KR20140041635A - Composition for protecting skin and inhibiting damage of skin against uv comprising polysiphonia morrowii harvey - Google Patents

Composition for protecting skin and inhibiting damage of skin against uv comprising polysiphonia morrowii harvey Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising Polysiphoniai morrowii Harvey extract as an active ingredient for treating skin and inhibiting skin damage caused by ultraviolet. The Polysiphonia morrowii Harvey extract of the present invention has an outstanding antioxidative effect through an activity of eliminating a free radical in cells generated by ultraviolet irradiation, and also the Polysiphonia morrowii Harvey extract has outstanding effects of directly absorbing ultraviolet per se and inhibiting apoptosis induced by ultraviolet. Thus, the pharmaceutical composition of the present invention, which comprises the Polysiphonia morrowii Harvey extract as an active ingredient, can be usefully applied to skin treatment and skin protection by effectively protecting skin cells from ultraviolet. Particularly, since the Polysiphonia morrowii Harvey extract is a native substance, which is an edible material, the composition of the present invention comprising the Polysiphonia morrowii Harvey extract as an active ingredient is beneficial to long term use in terms of safety.

Description

모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 조성물{Composition for protecting skin and inhibiting damage of skin against UV Comprising Polysiphonia morrowii Harvey}Composition for protecting skin and inhibiting damage of skin against UV Comprising Polysiphonia morrowii Harvey}

본 발명은 자외선에 의한 피부손상을 억제 및 피부를 보호해 줄 수 있는 치료용 약제학적 조성물 및 자외선 흡수용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a therapeutic pharmaceutical composition and a composition for absorbing ultraviolet rays that can inhibit skin damage caused by ultraviolet rays and protect the skin.

일반적으로 태양광에 포함된 자외선은 피부에 직접적으로 과도하게 조사되는 경우, 홍반 형성이나 피부 세포 내의 멜라닌색소 생성을 촉진시켜 기미나 잡티 발생의 원인이 되기도 하며, 표피에 분비되는 피지와 반응하여 과산화지질을 생성함으로써 피부트러블을 발생시키기도 하고, 심할 경우 피부암 발생의 원인이 되기도 한다. 자외선은 파장에 따라 UV-A (320~400 nm), UV-B (280~320 nm), UV-C (200~280 nm)로 구분되며, 이 중 지표에 도달하여 인체에 영향을 주는 자외선은 UV-A 및 UV-B로 알려져 있다. In general, ultraviolet rays contained in sunlight can cause erythema formation or melanin pigmentation in skin cells when excessively directly irradiated to the skin, which can cause blemishes and blemishes, and react with sebum secreted by the epidermis and peroxidation. The production of lipids can cause skin problems and, in severe cases, can cause skin cancer. Ultraviolet rays are classified into UV-A (320 to 400 nm), UV-B (280 to 320 nm) and UV-C (200 to 280 nm) depending on the wavelength. Among them, ultraviolet Are known as UV-A and UV-B.

자외선 노출은 피부 내에서 자유라디칼(free radical) 형성과 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 발생을 증가시키고, DNA, 세포막 및 단백질 등 세포성분들에 대한 산화적 스트레스를 유발시켜 피부노화를 일으키는 것으로 알려져 있다.
UV exposure increases free radical formation and the generation of reactive oxygen species (ROS) in the skin, and induces aging stress by oxidative stress on cellular components such as DNA, membranes and proteins. It is known to cause.

상기와 같은 자외선에 의한 피부손상 방지를 목적으로 사용되고 있는 자외선차단제는 크게 화학적 자외선차단제와 물리적 자외선차단제로 분류되고 있다. The sunscreens used for the purpose of preventing skin damage by ultraviolet rays are classified into chemical sunscreens and physical sunscreens.

자외선의 화학적 흡수를 메커니즘으로 하는 화학적 차단제는 신남산계, 살리실산계, 벤조페논계 등의 유기차단제가 잘 알려져 있으며, 자외선의 물리적 산란 및 차폐를 메커니즘으로 하는 물리적 차단제는 이산화티탄, 산화아연과 같은 무기차단제가 잘 알려져 있다. 화학적 차단제의 경우, 자외선차단 효과가 뛰어난 장점을 갖고 있으나 적용되는 파장범위가 좁고, 화장료에 적용함에 있어 끈적이고 번들거리는 사용감과 분자형태로 피부에 흡수되므로 피부자극을 유발하는 단점을 가지고 있다. 물리적 차단제의 경우, 피부자극은 화학적 차단제에 비해 상대적으로 낮지만 무거운 사용감과 백화현상 및 광독성을 유발하는 단점을 갖고 있다.Chemical blocking agents that act as chemical absorption of ultraviolet rays are well known organic blocking agents such as cinnamic acid, salicylic acid and benzophenone. Blockers are well known. Chemical blockers have the advantage of excellent UV-blocking effect, but has a disadvantage of causing skin irritation because it is narrow in the wavelength range applied, and is applied to the cosmetic in a sticky and bundley feeling and molecular form when applied to cosmetics. In the case of physical blockers, skin irritation is relatively low compared to chemical blockers but has the disadvantage of causing heavy feeling of use, whitening and phototoxicity.

상기한 화학적 차단제와 물리적 차단제의 단점을 보완하고자 자외선차단제에 대한 다양한 연구가 진행되어 왔으며, 특히 피부안전성에 장점을 갖는 천연 자외선차단 성분에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 이와 관련하여 개발된 기술로서, 대한민국특허 제10-0526637호, 제10-0858630호, 제10-0114124호 및 제10-0162282호 등에서는 도화, 녹두, 커피, 팬지, 대황 등에서 추출한 천연성분을 함유한 자외선차단용 화장료조성물이 개발된 바 있다. In order to compensate for the above disadvantages of the chemical and physical blockers, various studies on sunscreens have been conducted, and in particular, studies on natural sunscreen ingredients having advantages in skin safety have been actively conducted. As a technology developed in this regard, Korean Patent Nos. 10-0526637, 10-0858630, 10-0114124, and 10-0162282, etc., contain natural ingredients extracted from drawing, green beans, coffee, pansy, rhubarb, etc. A sunscreen cosmetic composition has been developed.

상기한 기술들은 피부안전성이 우수한 천연 자외선차단 성분들을 포함하고 있지만, 직접적인 자외선차단 효과가 낮아 천연추출물 단일 성분이 아니라 기존의 합성 유기 자외선차단 성분과 천연추출물을 혼합하여 사용해야 하는 단점을 갖고 있다. Although the above-described techniques include natural sunscreen ingredients having excellent skin safety, the direct sunscreen effect is low, and thus has a disadvantage of using a mixture of conventional synthetic organic sunscreen ingredients and natural extracts instead of a single natural extract.

또한 상기와 관련하여 개발된 기술로서, 미국특허 제5552135호에서는 오트, 옥수수, 밀, 쌀 등의 곡물류에서 페룰산(ferulic acid)과 에틸페룰레이트(ethylferulate)를 함유하는 자외선차단 천연성분을 개발하였으나, 단일 성분이 아니라 유기 자외선차단 성분과 혼합하여 사용했을 때 자외선차단 효과가 증가되는 기술을 제시하였다.In addition, as a technology developed in connection with the above, US Patent No. 5552135 developed a sunscreen natural ingredient containing ferulic acid (ferulic acid) and ethyl ferulate (ethylferulate) in grains such as oats, corn, wheat, rice, In addition, the present invention proposes a technique of increasing the sunscreen effect when used in combination with an organic sunscreen ingredient rather than a single ingredient.

한편, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)은 해수에 서식하는 홍조류로 비단풀목 빨간검둥이과(Rhodomelaceae)에 속하며, 우리나라에서는 제주도와 전국 연안에 분포하고, 유럽, 남아메리카, 중국, 일본 등 아시아에 분포하고 있는 것으로 보고되어 있다. 현재까지, 모로우붉은실로부터 몇 종의 브로모페놀 화합물이 분리가 보고되었고, 생리활성으로는 α-글루코시다아제 저해활성[Fisheries Science (1999), 65(2), 300-303]과 어병세균에 대한 항균활성[J. Fish Pathol., 18 (2): 147-156 (2005)], 어병바이러스에 대한 항바이러스 활성과 관련 국내특허[Food Sci. Biotechnol. 17(5): 1074-1078 (2008); 대한민국 특허 제 10-0838621] 및 항산화활성[Food Sci. Biotechnol. 18(1): 124-129 (2009)]이 보고되어 있다. 그러나 아직까지 상기 모로우붉은실 추출물의 자외선 흡수효과에 관해서는 보고된 바 없다.
On the other hand, Morrow red thread ( Polysiphonia morrowii Harvey) is a red algae in seawater, belongs to the Rhodomelaceae. It is reported to be distributed in Jeju Island and coastal areas of Korea, and in Asia such as Europe, South America, China, and Japan. To date, several species of bromophenol compounds have been reported from Morrow red thread, and physiological activities include α-glucosidase inhibitory activity [Fisheries Science (1999), 65 (2), 300-303] and fish pathogens. Antimicrobial activity against [J. Fish Pathol., 18 (2): 147-156 (2005)], a domestic patent relating to antiviral activity against fish disease virus [Food Sci. Biotechnol. 17 (5): 1074-1078 (2008); Korean Patent No. 10-0838621] and antioxidant activity [Food Sci. Biotechnol. 18 (1): 124-129 (2009). However, the ultraviolet absorbing effect of the Morrow red thread extract has not been reported so far.

이에 본 발명자들은 해양 생물을 이용한 기능성 약제학적 소재를 연구하던 중, 모로우붉은실 추출물이 자외선 조사로 인해 발생하는 세포 내 자유라디칼 소거활성에 따른 항산화효과 뿐만 아니라, 이러한 자외선 자체를 흡수하는 효과 및 자외선 조사에 의해 유발되는 세포자연사(apoptosis) 억제를 통한 세포보호 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The inventors of the present invention, while studying a functional pharmaceutical material using marine organisms, as well as the antioxidant effect according to the free radical scavenging activity in the cell caused by the extract of Morrow red thread, the effect of absorbing such ultraviolet rays itself and ultraviolet rays The present invention was completed by confirming that there is a cytoprotective effect through inhibition of apoptosis induced by irradiation.

따라서 본 발명의 목적은 자외선 흡수 효과, 세포 내 자유라디칼 소거 효과 및 자외선 조사에 의해 유발되는 세포자연사(apoptosis) 억제 효과를 가지는 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to inhibit skin damage and skin damage caused by ultraviolet rays, including the extract of Morrow red thread having the effect of absorbing ultraviolet rays, free radical scavenging effect and inhibiting apoptosis induced by ultraviolet irradiation as an active ingredient. It is to provide a pharmaceutical composition for treatment.

또한 본 발명의 다른 목적은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는자외선 흡수용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a composition for absorbing ultraviolet rays comprising the extract of Morrow red thread as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for inhibiting skin damage and protecting skin by ultraviolet rays comprising the extract of Morrow red thread as an active ingredient.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention is a red thread ( Polysiphonia) morrowii Harvey) provides a pharmaceutical composition for inhibiting skin damage and treatment of skin by ultraviolet rays comprising the extract as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모로우붉은실 추출물은 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매 추출물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the Morrow red thread extract may be water, an organic solvent or a mixed solvent extract thereof.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모로우붉은실 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the Morrow red thread extract may be an ethanol extract.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모로우붉은실 추출물은 자외선 흡수, 자외선 조사에 의해 발생된 세포 내 자유라디칼을 소거 및 자외선에 의해 유도된 세포자연사(apoptosis)를 억제하는 기작을 통해 피부보호 효과를 가질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the Morrow red thread extract has a skin protection effect through the mechanism of suppressing the free radicals induced by ultraviolet absorption, ultraviolet irradiation and inhibiting apoptosis induced by ultraviolet rays. It can have

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태의 조성물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition is a composition in the form of an external preparation for skin selected from the group consisting of creams, gels, patches, sprays, ointments, warnings, lotions, linings, pasta and cataplasma. Can be.

또한, 본 발명은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 흡수용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is a red thread ( Polysiphonia) morrowii Harvey) provides a composition for absorbing ultraviolet rays comprising the extract as an active ingredient.

본 발명은 또한, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a red thread ( Polysiphonia) morrowii Harvey) provides a cosmetic composition for inhibiting skin damage and protecting skin by ultraviolet rays comprising the extract as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물이 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도로 제형화될 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the cosmetic composition is a skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisture cream, hand cream, essence, nutrition It can be formulated as an essence, pack, soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, latex, lipstick, makeup base, foundation, press powder, loose powder, eye shadow.

본 발명의 모로우붉은실 추출물은 자외선 조사에 따라 발생하는 세포 내 자유라디칼 소거활성을 통한 항산화 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 자외선 자체를 직접적으로 흡수하는 작용 및 자외선에 의해 유도된 세포자연사(apoptosis)를 억제할 수 있는 효과가 우수하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 피부세포를 자외선으로부터 효과적으로 보호할 수 있어 피부보호 및 피부치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 이러한 모로우붉은실 추출물은 천연물질로서, 식용 가능한 물질에 해당하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.
Morrow red thread extract of the present invention is not only excellent in the antioxidant effect through free radical scavenging activity in the cell generated by ultraviolet irradiation, but also directly absorbs the ultraviolet light itself and inhibits apoptosis induced by ultraviolet light. Since the effect can be excellent, the pharmaceutical composition of the present invention comprising this as an active ingredient can effectively protect skin cells from ultraviolet rays can be usefully used for skin protection and skin treatment. In particular, such a Morrow red thread extract is a natural substance, so it corresponds to an edible substance, the composition of the present invention comprising it as an active ingredient has a safe advantage even in long-term use.

도 1은 UV 분광광도계를 이용하여 자외선영역(250~400 nm)에서 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 흡광도를 측정한 것이다.
도 2는 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 농도별 처리에 따른 DPPH 라디칼 소거활성, H2O2 처리된 세포 내 활성산소종 소거활성, UV-B 처리된 세포 내 활성산소종 소거활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(PME: 본 발명의 모로우붉은실 추출물, NAC: N-acetyl cysteine).
도 3은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 농도별로 처리한 후 UV-B 조사하였을 때, 세포 내에서 발생되는 활성산소종을 레이저 스캐닝 마이크로스코프 5 PASCAL 프로그램(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 이미지화한 사진이다.
도 4는 도 3의 이미지에 나타난 세포 내 활성산소종 발생에 따른 형광강도를 대조군과 비교하여 정량화한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용에 따른 과산화물음이온의 소거활성을 측정하기 위하여 ESR spectrometer를 이용하여 ESR 시그널을 측정한 그래프이다(control: 무처리군).
도 6은 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용에 따른 히드록실 라디칼의 소거활성을 측정하기 위하여 ESR spectrometer를 이용하여 ESR 시그널을 측정한 그래프이다(control: 무처리군).
도 7은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 농도별로 적용한 후 MTT assay 방법을 통해 세포생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B를 조사한 경우 MTT assay 방법을 통해 세포생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 SOD 효소 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
도 10은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 카탈라제 효소 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
도 11은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별로 세포에 처리한 경우 세포 내 SOD 및 카탈라제의 단백질 발현량을 웨스턴 블랏팅에 의해 측정한 결과이다.
도 12A는 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 apoptotic bodies의 핵의 단편을 DNA 특이적 형광염료인 Hoechst 33342로 염색한 후 형광현미경 하에서 이미지화한 사진이다(control: 무처리군).
도 12B는 도 12A의 이미지에 나타난 세포 내 apoptotic bodies를 대조군과 비교하여 정량화한 그래프이다(control: 무처리군).
도 13은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 apoptotic bodies 형성에 따른 세포의 DNA 단편을 분석하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
1 is a measurement of the absorbance of the Morrow red yarn extract of the present invention in the ultraviolet region (250 ~ 400 nm) using a UV spectrophotometer.
Figure 2 by measuring the concentration of DPPH radical scavenging activity, H 2 O 2 treated cell reactive oxygen species scavenging activity, UV-B treated cell reactive oxygen species scavenging activity according to the concentration-specific treatment of the Morrow red thread extract of the present invention It is shown graphically (PME: Morrow red thread extract of the present invention, NAC: N-acetyl cysteine).
3 is a laser scanning microscope 5 PASCAL program (Carl Zeiss, Jena, Germany) for the generation of active oxygen species generated in the cell when UV-B irradiation after the treatment of the extract of the Morrow red thread of the present invention to the cells by concentration It is a photograph imaged using.
4 is a graph quantifying the fluorescence intensity according to the generation of reactive oxygen species in the cell shown in the image of FIG.
Figure 5 is a graph measuring the ESR signal using an ESR spectrometer to measure the scavenging activity of the peroxide anion according to the application of the Morrow red thread extract of the present invention (control: no treatment group).
Figure 6 is a graph measuring the ESR signal using an ESR spectrometer to measure the scavenging activity of hydroxyl radicals according to the application of the Morrow red thread extract of the present invention (control: no treatment group).
Figure 7 shows the graph by measuring the cell viability through MTT assay method after applying the Morrow red thread extract of the present invention to the cells by concentration.
Figure 8 shows the graph by measuring the cell viability through the MTT assay method when the UV-B irradiated after treating the extract of Morrow red thread of the present invention cells.
9 is a graph showing the SOD enzyme activity measured by UV-B irradiation after treatment with the Morrow red thread extract of the present invention (control: untreated group).
10 is a graph showing the measurement of the catalase enzyme activity when UV-B irradiation after the treatment of the Morrow red thread extract of the present invention (control: untreated group).
11 is a result of measuring the amount of protein expression of SOD and catalase in the cells by Western blotting when the extract of the Morrow red thread extract of the present invention to the cells by concentration.
FIG. 12A is a photograph photographed under a fluorescence microscope after staining a fragment of a nucleus of apoptotic bodies with Hoechst 33342, a DNA-specific fluorescent dye, when UV-B irradiation was performed on the cells of the Morrow red thread extract of the present invention (control: No treatment).
FIG. 12B is a graph quantifying the intracellular apoptotic bodies shown in the image of FIG. 12A compared to the control group (control: no treatment group).
13 is a graph showing the analysis of DNA fragments of cells according to the formation of apoptotic bodies when UV-B irradiated after treatment of the extract of the Morrow red thread of the present invention (control: untreated group).

본 발명은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료(보호)용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.The present invention is characterized in that it provides a composition for inhibiting skin damage and skin treatment (protection) by ultraviolet light comprising the extract of the marrow red thread as an active ingredient.

모로우붉은실은 Ceramiales(비단풀목) Rhodomelaceae(빨간검둥이과)에 속하며 우리나라 제주도를 비롯한 동-서-남해안에 분포하고 있다. 모로우붉은실 분획물은 DPPH 라디칼 소거 활성이 있음이 알려져 있으며, 아라키돈산(arachidonic acid) 및 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid)의 원료로서의 기능성 및 바이오매스에 대해 보고된 바 있다. Morrow red thread belongs to Ceramiales (Rhodomelaceae) and is distributed in East-West-South coast including Jeju Island in Korea. Morrow red yarn fractions are known to have DPPH radical scavenging activity and have been reported for their functionality and biomass as a source of arachidonic acid and eicosapentaenoic acid.

본 발명은 상기한 특징을 가지는 모로우붉은실 추출물이 자유라디칼 소거활성을 통한 항산화 효과뿐만 아니라 자외선을 직접적으로 흡수할 수 있으며, 자외선에 의해 유도된 DNA 손상을 억제할 수 있는 효과가 우수함을 확인함으로써, 피부보호에 효과적이라는 사실을 최초로 규명하였다.The present invention by confirming that the Morrow red thread extract having the above characteristics can directly absorb ultraviolet rays as well as antioxidant effects through free radical scavenging activity, and has an excellent effect of inhibiting DNA damage induced by ultraviolet rays. It was first identified that it is effective for skin protection.

보다 구체적으로, 하기 실시예 2에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 UV-B 흡수능 측정한 결과 UV-B 범위에 해당하는 285nm에서 높은 흡광도를 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사에 대응하여 피부세포를 보호할 수 있음을 유추할 수 있었다.More specifically, in Example 2 below, the UV-B absorption ability of the Morrow red yarn extract of the present invention was confirmed as a high absorbance at 285nm corresponding to the UV-B range, through which the Morrow red thread extract of the present invention UV It was inferred that skin cells could be protected in response to -B irradiation.

또한, 하기 실시예 <3-1>에서는 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 본 발명의 모로우붉은실 추출물 100μg/ml에서 51%의 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 <3-2>에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용 후 UV-B 처리된 세포 내 활성산소종 측정한 결과 100μg/ml에서 30%의 활성산소종 소거효과를 보여 양성대조군인 NAC가 나타낸 26%보다 더욱 높은 것을 확인할 수 있었고, 실시예 <3-3>에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용 후 UV-B 처리된 세포 내에서 과산화물음이온(superoxide anion: O2-ㆍ) 및 히드록실 라디칼(hydroxyl radical: ㆍOH) 소거활성 측정한 결과 이들이 모두 유의적으로 제거되는 것을 확인할 수 있었다.In addition, in Example <3-1>, it was confirmed that when the DPPH radical scavenging activity was measured, it showed 51% scavenging activity at 100 μg / ml of the Morrow red thread extract of the present invention. As a result of measuring the active oxygen species in UV-B treated cells after application of the Morrow red thread extract of the present invention, it was confirmed that the positive control group was higher than the 26% indicated by the positive control group NAC at 30 μg / ml. In Example <3-3>, superoxide anion (O2-.) And hydroxyl radical (OH) scavenging activity in UV-B treated cells after application of the Morrow red thread extract of the present invention. As a result, all of them were significantly removed.

또한, 하기 실시예 5에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 항산화효소(SDO 및 catalase)에 미치는 영향을 조사하였는데, 본 발명의 추출물이 항산화효소 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 항산화효소 단백질 발현도 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. In addition, in Example 5 below, the effect of the Morrow red thread extract of the present invention on antioxidant enzymes (SDO and catalase) was investigated, and the extract of the present invention not only increases antioxidant enzyme activity but also increases antioxidant enzyme protein expression. I could confirm it.

또한, 하기 실시에 6에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사에 의해 발생되는 DNA 손상 및 이로 인해 발생되는 세포자연사(apoptosis)를 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.In addition, in Example 6, it was confirmed that the Morrow red yarn extract of the present invention effectively inhibits DNA damage and apoptosis caused by UV-B irradiation.

즉, 상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부손상을 억제하고 자외선으로부터 피부를 보호하는데 유용하게 사용될 수 있어, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물로 사용될 수 있으며, 또한 추출물 자체가 자외선 흡수 효과를 가지고 있어, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 흡수용 조성물로도 사용될 수 있다.That is, the composition of the invention having the characteristics as described above can be useful in inhibiting skin damage caused by ultraviolet rays and to protect the skin from UV rays, Morrow red thread (Polysiphonia morrowii Harvey) can be used as a pharmaceutical composition for inhibiting skin damage and skin treatment by ultraviolet rays containing the extract as an active ingredient, and the extract itself has an ultraviolet absorbing effect, Polysiphonia morrowii Harvey) can also be used as a composition for absorbing ultraviolet rays containing the extract as an active ingredient.

본 발명에 따른 모로우붉은실 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 모로우붉은실로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 모로우붉은실의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.The Morrow red thread extract according to the present invention may be obtained by extraction and separation from nature using extraction and separation methods known in the art, and the 'extract' as defined in the present invention may be obtained by using an appropriate solvent. It is extracted from the red thread, and may include, for example, hot water extracts of Morrow red thread, polar solvent soluble extract or nonpolar solvent soluble extract.

모로우붉은실로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. As a suitable solvent for extracting the extract from the Morrow red thread, any solvent that is acceptable in the art may be used, and water or an organic solvent may be used. Examples of the solvent include alcohols having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ether, and the like, including purified water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, Various solvents such as benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane may be used alone or in combination. But is not limited to.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.As the extraction method, any one of the methods such as hot water extraction method, cold extraction method, reflux cooling extraction method, solvent extraction method, steam distillation method, ultrasonic extraction method, elution method and compression method can be selected and used. In addition, the desired extract may be further subjected to a conventional fractionation process or may be purified using a conventional purification method. There is no limitation to the method for producing the Morrow red thread extract of the present invention, any known method may be used.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 모로우붉은실 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.For example, the Morrow red thread extract included in the composition of the present invention may be prepared in powder form by an additional process such as distillation under reduced pressure, freeze drying, or spray drying, which is extracted by the hydrothermal extraction or solvent extraction. Can be. Further, the primary extract can be further purified by using various chromatographies such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and the like, You can get it.

따라서 본 발명에 있어서 모로우붉은실 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.Therefore, in the present invention, the Morrow red thread extract is a concept including all the extracts, fractions and purified products obtained in each step of extraction, fractionation or purification, their dilutions, concentrates or dried products.

본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 제조는 다음과 같이 실시된다.According to a specific embodiment of the present invention, the preparation of the Morrow red thread extract of the present invention is carried out as follows.

본 발명의 모로우붉은실 추출물은 제주도에서 채집한 모로우붉은실을 음건한 다음 건조된 모로우붉은실을 80% 에탄올로 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 뒤 여과하여 회전농축기로 감압 농축하여 에탄올 가용성 성분을 수득할 수 있다.The Morrow red thread extract of the present invention is the dried Morrow red thread collected in Jeju Island and then dried dried red thread in 80% ethanol three times at room temperature for 24 hours, filtered and concentrated under reduced pressure with a rotary concentrator to ethanol soluble components Can be obtained.

이러한 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.The composition of the present invention comprising such a Morrow red thread extract as an active ingredient may be a pharmaceutical composition.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvants in addition to the above-mentioned active ingredients. Examples of the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants, A lubricant or a flavoring agent can be used.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.The pharmaceutical composition may be formulated into a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-described active ingredients for administration.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.The pharmaceutical composition may be in the form of granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, liquids, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions. For example, for formulation into tablets or capsules, the active ingredient may be combined with an oral, non-toxic pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like. Also, if desired or necessary, suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included as a mixture. Suitable binders include, but are not limited to, natural and synthetic gums such as starch, gelatin, glucose or beta-lactose, natural sugars such as corn sweeteners, acacia, tracker candles or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, Benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like. Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum and the like. Acceptable pharmaceutical carriers for compositions that are formulated into a liquid solution include sterile water and sterile water suitable for the living body such as saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Further, it can be suitably formulated according to each disease or ingredient, using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA as an appropriate method in the field.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 30 중량%로 포함될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the Morrow red thread extract of the present invention may be included in 0.00001 to 30% by weight based on the total weight of the composition.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 자외선 흡수 효과를 가지고 있는바, 피부에 바를 수 있는 피부 외용제나 자외선 흡수용 화장료 조성물로서 자외선 차단제 등으로 활용할 수도 있다.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention may be a topical skin composition. In addition, the composition of the present invention has a UV absorbing effect, it can also be used as a sunscreen or the like as a skin external preparation that can be applied to the skin or a cosmetic composition for UV absorption.

본 발명의 피부외용 약제학적 조성물은 자외선으로부터 피부보호 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.The dermatological pharmaceutical composition of the present invention is an external preparation for skin having an effect of protecting skin from ultraviolet rays, and it can be used as an external preparation for skin such as cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent, lotion, liniment, pasta or cataplasma But it is not limited thereto.

또한, 본 발명의 조성물은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물일 수 있다. In addition, the composition of the present invention may be a cosmetic composition for inhibiting skin damage and skin protection by ultraviolet rays comprising the extract of Morrow red thread as an active ingredient.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 모로우붉은실 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.When the composition of the present invention is made of a cosmetic composition, the composition of the present invention may include not only the above-described Morrow red thread extract, but also components commonly used in cosmetic compositions, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, Conventional adjuvants such as vitamins, pigments and flavorings, and carriers.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 모로우붉은실 추출물 이외에, 모로우붉은실 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.In addition, the composition of the present invention may be used in addition to the above-mentioned Morrow red thread extract, in combination with the organic sunscreen that has been conventionally used as long as it does not impair the skin protection effect by reacting with the Morrow red thread extract.

상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.Examples of the organic ultraviolet screening agent include glyceryl paraben, drometrizol trisiloxane, drometrizol, dicaloyl triolate, disodium phenyldibenzimidazole tetrasulfonate, diethylhexylbutamidotriazone, Hydroxybenzoylhexyl benzoate, di-methoxy cinnamate, a mixture of Rawson and dihydroxyacetone, methylenebis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol, 4-methylbenzylidene camphor, menthyl anthranylate, benzophenone Benzophenone-4, benzophenone-8 (dioxyphenyl) benzene, butylmethoxydibenzoylmethane, bishexyloxyphenol methoxyphenyltriazine, synoxate, , Octocrylene, ethylhexylmethylmethylphenyl, ethylhexylmethoxy cinnamate, ethylhexylsalicylate, ethylhexyltriazone, isoamyl-p-methoxy cinnamate, polysilicon-15 (dimethicone, At least one selected from the group consisting of terephthalylidene dicam persulfonic acid and salts thereof, tiei-salicylate and aminobenzoic acid (parabe) can be used.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.Examples of products to which the cosmetic composition of the present invention can be added include cosmetics such as astringent lotion, softening longevity lotion, nutrition lotion, various creams, essences, packs, foundation and the like, cleansing, cleanser, soap, .

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.As a specific formulation of the cosmetic composition of the present invention, there may be mentioned a skin lotion, a skin softener, a skin toner, an astringent, a lotion, a milk lotion, a moisturizing lotion, a nutrition lotion, a massage cream, It includes formulations such as soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, latex, lipstick, makeup base, foundation, press powder, loose powder, eye shadow.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001-30중량%이며, 바람직하게는 0.5-20%이며, 보다 바람직하게는 1.0-10중량%이다. 상기 모로우붉은실 추출물의 함량이 0.00001중량% 미만이면 모로우붉은실 추출물에 의한 자외선 흡수 효과가 크게 감소되고, 30중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the content of the Morrow red thread extract of the present invention is 0.00001-30% by weight, preferably 0.5-20%, more preferably 1.0-10% by weight based on the total weight of the composition. . When the content of the Morrow red thread extract is less than 0.00001% by weight, the ultraviolet absorbing effect by the Morrow red thread extract is greatly reduced, and when it exceeds 30% by weight, skin irritation may occur, and formulation problems may occur. .

한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 모로우붉은실 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 추출물의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.On the other hand, the cosmetic composition according to the present invention may be formulated by stabilizing the containment of the Morrow red thread extract inside the nanoliposomes. When the extract is contained inside the nanoliposomes, the components of the extract can be stabilized to solve problems such as precipitation formation, discoloration, and odor when formulated, and can increase the solubility and transdermal absorption of the components, thereby improving efficacy expected from the extract. Maximum expression can be achieved.

본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 300nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다.In the present invention, nanoliposome refers to a liposome having a typical liposome form and having an average particle diameter of 10 to 500 nm. According to a preferred embodiment of the present invention, the average particle diameter of the nanoliposome is 50 to 300 nm. When the average particle diameter of the nanoliposome is more than 300 nm, improvement of skin penetration and improvement of formulation stability is very weak among technological effects to be achieved in the present invention.

본 발명에 따라 상기 추출물을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.The nanoliposomes used to stabilize the extract according to the present invention may be prepared by a mixture comprising a polyol, an oily component, a surfactant, a phospholipid, a fatty acid and water.

본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.The polyol used in the nanoliposome of the present invention is not particularly limited and is preferably a polyol such as propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, methylpropanediol, isopropylene glycol, pentylene glycol, erythritol, , Sorbitol, and mixtures thereof. The amount thereof is 10 to 80% by weight, preferably 30 to 70% by weight, based on the total weight of the nanoliposome.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C10-40 지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.The oil component used in the preparation of the nanoliposome of the present invention may be selected from a variety of oils known in the art and is preferably a hydrocarbon oil such as hexadecane and paraffin oil, Vegetable oils such as silicon oil such as dimethicone and cyclomethicone, sunflower oil, corn oil, soybean oil, avocado oil, sesame oil and fish oil, ethoxylated alkyl ether oils, propoxylated alkyl ether oils 40 is a fatty alcohol, and mixtures thereof -, phytosphingosine, sphingosine, and scan non-ping the same scan pinggo cannabinoid lipid, cholesterol side-by celebrity, sitosterol cholesteryl sulfate, cholesteryl sulfate, cytokines, C 10. The amount thereof may be 1.0 to 30.0% by weight, and preferably 3.0 to 20.0% by weight based on the total weight of the nanoliposome.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.Any surfactant known in the art may be used as the surfactant used in the preparation of the nanoliposome of the present invention. For example, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants can be used. Preferred are anionic surfactants and nonionic surfactants. Specific examples of anionic surfactants include alkyl acyl glutamates, alkyl phosphates, alkyl lactylates, dialkyl phosphates and trialkyl phosphates. Specific examples of nonionic surfactants include alkoxylated alkyl ethers, alkoxylated alkyl esters, alkyl polyglycosides, polyglyceryl esters and sugar esters. Particularly preferred surfactants are polysorbates belonging to nonionic surfactants. The amount thereof may be 0.1 to 10% by weight, preferably 0.5 to 5.0% by weight, based on the total weight of the nanoliposome.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.The phospholipid, another component used in the preparation of the nanoliposomes of the present invention, is a lipophilic lipid that is used with both affinity lipids and is composed of natural phospholipids (e.g., egg yolk lecithin or soy lecithin, sphingomyelin) Dipalmitoyl phosphatidylcholine or hydrogenated lecithin), preferably lecithin. In particular, unsaturated lecithin or saturated lecithin derived from natural origin extracted from soybean or egg yolk is preferable. Normally, the amount of phosphatidylcholine is 23 to 95% and the amount of phosphatidylethanolamine is 20% or less in natural derived lecithin. In the production of the nanoliposome of the present invention, the amount of the phospholipid to be used is 0.5 to 20.0% by weight, preferably 2.0 to 8.0% by weight based on the total weight of the nanoliposome.

본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.Fatty acid to be used in nano-liposome preparation of the present invention is a higher fatty acid, preferably a C 12 - 22 as a saturated or unsaturated fatty acid of the alkyl chain, e.g., lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid . The amount thereof may be 0.05 to 3.0% by weight, preferably 0.1 to 1.0% by weight, based on the total weight of the nanoliposome.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.The water used in the preparation of the nanoliposome of the present invention is generally deionized distilled water, and the amount thereof may be 5.0-40 wt% based on the total weight of the nanoliposome.

나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.The preparation of nanoliposomes can be accomplished through a variety of methods known in the art, but most preferably is made by applying a mixture comprising the ingredients to a high pressure homogenizer. The preparation of a nanoliposome by a high pressure homogenizer can be carried out under various conditions (for example, pressure, number of times, etc.) depending on a desired particle size, and preferably at a high pressure homogenizer So that the nanoliposome can be produced.

본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은 상기 모로우붉은실 추출물을 나노리포좀 충 중량 기준으로 0.1~20.0중량%, 제형 안정화를 위하여 보다 바람직하게 1.0~10.0중량%로 함유할 수 있다.The cosmetic composition for skin protection according to the present invention may contain 0.1 ~ 20.0% by weight, based on the nanoliposome filling weight, more preferably 1.0 ~ 10.0% by weight for the formulation of the Morrow red thread extract.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 모로우붉은실 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. The composition of the present invention may also be a food composition, which may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, as well as ordinary food compositions, in addition to the extract of Morrow red thread as an active ingredient. .

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. The above-described flavors can be advantageously used as natural flavorings (tau martin), stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.).

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.The food composition of the present invention can be formulated in the same manner as the above pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods. Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolates, foods, confectionery, pizza, ram noodles, other noodles, gums, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, .

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 모로우붉은실 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. In addition, the food composition is a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, such as moor red thread extract as an active ingredient, coloring and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and Salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the food composition of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks.

본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 피부보호를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다. Morrow red thread extract as an active ingredient of the present invention is a natural substance, so there is almost no toxicity and side effects, so it can be used with confidence even for long-term use for the purpose of inhibiting skin damage by ultraviolet rays and protecting the skin for skin protection.

본 발명의 건강기능식품은 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호를 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.The health functional food of the present invention may be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills and the like for the purpose of inhibiting skin damage and protecting the skin by ultraviolet rays.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.In the present invention, the term &quot; health functional food &quot; refers to foods manufactured and processed using raw materials or ingredients having useful functions in accordance with Law No. 6727 on Health Functional Foods. Or to obtain a beneficial effect in health use such as physiological action.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.The health functional food of the present invention may include a conventional food additive, and the suitability as a food additive, unless otherwise specified, in accordance with the General Regulations of the Food Additives and General Test Methods approved by the Food and Drug Administration, etc. Judging by the standards and standards.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.Examples of the items listed in the above-mentioned "food additives" include chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; Natural additives such as persimmon extract, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigment and guar gum; L-glutamic acid sodium preparations, noodle-added alkalis, preservative preparations, tar coloring preparations and the like.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.For example, the health functional food in the form of tablets is a mixture of excipients, binders, disintegrants and other additives with the extract of Morrow red thread, the active ingredient of the present invention by granulating in a conventional manner, then adding a lubricant and the like Compression molding or the mixture can be compression molded directly. In addition, the health functional food in the form of tablets may contain a mating agent and the like as necessary.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 모로우붉은실 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.Hard capsules among the health functional foods in the form of capsules can be prepared by filling a mixture of a mixture of additives such as the excipient such as Morrow red thread extract of the present invention in a conventional hard capsule, soft capsule agent is a red capsule extract The mixture mixed with additives such as excipients can be prepared by filling in a capsule base such as gelatin. The soft capsule may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a coloring agent, a preservative and the like, if necessary.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.The health functional food of the cyclic form may be prepared by molding a mixture of the Morrow red thread extract, the active ingredient of the present invention, an excipient, a binder, a disintegrant, and the like by a conventionally known method. It can be zeroed away or the surface can be coated with materials such as starch, talc.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.The health functional food in the form of granules can be prepared in a granular mixture of a mixture of Morrow red yarn extract, an active ingredient of the present invention, an excipient, a binder, a disintegrant, and the like by a conventionally known method. It may contain an agent and the like.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
The health functional food may be a beverage, a meat, a chocolate, a food, a confectionery, a pizza, a ramen, a noodle, a gum, a candy, an ice cream, an alcoholic beverage, a vitamin complex and a health supplement food.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example > >

통계처리Statistical processing

실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 그 결과들은 차이를 분석하기 위하여 Tokey's test를 이용한 variance(ANOVA)로 분석하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
The experimental results were expressed as mean ± standard deviation, and the results were analyzed by variance (ANOVA) using Tokey's test to analyze the difference. A p-value <0.05 was considered statistically significant.

시약reagent

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼, N-acetyl cysteine(NAC), 5,5-demethyl-1-pyrroline-N-oxide(DMPO), 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA), [3-(4,5-dimehtylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium] bromide(MTT) 및 Hoechst 33342 염료는 Sigma chemical company(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. Cu/Zn SOD 및 CAT 항체는 Biodesign International Company(Saco, Maine, USA)에서 구입하였다. 모든 다른 화합물 및 시약은 분석용 등급을 사용하였다.
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical, N-acetyl cysteine (NAC), 5,5-demethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO), 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF- DA), [3- (4,5-dimehtylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium] bromide (MTT) and Hoechst 33342 dyes were purchased from Sigma chemical company (St. Louis, Mo, USA). Cu / Zn SOD and CAT antibodies were purchased from Biodesign International Company (Saco, Maine, USA). All other compounds and reagents used analytical grades.

<< 실시예Example 1> 1>

본 발명의 The 모로우붉은실Morrow Red Thread 추출물 제조 Extract preparation

모로우붉은실 시료는 제주도에서 채집하였으며, 증거표본은 제주생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institute: JBRI)에 기탁하여 JBRI-10365를 부여받았다. 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 제주도에서 채집한 모로우붉은실을 음건한 다음 건조된 모로우붉은실을 80% 에탄올로 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 뒤 여과하여 회전농축기로 감압 농축하여 에탄올 가용성 성분을 수득할 수 있었다.
Morrow red yarn samples were collected from Jeju Island, and the specimens were deposited with the Jeju Biodiversity Research Institute (JBRI) and received JBRI-10365. The Morrow red thread extract of the present invention is the dried Morrow red thread collected in Jeju Island and then dried dried red thread in 80% ethanol three times at room temperature for 24 hours, filtered and concentrated under reduced pressure with a rotary concentrator to ethanol soluble components Could be obtained.

<< 실시예Example 2> 2>

본 발명의 The 모로우붉은실Morrow Red Thread 추출물의  Extract UVUV -B -B 흡수능Absorption capacity 측정 Measure

상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 자외선흡수능을 평가하기 위하여 UV 분광광도계(Shimadzu, UV-1800, Japan)를 이용하여 자외선영역(250~400 nm)에서 흡광도를 측정하였다. In order to evaluate the ultraviolet absorbing ability of the Morrow red yarn extract of the present invention prepared in Example 1, the absorbance was measured in the ultraviolet region (250 ~ 400 nm) using a UV spectrophotometer (Shimadzu, UV-1800, Japan).

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, UV-B 범위에 해당하는 285nm에서 피크가 나타나 본 범위에서 높은 흡광도를 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 모로우붉은실 추출물이 UV-B를 흡수하는 작용을 할 수 있어 UV-B 조사에 대응하여 세포를 보호할 수 있을 것으로 판단되었다.
As a result, as shown in Figure 1, the peak appeared at 285nm corresponding to the UV-B range, it was confirmed that the high absorbance in this range. Therefore, through these results, the present inventors were determined that the Morrow red thread extract may act to absorb UV-B, thereby protecting cells in response to UV-B irradiation.

<< 실시예Example 3> 3>

본 발명의 The 모로우붉은실Morrow Red Thread 추출물의  Extract 자유라디칼Free radical 소거능Scatters 측정 Measure

상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 자유라디칼 소거능을 확인하기 위하여, DPPH 라디칼 소거활성, 세포 내 활성산소종(ROS) 소거활성, 과산화물음이온 소거활성 및 히드록실 라디칼 소거활성을 측정하였다.
In order to confirm the free radical scavenging activity of the Morrow red thread extract of the present invention prepared through Example 1, DPPH radical scavenging activity, intracellular reactive oxygen species (ROS) scavenging activity, peroxide anion scavenging activity and hydroxyl radical scavenging activity Was measured.

<3-1> <3-1> DPPHDPPH 라디칼Radical 소거활성 측정 Measurement of scavenging activity

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 분석은 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 의해 환원되어 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 항산화 능력을 측정하는 방법이다. 이 실험에서 양성대조군으로는 항산화 효능이 잘 알려진 NAC(N-acetyl cysteine)을 사용하였다.DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) analysis is a method of measuring the antioxidant capacity as an indicator of the degree to which the purple color is reduced by aromatic compounds and aromatic amines due to the electron donating ability of antioxidants. In this experiment, NAC (N-acetyl cysteine), which is well known for its antioxidant efficacy, was used as a positive control group.

먼저 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 각 농도별로 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml씩 메탄올 내 1×10-4M DPPH 용액에 첨가한 후 격렬히 혼합한 다음, 3시간 후에 DPPH 잔여 농도를 분광광도계를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.First, the Morrow red thread extract of the present invention prepared in Example 1 was added to each solution at 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 μg / ml by concentration to 1 × 10 -4 M DPPH solution in methanol, and then mixed vigorously. After 3 hours, the absorbance was measured at 520 nm using a spectrophotometer of the residual DPPH concentration.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 갖는다는 사실을 알 수 있었는데, 본 발명의 추출물은 6.25μg/ml에서 4%, 12.5μg/ml에서 6%, 25μg/ml에서 13%, 50μg/ml에서 26%, 100μg/ml에서 51%의 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 2, it was found that the Morrow red thread extract of the present invention has a DPPH radical scavenging ability in a concentration-dependent manner, the extract of the present invention at 6.25μg / ml at 4%, 12.5μg / ml 6%, it was confirmed that the scavenging activity of 13% at 25μg / ml, 26% at 50μg / ml, 51% at 100μg / ml.

<3-2> 세포 내 <3-2> intracellular 활성산소종Active oxygen species (( ROSROS ) 소거활성 측정) Scavenging activity measurement

본 발명의 모로우붉은실 추출물이 세포 내에서 발생하는 활성산소종(ROS)을 소거하는 활성이 있는지 확인하기 위하여, 인간 케라틴 세포(HaCaT cells)에 본 발명의 추출물을 처리한 후, H2O2 처리 또는 UV-B를 조사하여 케라틴세포 내 ROS 수준을 측정하였으며, 이때 세포 내 활성산소종 측정은 DCF-DA(dichlorodihydrofluorescein diacetate) 방법을 이용하였다. DCF-DA는 세포 내 활성산소종과 반응하여 형광물질(dichlorodihydrofluorescein: DCF)을 만들어 내는 것으로 세포 내에서 발생하는 형광 측정을 통해 세포 내 활성산소종을 측정할 수 있다. 이 실험에서 양성대조군으로는 항산화 효능이 잘 알려진 NAC(N-acetyl cysteine)을 사용하였다.
In order to check whether the Morrow red thread extract of the present invention has an activity of scavenging reactive oxygen species (ROS) generated in cells, the human keratinocytes (HaCaT cells) after treatment with the extract of the present invention, H 2 O 2 ROS levels in keratinocytes were measured by treatment or UV-B irradiation. In this case, free radical species was measured using DCF-DA (dichlorodihydrofluorescein diacetate). DCF-DA reacts with intracellular reactive oxygen species to produce a fluorescent substance (dichlorodihydrofluorescein (DCF)) and can measure intracellular reactive oxygen species by measuring fluorescence generated in the cell. In this experiment, NAC (N-acetyl cysteine), which is well known for its antioxidant efficacy, was used as a positive control group.

① 세포 배양① Cell culture

인간 케라틴세포(HaCaT cells)는 5% CO2 및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% heat-inactivated fetal calf serum, 100μg/ml 스트렙토마이신 및 100unit/ml 페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbeccos modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다.
Human keratinocytes (HaCaT cells) are 5% CO 2 And in an incubator with at least 95% humidity at 37 ° C. Cultured in DMEM (Dulbeccos modified Eagle's medium) containing 10% heat-inactivated fetal calf serum, 100μg / ml streptomycin and 100 units / ml penicillin.

HH 22 OO 22 처리된 세포 내  In treated cells 활성산소종Active oxygen species 측정 Measure

상기 배양된 인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 플레이트에 1.5×105 cells/well 밀도로 분주하고 16시간 동안 배양 한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml)로 처리하였으며, 30분 후에 H2O2(1mM)를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 마지막으로 DCF-DA 용액 25μM을 첨가 후 10분이 경과한 다음, 2',7'-dichlorofluorescein의 형광을 PerkinElmer LS-5B 분광형광계(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 검출하였다.The cultured human keratinocytes (HaCaT cells) were plated at a density of 1.5 × 10 5 cells / well on a plate and incubated for 16 hours, followed by concentration of Morrow red thread extract of the present invention (6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg / ml), and after 30 minutes H 2 O 2 (1 mM) was added to the plate and further incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Finally, 10 minutes after the addition of 25 μM of DCF-DA solution, fluorescence of 2 ', 7'-dichlorofluorescein was detected using a PerkinElmer LS-5B spectrofluorometer (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 농도 의존적으로 H2O2-유도된 세포 내의 ROS를 소거하는 것을 확인할 수 있었는데, 본 발명의 추출물을 6.25μg/ml로 처리한 경우, 14%의 ROS 소거활성을 보였고, 12.5μg/ml로 처리한 경우는 17%, 25μg/ml로 처리한 경우는 25%, 50μg/ml로 처리한 경우는 47%, 100μg/ml로 처리한 경우는 61%의 ROS 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 2, the Morrow red thread extract of the present invention was confirmed to erase the ROS in H 2 O 2 -induced cells in a concentration-dependent manner, the extract of the present invention was treated with 6.25μg / ml In this case, ROS scavenging activity was 14%, 17% when treated with 12.5μg / ml, 25% when treated with 25μg / ml, 47% when treated with 50μg / ml, and 100μg / ml. One case showed 61% ROS scavenging activity.

UVUV -B 처리된 세포 내에서의 In B-treated cells 활성산소종Active oxygen species 소거 효과 측정 Measure erasure effect

본 실험에서는 실제로 UV-B 조사에 따라 생성된 세포 내 활성산소종을 소거하는 효과를 보이는지 확인하기 위하여, 인간 케라틴세포(HaCaT cells)에 UV-B를 조사한 후 활성산소종 소거 효과를 조사하였다.In this experiment, in order to confirm the effect of scavenging the active oxygen species in the cells generated by UV-B irradiation, we investigated the effect of scavenging the active oxygen species after irradiating UV-B to human keratinocytes (HaCaT cells).

먼저 인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 플레이트에 1.5×105 cells/well 밀도로 분주하고 16시간 동안 배양 한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml)로 처리하였다. 1시간 후 CL-1000M UV Crosslinker(UVP, Upland, CA, USA)를 이용하여 UV-B(280-320nm; peak intensity 302nm)를 150mJ/cm2 양으로 세포에 조사하였으며, 이렇게 UV-B에 노출된 세포들은 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 마지막으로 DCF-DA 용액 25μM을 첨가 후 10분 이 경과한 다음, 2',7'-dichlorofluorescein의 형광을 PerkinElmer LS-5B 분광형광계(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 검출하였다.First, the human keratinocytes (HaCaT cells) are plated at a density of 1.5 × 10 5 cells / well on a plate and incubated for 16 hours, and then the Morrow red thread extract of the present invention is concentrated by concentration (6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg / ml). After 1 hour, the cells were irradiated with UV-B (280-320 nm; peak intensity 302 nm) at 150 mJ / cm 2 using a CL-1000M UV Crosslinker (UVP, Upland, CA, USA). The cells were incubated for 24 hours at 37 ℃. Finally, 10 minutes after the addition of 25μM of DCF-DA solution, the fluorescence of 2 ', 7'-dichlorofluorescein was detected using a PerkinElmer LS-5B spectrophotometer (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 농도 의존적으로 UVB에 의해 발생된 세포 내 ROS를 소거하는 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 추출물은 6.25μg/ml에서 14%, 12.5μg/ml에서 15%, 25μg/ml에서 16%, 50μg/ml에서 24%, 100μg/ml에서 30%의 ROS 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that the Morrow red thread extract of the present invention has the activity of eliminating intracellular ROS generated by UVB in a concentration-dependent manner, the extract of the present invention is 14 at 6.25μg / ml %, 15% at 12.5μg / ml, 16% at 25μg / ml, 24% at 50μg / ml, it was confirmed that the ROS scavenging activity of 30% at 100μg / ml.

또한 세포 내 활성산소종 발생에 따른 이미지 분석을 위하여 cover-slip loaded 6-well plate에 2×105 cells/well을 분주하고 16시간 배양한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별(25, 50, 100μg/ml)로 처리하였다. 추출물을 처리하고 1시간이 지난 후, 플레이트에 UV-B를 82시간 조사하였다. 그리고 24시간 후, DCF-DA(100μM)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 추가적으로 30분 동안 세포들을 배양하였다. 이러한 과정을 거친 세포들을 PBS로 세척한 후, 염색된 세포들은 공초점현미경 상의 레이저 스캐닝 마이크로스코프 5 PASCAL 프로그램(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 이미지화하였다.In addition, 2 × 10 5 cells / well was dispensed on a cover-slip loaded 6-well plate and cultured for 16 hours for image analysis according to the generation of reactive oxygen species in the cell. , 50, 100 μg / ml). One hour after the extract was treated, the plate was irradiated with UV-B for 82 hours. And after 24 hours, DCF-DA (100 μM) was added to each well and the cells were incubated for additional 30 minutes at 37 ° C. After washing the cells with PBS, the stained cells were imaged using a laser scanning microscope 5 PASCAL program (Carl Zeiss, Jena, Germany) on a confocal microscope.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, ROS에 의해 생산된 DCF와 일치하는 붉은 형광강도가 나타났으며, 이러한 형광강도를 대조군과 비교하여 정량화하였을 때 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 25μg/ml 처리한 실험군에서는 41의 형광강도 값이, 50μg/ml 처리한 실험군에서는 25의 형광강도 값이, 100μg/ml를 처리한 실험군에서는 20의 형광강도 값이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리가 UV-B 조사에 따른 ROS 시그널을 감소시키는 것으로 ROS 발생 감소를 반영하는 것이다(도 4 참조).
As a result, as shown in Figure 3, the red fluorescence intensity was matched with the DCF produced by ROS, when the fluorescence intensity was compared with the control group treated with 25μg / ml Morrow red thread extract of the present invention In the experimental group, it was confirmed that the fluorescence intensity value of 41 was 50 μg / ml, and the fluorescence intensity value of 25 appeared in the experimental group treated with 50 μg / ml, and the fluorescence intensity value of 20 appeared in the experimental group treated with 100 μg / ml. This result reflects the reduction of ROS generation as the Morrow red thread extract treatment of the present invention reduces the ROS signal according to UV-B irradiation (see FIG. 4).

<3-3> <3-3> 과산화물음이온Peroxide Anion (( superoxidesuperoxide anionanion : : O2O2 -ㆍ) 소거활성 측정-·) Scavenging activity measurement

xanthine/xanthine oxidase 시스템을 통해 생산된 과산화물음이온은 spin trapping agent인 DMPO(5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)에 의해 DMPO/ㆍOOH adduct을 형성시킨 후, DMPO/ㆍOOH adduct 양을 ESR(electron spin resonance) spectrometer를 이용하여 측정하였다. 간략하게, xanthine oxidase(0.25U/mL) 20μl에 xanthine(5mM) 20μl, DMPO(1.5M) 20μl 및 모로우붉은실 추출물(100μg/mL) 20μl를 첨가하여 혼합한 후 5분 뒤에 ESR 시그널을 기록하였다. ESR spectrum의 조건은 하기 표 1에서 나타내었다.
Peroxide anion produced through xanthine / xanthine oxidase system forms DMPO / .OOH adduct by DMPO (5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide), a spin trapping agent, and then the amount of DMPO / .OOH adduct is increased. It was measured using an electron spin resonance (ESR) spectrometer. Briefly, 20 μl of xanthine oxidase (0.25 U / mL) was added to 20 μl of xanthine (5 mM), 20 μl of DMPO (1.5 M) and 20 μl of Morrow Red Thread Extract (100 μg / mL), and the ESR signal was recorded after 5 minutes. . The conditions of the ESR spectrum are shown in Table 1 below.

매개변수parameter 조건Condition magnetic fieldmagnetic field 336mT336mT powerpower 1.00mW1.00 mW frequencyfrequency 9.4380GHz9.4380 GHz modulation amplitudemodulation amplitude 0.2mT0.2mT gaingain 500500 scan timescan time 0.5 min0.5 min scan widthscan width 10mT10 mT time constanttime constant 0.03sec0.03sec temperature온도 2525

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, ESR spectrometer 데이터는 과산화물음이온 시그널이 xanthine/xanthine oxidase 시스템에서 2756의 값으로 증가하는 것으로 나타났으나, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 경우 과산화물음이온 시스널이 1552 값으로 감소되었다. 이를 통해 본 발명의 추출물이 O2-ㆍ를 제거함으로서 시그널 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 5, the ESR spectrometer data showed that the peroxide anion signal increased to a value of 2756 in the xanthine / xanthine oxidase system, but the peroxide anion signal was treated when the Morrow red thread extract of the present invention was treated. Reduced to a value of 1552. It was confirmed to be a signal formed by removing the inhibition and - This enables the extract of the present invention O2.

<3-4> 히드록실 <3-4> hydroxyl 라디칼Radical (( hydroxylhydroxyl radicalradical : ㆍ: ㆍ OHOH ) 소거활성 측정) Scavenging activity measurement

펜톤 반응(H2O2+FeSO4)으로 생성된 히드록실 라디칼은 spin trapping agent인 DMPO(5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)에 의해 DMPO/ㆍOH adduct을 형성시킨 후, DMPO/ㆍOH adduct 양은 JES-FA ESR spectrometer(JEOL, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 0.3M의 DMPO, 10mM FeSO4, 10mM H2O2을 포함하는 pH 7.4의 인산버퍼용액에 100μg/ml 모로우붉은실 추출물을 혼합한 후 2.5분 뒤에 ESR 시그널을 기록하였다. ESR spectrum의 조건은 하기 표 2에서 나타내었다.
The hydroxyl radical generated by the Fenton reaction (H 2 O 2 + FeSO 4 ) forms DMPO / .OH adduct by DMPO (5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide), a spin trapping agent, and then DMPO. OH adduct amount was measured using a JES-FA ESR spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan). 0.3 M of DMPO, 10 mM FeSO 4, 10 mM H 2 O 2 ESR signal was recorded 2.5 minutes after mixing 100 μg / ml Morrow red thread extract with a phosphate buffer solution of pH 7.4. The conditions of the ESR spectrum are shown in Table 2 below.

매개변수parameter 조건Condition magnetic fieldmagnetic field 336mT336mT powerpower 1.00mW1.00 mW frequencyfrequency 9.4380GHz9.4380 GHz modulation amplitudemodulation amplitude 0.2mT0.2mT gaingain 200200 scan timescan time 0.5 min0.5 min scan widthscan width 10mT10 mT time constanttime constant 0.03sec0.03sec temperature온도 2525

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, ESR spectrometer 데이터는 히드록실 라디칼 시그널이 펜톤반응 시스템 하에 3930의 값까지 증가되었으며, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 경우 히드록실 라디칼 시스널이 2182 값으로 감소되는 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 추출물이 ㆍOH를 제거함으로서 시그널 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 6, ESR spectrometer data showed that the hydroxyl radical signal was increased to the value of 3930 under the Fenton reaction system, and the hydroxyl radical signal was reduced to the value of 2182 when the Morrow red thread extract of the present invention was treated. Appeared to be. Through this, the extract of the present invention was confirmed that the signal formation is inhibited by removing the OH.

<< 실시예Example 4> 4>

본 발명의 The 모로우붉은실Morrow Red Thread 추출물이 세포에 미치는 영향 Effect of Extracts on Cells

본 실험에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 세포성장에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 조사하였다.
In this experiment, the cell survival rate was investigated by using MTT assay to observe the effect of Morrow red thread extract of the present invention on cell growth.

<4-1> 농도별 세포독성 측정<4-1> Cytotoxicity measurement by concentration

인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/ml가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 배양한 후, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml 의 농도로 각각 첨가하였다. MTT assay를 위하여 50μL의 MTT stock solution(2mg/mL)을 전체 반응볼륨이 200μL가 되도록 각각의 웰(well)에 첨가한 후 4시간 동안 세포들을 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 플레이트는 800×g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 각각의 웰에 150μl 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가하여 formazan crystal을 녹인 후, scanning multi-well spectrophotometer로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 웰(well)에 존재하는 세포 생존수와 비례한다.After dispensing human keratinocytes (HaCaT cells) in 96 well plates at 1 × 10 5 cells / ml and incubating for 16 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, the Morrow red thread extract of the present invention was 6.25, 12.5, It was added at concentrations of 25, 50 and 100 μg / ml, respectively. For MTT assay, 50μL of MTT stock solution (2mg / mL) was added to each well so that the total reaction volume was 200μL, and the cells were further cultured for 4 hours to reduce MTT. The plate was centrifuged at 800 × g for 5 minutes, the supernatant was removed, 150 μl dimethyl sulfoxide (dimethylsulfoxide) was added to each well to dissolve the formazan crystal, and the absorbance was measured at 540 nm with a scanning multi-well spectrophotometer. This absorbance represents the amount of MTT reduced by the cells and is therefore proportional to the cell viability present in each well.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 추출물은 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml의 어떤 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 항산화효과가 높은 100μg/ml가 최적의 양이라 판단되었으며, 하기에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 농도를 100μg/ml로 하여 실험을 실시하였다.
As a result, as shown in Figure 7, the extract of the present invention did not appear cytotoxic at any concentration of 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg / ml. Based on these results, it was determined that the extract of Morrow red thread of the present invention is an optimal amount of 100 μg / ml having high antioxidant effect, and in the following, the concentration of the Morrow red thread extract of the present invention was 100 μg / ml. .

<4-2> 본 발명의 추출물 처리 후 <4-2> After the extract treatment of the present invention UVUV -B 조사 시 세포생존율 측정-Cell survival rate when -B irradiation

본 실험에서는 UV-B 조사가 세포에 미치는 영향과 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 경우 UV-B 조사에 대응하여 세포를 보호하는 효과를 조사하였다.In this experiment, the effect of UV-B irradiation on the cells and the effect of protecting the cells in response to UV-B irradiation when treated with the Morrow red thread extract of the present invention.

인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/ml가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 배양한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 100μg/ml를 첨가하였다. 1시간 후 UV-B를 조사한 다음 37℃에서 48시간 동안 배양하였으며, MTT assay를 위하여 50μL의 MTT stock solution(2mg/mL)을 전체 반응볼륨이 200μL가 되도록 각각의 웰(well)에 첨가한 후 4시간 동안 세포들을 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 플레이트는 800×g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 각각의 웰에 150μl 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가하여 formazan crystal을 녹인 후, scanning multi-well spectrophotometer로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 웰(well)에 존재하는 세포 생존수와 비례한다. 대조군으로는 본 발명의 추출물 대신 PBS를 사용하였다.Human keratinocytes (HaCaT cells) were dispensed in 96 well plates at 1 × 10 5 cells / ml and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 16 hours, followed by 100 μg / ml of the Morrow red thread extract of the present invention. Added. After 1 hour, UV-B was irradiated and incubated for 48 hours at 37 ° C. For MTT assay, 50 μL of MTT stock solution (2 mg / mL) was added to each well so that the total reaction volume was 200 μL. Cells were further incubated for 4 hours to allow MTT to be reduced. The plate was centrifuged at 800 × g for 5 minutes, the supernatant was removed, 150 μl dimethyl sulfoxide (dimethylsulfoxide) was added to each well to dissolve the formazan crystal, and the absorbance was measured at 540 nm with a scanning multi-well spectrophotometer. This absorbance represents the amount of MTT reduced by the cells and is therefore proportional to the cell viability present in each well. PBS was used instead of the extract of the present invention as a control.

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, UV-B가 조사된 실험군에서는 28%의 세포생존율을 보인 것과 비교하여 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 후 UV-B 조사한 실험군에서는 세포생존율이 79%로 두드러지게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 8, in the experimental group irradiated with UV-B, the cell survival rate was 79% in the experimental group irradiated with UV-B after treatment with the Morrow red thread extract of the present invention compared with 28% cell viability in the experimental group. It was confirmed that the increase significantly.

<< 실시예Example 5> 5>

본 발명의 The 모로우붉은실Morrow Red Thread 추출물이 항산화효소에 미치는 영향 Effect of Extracts on Antioxidant Enzymes

상기 실시예 3에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 자유라디칼 소거 효과를 보이는 것을 확인하였는데, 본 실험에서는 이러한 자유라디칼 소거능이 항산화 효소에 따른 영향을 받은 것인지 확인하기 위하여 본 발명의 모로우붉은실 추출물로 처리된 세포에서의 항산화효소(SDO 및 catalase) 활성 및 단백질 발현량을 조사하였다.
In Example 3, it was confirmed that the Morrow red thread extract of the present invention shows a free radical scavenging effect, in the present experiment to check whether the free radical scavenging ability is affected by the antioxidant enzyme as the Morrow red thread extract of the present invention Antioxidase (SDO and catalase) activity and protein expression levels in treated cells were investigated.

<5-1> <5-1> SODSOD (( superoxidesuperoxide dismutasedismutase )의 활성 측정) Activity measurement

슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase: SOD)는 인체 내에서 대표적인 활성산소라고 할 수 있는 과산화물음이온(superoxide anion: O2-ㆍ)을 과산화수소(H2O2)로 변화시키는 항산화효소이다.Superoxide dismutase (superoxide dismutase: SOD) is a representative radical anion as peroxide that can be in the human body: - an antioxidant for changing the (superoxide anion and O2), hydrogen peroxide (H 2 O 2).

인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 100μg/ml 농도의 본 발명의 모로우붉은실 추출물로 24시간 동안 처리하고, 1시간 후 세포들에 UV-B를 조사한 다음 인큐베이터에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. SOD 활성은 colorimetric assay kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 측정하였다. 이때 키트는 과산화물음이온의 감소에 따라 수용성 formazan을 생산할 수 있는 tetrazolium salt WST-1을 이용하였으며, formazan 염료 생산물은 450nm에서 검출되었다. SOD 활성은 과산화물음이온(superoxide anion: O2-ㆍ)의 억제 퍼센트로써 나타내었다.Human keratinocytes (HaCaT cells) were treated with Morrow's red thread extract of the present invention at a concentration of 100 μg / ml for 24 hours. After 1 hour, the cells were irradiated with UV-B and incubated at 37 ° C. for 24 hours in an incubator. SOD activity was measured according to the manufacturer's protocol using a colorimetric assay kit (Abcam, Cambridge, MA, USA). The kit used tetrazolium salt WST-1, which can produce water-soluble formazan as the peroxide anion decreases, and the formazan dye product was detected at 450 nm. SOD activity of peroxide anion - are shown as percent inhibition of (superoxide anion and O2).

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, UV-B 조사에 의해 세포 내 SOD 활성은 54 mU/ml로 감소하였으나, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 실험군에서는 61 mU/ml로 효소활성이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 9, the intracellular SOD activity was reduced to 54 mU / ml by UV-B irradiation, but the enzyme activity is restored to 61 mU / ml in the experimental group treated with the Morrow red thread extract of the present invention I could confirm that.

<5-2> <5-2> 카탈라제Catalase (( catalasecatalase )의 활성 측정) Activity measurement

카탈라제는 과산화수소를 물로 변화시키는 효소로서 지질과산화를 일차적으로 방호하며 라디칼 생성을 억제하는 항산화효소이다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 모로우붉은식 추출물이 라디칼 생성 억제 효소인 카탈라제의 활성을 조절하여 항산화활성을 갖는지를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.Catalase is an enzyme that converts hydrogen peroxide into water. It is an antioxidant enzyme that primarily protects lipid peroxidation and inhibits radical production. Therefore, the present inventors confirmed whether the Morrow red expression extract of the present invention has antioxidant activity by regulating the activity of catalase, a radical production inhibitory enzyme, through the following experiment.

모로우붉은실 추출물을 인간 케라틴세포(HaCaT cells)에 100μg/ml 농도로 24시간 동안 처리하고, 1시간 후 상기 세포에 UV-B를 조사한 다음 인큐베이터에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 카탈라제 활성은 colorimetric assay kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 측정하였다. 간략하게 카탈라제는 H2O2 존재 하에 전자 공여체로써 제공하는 메탄올과 반응한다. 생산된 포름알데하이드는 발색체(chromogen)로서 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-trizole를 이용하여 측정되었으며, 540nm에서 검출되었다. 카탈라제 활성은 nmol/min/ml로써 나타내었다.Morrow red yarn extract was treated with human keratinocytes (HaCaT cells) at 100 μg / ml for 24 hours, and after 1 hour, the cells were irradiated with UV-B and incubated at 37 ° C. for 24 hours in an incubator. Catalase activity was measured according to the manufacturer's protocol using a colorimetric assay kit (Abcam, Cambridge, MA, USA). Briefly, catalase reacts with methanol, which serves as an electron donor in the presence of H 2 O 2 . Formaldehyde produced was measured using 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-trizole as chromogen and detected at 540 nm. Catalase activity is expressed as nmol / min / ml.

그 결과, 도 10에서 나타낸 바와 같이, UV-B 조사에 의해 세포 내 CAT 활성은 10 nmol/min/ml로 감소하였으나, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 실험군에서는 21 nmol/min/ml로 효소활성이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 10, the intracellular CAT activity was reduced to 10 nmol / min / ml by UV-B irradiation, but in the experimental group treated with the Morrow red thread extract of the present invention to 21 nmol / min / ml. It was confirmed that the enzyme activity was restored.

<5-3> 세포 내 <5-3> intracellular SODSOD  And 카탈라제Catalase 단백질 발현량 측정 Protein expression level measurement

본 발명의 모로우붉은실 추출물이 세포 내 SOD 및 카탈라제의 활성뿐만 아니라 이들의 단백질 발현에도 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 웨스턴 블랏팅을 통해 SOD 및 카탈라제의 단백질 발현수준을 측정하였다.In order to investigate whether the Morrow red thread extract of the present invention affects the activity of SOD and catalase in cells as well as their protein expression, protein expression levels of SOD and catalase were measured by western blotting.

인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 100μg/ml 농도의 모로우붉은실 추출물로 1, 6, 12, 24시간 동안 처리한 후, 수득하여 용해버퍼(120mM NaCl, 40mM Tris(pH 8) 및 0.1% NP 40을 포함) 100μl로 30분 동안 처리하였다. 이후 세포들은 13,000×g에서 15분 동안 원심분리한 다음, 세포 용출액에서 상등액을 분리한 후, 단백질 농도를 결정하였다. 이후 세포 용출액 중 일부를(40μg)를 5분 동안 가열한 후 10% SDS-폴리아크릴아마이트 젤 상에서 전기영동하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 그 다음 10% skim milk를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전처리하고, 목적 단백질에 대한 1차 항체를 처리한 후 2차 이뮤노글로불린-G-호스라디시 퍼옥시데이스 컨쥬게이트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 처리하였다. 단백질 밴드는 강화된 chemiluminescence western blotting detection kit(Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 검출하였다.Human keratinocytes (HaCaT cells) were treated with Morrow red thread extract at 100 μg / ml concentration for 1, 6, 12, 24 hours, and then obtained by dissolving buffer (120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8) and 0.1% NP 40). Treated with 100 μl for 30 minutes. Cells were then centrifuged at 13,000 × g for 15 minutes, then the supernatant was separated from the cell eluate, and protein concentration was determined. Some of the cell eluate (40 μg) was then heated for 5 minutes followed by electrophoresis on a 10% SDS-polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose membrane. 10% skim milk was then pretreated on the nitrocellulose membrane, and the secondary immunoglobulin-G-horseradish peroxidase conjugate (Pierce, Rockford, IL, USA) after treatment with the primary antibody against the protein of interest. Was treated. Protein bands were detected using an enhanced chemiluminescence western blotting detection kit (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK).

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 모로우붉은실 추출물을 처리한 실험군은 대조군(β-actin)과 비교하여 Cu/Zn SOD 및 카탈라제 단백질 발현량이 시간 의존적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 11, the experimental group treated with the Morrow red thread extract was confirmed that the time-dependent increase in the amount of Cu / Zn SOD and catalase protein expression compared to the control (β-actin).

<< 실시예Example 6> 6>

모로우붉은실Morrow Red Thread 추출물의  Extract UVUV -B에 의한 세포자연사(Natural death by -B apoptosisapoptosis ) 억제 효과 분석Inhibitory Effect Analysis

상기 실시예 <4-2>에서는 UV-B에 의한 세포사멸이 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명자들은 UV-B에 의한 세포사멸이 직접적으로 세포자연사와도 연관되어 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리에 따른 세포자연사(apoptosis) 억제 효과를 측정하였다.In Example <4-2>, it was confirmed that cell death by UV-B was suppressed by the Morrow red thread extract treatment of the present invention. In order to investigate whether apoptosis by UV-B is directly related to apoptosis, the present inventors measured apoptosis inhibitory effect according to the Morrow red thread extract treatment of the present invention.

세포자연사 억제 효과를 위해 먼저 세포들의 핵 염색을 통해 apoptotic bodies를 관찰하였다. 인간 케라틴세포(HaCaT cells)에 모로우붉은실 추출물을 100μg/ml 농도로 처리하고, 1시간 후 세포들을 UV-B에 노출시켰다. 세포들은 추가적으로 37℃에서 48시간 동안 배양시킨 후, DNA 특이적 형광염료인 Hoechst 33342(stock 10mg/ml) 1.5μl를 각각의 웰(well)에 첨가하여 37℃에서 10분간 배양시켰다. 염색된 세포들은 핵 응축의 정도를 검사하기 위해 CoolSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라가 장착된 형광현미경 하에서 가시화시켰고 이를 정량화하였다. For apoptosis, apoptotic bodies were first observed through nuclear staining of cells. Human keratinocytes (HaCaT cells) were treated with Morrow red thread extract at a concentration of 100 μg / ml, and cells were exposed to UV-B after 1 hour. Cells were additionally incubated for 48 hours at 37 ° C., and 1.5 μl of Hoechst 33342 (stock 10 mg / ml), a DNA-specific fluorescent dye, was added to each well and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Stained cells were visualized and quantified under a fluorescence microscope equipped with a CoolSNAP-Pro color digital camera to examine the degree of nuclear condensation.

그 결과 도 12에서 나타낸 바와 같이, UV-B가 조사된 실험군에서 세포자연사를 나타내는 apoptotic bodies의 핵의 단편들이 두드러지게 관찰되는 반면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리한 후 UV-B를 조사한 실험군에서는 apoptotic bodies의 핵 단편이 급격히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 12, in the experimental group irradiated with UV-B, the fragments of the nucleus of the apoptotic bodies showing the natural apoptosis were remarkably observed, whereas the experimental group irradiated with UV-B after treatment with the Morrow red thread extract of the present invention In Esau, nuclear fragments of apoptotic bodies were rapidly reduced.

또한 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 세포자연사 억제 효과를 측정하기 위하여 세포들의 DNA 단편화(fragmentation)를 관찰하였다. 세포의 DNA 단편화는 제조자의 지시에 따라 Roche Diagnostic(Portland, OR, USA)로부터 구입한 키트를 사용하여 분석되는 세포질의 히스톤-관련된 DNA 단편으로써 평가되었다.In addition, the DNA fragmentation of the cells was observed in order to measure the cytotoxic effect of the Morrow red thread extract of the present invention. DNA fragmentation of cells was assessed as cytoplasmic histone-related DNA fragments analyzed using kits purchased from Roche Diagnostic (Portland, OR, USA) according to the manufacturer's instructions.

그 결과 도 13에서 나타낸 바와 같이, UV-B 조사된 세포에서는 DNA의 단편화가 높게 나타난 반면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리 후 UV-B를 조사한 실험군에서는 DNA의 단편화가 두드러지게 감소되는 것으로 나타났다.
As a result, as shown in Fig. 13, DNA fragmentation was high in UV-B irradiated cells, while DNA-fragmentation was significantly reduced in the experimental group irradiated with UV-B after treatment with the Morrow red thread extract of the present invention. .

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사에 의한 세포자연사(apoptosis)의 억제를 핵 응축의 정도 및 DNA 단편화 실험을 통해 효과적으로 억제한다는 사실을 알 수 있었고, 궁극적으로 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사로부터 세포를 보호하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.
Therefore, the present inventors have found that the Morrow red thread extract effectively inhibits the inhibition of apoptosis by UV-B irradiation through the degree of nuclear condensation and DNA fragmentation experiments. It was found that the silk extract was excellent in protecting the cells from UV-B irradiation.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (5)

모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 약제학적 조성물.
Morrow Red Thread ( Polysiphonia) morrowii Harvey) A pharmaceutical composition for protecting skin cells against ultraviolet rays comprising the extract as an active ingredient.
제 1항에 있어서,
모로우붉은실 추출물은 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 약제학적 조성물.
The method according to claim 1,
Morrow red thread extract is a pharmaceutical composition for protecting skin cells against ultraviolet rays, characterized in that water, organic solvents or mixed solvent extracts thereof.
제 2항에 있어서,
상기 모로우붉은실 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 약제학적 조성물.
3. The method of claim 2,
The Morrow red thread extract is a pharmaceutical composition for protecting skin cells against ultraviolet light, characterized in that the ethanol extract.
제 1항에 있어서,
상기 모로우붉은실 추출물은 자외선 흡수, 자외선 조사에 의해 발생된 세포 내 자유라디칼을 소거 및 자외선에 의해 유도된 세포자연사(apoptosis) 억제할 수 있는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 약제학적 조성물.
The method according to claim 1,
The Morrow red thread extract has a medicament for protecting skin cells against ultraviolet rays, characterized in that it has the effect of eliminating free radicals in cells generated by ultraviolet absorption, ultraviolet irradiation, and inhibiting apoptosis induced by ultraviolet rays. Pharmaceutical composition.
제 1항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태의 조성물인 것을 특징으로 하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 약제학적 조성물.
The method according to claim 1,
The pharmaceutical composition is a composition for external application to the skin, characterized in that the composition for the skin, selected from the group consisting of creams, gels, patches, sprays, ointments, warnings, lotions, linings, pasta and cataplasma. Pharmaceutical composition for cell protection.
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