innocua and Streptococcus pneumonia . Antimicrobial activity was also observed in Gram-negative bacteria such as Salmonella typhimuruium and Shigella sonnei , and opportunistic pathogenic fungi such as Candida albicans (Figure 2B).

또한, 항균 물질이 열에 안정한지 확인하기 위해 다양한 조건하에 열을 가한 후 배양액에 대한 항균 활성 시험을 하였다(도 2C). 열처리한 배양액은 항균 활성이 변하지 않았다. 지표 균주로 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스와 그람 음성균인 살모넬라 티피무루이움을 사용하여 배양액의 활성을 관찰한 결과, 열을 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 열을 가한 조건에 관계없이 실험군 모두 대조군과 비슷한 양상을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 항균 활성은 15분간 멸균기에서 121℃로 열을 가해도 그대로 유지되었다. 이 결과로 보아 항균 활성을 가지는 물질이 열에 의해 변성되지 않고 안정함을 확인하였다(도 2C).
In addition, the antimicrobial activity test for the culture solution was added to heat under various conditions to confirm that the antimicrobial material is stable to heat (Fig. 2C). The heat-treated culture did not change the antimicrobial activity. The activity of the culture medium was observed using the Gram-positive bacillus Bacillus subtilis and the Gram-negative bacterium Salmonella typhimurium, and the experimental groups were similar to the control group, regardless of the conditions in which the heat was applied. It was confirmed to show an aspect. In addition, the antimicrobial activity was maintained even after heating to 121 ° C. in a sterilizer for 15 minutes. As a result, it was confirmed that the material having antimicrobial activity was stable without being denatured by heat ( FIG. 2C ).

단백질 분해효소(proteinase)의 효과는 CS에 대한 억제 물질을 특성 규명하기 위해 지정된 것이고 다양한 효소를 시험했다(프로테인카이네이즈 K,키모트립신 및 트립신)(도 2D). 본 발명의 실험 절차를 위해서, CS를 사용하여 72시간 동안 배양했고, CS 용액을 분자량 1000의 위 아래로 차단하기 위해서 YM-1 아세테이트 막(Amicon,USA)을 이용함으로써 단백질성(proteinous) 및 비단백질성 프랙션의 2 부분으로 나누었다. 대조군으로서 YM1S(분자량 1000 초과의 CS 용액) 및 YM1C(분자량 1000 미만의 CS 용액)의 CS를 제조했고 단백질 분해 효소를 1mg/ml의 농도로 처리했다[Pangsomboon,2009]. 이 단백질 분해 효소를 처리한 경우, 성장 억제 지역의 원인이 되는 B.subtilis 및 E.coli에 대한 항균 활성은 CS 및 YM1S의 두 실험 샘플 용액에서 감소되었다(도 2D). B.subtilis의 경우, 트립신은 대조군 CS에서 10.5%로 감소되었고 키모트립신은 6.5%로 감소되었다. 그러나, 프로테이네이즈 K 활성은 거의 남아있었다. B.subtilis와 비교해서, E.coli는 프로테이네이즈 K 및 트립신에 있어서 7.0% 감소를 나타냈다(도 2D). 아세테이트 막을 분자량 1,000을 기준으로 3부분으로 나누었기 때문에, 항균 활성의 효과는 CS 및 YM1S의 단백질성 물질에 의존적일 수 있다. 분자량 1000 미만에서 항균 활성을 변화시키지 못한 YM1C와 비교한, CS 및 YM1S의 전반적인 항균적 특성이 약간 감소했지만, 항균 활성의 대부분은 남아있었다. 이러한 결과로부터, 항균 활성이 열 및 단백질 분해 안정성에 따르면 비단백질성 물질일거라 판단된다. 그러므로, 배양 사층액으로부터의 항박테리아 활성의 대부분은 Lb.plantarum LBP-K10에서 비단백질성 물질이라는 결론을 내렸다(도 2C, 2D).The effect of proteinases was designated to characterize inhibitors to CS and tested for various enzymes (protein kinase K, chymotrypsin and trypsin) ( FIG. 2D ). For the experimental procedure of the present invention, the cells were incubated for 72 hours using CS, and proteinaceous and non-specific by using YM-1 acetate membrane (Amicon, USA) to block the CS solution above and below molecular weight 1000. The protein fraction was divided into two parts. As controls, CSs of YM1S (CS solution with molecular weight greater than 1000) and YM1C (CS solution with molecular weight less than 1000) were prepared and proteolytic enzymes were treated at a concentration of 1 mg / ml [Pangsomboon, 2009]. When treated with this proteolytic enzyme, the antimicrobial activity against B.subtilis and E. coli , which is responsible for the growth inhibition zone, was reduced in two experimental sample solutions of CS and YM1S ( FIG. 2D ). For B.subtilis , trypsin was reduced to 10.5% in the control CS and chymotrypsin was reduced to 6.5%. However, proteinase K activity remained almost unchanged. Compared to B.subtilis , E. coli showed a 7.0% reduction in proteinase K and trypsin (FIG. 2D). Since the acetate membrane was divided into three parts based on molecular weight 1,000, the effect of the antimicrobial activity may depend on the proteinaceous material of CS and YM1S. Although the overall antimicrobial properties of CS and YM1S were slightly reduced compared to YM1C, which did not change the antimicrobial activity at molecular weight below 1000, most of the antimicrobial activity remained. From these results, it is determined that the antimicrobial activity is a nonproteinaceous substance according to heat and proteolytic stability. Therefore, it was concluded that most of the antibacterial activity from the cultured dead layer solution was nonproteinaceous in Lb.plantarum LBP-K10 (Figures 2C, 2D).

항균 또는 항바이러스 물질의 분리 및 특성Isolation and Characterization of Antibacterial or Antiviral Substances

락토바실러스 플란타룸의 항균 물질의 순수 분리는 앞서 여러 가지 실험 결과를 토대로 3일간 배양한 상층 배양액을 가지고 실시하였다. 분리 과정은 CH2Cl2를 이용하여 액체-액체 추출법에 의해 배양액으로부터 항균 물질을 분리한 후 세미-프렙(semi-prep)용 HPLC를 이용하여 분획하고, 수집하였고 분획한 결과는 HPLC 크로마토그램으로 확인하였다(도 6 및 도 7). 이러한 실험을 실시하기 위하여 본 실험에서는 항균 물질의 순수 분리 과정에서 일부 불필요한 산성 불순물인 D-젖산이나 아세트산등을 제거하기 위해 CH2Cl2를 이용하여 추출한 하층 배양액, CH2Cl2로 추출한 상층 배양액과 CH2Cl2로 추출하지 않은 배양액의 항균 활성을 액체-액체 추출법으로 비교해 보았고 이후의 실험에 적용하였다(도 6). Pure water isolation of Lactobacillus plantarum was carried out with the upper layer culture solution for 3 days. The separation process was performed by liquid-liquid extraction using CH 2 Cl 2 to separate the antimicrobial material from the culture medium, and then fractionated using semi-prep HPLC. The collected fractions were collected by HPLC chromatography. It was confirmed ( FIGS. 6 and 7 ). In this experiment, in order to carry out these experiments, a lower layer extracted broth using a CH 2 Cl 2 to remove the unnecessary portion such as the D- lactic acid impurities or acid in a pure separation of the antimicrobial substance, the culture supernatant was extracted with CH 2 Cl 2 The antimicrobial activity of the culture medium not extracted with and CH 2 Cl 2 was compared by liquid-liquid extraction and applied to subsequent experiments ( FIG. 6 ).

이 실험을 통해 배양액의 모든 항균 물질은 CH2Cl2 추출 후 하층액을 가지고 이후의 실험을 수행하였다(도 6). 즉, 앞서 설명한 방법으로 배양액의 CH2Cl2 추출 상층액과 하층액, 그리고 CH2Cl2 추출을 하지 않은 농축 배양액을 가지고 항균 활성 실험을 확인한 결과, CH2Cl2 추출 상층액과 CH2Cl2 추출을 하지 않은 농축 배양액의 항균 활성이 비슷하게 나타났으며 하층액의 경우 다른 두 가지 실험군보다 훨씬 더 높은 항균 활성을 가짐을 관찰하였다(도 6). 따라서 항균 물질의 분리는 CH2Cl2 추출의 하층액을 가지고 실험하는 것이 더욱 효율적임을 알 수 있었다(도 6).Through this experiment, all the antimicrobial substances of the culture medium were extracted with CH 2 Cl 2 and then the subsequent experiments were performed ( FIG. 6 ). That is, with the concentrated culture solution is not the above the described method the culture of CH 2 Cl 2 extracted supernatant and the lower layer liquid, and the CH 2 Cl 2 extract confirm the antibacterial activity test results, CH 2 Cl 2 extraction supernatant with CH 2 Cl It was observed that the antimicrobial activity of the concentrated culture medium without 2 extraction was similar, and the lower layer solution had much higher antimicrobial activity than the other two experimental groups ( FIG. 6 ). Therefore, the separation of the antimicrobial material was found to be more efficient to experiment with the lower layer of CH 2 Cl 2 extraction ( Fig. 6 ).

또한, 이러한 전처리 과정을 통해 준비된 실험군은 세미-프렙 HPLC 크로마토그램에서 분획된 물질을 적당한 양으로 농축한 후 항균 활성 실험을 실시하였고 락토바실러스 플란타룸의 크로마토그램에서 10여 개의 분획된 물질이 확인되었으며, 시간대 별로 나오는 피크를 분획화하여 수집하여 각각의 분획에 대한 항균 활성을 확인해 보았다(도 7 및 표 3). 그 결과, 2, 7, 8 및 10번의 분획에서의 항균 활성을 최소배지농도법(MIC)을 통해 관찰하였다(도 8 내지 도 10). 이상과 같은 실험을 통해 이 중에서도 8번째 분획 물질의 항균 활성이 분리된 물질들 가운데 가장 높음을 확인하였다(도 8 내지 도 10).In addition, the experimental group prepared through such a pretreatment process concentrated the appropriate amount of the fractions in the semi-prep HPLC chromatogram and carried out the antimicrobial activity experiment and confirmed the fraction of 10 fractions in the chromatogram of Lactobacillus plantarum And, the peaks coming out during each time period were collected by fractionation to check the antimicrobial activity of each fraction (Fig. 7 and Table 3). As a result, the antimicrobial activity in the fractions 2, 7, 8 and 10 was observed through the minimum medium concentration method (MIC) (Figs. 8 to 10). Through the above experiments, it was confirmed that the antimicrobial activity of the eighth fraction material was the highest among the separated materials ( FIGS. 8 to 10 ).

지표 균주 Indicator strain MICa MIC a 분획Fraction 염기서열로 확인된 균체 분류군Mycobacterium tuberculosis 바실러스 서브틸리스 Bacillus Subtilis +++ +++ M8 M8 Lc. mesenteroides LBP-K06 Lc. mesenteroides LBP-K06 +++ +++ N8 N8 Lb. plantarum LBP-K10 Lb. plantarum LBP-K10 +++ +++ P8 P8 P. pentosaceus MCPP P. pentosaceus MCPP 에스케리치아 콜리Escherichia coli ++ ++ M8 M8 Lc. mesenteroidesLc. mesenteroides 스타필로코쿠스 아우레우스Staphylococcus aureus ++ ++ M8 M8 Lc. mesenteroidesLc. mesenteroides 스트렙토코쿠스 뉴모니애Streptococcus pneumoniae ++ ++ M8 M8 Lc. mesenteroides Lc. mesenteroides 쉬겔라 디센테리애Shigella descenteria ++ ++ M8 M8 Lc.mesenteroidesLc.mesenteroides

a는 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration:MIC)를 의미한다. +는 1배를 의미하고, ++는 0.5배를 의미하며, +++는 0.25배를 의미한다.
a means minimum inhibitory concentration (MIC). + Means 1x, ++ means 0.5x, and +++ means 0.25x.

최소배지농도법의 결과, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스의 모든 분획된 물질에서 공통된 크로마토그램의 각 균주에 해당하는 분획 물질인 P8, N8 및 M8에서 항균 활성이 가장 높은 것으로 나타났다(도 8, 도 9, 도 10 및 표 3). 각 분획된 물질들의 pH는 크로마토그램 앞부분의 분획하여 확인한 산성 물질을 제외하고 모두 중성 pH에 가까웠으며(표 4), 이러한 결과는 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스에서 모두 비슷한 경향성을 보였다(도 8, 도 9 및 도 10).As a result of the minimum medium concentration method, P8, N8 and M8, which are the fractions corresponding to each strain of the chromatogram common to all fractions of Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and Leukonostock mesenteroides The antimicrobial activity was found to be the highest in ( Fig. 8, 9, 10 and Table 3 ). The pH of each fractionated material was close to the neutral pH except for the acidic material identified by fractionation in the front of the chromatogram (Table 4). These results were found in Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and leukonostock. All showed similar trends in Mesenteroides ( FIGS. 8, 9 and 10 ).

분획 수Fraction number 구분division P1P1 P2P2 P3P3 P4P4 P5P5 P6aP6a P6bP6b P7aP7a P7bP7b P8P8 P9P9 P10P10 g/ℓg / ℓ -- 5.885.88 -- -- -- 14.514.5 2.02.0 5.05.0 7.37.3 2.22.2 4.24.2 10.710.7 pHpH -- 3.83.8 7.67.6 7.97.9 9.69.6 9.29.2 8.98.9 8.88.8 8.68.6 8.58.5 8.28.2 8.18.1 - : 활성 없음.-: No activity.

또한, 최소저해농도법의 결과를 토대로 본 실험에서 동정한 여러 가지 유산균을 가지고 HPLC로 크로마토그램을 비교 분석한 결과, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스에서 분획 물질의 분포가 비슷하다는 사실을 발견하였다(도 11). 다른 유산균 균주들에서의 크로마토그램도 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스와 유사한 분획 경향성이 보였다(도 12). 이러한 결과를 통해 유산균이 생장을 거치며 항균 물질을 생성하고 생성된 대사산물이 서로 비슷하다는 것을 알 수 있었다(도 11 및 12).
In addition, the chromatograms were analyzed by HPLC with various lactic acid bacteria identified in this experiment based on the results of the minimum inhibitory concentration method. As a result, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and leukonostock mesenteroides were analyzed. It was found that the distribution of fractional substances in was similar (FIG. 11). Chromatograms from other lactic acid bacteria strains also showed similar fractional trends as Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and leukonostock mesenteroides ( FIG. 12 ). These results show that lactic acid bacteria grow and produce antibacterial substances and the resulting metabolites are similar to each other ( FIGS. 11 and 12 ).

항바이러스 활성분석Antiviral Activity Assay

항바이러스 활성의 경우 성견 코카스파니엘의 신장(Madin-Darby, canine kidney)에서 수립한 상피유사세포를 이용하였으며 이를 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 3일간 감염시켰다. 실험에 사용된 락토바실러스 플랜타룸 LBP-K10의 세미-프렙 HPLC 분석에서 나온 각각의 분획물을 0.7% 완전 최소 필수배지(complete minimal essential medium, MEM agarose)에 섞어 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)로 감염시킨 성견 상피세포(MDCK)에 적용하였다. 모든 항바이러스 활성 실험군은 플라크(plaque) 분석을 사용하였다. 도 22에서 (A) 대조구; (B) 바이러스 대조구; (C) 8번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (D) 8번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린); (E) 10번째 분획물, 5.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린); (F) 10번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)이다. 도 22에서 보여주듯이 8번째 분획물, 10.0 mM 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)과 10번째 분획물, 10.0mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)이 플라크 분석에서 항바이러스 활성을 보였다. 특히 10번째 분획물인 10.0 mM 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 경우 매우 높은 항바이러스 활성을 보였다.
In the case of antiviral activity, epithelial-like cells established in the dog's kidney (Madin-Darby, canine kidney) were used and infected with influenza A virus (H3N2) for 3 days. Each fraction from the semi-prep HPLC analysis of Lactobacillus Plantarum LBP-K10 used in the experiment was mixed with 0.7% complete minimal essential medium (MEM agarose) and infected with influenza A virus (H3N2). Applied to epithelial cells (MDCK). All antiviral activity groups used plaque assay. (A) control in FIG. 22 ; (B) virus control; (C) 8th fraction, 5.0 mM cis-cyclo (L-leucine-L-proline); (D) 8th fraction, 10.0 mM cis-cyclo (L-leucine-L-proline); (E) 10th fraction, 5.0 mM cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline); (F) 10th fraction, 10.0 mM cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline). As shown in FIG. 22 , the eighth fraction, 10.0 mM cis-cyclo (L-leucine-L-proline) and the tenth fraction, 10.0 mM cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline) showed antiviral activity in the plaque assay. Seemed. In particular, the 10th fraction, 10.0 mM cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline) showed very high antiviral activity.

항균 및 항바이러스 물질의 구조 분석Structural analysis of antibacterial and antiviral substances

항균 및 항바이러스 물질의 구조를 분석하기 위해 HPLC로 분리한 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스의 8번째 및 10번째 분획물을 동결 건조기로 분말 형태로 만들어 준비하였다. 실험 재료 및 방법에서 기술한 대로 분자량은 다이렉트 인서션 프로브(DIP, Direct Insertion Probe; DIP)로 크로마토그래피 질량분석기(Agilent 6890 series GC, Agilent Technologies, Waldron, Germany; high-resolution mass spectrometer, JEOL JMS-700, Tokyo, Japan)(GC-MS)를 이용하여 분석하였다(도 13,도 14, 도 23 및 도 24). 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석을 하였고 참고치와의 연관성을 파악하였다. 8번째 및 10번째 분획물의 분자량의 참고치는 각각 분자량 210 및 244으로 조사되었고, 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석 결과 페디오코쿠스 펜토사세우스 및 락토바실러스 플란타룸 8번째 분획물은 모두 210으로 나타났고, 10번째 분획물은 모두 244로 나타났다(도 13 및 도 14).Eighth and tenth fractions of Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, and leukonostock mesenteroides isolated by HPLC were powdered by freeze dryer to analyze the structure of antimicrobial and antiviral substances. Ready. As described in Experimental Materials and Methods, the molecular weight was determined using a Direct Insertion Probe (DIP) with a chromatographic mass spectrometer (Agilent 6890 series GC, Agilent Technologies, Waldron, Germany; high-resolution mass spectrometer, JEOL JMS- 700, Tokyo, Japan) (GC-MS) and analyzed ( FIG. 13, FIG. 14, FIG. 23 and FIG. 24 ). The analysis was performed by electron ionization (EI) and chemical ionization (CI), and the correlation with reference values was determined. The reference values of the molecular weights of the eighth and tenth fractions were examined at molecular weights of 210 and 244, respectively. As a result of the analysis by electron ionization (EI) and chemical ionization (CI), Pediococcus pentosase The eighth fraction of U.S. and Lactobacillus plantarum were both 210 and the tenth fraction was 244 (FIGS. 13 and 14).

보다 정확한 분자 구조를 파악하고 선행 실험인 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석을 비교하기 위해 500 MHz 자기공명법을 이용하여 8번째 분획물과 10번째 분획물의 구조를 관찰하였다(도 15). 100 % DMSO 가 처리된 P8과 10% 중수(D2O)가 DMSO와 혼합된 8번째 및 10번째 분획물을 1H 핵자기공명법과 13C 핵자기공명법으로 분석하였다(도 15 내지 18, 도 25 내지 도 27). 100% DMSO로 처리한 P8은 8.0 ppm에서 전형적인 질소-수소 피크를 나타내지만(도 15), 10% D2O가 함유된 P8의 경우 질소-수소 피크에서 중수로 치환되어 8.0 ppm의 피크가 사라지는 것을 확인하였다(도 16). 8번째 및 10번째 분획물의 13C 핵자기공명법을 통한 화학적 이동(Chemical shift)은 DMSO와 10% 중수를 함유한 DMSO 시료에서 8번째 분획물은 모두 11개의 탄소를 가지고, 10번째 분획물은 모두 14개의 탄소를 가진 물질로 나타났다(도 17, 18, 도 25 내지 도 27).In order to identify more accurate molecular structures and to compare the analysis by previous experiments, electron ionization (EI) and chemical ionization (CI), the eighth fraction and 10 were analyzed using 500 MHz magnetic resonance. The structure of the first fraction was observed ( FIG. 15 ). The 8th and 10th fractions of P8 treated with 100% DMSO and 10% heavy water (D 2 O) mixed with DMSO were analyzed by 1 H nuclear magnetic resonance method and 13 C nuclear magnetic resonance method ( FIGS. 15 to 18 , FIG. 25 to 27 ). P8 treated with 100% DMSO showed a typical nitrogen-hydrogen peak at 8.0 ppm ( FIG. 15 ), whereas P8 containing 10% D 2 O was replaced with heavy water at the nitrogen-hydrogen peak, disappearing 8.0 ppm. It was confirmed ( FIG. 16 ). Chemical shifts of the 8th and 10th fractions by 13 C nuclear magnetic resonance analysis showed that in the DMSO sample containing DMSO and 10% heavy water, the 8th fraction had 11 carbons and the 10th fraction all 14 Materials with 2 carbons ( FIGS. 17, 18, 25-27 ).

또한 X선 회절을 이용한 결정 구조 분석 결과와 여러 구조 분석 결과를 통해 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 메센테로이데스 LBP-K06 및 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 8번째 분획물은 C11H18O2N2의 구조를 가지는 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo L-Leu-L-Pro)임을 확인하였고(도 21). 이의 최종 구조는 도 21에 제시하였다.In addition, through the crystal structure analysis and the multiple structure analysis using X-ray diffraction Phedi OKO kusu pen soil three mouse, Lactobacillus mesen teroyi des LBP-K06 and eighth fractions of Lactobacillus Planta room LBP-K10 is C 11 H It was confirmed that the cis-cyclo (L- leucine-L-proline) ( cis -cyclo L-Leu-L-Pro) having a structure of 18 O 2 N 2 ( Fig. 21 ). Its final structure is presented in Fig.

ESI-CID mass spectrum m/z 211 [MH]+ base peak, 195[MH-O]+, 154[MH-C4H9]+ ESI-CID mass spectrum m / z 211 [MH] + base peak, 195 [MH-O] + , 154 [MH-C 4 H 9 ] +

1H NMR (DMSO-d6) δ 0.83 및 0.85 (6H at C-12 and C-13, d, J = 6.49 Hz and 6.45 Hz), 1.34 - 1.36 (1H at C-5, m), 1.73 -1.76 (1H at C-5, m), 1.80 1.87 (3H at C-4 and C-10, m), 2.10 -2.13 (1H at C-10, m), 3.31 - 3.34 (2H at C-3, m), 3.98 - 4.02 (1H at C-6, m), 4.16 - 4.19 (1H at C-9, m), 8.02 (1H at N-8, s). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 0.83 and 0.85 (6H at C-12 and C-13 , d, J = 6.49 Hz and 6.45 Hz), 1.34-1.36 (1H at C-5 , m), 1.73- 1.76 (1H at C-5 , m), 1.80 1.87 (3H at C-4 and C-10, m), 2.10 -2.13 (1H at C-10 , m), 3.31-3.34 (2H at C-3 , m), 3.98-4.02 (1H at C-6 , m), 4.16-4.19 (1H at C-9, m), 8.02 (1H at N-8 , s).

13C NMR (DMSO-d6) δ 170.8 (C-1), 167.0 (C-7), 58.8 (C-9), 52.9 (C-6), 45.2 (C-3), 37.9 (C-5), 27.7 (C-10), 24.4 (C-4), 23.0 (C-11), 22.7 및 22.2 (C-12 and C-13). 13 C NMR (DMSO-d 6 ) δ 170.8 ( C-1 ), 167.0 ( C-7 ), 58.8 ( C-9 ), 52.9 ( C-6 ), 45.2 ( C-3 ), 37.9 ( C-5 ), 27.7 ( C-10 ), 24.4 ( C-4 ), 23.0 ( C-11 ), 22.7 and 22.2 (C-12 and C-13).

또한 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 메센테로이데스 LBP-K06 및 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 10번째 분획물은 C14H16O2N2, 의 구조를 가지고 시스-사이클로 (L-페닐알라닌-L-프롤린)으로 확인되었다(도 28 내지 도 30). In addition, the tenth fractions of Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus mesenteroides LBP-K06 and Lactobacillus plantarum LBP-K10 have the structure of C 14 H 16 O 2 N 2 , and have cis-cyclo (L- Phenylalanine-L-proline) ( FIGS. 28-30 ).

ESI-CID mass spectrum m/z 245 [MH]+ base peak, 153 [MH-C7H8]+, 125 [MH-C7H8-CO]+ ESI-CID mass spectrum m / z 245 [MH] + base peak, 153 [MH-C 7 H 8] +, 125 [MH-C 7 H 8 -CO] +

1H NMR (DMSO-d6) 1.41 - 1.45 (1H at C-5, m), 1.69 - 1.74 (2H at C-4, m), 1.98 - 2.03 (1H at C-5, m), 3.01 - 3.08 (2H at C-10, m), 3.24 - 3.42 (2H at C-3, m), 4.05 - 4.08 (1H at C-6, m), 4.33 - 4.35 (1H at C-9, m), 7.17 - 7.27 (5H at phenyl group, m) 7.98 (1H at N-8, s).
1 H NMR (DMSO-d 6 ) 1.41-1.45 (1H at C-5 , m), 1.69-1.74 (2H at C-4 , m), 1.98-2.03 (1H at C-5 , m), 3.01- 3.08 (2H at C-10 , m), 3.24-3.42 (2H at C-3 , m), 4.05-4.08 (1H at C-6 , m), 4.33-4.35 (1H at C-9 , m), 7.17-7.27 (5H at phenyl group , m) 7.98 (1H at N-8 , s).

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Claims (20)

시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 항균용 조성물. Cis-bicyclo (L- leucine -L- proline) contains the (cis -cyclo (L-Leu- L-Pro)) of the active ingredient, and streptococcus (Streptococcus) or a break in Gela for (Shigella) spp. Antimicrobial composition having a specific antimicrobial activity. 제 1 항에 있어서, 상기 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)은 류코노스톡 속(Leuconostoc)으로 균으로부터 분리된 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.The method of claim 1, wherein the cis-bicyclo (L- leucine -L- proline), are separated from the bacteria by a sheath flow in Kono stock (Leuconostoc) - Antibacterial characterized in that the cycle (L- leucine -L- proline) Composition. 제 2 항에 있어서, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 균인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.According to claim 2, wherein the genus Leukonstock is Leuconostoc mesenteroides ( Leuconostoc mesenteroides ), Leuconostoc lactis ( Leuconostoc lactis ), Leuconostoc gelidum , Leuconostok paramesenteroi Death ( Leuconostoc paramesenteroides ), Leuconostoc citreum , Leuconostoc pseudomesenteroides ( Leuconostoc pseudomesenteroides ) And leuconostok holzapfelii ( Leuconostoc holzapfelii ) antimicrobial composition, characterized in that at least one leukonostok bacteria selected from the group consisting of. 제 1 항에 있어서, 상기 스트렙토코쿠스 속 균은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes) 및 스트렙토코쿠스 비리단스(Streptococcus viridans)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 스트렙토코쿠스 속 균인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.According to claim 1, wherein the Streptococcus genus is Streptococcus pneumoniae , Streptococcus agalactiae , Streptococcus bovis , Streptococcus oralis Streptococcus oralis ), Streptococcus pyogenes ( Streptococcus pyogenes ) and Streptococcus viridans ( Streptococcus viridans ) antimicrobial composition, characterized in that at least one Streptococcus genus selected from the group consisting of. 제 1 항에 있어서, 상기 쉬겔라 속 균은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae) 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 쉬겔라 속 균인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.According to claim 1, wherein the genus Shigella is composed of Shigella sonnei , Shigella boydii , Shigella dysenteriae and Shigella flexneri Antimicrobial composition, characterized in that at least one Shigella genus bacteria selected from the group. 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 농약 조성물. Cis-bicyclo (L- leucine -L- proline) contains the (cis -cyclo (L-Leu- L-Pro)) of the active ingredient, and streptococcus (Streptococcus) or a break in Gela for (Shigella) spp. Pesticide composition having a specific antimicrobial activity. 제 6 항에 있어서, 상기 농약 조성물은 용매, 담체, 유화제 및 분산제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분 또는 첨가물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 농약 조성물.7. The pesticide composition of claim 6, wherein the pesticide composition further comprises one or more components or additives selected from the group consisting of solvents, carriers, emulsifiers and dispersants. (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-루신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 항균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속 또는 쉬겔라(Shigella) 속 균에 대한 항균제 생산 방법.(a) culturing a lactic acid bacterium to prepare a culture solution of lactic acid bacteria; And
(b) concentrating the cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Leu-L-Pro)) in the culture medium to a concentration effective to antimicrobial Method for producing antimicrobial agents against the genus Streptococcus or Shigella . 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물.Anti-viral composition comprising cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Phe-L-Pro)) as an active ingredient. 제 9 항에 있어서, 상기 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)은 류코노스톡 속(Leuconostoc)으로 균으로부터 분리된 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)인 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.The method of claim 9, wherein the cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) is characterized in that the cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) isolated from the bacteria in the genus Leuconostoc Viral composition. 제 10 항에 있어서, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 균인 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.The method according to claim 10, wherein the genus Leukonstock is Leuconostoc mesenteroides , Leuconostoc lactis , Leuconostoc gelidum , Leuconost stock paramesenteroi Death ( Leuconostoc paramesenteroides ), Leuconostoc citreum , Leuconostoc pseudomesenteroides ( Leuconostoc pseudomesenteroides ) And Leuconostoc holzapfelii ( Leuconostoc holzapfelii ) antiviral composition, characterized in that at least one of the genus Leuconostok selected from the group consisting of. 제 9 항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 조성물.10. The antiviral composition according to claim 9, wherein the virus is influenza A virus (H3N2). 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 의약 조성물.A pharmaceutical composition comprising cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Phe-L-Pro)) as an active ingredient and having specific antimicrobial activity against influenza A virus (H3N2). (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 항균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 항바이러스제 생산 방법.(a) culturing a lactic acid bacterium to prepare a culture solution of lactic acid bacteria; And
(b) influenza A comprising concentrating the cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Phe-L-Pro)) in the culture at an effective concentration Antiviral production method against virus (H3N2). 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물.Antiviral composition comprising cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis -cyclo (L-Leu-L-Pro)) as an active ingredient. 제 15 항에 있어서, 상기 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)은 류코노스톡 속(Leuconostoc)으로 균으로부터 분리된 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)인 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.The method according to claim 15, wherein the cis- cyclo (L-leucine-L-proline) is characterized in that the cis- cyclo (L-leucine-L-proline) isolated from the bacteria in the genus Leuconostoc Viral composition. 제 16 항에 있어서, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 균인 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.17. The method of claim 16, wherein the genus Leukonostock is Leuconostoc mesenteroides , Leuconostoc lactis , Leuconostoc gelidum , Leuconost stock paramesenteroi Death ( Leuconostoc paramesenteroides ), Leuconostoc citreum , Leuconostoc pseudomesenteroides ( Leuconostoc pseudomesenteroides ) And Leuconostoc holzapfelii ( Leuconostoc holzapfelii ) antiviral composition, characterized in that at least one of the genus Leuconostok selected from the group consisting of. 제 17 항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 조성물.18. The antiviral composition according to claim 17, wherein the virus is influenza A virus (H3N2). 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 특이적인 항균활성을 가지는 의약 조성물.A pharmaceutical composition comprising cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Leu-L-Pro)) as an active ingredient and having specific antimicrobial activity against influenza A virus (H3N2). (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-류신-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Leu-L-Pro))을 항균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)에 대한 항바이러스제 생산 방법.(a) culturing a lactic acid bacterium to prepare a culture solution of lactic acid bacteria; And
(b) influenza A comprising concentrating the cis- cyclo (L-leucine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Leu-L-Pro)) in the culture medium to an effective antimicrobial concentration. Antiviral production method against virus (H3N2).
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