KR20140044380A - 유도 만능 줄기 세포 스크리닝 방법 - Google Patents

유도 만능 줄기 세포 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분화 내성을 나타내는 iPS 세포주에서 특이적으로 발현되는 lincRNA 또는 mRNA를 인식하는 마커를 사용하여 분화 내성을 나타내는 iPS 세포에 대한 스크리닝 방법 및, 상기 마커를 제공한다.

Description

유도 만능 줄기 세포 스크리닝 방법{Method for screening induced pluripotent stem cells}
본 발명 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells)의 스크리닝 방법에 관한다.　보다 구체적으로, 본 발명은 유도 만능 줄기 세포에서 큰 유전자간 비-암호 RNA(large intergenic non-coding RNA; lincRNA) 또는 mRNA의 발현의 확인을 통하여 분화 내성을 나타내지 않는 유도 만능 줄기 세포의 스크리닝 방법에 관한다.
최근, 마우스 및 인간 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells)가 성공적으로 수립되고 있다. Yamanaka 등은 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc 유전자의 강제적인 발현이 가능함에 따라 마우스-유래의 섬유아세포(fibroblast) 내로 상기 유전자를 도입함으로써 iPS 세포를 유도하였다(WO 2007/069666 A1 and Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)). 그 후에, iPS 세포는 또한 상기 인자 중 (c-Myc 유전자를 제외한) 세 개를 사용하여 만들어질 수 있음이 밝혀졌다(Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol., 26: 101-106 (2008)).　추가로, Yamanaka 등은 마우스와 연관된 경우와 유사하게, 인간 피부-유래 섬유아세포로 상기 4 유전자를 도입함으로써 iPS 세포를 수립하는데 성공하였다(WO 2007/069666 A1 and Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)). 한편, Thomson 등의 팀은 Klf4 및 c-Myc 대신에 Nanog 및 Lin28을 이용하여 인간 iPS 세포를 제조하였다(WO 2008/118820 A2 and Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)).　iPS 세포는 배아 파괴(embryo disruption)와 같은 생물윤리적인 문제를 해결할 수 있으며, 이들의 전분화능을 유지하면서 생장할 수 있으므로, 따라서 iPS 세포는 재생의약품(regenerative medicine)을 위한 이식 물질(grafting material)로서 기대되고 있다.
그러나, 심지어 이렇게 수립된 iPS 세포가 특이적인 조직 세포 내로 분화되도록 유도될 때, 결과된 세포는 증식 가능성(proliferation potency)을 가지는 비분화된(또는 불충분하게 분화된) 세포를 포함할 수 있다(Miura K. et al., Nat Biotechnol., 27: 743-745 (2009)). 이러한 경우에, 이식 이후에 종양발생(tumorigenes)의 우려가 있다. 따라서, 이와 같이 수립된 iPS 세포주 사이로부터 분화 유도에 내성을 나타내는 세포를 포함하지 않는 iPS 세포주에 대한 스크리닝 방법이 요구된다.
본 발명의 목적은 임상 적용에 적합한 안전한 iPS 세포(유도 만능 줄기 세포, induced pluripotent stem cells)를 효과적으로 선별하는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 분화 내성을 나타내지 않는 세포주를 스크리닝하는 도구를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 분화내성을 나타내는 iPS 세포주 및 분화내성을 나타내지 않는 iPS 세포주를 사용하여 분화 내성을 나타내는 iPS 세포주에서 특이적으로 발현되는 RNA 또는 분화내성을 나타내지 않는 iPS 세포주에서 특이적으로 발현되는 RNA를 실험하였다. 이에 따라 특이적인 유전체 지역(genomic region)에 의해서 암호화되는 유전자간 비-번역 RNA(large intergenic non-coding RNA, lincRNA) 또는 mRNA가 분화 내성을 나타내는 iPS 세포주 또는 분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포주 내에서 특이적으로 발현되는 것을 검증하였다.
상기 결과에 기반하여, 본 발명자들은 특이적인 유전체 지역에 의해서 암호화되는 유전자간 비-번역 RNA(lincRNA) 또는 mRNA의 지표(indicator)(마커)로서의 용도를 통해 분화 내성을 나타내는 iPS 세포를 스크리닝할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 하기 [1] 내지 [9]를 포함한다.
하기의 단계를 포함하는, 분화 내성(differentiation resistance)을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기세포주에 대한 스크리닝 방법:
(i) A 군 및/또는 B 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자간 비-번역 RNA(large intergenic non-coding RNA, lincRNA)의 발현을 측정;
(ii) A 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA이 발현되거나 B 군에서 선택된 lincRNA 또는 mRNA가 발현되지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 선별;
A 군은
(A1) lincRNA:chr1:852245-854050 역방향 가닥(reverse strand),
(A2) GPR177,
(A3) VTCN1,
(A4) lincRNA:chr1:142803013-142804254 역방향 가닥,
(A5) APOA2,
(A6) WNT6,
(A7) EPAS1,
(A8) COL3A1,
(A9) SLC40A1,
(A10) S100P,
(A11) HOPX,
(A12) GUCY1A3,
(A13) CDH10,
(A14) HAPLN1,
(A15) PITX1,
(A16) HAND1,
(A17) CGA,
(A18) AQP1,
(A19) DLX6,
(A20) DLX5,
(A21) SOX17,
(A22) FLJ45983,
(A23) PLCE1,
(A24) H19,
(A25) lincRNA:chr11:2016408-2017024 역방향 가닥,
(A26) lincRNA:chr11:2017517-2017651 정방향 가닥(forward strand),
(A27) IGF2,
(A28) P2RY6,
(A29) SLN,
(A30) NNMT,
(A31) APOA1,
(A32) ERP27,
(A33) LUM,
(A34) CCDC92,
(A35) CDX2,
(A36) FLJ41170,
(A37) MEG3,
(A38) lincRNA:chr14:101292469-101299626 정방향 가닥,
(A39) lincRNA:chr14:101295637-101302637 정방향 가닥,
(A40) lincRNA:chr14:101296681-101298460 정방향 가닥,
(A41) lincRNA:chr14:101298129-101300147 정방향 가닥,
(A42) lincRNA:chr14:101324825-101327247 정방향 가닥,
(A43) MEG8,
(A44) lincRNA:chr14:101365673-101366049 정방향 가닥,
(A45) lincRNA:chr14:101396955-101397357 정방향 가닥,
(A46) lincRNA:chr14:101430757-101433381 정방향 가닥,
(A47) lincRNA:chr14:101434059-101436282 정방향 가닥,
(A48) lincRNA:chr14:101472355-101473369 정방향 가닥,
(A49) DIO3,
(A50) MEIS2,
(A51) PRTG,
(A52) C17orf51,
(A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 역방향 가닥,
(A54) lincRNA:chr17:21435180-21454915 역방향 가닥,
(A55) lincRNA:chr17:21435959-21436405 역방향 가닥,
(A56) CCR7,
(A57) KRT23,
(A58) GREB1L,
(A59) GATA6,
(A60) TTR,
(A61) UCA1,
(A62) FLRT3,
(A63) lincRNA:chrX:73040495-73047819 역방향 가닥,
(A64) VGLL1,
(A65) RPS4Y1,
(A66) DDX3Y, 및
(A67) RPS4Y2으로 구성,
B 군은
(B1) DMRTB1,
(B2) lincRNA:chr1:73430887-73446112 역방향 가닥,
(B3) lincRNA:chr1:73444697-73444997 역방향 가닥,
(B4) C4orf51,
(B5) PCDHA1,
(B6) lincRNA:chr6:95250854-95263604 역방향 가닥,
(B7) lincRNA:chr6:14280358-14285376 역방향 가닥,
(B8) lincRNA:chr6:14283301-14285685 역방향 가닥,
(B9) C7orf57,
(B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 역방향 가닥,
(B11) lincRNA:chr8:129599518-129624118 역방향 가닥,
(B12) OC90,
(B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 역방향 가닥,
(B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 역방향 가닥,
(B15) HHLA1,
(B16) lincRNA:chr8:133076031-133093351 역방향 가닥,
(B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 역방향 가닥,
(B18) lincRNA:chr8:138387843-138421643 역방향 가닥,
(B19) lincRNA:chr8:138418343-138425831 역방향 가닥,
(B20) NDUFA4L2,
(B21) lincRNA:chr13:54698462-54707001 역방향 가닥,
(B22) ABHD12B,
(B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 역방향 가닥,
(B24) ZNF208,
(B25) ZNF257,
(B26) ZNF676,
(B27) ZNF541,
(B28) TBX1,
(B29) CXorf61, 및
(B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA 클론 TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]으로 구성됨.
[2] [1]에 있어서, 상기 A 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA는 하기 군으로부터 구성되는 방법;
(A20) DLX5,
(A50) MEIS2,
(A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 역방향 가닥, 및
(A58) GREB1L.
[3] [1]에 있어서, 상기 B 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA는 하기 군으로부터 구성되는 방법;
(B4) C4orf51,
(B9) C7orf57,
(B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 역방향 가닥,
(B12) OC90,
(B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 역방향 가닥,
(B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 역방향 가닥,
(B15) HHLA1,
(B16) lincRNA:chr8:133076031-133093351 역방향 가닥,
(B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 역방향 가닥,
(B22) ABHD12B,
(B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 역방향 가닥,
(B27) ZNF541,
(B28) TBX1,
(B29) CXorf61, 및
(B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA 클론 TESTI4038997 5', mRNA 서열 [DB090170]로 구성됨.
[4] [1]에 있어서, 상기 B 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA는 하기 군으로부터 구성되는 방법;
(B4) C4orf51,
(B15) HHLA1, 및
(B22) ABHD12B.
[5] 하기의 단계를 포함하는, 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기세포주에 대한 스크리닝 방법;
(i) (B4) C4orf51, (B15) HHLA1, 및 (B22) ABHD12B의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에서 LTR 지역 또는 이의 주위(neighborhood)의 DNA-메틸화된 위치를 측정, 및
(ii) LTR7 지역이 DNA-메틸화된 위치인 인간 유도 만능 줄기 세포주를 선별.
[6] 상기 A 군 또는 B 군에 나타난 적어도 하나의 mRNA 또는 LincRNA의 뉴클레오티드 서열에서 적어도 15 개의 연속된 뉴클레오티드를 가지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 스크리닝하기 위한 시약(reagent).
[7] [6]에 있어서, 프로브(probe)로서, 상기 A 군 또는 B에 나타나는 적어도 하나의 mRNA 또는 LincRNA의 뉴클레오티드 서열에서 적어도 15 개의 연속된 뉴클레오티드를 가지는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드가, 고정됨으로써 제조된 마이크로어레이(microarray)인 시약.
[8] 상기 A 군 또는 B 군에 나타난 적어도 하나의 mRNA로서 암호화되는 단백질과 결합하는 항체를 포함하는, 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 스크리닝하기 위한 시약.
[9] [6] 내지 [8] 중 어느 하나의 시약을 포함하는, 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 스크리닝하기 위한 키트.
본 출원은 2011년 7월 25일에 출원된 미국 가출원 제 61/511,156호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 개시 사항은 참조로서 본 명세서에 축합된다.
본 발명에 따라서, 분화 내성을 나타내지 않는 인간 iPS 세포는 효율적으로 스크리닝될 수 있다. 따라서, 본 발명은 재생의약품(regenerative medicine)에 iPS 세포의 적용에 대해 매우 유용하다.
[도 1] 도 1은 정량적 PCR으로, 분화 내성을 나타내는 세포주(분화 내성으로 나타냄): FB-RV3F-4, CB-RV4F-2, DP-EP6F-1, FB-RV3F-4 sub2, CB-RV4F-2 sub2 및 DP-EP6F-1, 및 분화 내성을 나타내지 않는 세포주(정상군으로 나타냄): H1, FB-RV4F-2, FB-RV3F-1, FB-RV3F-4 sub6, CB-RV4F-2 sub1 및 DP-EP6F-1 sub5의 HHLA1, ABHD12B 및 C4orf51 발현 수준 측정의 결과를 나타낸다.
[도 2] 도 2는 C4orf51, HHLA1 및 ABHD12B에서 LTR 지역의 위치를 나타내는 모식도이다.
[도 3] 도 3은 이황화 방법(Bisulfite method)에 의해 6 개의 분화 내성을 나타내는 세포주(분화 내성으로 나타냄): FB-RV3F-4, CB-RV4F-2, DP-EP6F-1, FB-RV3F-4 sub2, CB-RV4F-2 sub2 및 DP-EP6F-1, 및 6 개의 분화 내성을 나타내지 않는 세포주(정상군으로 나타냄): H1, FB-RV4F-2, FB-RV3F-1, FB-RV3F-4 sub6, CB-RV4F-2 sub1 및 DP-EP6F-1 sub5의 C4orf51, HHLA1 또는 ABHD12B에 위치한 LTR7 지역 내의 CG 디뉴클레오티드(dinucleotide)의 평균적인 메틸화 상태(methylation stat)의 결과를 나타낸다.
1. 인간 유도 만능 줄기세포(iPS cells) 스크리닝을 위한 방법.
본 발명의 인간 유도 만능 줄기세포(iPS cells) 스크리닝을 위한 방법은 분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포주를 위한 스크리닝의 마커로서 하기 [표 1](A 군) 또는 [표 2](B 군)에 나타난 적어도 하나의 lincRNA 또는 mRNA의 사용을 포함한다.
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

Figure pct00004

Figure pct00005
본 발명에 있어서, 용어 “lincRNA”는 유전자를 암호화하지 않는, 게놈으로부터 전사된 긴-사슬 단일-가닥의 RNA를 나타낸다. LincRNA는 염색체(chromosome) 번호로서 표기되며, 게놈 위치는 유전자 은행 데이터베이스에 기재된 뉴클레오티드 번호 및 전사 방향(transcriptional direction)으로서 나타낸다. 예를 들면, “chr1:852245-854050 역방향 가닥”은 유전자 은행 데이터베이스 내 염색체 1의 852245 내지 854050 뉴클레오티드에 상보적인 서열로 부합하는(matching) 단일-가닥 RNA를 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 “mRNA”는 또한 스플라이싱(splicing) 전의 전구체 또는 스플라이싱 후의 성숙된 mRNA로서 나타날 수 있다. 성숙한 mRNA의 서열의 예시는 표 1 또는 2에 기재된 유전자 은행의 등록 번호에 따르는 서열을 가지는 mRNA 뿐만 아니라 선택적 스플라이싱으로서 제조되는 동형단백질(isoform) 또한 포함한다. 또한 본 발명에 있어서, mRNA 유래의 폴리뉴클레오티드(예를 들면, cDNA) 또는 RNA로 암호화된 단백질은 또한 마커로서 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명에 있어서, 용어 “iPS 세포”는 DNA 또는 단백질의 형태에서 특이적인 리프로그래밍 인자를 체세포 내로 유도하여 제조될 수 있고 전분화능(pluripotency) 자기-증식(self-replication)에 기반한 및 증식력(proliferation potency)과 같은, ES 세포의 성질과 거의 일치하는 성질을 가지는 체세포(somatic cells)로부터 인위적으로(artificially) 유래된 줄기세포를 나타낸다(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International Publication WO 2007/069666).
본 발명에 있어서, 마커로서 인식될 수 있는 lincRNA 또는 mRNA는 상기 lincRNA 또는 mRNA의 전장(full-length) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이에 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는, 이의 단편일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 절편의 경우, 이는 lincRNA 또는 mRNA의 서열에서 적어도 15 개의 연속된 뉴클레오티드를 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 적어도 15 개의 뉴클레오티드를 가지는 상기 폴리뉴클레오티드의 구체적인 예는 적어도 18 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 적어도 19 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 적어도 20 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 적어도 30 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 적어도 40 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 적어도 50 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 적어도 60 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 적어도 70 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 100 개의 연속된 뉴클레오티드의 길이를 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 있어서, 분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포주는 상기 마커의 발현의 정도 측정에 의해서 검출될 수 있으며, 이에 따라 iPS 세포주는 스크리닝될 수 있다. 보다 구체적으로, [표 1]에 기재된 A 군의 마커를 발현하는 iPS 세포주는 분화 내성을 나타내지 않는 세포주로서 스크리닝될 수 있거나, 또는 [표 2]에 기재된 B 군의 마커를 발현하지 않는 세포주는 분화 내성을 나타내지 않는 세포주로서 스크리닝될 수 있다.
여기에서, “마커를 발현하는” 발현은 마커가 임의의 측정 방법에 의하여 검출되는 경우를 나타내고, 보다 바람직하게는 이와 같이 수득된 검출값이 대조군 검출값과 같거나 더 높은 경우를 나타낸다. 유사하게, “마커를 발현하지 않는” 발현은 마커가 임의의 측정 방법에 의하여 검출되지 않는 경우를 나타내고, 더욱 바람직하게는 이와 같이 수득된 검출값이 대조군 검출값과 같거나 더 낮은 경우를 나타낸다. 보다 구체적으로, A 군의 마커가 사용되었을 때, 검출값이 분화 내성을 나타내지 않는 것으로 알려진 대조군 ES 세포주 또는 iPS 세포주의 것과 유사한 경우 또는 검출값이 분화 내성을 나타내는 것으로 알려진 iPS 세포주의 것과 더 높은 경우는 A 군의 마커가 발현되었음을 지시한다. 한편, B 군의 마커가 사용되었을 때, 이와 같이 수득된 검출값이 분화 내성을 나타내지 않는 것으로 알려진 EC 세포주 또는 iPS 세포주의 것과 유사한 경우 또는 이와 같이 수득된 검출값이 분화내성을 나타내는 것으로 알려진 iPS 세포주의 것보다 낮은 경우는 B 군의 마커가 발현되지 않았음을 지시한다. 여기에서, “높은(더 높은) 검출값의” 발현은 검출값이 대조군 값보다 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 또는 5 배 높은 경우, 예를 들면, 더욱 바람직하게는, 대조군 값보다 5 배 또는 그 이상으로 높은 경우를 나타낸다. “낮은 검출값의” 발현은 검출값이 대조군 값보다 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 또는 1/5(또는 그 이하)이고, 예를 들면, 더욱 바람직하게는, 대조군 값의 1/5(또는 그 이하)인 경우를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 마커 측정을 위한 방법의 예는 노던블럿법(Northern blot method), 가시적 분자결합화(in situ hybridization), Rnase 보호 분석법(RNase protection assay), 마이크로어레이 방법(microarray method), PCR 방법(PCR method), 실시간 PCR 방법(real-time PCR method), 웨스턴블럿법(Western blot method), 및 유세포분석(flow cytometry)을 구체적으로 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
노던블럿법과 같은, 혼성화를 사용하여 측정한 방법의 경우에서, 상기 마커의 전장 뉴클레오티드 서열 또는 이에 부분적인 서열이 상보적인 폴리뉴클레오티드는 프로브(probe)로서 사용될 수 있다. 여기에서, 용어 “상보적 폴리뉴클레오티드(상보적 가닥, 반대 가닥(opposite strand))”는 A:T(U) 또는 G:C와 같이 염기쌍 관계에 기반하여 뉴클레오티드에 관하여 대상 서열(subject sequence)과 상보적 관계인 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 상기 상보적 가닥의 예는 정방향 가닥 개체의 뉴클레오티드 서열에 완전하게 상보적인 상보적 서열뿐만 아니라, 엄격한(stringent) 조건 하에서 정방향 가닥 개체에 혼성화될 수 있는 것과 같은 상보적 관계를 가지는 서열도 포함한다. 추가로, 엄격한 조건은 Berger 및 Kimmel에 의해 고안된, 프로브에 결합되는 핵산의 녹는점(Tm)에 기반하여 정의될 수 있다(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques 방법s in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). 혼성화 후의 세척 조건은 일반적으로, 예를 들면 약 “1 x SSC, 0.1% SDS, 37℃”의 조건이다. 바람직하게는 상보적 가닥은 상기 조건 하에서 세척될 때조차도 정방향 가닥 개체에 혼성화한 상태를 유지할 수 있다. 더욱더 엄격한 혼성화 조건의 예는 구체적으로 약 “0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42℃”의 세척 조건을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 엄격한 혼성화 조건의 예는 약 “0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65℃”의 세척 조건 하에서 세척될 때 정방향 가닥 및 상보적 가닥이 혼성화 상태를 유지하는 조건을 포함한다. 상기 상보적 가닥의 구체적인 예는 정방향-가닥 뉴클레오티드 서열 개체에 온전하게 상보적인 관계인 뉴클레오티드 서열을 구성하는 가닥, 및 가닥과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 구성하는 가닥을 포함한다. 프로브 크기는 적어도 15 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 18 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 19 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 20 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 30 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 40 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 50 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 60 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 70 개의 연속된 뉴클레오티드, 적어도 100 개의 연속된 뉴클레오티드, 또는 전체-길이의 연속된 뉴클레오티드의 길이이다. 상기 프로브는 예를 들면, 방사성동위원소(radioisotope)(예를 들면, 32P 및 33P), 형광 물질(fluorescent substance)(예를 들면, 플루오레사민(fluorescamine), 로다민(rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), 단실(dansyl), 또는 이의 유도체), 화학발광 물질(chemiluminescent substance), 또는 효소로 표지될 수 있다.
뿐만 아니라, 상기 프로브로서 제공되는 폴리(올리고)뉴클레오티드는 고상 지지체(solid-phase support)(기질) 위에 고정된 폴리(올리고)뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이의 형태로서 제공되는 것이 바람직하다. 마이크로어레이를 위한 고상 지지체의 예시는 유리 기질, 실리콘 기질, 막(membrane), 및 비드(beads)를 포함하나, 이들의 제제(material), 크기, 및 모양은 구체적으로 제한되지 않는다. 마이크로어레이를 형성하는 방법은 구체적으로 제한되지 않으며, 당업계의 숙련된 기술자에 의해 사용될 수 있는 어떠한 방법도 본 발명에서 사용될 수 있다. 이들의 예시는 고상 지지체의 표면에 합성된 프로브가 직접적으로 포함되는 방법(온칩 방법, on-chip method) 및 고상 지지체의 표면에 앞서 준비된 프로브의 결합을 포함하는 방법을 포함한다. 프로브가 고상 지지체의 표면에 직접적으로 결합될 때 일반적으로 사용되는 방법은 반도체(semiconductor) 제조에 사용되는 사진석판 기술(photolithographic technique) 및 고상 합성 기술의 조합에서 광 조사(light irradiation)를 통해 선택적으로 제거된 보호기(protecting group)를 사용하여 미리 계측된 마이크로-매트릭스 지역의 올리고뉴클레오티드의 선택적인 합성의 수행을 포함한다. 한편, 프로브를 준비한 다음에 고상 지지체의 표면에 이를 결합하는 것을 포함하는, 본 발명에서 사용될 수 있는 방법의 예시는, 핵산 프로브 종류 또는 고상 지지체 종류에 따르는 점적 장치(spotter device)를 사용하여 다중양이온 화합물(polycationic compound) 또는, 아미노 기, 알데하이드 기, 에폭시 기 또는 유사체를 가지는 실란 커플링제(silane coupling agent)로 표면에 처리되어진 고상 지지체 표면 위로 프로브의 점적(spotting)하는 방법, 및 상기 도입된 활성 기를 가지는 프로브의 합성하고, 활성 기의 형성을 유발하도록 하기 위해 사전에 표면-처리된 고상 지지체의 표면위로 상기 프로브를 점적한 다음 공유 결합을 통해 고상 지지체의 표면 위로 상기 프로브의 결합 및 고정을 포함하는 방법을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 마커가 구체적으로 인식되고 증폭될 때, 상기 마커의 뉴클레오티드 서열 및 상기 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 프라이머로서 사용될 수 있다. 프라이머는 예를 들면, 프라이머 3(primer 3)(http://primer3.sourceforge.net/) 또는 벡터 NTI(vector NTI)(Infomax)를 사용하여 상기 마커의 각각의 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하여 이를 디자인한 후 합성 및 정제를 수행함으로써 준비될 수 있다. 프라이머는 각각이 풀림(annealing)으로부터 정방향 가닥(sense strand)(5′-말단 쪽) 및 역방향 가닥(antisense strand)(3′-말단 쪽)으로 구성된 프라이머 짝(set) 또는 쌍(pair)(2 개의 프라이머)을 방지하기 위하여 2 개 프라이머들의 상보적인 서열을 피하고; 또한 프라이머 내에서 헤어핀 구조(hairpin structure)의 형성을 방지하기 위하여 역상보성 염기서열(palindrome)을 피하면서 짜여진다. 프라이머 크기는, 상기 마커의 증폭 및 검출이 가능하다면 구체적으로 제한되지 않으며, 적어도 15 개의 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 15 내지 50 개의 뉴클레오티드 길이이며, 보다 바람직하게는 20 내지 35 개의 뉴클레오티드 길이이다. 프라이머는 일반적으로 사용되는 자동화 DNA 합성기를 사용하는 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 방법(예를 들어, 포스포트리에티딜 방법(phosphotriethyl method) 및 포르포디에스터(phosphodiester method))과 같이 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 합성되어질 수 있다. 상기 프라이머는 증폭 산물의 검출을 가능하게 하기 위하여 상기와 유사한 표지 기질을 사용하여 표지될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 항체는 상기 마커가 단백질로서 인식될 때 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 형태는 표 1 또는 2에 기재된 mRNA로 암호화되는 단백질, 또는 키메라 항체(chimeric antibody)(예를 들면, 사람/마우스 키메라 항체), 인간화 항체(humanized antibody), 또는 인간 항체, 또는, 이들 항체의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fv, 및 scFv), 또는, 단백질의 아미노산 서열에서 적어도 8 개의 연속된 아미노산(예를 들어, 10 내지 20 개의 연속된 아미노산)을 포함하는 폴리펩타이드로서 항원-결합 성질을 가지는 항체의 면역원(immunogen)인 다클론 항체 또는 단클론 항체 일 수 있다. 상기 항체를 제조하기 위한 방법은 공지되어 있으며 본 발명의 항체는 이러한 통상의 방법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13)에 따라 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 항체가 다클론 항체일 때, 이는, 표 1 또는 2에 기재된 mRNA에 의해 대장균(Escherichia coli) 또는 이와 같은 균을 사용하는 통상적인 방법에 따라 발현 및 정제되어지는 암호화된 단백질, 또는 이들의 부분적인 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드로 합성되고, 그 결과물을 애완용 토끼(domestic rabbit)와 같은 비-인간 동물에 면역하여, 그런 다음 통상적인 방법에 따라 면역화된 동물의 혈청으로부터 항체를 수득함으로써 수득될 수 있다. 한편, 단클론 항체의 경우에는, 이는 예를 들면, HAT 선별 및 타겟 폴리펩타이드와의 친화력 분석한 (상기 면역화된 비-인간 동물로부터 수득된 비장 세포(spleen cell)과 골수종 세포(myeloma cell)의 세포 융합으로 제조된) 하이브리도마 세포를 분류함으로써 수득될 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11). 이에 따라 수득된 항체는 예를 들면, 형광 물질(예를 들면, 플루오레사민, 로다민, 텍사스 레드, 댄실, 또는 이의 유도체), 화학발광 물질, 또는 효소로 표지될 수 있다.
더욱이, 항체 제조물로서 사용되는 단백질은 유전자은행 데이터베이스로부터 유전자 서열 정보에 근거하여, DNA 클로닝, 각각의 플라스미드 구축, 숙주로의 형질감염, 형질전환체 배양, 및 배양 산물로부터 단백질의 수집을 통해, 수득될 수 있다. 이러한 과정은 당업계의 숙련된 기술자에 의해 알려진 방법 또는 예를 들면, 문서에 기재된 방법(Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 이러한 단백질은 적당한 숙주 세포에서 유전자 발현을 할 수 있는 재조합 DNA(발현 벡터)의 제조, 형질전환을 통해 숙주 세포로 상기 DNA의 도입, 형질전환체의 배양, 및 그런 다음 이로써 수득된 배양 산물로부터 타겟 단백질 수집을 통해 수득될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 있어서, 분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포를 스크리닝하는 방법은 인트론 및 엑손을 포함하는 후보자 유전자 몸체(gene bodies)에 위치하는 LTR 지역 또는 이들의 근접한 지역의 DNA 메틸화 상태의 측정함으로써 또한 수행될 수 있다. 이때에, LTR은 레트로바이러스로부터 유래된 반복 서열을 의미한다. 예를 들어, LTR1, LTR1B, LTR5, LTR7, LTR8, LTR16A1, LTR16C, LTR26, LTR26E, MER48, 및 MLT2CB과 같은 LTR 서브패밀리들(subfamilies)로써 알려져 있다. 본 발명에서 바람직한 LTR 서브패밀리는 인간 내인성 레트로바이러스(human endogenous retroviruses, HERV)-패밀리의 LTR7이다. LTR7은 전체 인간 게놈의 유전자 몸체에서 658 위치에 위치하여있다. LTR7의 서열은 서열번호 1에 나타나있다. 본 발명에서, LTR7의 서열은 가닥과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 가지는 서열을 포함한다.
후보자 유전자의 예시는 표 2에 기재된 B 군의 마커이다. 이러한 유전자의 바람직한 예시는 C4orf51, HHLA1 및, ABHD12B의 군으로부터 선택된다. C4orf51, HHLA1, 및 ABHD12B의 LTR 지역의 예는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6 및 7에 나타나있다.
DNA-메틸화 상태를 측정하는 방법의 예시는 중아황산염(bisulfate)을 사용하여 비메틸화된 시토신의 가수분해와 관련된다. 구체적으로, 상기 방법은 중아황산염 처리 수행, PCR, 및 그런 다음 서열분석(sequencing)에 연관된 방법, 특이적-올리고뉴클레오티드 메틸화(methylation-specific oligoneucleotide, MSO) 마이크로어레이를 사용하여 연관된 방법, 또는 중아황산염 처리 이전에 서열 및 중아황산염 처리 후의 서열 간의 차이를 인식하는 PCR 프라이머를 만든 다음 PCR 산물의 존재 또는 부재에 기반해서 메킬화된 DNA의 존재 또는 부재를 측정하는 메틸화-특이적인 PCR을 포함한다. DNA 메틸화 특이적인 항체를 사용하여 염색체 면역침강법(chromosome immunoprecipitation)에 의한 이러한 방법에 더하여, DNA 메틸화 지역은 DNA 메틸화 지역, PCR 수행, 및 그런 다음 서열분석을 통하여 DNA 서열을 추출함으로써 특이적인 지역으로부터 검출될 수 있다.
분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포의 스크리닝에 있어서, 후보 유전자 몸체에 위치한 상기 LTR 지역에서 DNA 메틸화 상태가 DNA 메틸화 상태에 있는 개체 iPS 세포는 분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포로서 선택될 수 있다. 본 발명에서, 발현, “DNA 메틸화 상태”는, 예를 들면, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상, 바람직하게는 모든 검출된 CpGs의 100%에 대하여 개체 지역 계수(subject region account)에서 검출된 메틸화된 CpGs의 상태를 말한다. 검출하기 위한 방법의 예시로서 임의적으로 선택된 하나의 세포에서 메틸화된 CpGs의 백분율이 나열된다. 여기에서, 백분율은 2 배 또는 그 이상, 바람직하게는 5 배 또는 그 이상, 및 더욱 바람직하게는 10 또는 그 이상과 같은 수많은 배율로 클로닝된 PCR 산물에서 주형을 서열 분석한 후에 서열 분석된 클론의 수와 DNA 메틸화가 검출되는 클론의 수의 비교를 되풀이함으로써 계산될 수 있다. 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법이 사용될 때, 백분율을 또한 시토신(sytosine) 또는 티민(thymine)의 수를 측정함으로써 직접적으로 검출될 수 있다(시토신의 수는 메틸화된 DNA의 수를 의미하며 티민의 수는 비메틸화된 DNA 수를 의미한다).
상기 마커의 사용과 함께 분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포에 대한 스크리닝에 있어서, 스크리닝을 받는 iPS 세포는 이전에 공지된 방법을 따라, 체세포 내로 DNA 또는 단백질의 모양으로 특이적 리프로그래밍 인자(reprogramming factor)를 도입함으로써 준비될 수 있다.
리프로그래밍 인자는 구체적으로 ES 세포, 이들의 유전자 산물, 또는 비-암호화 RNA에서 발현되는 유전자, ES 세포의 비분화를 유지하는데 중요한 역할을 수행하는 유전자, 이들의 유전자 산물, 또는 비-암호화 RNA, 또는 저분자량 화합물로 구성될 수 있다. 리프로그래밍 인자로서 포괄되는 유전자(들)의 예시는 Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, 및 Glis1를 포함한다. 이러한 리프로그래밍 인자는 독립적 또는 조합(combination)으로 사용될 수 있다.
리프로그래밍 인자 조합의 예시는 WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, 및 WO2010/147612에 기재된 바로서, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106: 8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461: 649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6: 167-74, Han J, et al. (2010), Nature. 463: 1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28: 713-720, Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474: 225-9.에 기재된 바로서 조합을 포함한다.
상기 리프로그래밍 인자의 예시는 또한 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase, HDAC) 억제제{예를 들면, 발포릭 산(valproic acid, VPA), 트리코스타틴 A(trichostatin A), 낙산 나트륨(sodium butyrate), MC 1293, 및 M344과 같은 저-분자량 억제제, 및 HDAC(예를 들면, HDAC1 siRNA SmartpoolTM (Millipore) 및 HDAC1 (OriGene)에 대한 HuSH 29 머 shRNA 구축체)에 대한 siRNA 및 shRNA과 같은 핵산 발현 억제제}, MEK 억제제(예를 들면, PD184352, PD98059, U0126, SL327, 및 PD0325901), 글리코겐 합성효소 카이나제-3(Glycogen synthase kinase-3) 억제제(예를 들면, Bio 및 CHIR99021), DNA 메틸기 전달효소(DNA methyl transferase) 억제제(예를 들면, 5-azacytidine), 히스톤 메킬기 전달효소(histone methyltransferase) 억제제(예를 들면, BIX-01294와 같은 저-분자량 억제제 , 및 Suv39hl, Suv39h2, SetDBl, 및 G9a에 대한 siRNA 및 shRNA과 같은 핵산 발현 억제제), L-채널 칼슘 길항체(L-channel calcium agonists)(예를 들면, Bayk8644), 부틸 산(butyric acid), TGF 베타 억제제(TGF beta 억제제)(예를 들면, LY364947, SB431542, 616453, 및 A-83-01), p53 억제제(예를 들면, p53에 대한 siRNA 및 shRNA), ARID3A 억제제(예를 들면, ARID3A 에 대한 siRNA 및 shRNA), miRNA(예를 들면, miR-291-3p, miR-294, miR-295, 및 mir-302), Wnt 신호(Signaling)(예를 들면, soluble Wnt3a), 신경펩티드 Y(neuropeptide Y), 프로스타글란딘(prostaglandins)(예를 들면, 프로스타글란딘 E2 및 프로스타글란딘 J2), hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLISl, PITX2, 및 DMRTB1과 같이 제조물(establishment)에 대하여 효율을 개선하기 위하여 사용되는 인자를 포함한다. 본 명세서에서, 제조물에 대하여 효율을 개선하기 위하여 사용되는 이러한 인자는 리프로그래밍 인자로부터 구체적으로 구별되지 않는다.
리프로그래밍 인자가 단백질의 형태로 사용될 때, 이는 리포펙션(lipofection), 세포막-투과성의 펩티드(예를 들면, HIV-derived TAT 및 polyarginine)와의 융합(fusion), 또는 마이크로주입(microinjection)과 같은 기술로서 체세포 내로 도입될 수 있다.
한편, DNA의 형태에 리프로그래밍 인자가 있을 때, 이는 예를 들면, 바이러스, 플라스미드, 또는 인공의 염색체(chromosome)와 같은 벡터를 사용하는 기술, 리포펙타민(lipofection)(또는 리포좀 형질감염(liposome transfetion)), 또는 마이크로주입(microinjection)으로 체세포 내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터의 예시는 레트로바이러스 벡터(retrovirus vector), 렌티바이러스 벡터(lentivirus vector)(Cell, 126, pp. 663-676, 2006; Cell, 131, pp. 861-872, 2007; Science, 318, pp. 1917-1920, 2007), 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector)(Science, 322, 945-949, 2008), 아데노-관련의 바이러스 벡터(adeno-associated virus vector), 및 센다이 바이러스 벡터(a Sendai virus vector)(WO 2010/008054)를 포함한다. 뿐만 아니라, 인공의 염색체 벡터의 예시는 인간 인공 염색체(human artificial chromosome)(HAC), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome)(YAC), 및 미생물 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)(BAC 또는 PAC)를 포함하고, 플라스미드로서, 포유동물 세포에 대한 플라스미드가 사용될 수 있다(Science, 322: 949-953, 2008). 여기에서 사용된 벡터는 프로모터, 증폭자(enhancer), 리보솜 결합 서열, 종결자, 및 폴리아데닐화 위치(polyadenylation site)와 같은 일반적인 서열을 포함할 수 있으므로 핵산 리프로그래밍 물질이 발현될 수 있다. 뿐만 아니라, 필요하다면, 상기 벡터는 약물 저항성 유전자(예를 들면, 가나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 암피실린(ampicillin) 저항 유전자, 및 푸로마이신(puromycin) 저항 유전자), 티미딘 키나아제 유전자, 및 티프테리아(diphtheria) 독소 유전자와 같은 선별 마커 서열, 및 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)(GFP), 베타 글루쿠로니다제(beta glucuronidase)(GUS), 및 FLAG와 같은 리포터 유전자 서열을 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 벡터는 체세포 내로 유도된 후 유전자를 절단하도록 하는, 리프로그래밍 인자를 암호화하는 유전자 또는 프로모터와 연결된 리프로그래밍 인자를 암호화하는 유전자의 5][-말단 및 3][-말단에 LoxP 서열을 추가로 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, RNA의 형태에 리프로그래밍 인자가 있을 때, 이는 리포펙타민 또는 마이크로주입과 같은 기술로서 체세포 내로 유도될 수 있다. 분해를 억제하기 위하여, 그 안에 인가된 5-메틸시티딘(5-methylcytidine) 및 슈도리딘(pseudouridine)(TriLink Biotechnologies)의 RNA는 또한 사용될 수 있다(Warren L, (2010) Cell 줄기 세포, 7: 618-630).
iPS 세포를 유도하기 위한 배양 용액의 예시는 10% 내지 15% FBS-포함하는 DMEM, DMEM/F12, 또는 DME 배양 용액(이러한 배양 용액은 LIF, 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 푸로마이신(puromycin), L-글루타민(L-glutamine), 비필수 아미노산(nonessential amino acids), 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 또는 유사체를 적절하게 추가로 포함할 수 있다) 또는 상업적으로 가능한 배양 용액{예를 들면, 마우스 ES 세포를 배양하기 위한 배양 용액(TX-WES 배양 용액, Thromb-X), 일차 ES 세포를 배양하기 위한 배양 용액(일차 ES/iPS 세포에 대한 배양 용액, ReproCELL), 및 무혈청 배지(mTeSR, Stemcell Technology)}을 포함한다.
배양 방법의 예시는 다음과 같다. 체세포는 5% CO2 존재의 37℃에서 10% FBS를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12 배양 용액에서 리프로그래밍 인자로 접촉되어서 4 내지 7 일 동안 배양되었다. 그런 다음, 세포는 지지세포(feeder cells)(예를 들면, 미토마이신 C-처리된 STO 세포(mitomycin C-treated STO cells) 또는 SNL 세포) 위에 재 접종되었다. 체세포 및 리프로그래밍 인자 사이에 접촉 후 10 일에, 세포는 bFGF를 포함하는 일차 ES 세포 배양을 위해 배양 용액에서 배양되었다. 접촉 후 약 30 내지 45 일 또는 그 이상에, iPS 세포-유사 콜로니가 형성될 수 있다.
대체적으로, 세포는 지지 세포 위에서(예를 들면, 미토마이신 C-처리된 STO 세포 또는 SNL 세포) (LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 푸로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 또는 유사체를 적절하게 추가로 포함할 수 있는)10% FBS를 포함하는 DMEM 배양 용액을 사용하여 5% CO2 존재의 37℃에서 배양될 수 있다. 약 25 내지 30 일 또는 그 이상 후에, ES-유사 콜로니가 형성될 수 있다. 바람직한 방법의 예시는 지지 세포 대신에 직접적으로, 리프로그래밍된 체세포(Takahashi K, et al., (2009), PLoS One, 4: e8067 또는 WO2010/137746) 또는 세포 외 기질((예를 들면, Laminin-5 (WO2009/123349) 및 matrigel (BD))을 사용하는 것과 연관된 방법을 포함한다.
이러한 예시에 더한 다른 예시는 무혈청 배지(Sun N, et al., (2009), Proc Natl Acad Sci U.S.A., 106: 15720-15725)에서 배양하는 것과 관련되는 배양 방법이다. 뿐만 아니라, iPS 세포는 수립체의 효율을 증가시키기 위하여 저산소 조건(hypoxia conditions (0.1% 또는 그 이상, 15% 또는 미만의 산소 농도) 하에서 또한 수립될 수 있다(Yoshida Y, et al., (2009), Cell 줄기 세포, 5: 237-241 또는 WO2010/013845).
상기 배양 동안에, 배양 용액은 배양 개시 이후 2 일에 한 번 씩 신선한 배양 용액으로 교환되었다. 추가로, 핵산 리프로그래밍에 사용되는 체세포의 수는 제한되지 않으나, 배양 디쉬(100 ㎠) 당 대략 5×103 세포 내지 대략 5×106 세포의 범위이다.
iPS 세포는 이로써 형성된 콜로니의 형태에 의존하여 선별될 수 있다. 한편, 체세포가 리프로그래밍될 때 발현된 유전자와 결합되어 발현된 약물 저항 유전자가 마커 유전자로서 도입되었을 때, 세포는 적합한 약학적 제제를 포함하는 배양 용액(선별 배양 용액)에서 배양되므로, 이로써 수립된 iPS 세포는 선별될 수 있다. 뿐만 아니라, iPS 세포는 마커 유전자가 형광 단백질 유전자를 가지고 있을 때, 형광 현미경으로 관찰을 통해, 마커 유전자가 루미네센스 효소(luminescent enzyme) 유전자일 때 루미네센스 기질의 첨가를 통해, 또는 마커 유전자가 발색 효소(chromogenic enzyme) 유전자일 때 발색 기질의 첨가를 통해 선별될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “체세포”는 생식계 세포(예를 들면, 난자, 난모, 및 ES 세포)를 제외한 모든 동물 세포(바람직하게는, 인간 세포를 포함하는 포유류 세포)를 나타낼 수 있다. 체세포의 예시는 어떠한 태아의(fetal) 체세포, 신생아(neonate) 체세포, 및 성숙하고 건강한 또는 병원성 체세포, 또는 일차 배양된 세포, 계대 배양된(passaged) 세포, 및 수립된 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 체세포의 구체적인 예는 (1) 조직 줄기세포(tissue stem cells)(체세포 줄기 세포) such as 신경 줄기세포, 조혈계(hematopoietic) 줄기세포, 간엽성(mesenchymal) 줄기세포, 및 치수(dental pulp) 줄기 세포, (2) 조직 전구 세포(tissue precursor cells), (3) 림프구(lymphocytes), 혈관 상피세포(epithelial cells), 내피 세포(endothelial cells), 근육 세포(muscle cells), 섬유아세포(fibroblasts)(예를 들면, 피부 세포), 모발 세포, 간세포(hepatocytes), 위점막 세포(gastric mucosal cells), 장세포(enterocytes), 비장 세포(spleen cells), 췌장 세포(pancreatic cells)(예를 들면, 췌장 외분비 세포), 뇌 세포, 폐포 세포(pneumocytes), 신장 세포(renal cells), 및 지방 세포와 같은 분화된 세포를 포함한다.
2. 인간 유도 만능 줄기 세포주 스크리닝을 위한 시약 및 키트
본 발명은 추가로 인간 유도 만능 줄기 세포주를 스크리닝하기 위한 시약을 제공한다. 본 발명의 스크리닝을 위한 시약은 적어도 상기-기재한 마커에 인식하는 프로브, 프라이머, 또는 항체 중 하나의 형태를 포함한다. 상기 시약은 다른 시약 또는 장치(apparatuses)와 조합된 키트로 생산되어 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 RNA 추출을 위한 시약, 유전자 추출을 위한 시약, 염색체 추출을 위한 시약, 또는 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 차이 분석을 위한 과정을 포함하는 문서 또는 설명과 같이 분화 내성을 나타내는 세포주 및 분화 내성을 나타내지 않는 세포주 간의 차이(discrimination)에 대하여 차이 분석을 위한 수단, 컴퓨터에 의하여 차이 분석을 위한 과정을 시행하기 위한 프로그램, 프로그램 목록, 컴퓨터로 읽을 수 있는, 이에서 기록된 프로그램을 포함하는 기록 매체(예를 들면, 플로피 디스크, 광디스크, CD-ROM, CD-R, 및 CD-RW), 및 차이 분석의 실행을 위한 장치 또는 시스템(예를 들면, 컴퓨터)를 포함할 수 있다.
[실시예]
본 발명은 이하 실시예의 방법에 의하여 자세하게 기재할 것이나, 이것이 본 발명의 범주를 제한하는 것으로써 이해되어서는 안된다.
[실시예 1]
1. 세포
인간 ES 세포로서, KhES1, KhES3 (Suemori H, et al., Biochem Biophys Res Commun. 345: 926-32, 2006) 및 H9 (Thomson, J.A., et al., Science 282: 1145-1147, 1998)가 사용되었다.
인간 iPS 세포로서, 하기의 방법에 의하여 준비된 9 가족 및 39 클론이 사용되었다.
(i) 4 개의 CB-EP6F 클론을 준비하기 위해서, 여섯(6) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-Myc, LIN28, 및 p53shRNA)는 에피솜 벡터(episomal vector)(Okita K, et al., Nat methods, 8: 409-12, 2011)를 사용하여 탯줄(umbilical cord) 혈액으로부터 추출된 CD34 양성 세포(WO2010/131747) 내로 유도되었다.
(ii) 3 개의 CB-RV4F 클론을 준비하기 위해서, 네(4) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, 및 c-MYC)는 레트로바이러스를 이용하여 탯줄 혈액으로부터 추출된 CD34 양성 세포 내로 유도되었다(WO2010/131747).
(iii) 5 개의 CB-SV4F 클론을 준비하기 위해서, 네(4) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, 및 c-MYC)는 센다이바이러스(Seki T, et al., cell stem cell, 7: 11-4, 2010)를 이용하여 탯줄 혈액으로부터 추출된 CD34 양성 세포(WO2010/131747) 내로 유도되었다.
(iv) 2 개의 DP-EP6F 클론을 준비하기 위해서, 여섯(6) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-Myc, LIN28, 및 p53shRNA)는 에피솜 벡터를 사용하여 치수 줄기 세포 내로 유도되었다(Okita K, et al., Nat Methods, 8: 409-12, 2011).
(v) 3 개의 FB-EP6F 클론을 준비하기 위해서, 여섯(6) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-Myc, LIN28, 및 p53shRNA)는 에피솜 벡터를 사용하여 섬유아세포 내로 유도되었다(Okita K, et al., Nat Methods, 8: 409-12, 2011).
(v) 3 개의 FB-EP6F 클론을 준비하기 위해서, 여섯(6) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-Myc, LIN28, 및 p53shRNA)는 에피솜 벡터를 사용하여 섬유아세포 내로 유도되었다(Okita K, et al., Nat Methods, 8: 409-12, 2011).
(vi) 4 개의 FB-RV3F 클론을 준비하기 위해서, 세(3) 인자(OCT3/4, SOX2, 및 KLF4)는 레트로바이러스를 사용하여 섬유아세포 내로 유도되었다(Okita K, et al., Nat Methods, 8: 409-12, 2011).
(vii) 7 개의 FB-RV4F 클론을 준비하기 위해서, 네(4) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, 및 c-MYC)는 레트로바이러스를 사용하여 섬유아세포 내로 유도되었다(Okita K, et al., Nat Methods, 8: 409-12, 2011).
(viii) 4 개의 PM-EP6F 클론을 준비하기 위해서, 여섯(6) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-Myc, LIN28, 및 p53shRNA)는 레트로바이러스를 사용하여 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)(PBMC)에 포함되는 T 세포(Seki T, et al., cell stem cell, 7: 11-4, 2010) 내로 유도되었다(Okita K, et al., Nat Methods, 8: 409-12, 2011).
(xi) 4 개의 PM-SV4F 클론을 준비하기 위해서, 네(4) 인자(OCT3/4, SOX2, KLF4, 및 c-MYC)는 센다이바이러스를 사용하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 포함되는 T 세포 내로 유도되었다(Seki T, et al., cell stem cell, 7: 11-4, 2010).
2. 분화 내성의 확인
ES 세포 및 iPS 세포의 분화 내성을 확인하기 위해서, 상기 언급한 세포는 하기 단계를 포함하는 변형된 SFEBq 방법을 사용하여 신경 세포에서 결과물을 유도 분화하도록 하였다.
(1) 10 마이크로몰라 Y27632(WAKO)는 ES 세포 또는 iPS 세포의 배양 용액에 첨가한 후 용액은 세 시간 동안 방치하였다.
(2) 지지 세포는 CTK 용액(콜라게나제-트립신-KSR(collagenase-trypsine-KSR))을 사용하여 제거되었고, 결과물은 아큐막스(Accumax)(Innovate cell technologies 사)를 처리하여, 결과된 세포는 96-웰 플레이트(리피듀어 코팅된 U96w(Lipidure-coat U96w), NOF Corporation 사)에 9,000 세포/150 ㎕/웰로 첨가되었다.
(3) 세포는 10 μM Y-27632, 2 μM 도르소모르핀(Dorsomorphin)(Sigma), 10 μM SB431542 (Sigma), 5% KSR (Invitrogen), MEM-비필수 아미노산 용액(Invitrogen), L-글루타민(Invitrogen), 및 2-머캅토에탄올(Invitrogen)을 포함하는 DMEM/F12(Invitrogen)에 배양되었다. 절반의 배지는 14 일의 배양을 따르면서, 매 3 또는 4 일 마다 Y-27632, 도르소모르핀, 및 SB431542이 결여된 배지로 교환되었다. 그런 다음, 이로써 수득된 신경 세포는 분리하여, 37% 포르말린에 고정하고, 알렉사 플루오르 488 마우스 항-Oct3/4(BD Pharmingen)로 염색한 다음, 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. CB-RV4F-2, DP-EP6F-1, FB-RV3F-3, FB-RV3F-4, FB-RV4F-5, 및 FB-RV4F-11의 경우에서, Oct3/4 양성 세포는 분화 유도 후에 5% 또는 그 이상으로 포함되었다. 이러한 iPS 세포는 분화 내성을 나타내는 세포주의 세포로서 사용되었다. 결과는 [표 3]에 나타내었다.
Figure pct00006
Figure pct00007

Figure pct00008
“○”은 분화 내성을 나타내지 않는 클론을 의미한다.
“×”은 분화 내성을 나타내는 클론을 의미한다.
3. 분화 내성 마커의 확인
RNA는 5 개의 분화 내성을 나타내는 iPS 세포주(CB-RV4F-2, DP-EP6F-1, FB-RV3F-3, FB-RV3F-4, 및 FB-RV4F-5) 및 27 종류의 분화 내성을 나타내지 않는 iPS 세포주(ES 세포를 포함)로부터 수집되었다. RNA 발현은 마이크로어레이(인간 GE G3 8x60k, Agilent)를 사용하여 측정되었다. 표 4는 분화 내성을 나타내는 세포주에서보다 5 배 또는 그 이상 수준으로 분화 내성을 나타내지 않는 세포주에서 발현되는 마커군을 나타낸다. 유사하게, 표 5는 분화 내성을 나타내는 세포주에서보다 5 배 또는 그 미만 수준으로 분화 내성을 나타내지 않는 세포주에서 발현되는 마커군을 나타낸다.
여기에서, t-검사에 의해서 수득된 각각의 P 값이 0.05 또는 미만인, 4 개의 마커는 표 4로부터 확인되었고 DLX5, MEIS2, lincRNA:chr17:21434064-21435857 역방향 가닥, GREB1L), t-검사에 의해서 수득된 각각의 P 값이 0.05 또는 미만인, 12 개의 마커는 표 5로부터 확인되었다(C4orf51, C7orf57, lincRNA:chr7:124873114-124899839 역방향 가닥, OC90, lincRNA:chr8:133071643-133092468 역방향 가닥, lincRNA:chr8:133076031-133093351 역방향 가닥, ABHD12B, lincRNA:chr18:54721302-54731677 역방향 가닥, ZNF541, TBX1, CXorf61, DB090170 TESTI4 인간(Homo sapiens) cDNA 클론 TESTI4038997 5', mRNA 서열 [DB090170]).
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012

Figure pct00013
Figure pct00014

[실시예 2]
(1) 세포
상기 4 종류의 분화 내성을 나타내는 iPS 세포주(CB-RV4F-2, DP-EP6F-1, FB-RV3F-4, 및 FB-RV4F-5)는 접종된 후 이로써 수득된 콜로니를 15 개의 서브클론(서브클론)은 CB-RV4F-2로부터 수득하며, 15 개의 서브클론은 DP-EP6F-1로부터 수득하고, 10 개의 서브클론은 FB-RV3F-4로부터 수득하며, 및 11 개의 서브클론은 FB-RV4F-5로부터 수득하도록 얻었다(pick up).
(2) 분화 내성의 확인
ES 세포 및 iPS 세포의 분화 내성을 확인하기 위하여, 신경 세포로의 분화 유도는
상기 변형된 SFEBq 방법을 사용하여 수행한 다음, TRA-1-60 양성 세포의 비율을 유세포 분석기를 사용하여 확인하였다. 결과로서, 15 개 CB-RV4F-2 서브클론 중 12 개는 신경 세포로의 세포 분화 유도 후에 1% 또는 그 이상의 TRA-1-60 양성 세포를 포함하였다(표 6). 유사하게, 15 개의 DP-EP6F-1 서브클론 중 12 개(표 7), 10 개의 FB-RV3F-4 서브클론 중 8 개(표 8), 11 개의 FB-RV4F-5 서브클론 중 3 개(표 9)는 1% 또는 그 이상에서 TRA-1-60 양성 세포를 포함하였다. 상기 1% 또는 그 이상에서 TRA-1-60 양성 세포를 포함하는 것으로 확인된 35 개의 서브클론은 iPS 분화 내성을 나타내는 세포주로서 스크리닝되었다.
Figure pct00015

Figure pct00016
Figure pct00017

Figure pct00018

분화 내성 마커의 확인
RNA는, 상기 방법을 통해 스크리닝된, 분화 내성을 나타내는 35 개의 서브클론 및 분화 내성을 나타내지 않는 16 개의 서브클론으로부터 추출된 다음, 각각의 RNA 발현 수준은 마이크로어레이를 사용하여 확인되었다. 결과로서, lincRNA 및 mRNA는 표 10에 나타난 바와 같이 분화 내성을 나타내는 서브클론에서 유의적으로 높은 수준으로 발현되었다.
Figure pct00019

[실시예 3]
분화 내성을 나타내는 세포주에 대한 마커로서 표 5(실시예 1) 및 표 10(실시예 2)에 포함된 C4orf51, HHLA1 및 ABHD12B의 RNA 발현은 정량적 PCR로 분화 내성을 나타내는 6 개의 클론 및 분화 내성을 나타내지 않는 6 개의 클론에서 측정되었다(도 1). 이는 상기 마커 유전자가 이전 결과와 마찬가지로서 분화 내성을 나타내는 클론에서 발현되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 이는 상기 유전자들이 그들의 유전자 몸체에서 LTR7 지역을 가지는 것으로 확인되었다(도 2). 결과적으로, LTR7 지역 또는 이들의 인접지역의 CpG 디뉴클레오티드에서 메틸화된 시토신의 비율이 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)으로 확인되었다(도 3). 간단하게, 파이로시퀀싱은 파이로마크 분석 디자인 소프트웨어 2.0(Pyromark Assay Design Software 2.0)(Qiagen)으로 디자인된 프라이머와 함께 수행되었다. LTR7 지역의 프라이머 서열 및 CpG 디뉴클레오티드는 표 11 및 12에 나타내었다. PCR은 25 ng 중아황산염 치환된 DNA(bisulfite-converted DNA), 1X 파이로마크 PCR 전체 혼합물(Pyromark PCR Master Mix)(Qiagen), 1X 코럴 로드 농축액(Coral Load Concentrate)(Qiagen), 및 0.3 μM 정방향 및 5′비오틴화된 역방향 프라이머(biotinylated reverse primers)를 포함하는 반응 혼합물 25 ㎕에서 수행되었다. PCR 조건(conditions)은 30 초 동안 95℃, 30 초 동안 50℃, 및 30 초 동안 75℃의 45 사이클(cycles)이었다. PCR 산물은 스트렙타비딘 세파로즈 비드(streptavidin sepharose beads)(Amersham Biosciences로 옮긴 후 정제, 세척, 분리하고, 다시 세척하였다. 그런 다음, 0.3 μM/+리터+ 파이로시퀀싱 프라이머는 정제된 PCR 산물에 어닐링(annealed)되었다. 파이로시퀀싱 반응은 PSQ HS 96 파이로시퀀싱 시스템에서 수행되었다. 메틸화의 정도는 메틸화 및 비메틸화된 시토신의 합을 메틸화된 시토신의 비율을 메틸화 및 비메틸화된 시토신의 합으로 나누어 표현되었다( 5mC의 백분율). PCR 파이로시퀀싱 분석을 확인하기 위하여, 각각의 CpG 디뉴클레오티드 위치는 3 회 반복으로 분석하여 이들의 평균은 최종 분석에서 사용되었다. 결과로서, C4orf51, HHLA1 및 ABHD12B 유전자 몸체에 위치하는 LTR7 지역 또는 그의 근접한 부분의 CpG 디뉴클레오티드 위치의 메틸화된 상태는 유의적으로 높은 수준이었다.
Figure pct00020
Figure pct00021

Figure pct00022
Figure pct00023

“강조된 CG 서열”은 DNA 메틸화 상태로 분석되었다.
상기 결과로부터, 분화 내성을 나타내는 클론은 C4orf51, HHLA1 및 ABHD12B의 발현을 인식함으로써 분리될 수 있다. 유사하게, 분화 내성을 나타내는 클론은 C4orf51, HHLA1, 및 ABHD12B 유전자 몸체에 위치하는 LTR7 지역 또는 그들의 인접한 부분의 DNA 메틸화 상태를 인식함으로써 분리될 수 있다.
본 발명에서 언급한 모든 문헌, 특허 및 출원 특허는 이들 전체의 선행기술문헌으로 본 발명에 포함된다.
본 출원의 발명은 재생의약품 제제 생산의 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Kyoto University <120> METHOD FOR SCREENING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS <130> 13fpi-12-001 <150> US 61/511,156 <151> 2011-07-25 <150> PCT/JP 2012/004747 <151> 2012-07-25 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> retroviral virus <400> 1 tgtcaggcct ctgagcccaa gctaagccat cacatcccct gtgactagca catatacgct 60 cagatggcct gaagtaactg aagaatcaca aagaagtgaa aatgccctgc cccaccttaa 120 ctgatgacat tccaccacaa aagaagtgaa aatggccggt ccttgcctta agtgatgaca 180 ttaccttgta agagtccttt tcctggctca tcctagctca aaaatctccc ctactgagca 240 ccctgcgacc cccactccta cccgccaaag aacaaccccc ctttgactgt aattgtcctt 300 tacctaccca aatcctataa aacagcccca cccctatctc cctttgctga ctctcttttc 360 ggactcagcc cgcctgcacc caggtgatta aaagctttat tgctcacaca aagcctgttt 420 ggtggtctct tcacacggac gcgcatgaaa 450 <210> 2 <211> 453 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgtcaggcct ctgagcccaa gccaagccat cgcaacccct gtgacttgca cctatacgcc 60 cagatggcct gaagtaactg aagaatcaca aaagaagtga atatgccctg ccccacctta 120 actgatgaca ttccaccaca aaagaagtgt aaatggccgg tccttgcctt aactgatgac 180 attaccttgt gaaagtcctc ttcctggctc atcctggctc aaaaagcacc cccactgagc 240 accttgagac ccccactcct gcccgccaga gaacaaaccc cctttgactg taattttcct 300 ttacctaccc aaatcctata aaacggcccc acccttatct cccttcactg actctctttt 360 cggactcagc ccgcctgcac ccaggtgaaa taaacagctt tattgctcac acaaagcctg 420 tttggtggtc tcttcacacg gacgcgcatg aaa 453 <210> 3 <211> 453 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgtcaggcct ctgagcccaa gccaagccat cgcaacccct gtgacttgca cctatacgcc 60 cagatggcct gaagtaactg aagaatcaca aaagaagtga atatgccctg ccccacctta 120 actgatgaca ttccaccaca aaagaagtgt aaatggctgg tccttgcctt aactgatgac 180 attaccttgt gaaagtcctc ttcctggctc atcctggctc aaaaagcacc cccactgagc 240 accttgagac ccccactcct gcccgccaga gaacaaaccc cctttgactg taattttcct 300 ttacctaccc aaatcctata aaacggcccc acccttatct cccttcactg actctctttt 360 cggactcagc ccgcctgcac ccaggtgaaa taaacagctt tattgctcac acaaagcctg 420 tttggtggtc tcttcacacg gacgcacatg aaa 453 <210> 4 <211> 451 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tgtcaggcct ctgagcccaa gccaagccat cgcatcccct gtgacttgca ggtatctgcc 60 cagatggcct gaagtaactg aagaatcaca aaagaagtga atatgccctg ccccacctta 120 actgatgaca ttccaccaca aaagaagtat aaatggccgg tccttgcctt aagtgatgac 180 actaccttgt gaaagtcctt ttcctggctc atcctggctc agaagctccc ccactgagca 240 ccttgtgacc cccacccctg cccaccagag aacaaccccc tttgactgta attttccatt 300 accttcccaa atcctataaa acagccccac ccctatctcc cttggctgac tctcttttcg 360 gactcagccc acctgcaccc aggtgaaata aacagccatg ttgctcacac aaagcctgtt 420 tggtggtctc ttcacacgga cgcgcatgaa a 451 <210> 5 <211> 491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgtcaggcct ctgagcccaa gccaagccat cgcatcccct gtgacttgca catatacgcc 60 cagatggcct gaagtaactg aagaatcaca aaagaagtga aaaggccctg ccctgcctta 120 actgatgaca ttccaccatt gtgatttgtt cctgccccac cttaactgag tgattaaccc 180 tgtgaatttc cttctcctgg ctcagaagct gccccacctt aactgagtga ttaaccctgc 240 gaatttcctt ctcctggctc agaagctccc ccactgagca ccttgtgacc cccgcccctg 300 cccaccagag agcaaccccc tttgactgta attttccatt accttcccaa atcctataaa 360 acggccccac ccctatctcc cttggctgac tctctttgcg gactcagccc gcctgcaccc 420 aggtgaaata aacagccatg ttgctcacac aaagcctgtt tggtggtctc ttcacacaga 480 cgcgcatgaa a 491 <210> 6 <211> 452 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tgtcaggcct ctgagcccaa gccaagccat cgcatcccct gtgacttgca catatacgcc 60 cagatggcct gaagtaactg aagaatcaca aaagaagtga atatgcccag ccccacctta 120 actgatgaca ttccaccaca aaaagaagtg taaatggccg gtccttgcct taactgatga 180 cattaccttg tgaaagtcct tttcctggct cattctggct caaatagcac ccccattgag 240 caccttgcaa cccccactcc tgcccgccag agaacaaacc ccctttgact gtaattttcc 300 tttacccacc caaatcatat aaaatggccc cacccttatc tcccttcgct gactctcttt 360 tcagactcag cccacctgca cccaggtgat taaaagcttt attgctcaca caaagcctgt 420 ttggtggtct cttcacacgg atgcgcaaga aa 452 <210> 7 <211> 450 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgtcaggcct ctgagcccaa gccaagccat cacatcccct gtgacttgca catatatgcc 60 cagatggcct gaagtaactg aagaatcaca aaagaagtga atatgccctg ccccacctta 120 actgatgaca ttccaccaca aaacaagtgt aaatggccgg tccttgcctt aactgatgac 180 attaccttgt gaaagtcctt ttcctggctc atcctggctc aaaagcaccc ccactgagca 240 ccttgcgacc cccactcctg cccgccagag aacaaacccc ctttgactgt aattttcctt 300 tacctaccca aatcctataa aacggcccca cccttaactc ccttcactga ctctcttttc 360 ggactcagcc cacctgtacc caggtgatta aaagctttat tgctcacaca aaacctgttt 420 ggtggtctct tcacacggac gcgcatgaaa 450 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 tgtgaaagtt ttttttttgg tttattttg 29 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 cctctccaaa actctaatac atatctt 27 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 10 acaataaaac tatttatttc acct 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 aaagtttgtt tggtggtttt tt 22 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 aaaaaaatta atctcctcca tatacctt 28 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 13 ttgtttggtg gttttttta 19 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 tgtgtattaa tgtatggtta attttggtaa 30 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 caaaccatct aaacaaatac ctacaa 26 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 16 gttgtttttt atgtagtgtt t 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 17 ttaggttttt gagtttaagt taa 23 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 aagtttgttt ggtggttttt ttatataga 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 accattccac aatcataata aaatacttt 29 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 20 accaataaca ataaacaaaa ttt 23 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 gttgtggagt tatttagatt tgggttta 28 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 cttttcctac catacataac actttaac 28 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 23 ttttttatta aggggttgg 19 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 tttttttttt gaaggtgagg gaaagtagtt 30 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 aacctataaa tctccatttc tctcatctc 29 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 26 tggtaggaat ggggt 15 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 ggataatttg aaaatgtttt tggttaagg 29 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 ataattcttc aattacttca aaccatcta 29 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 29 ggtttttgag tttaagttaa g 21 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 tttttttttt ggtttatttt ggtttaaaag 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 acaaaccata tctcaaataa aaaatttcat 30 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 32 atataaaatt tgtttggtgg 20 <210> 33 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 tgtgaaagtc ctcttcctgg ctcatcctgg ctcaaaaagc acccccactg agcaccttga 60 gacccccact cctgcccgcc agagaacaaa ccccctttga ctgtaatttt cctttaccta 120 cccaaatcct ataaaacggc cccaccctta tctcccttca ctgactctct tttcggactc 180 agcccgcctg cacccaggtg aaataaacag ctttattgct cacacaaagc ctgtttggtg 240 gtctcttcac acggacgcac atgaaattta gttgtatcca taaggcatat ggaggagact 300 aattcctctt ccaaagacat gtaccagagt cctggagagg 340 <210> 34 <211> 84 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 aaagcctgtt tggtggtctc ttcacacgga cgcacatgaa atttagttgt atccataagg 60 catatggagg agactaattc ctct 84 <210> 35 <211> 196 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tgtgtaccaa tgtatggtca attttggcaa attttccata tgcttgaaaa gaatgtgttc 60 tgctgttttt catgcagtgt tctatgtacg tcgattgaat cgggattatt aaccatgctt 120 aaatttgtca ggcctctgag cccaagccaa gccatcgcat cccctgtgac ttgcaggtat 180 ctgcccagat ggcctg 196 <210> 36 <211> 135 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 aagcctgttt ggtggtctct tcacacagac gcgcatgaaa aaattttgtc tattgttact 60 ggttttttgg actgcttgct ttttcagtta ctcaaagagg attattaaag tacctcatca 120 tgattgtgga atggt 135 <210> 37 <211> 267 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gctgtggagc cactcagact tgggttcaaa tctgtccttg gccacatacc ctttgtgacc 60 ttggtaaatt gtttctccct aagttttccc atttttttac caaggggttg gcgaagacca 120 ctgcacaggg ttgttgtgaa gactgaatta agtaagataa tgtatgtaaa gtacccagct 180 gctagtaagc actagacaaa tacttgttcc tttccgtccc tctttctgtt acaaattagg 240 ctaaagtgtt atgtatggca ggaaaag 267 <210> 38 <211> 236 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 cttctttctt gaaggtgagg gaaagcagtt aggaaacaga gcgaggaaca ggtgaatgtt 60 aactcagacc cctggcagga atggggctgt tctacgttat aaactgcctg agagttaata 120 gaggacttcc acacaagtct ttcgcactcg ttattctttt aaatcctcac agcaactctc 180 tgagtttgtc atcattgctt ccacttagag atgagagaaa tggagaccta taggtt 236 <210> 39 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ggataatttg aaaatgccct tggccaaggg gaagctccac cagtcagttg ggggagctta 60 gaattttatt tttggtttac aagttcatta tatattttgg atattaactc cttgtcaggc 120 ctctgagccc aagccaagcc atcgcatccc ctgtgacttg cacatatacg cccagatggc 180 ctgaagtaac tgaagaatca c 201 <210> 40 <211> 279 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 tccttttcct ggctcatcct ggctcaaaag cacccccact gagcaccttg cgacccccac 60 tcctgcccgc cagagaacaa accccctttg actgtaattt tcctttacct acccaaatcc 120 tataaaacgg ccccaccctt aactcccttc actgactctc ttttcggact cagcccacct 180 gtacccaggt gattaaaagc tttattgctc acacaaaacc tgtttggtgg tctcttcaca 240 cggacgcgca tgaaactcct tatctgagat atggtttgc 279

Claims (9)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 분화 내성(differentiation resistance)을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기세포주에 대한 스크리닝 방법:
    (i) A 군 및/또는 B 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자간 비-번역 RNA(large intergenic non-coding RNA, lincRNA)의 발현을 측정하는 단계;
    (ii) A 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA이 발현되거나 B 군에서 선택된 lincRNA 또는 mRNA가 발현되지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 선별하는 단계;
    A 군은
    (A1) lincRNA:chr1:852245-854050 역방향 가닥(reverse strand),
    (A2) GPR177,
    (A3) VTCN1,
    (A4) lincRNA:chr1:142803013-142804254 역방향 가닥,
    (A5) APOA2,
    (A6) WNT6,
    (A7) EPAS1,
    (A8) COL3A1,
    (A9) SLC40A1,
    (A10) S100P,
    (A11) HOPX,
    (A12) GUCY1A3,
    (A13) CDH10,
    (A14) HAPLN1,
    (A15) PITX1,
    (A16) HAND1,
    (A17) CGA,
    (A18) AQP1,
    (A19) DLX6,
    (A20) DLX5,
    (A21) SOX17,
    (A22) FLJ45983,
    (A23) PLCE1,
    (A24) H19,
    (A25) lincRNA:chr11:2016408-2017024 역방향 가닥,
    (A26) lincRNA:chr11:2017517-2017651 정방향 가닥(forward strand),
    (A27) IGF2,
    (A28) P2RY6,
    (A29) SLN,
    (A30) NNMT,
    (A31) APOA1,
    (A32) ERP27,
    (A33) LUM,
    (A34) CCDC92,
    (A35) CDX2,
    (A36) FLJ41170,
    (A37) MEG3,
    (A38) lincRNA:chr14:101292469-101299626 정방향 가닥,
    (A39) lincRNA:chr14:101295637-101302637 정방향 가닥,
    (A40) lincRNA:chr14:101296681-101298460 정방향 가닥,
    (A41) lincRNA:chr14:101298129-101300147 정방향 가닥,
    (A42) lincRNA:chr14:101324825-101327247 정방향 가닥,
    (A43) MEG8,
    (A44) lincRNA:chr14:101365673-101366049 정방향 가닥,
    (A45) lincRNA:chr14:101396955-101397357 정방향 가닥,
    (A46) lincRNA:chr14:101430757-101433381 정방향 가닥,
    (A47) lincRNA:chr14:101434059-101436282 정방향 가닥,
    (A48) lincRNA:chr14:101472355-101473369 정방향 가닥,
    (A49) DIO3,
    (A50) MEIS2,
    (A51) PRTG,
    (A52) C17orf51,
    (A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 역방향 가닥,
    (A54) lincRNA:chr17:21435180-21454915 역방향 가닥,
    (A55) lincRNA:chr17:21435959-21436405 역방향 가닥,
    (A56) CCR7,
    (A57) KRT23,
    (A58) GREB1L,
    (A59) GATA6,
    (A60) TTR,
    (A61) UCA1,
    (A62) FLRT3,
    (A63) lincRNA:chrX:73040495-73047819 역방향 가닥,
    (A64) VGLL1,
    (A65) RPS4Y1,
    (A66) DDX3Y, 및
    (A67) RPS4Y2으로 구성,
    B 군은
    (B1) DMRTB1,
    (B2) lincRNA:chr1:73430887-73446112 역방향 가닥,
    (B3) lincRNA:chr1:73444697-73444997 역방향 가닥,
    (B4) C4orf51,
    (B5) PCDHA1,
    (B6) lincRNA:chr6:95250854-95263604 역방향 가닥,
    (B7) lincRNA:chr6:14280358-14285376 역방향 가닥,
    (B8) lincRNA:chr6:14283301-14285685 역방향 가닥,
    (B9) C7orf57,
    (B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 역방향 가닥,
    (B11) lincRNA:chr8:129599518-129624118 역방향 가닥,
    (B12) OC90,
    (B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 역방향 가닥,
    (B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 역방향 가닥,
    (B15) HHLA1,
    (B16) lincRNA:chr8:133076031-133093351 역방향 가닥,
    (B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 역방향 가닥,
    (B18) lincRNA:chr8:138387843-138421643 역방향 가닥,
    (B19) lincRNA:chr8:138418343-138425831 역방향 가닥,
    (B20) NDUFA4L2,
    (B21) lincRNA:chr13:54698462-54707001 역방향 가닥,
    (B22) ABHD12B,
    (B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 역방향 가닥,
    (B24) ZNF208,
    (B25) ZNF257,
    (B26) ZNF676,
    (B27) ZNF541,
    (B28) TBX1,
    (B29) CXorf61, 및
    (B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA 클론 TESTI4038997 5', mRNA sequence [DB090170]으로 구성됨.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 A 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA는 하기 군으로부터 구성되는 방법;
    (A20) DLX5,
    (A50) MEIS2,
    (A53) lincRNA:chr17:21434064-21435857 역방향 가닥, 및
    (A58) GREB1L.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 B 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA는 하기 군으로부터 구성되는 방법;
    (B4) C4orf51,
    (B9) C7orf57,
    (B10) lincRNA:chr7:124873114-124899839 역방향 가닥,
    (B12) OC90,
    (B13) lincRNA:chr8:133071643-133092468 역방향 가닥,
    (B14) lincRNA:chr8:133073732-133075753 역방향 가닥,
    (B15) HHLA1,
    (B16) lincRNA:chr8:133076031-133093351 역방향 가닥,
    (B17) lincRNA:chr8:133090096-133097869 역방향 가닥,
    (B22) ABHD12B,
    (B23) lincRNA:chr18:54721302-54731677 역방향 가닥,
    (B27) ZNF541,
    (B28) TBX1,
    (B29) CXorf61, 및
    (B30) DB090170 TESTI4 Homo sapiens cDNA 클론 TESTI4038997 5', mRNA 서열 [DB090170]로 구성됨.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 B 군으로부터 선택된 lincRNA 또는 mRNA는 하기 군으로부터 구성되는 방법;
    (B4) C4orf51,
    (B15) HHLA1, 및
    (B22) ABHD12B.
  5. 하기의 단계를 포함하는, 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기세포주에 대한 스크리닝 방법;
    (i) (B4) C4orf51, (B15) HHLA1, 및 (B22) ABHD12B의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에서 LTR 지역 또는 이의 주위(neighborhood)의 DNA-메틸화된 위치를 측정, 및
    (ii) LTR7 지역이 DNA-메틸화된 위치인 인간 유도 만능 줄기 세포주를 선별.
  6. 상기 A 군 또는 B 군에 나타난 적어도 하나의 mRNA 또는 LincRNA의 뉴클레오티드 서열에서 적어도 15 개의 연속된 뉴클레오티드를 가지는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 스크리닝하기 위한 시약(reagent).
  7. 제 6항에 있어서, 프로브(probe)로서, 상기 A 군 또는 B에 나타나는 적어도 하나의 mRNA 또는 LincRNA의 뉴클레오티드 서열에서 적어도 15 개의 연속된 뉴클레오티드를 가지는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드가, 고정됨으로써 제조된 마이크로어레이(microarray)인 시약.
  8. 상기 A 군 또는 B 군에 나타난 적어도 하나의 mRNA로서 암호화되는 단백질과 결합하는 항체를 포함하는, 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 스크리닝하기 위한 시약.
  9. 제 6 내지 8항 중 어느 한 항의 시약을 포함하는, 분화 내성을 나타내지 않는 인간 유도 만능 줄기 세포주를 스크리닝하기 위한 키트.
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