KR20140035321A - 수소를 포함하는 가스 기질의 발효의 수행 방법 - Google Patents

수소를 포함하는 가스 기질의 발효의 수행 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 하기를 포함하는 가스 기질 발효 방법을 제공한다: 가스 기질을 생물반응기 내 수성 배지로 가하는 것. 본 개시내용의 방법은 하기를 포함한다: 세포 밀도를 측정하는 것; 세포 밀도를 증가시키기 위해 가스 기질의 주입을 조절하는 것; 수소 흡수를 변화시키는 것.
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Description

수소를 포함하는 가스 기질의 발효의 수행 방법 {METHOD OF OPERATION OF FERMENTATION OF GASEOUS SUBSTRATE COMPRISING HYDROGEN}
본 개시내용은 수소를 포함하는 가스 기질의 발효 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 상세하게는 하나 이상의 알코올을 생산하기 위한 수소를 포함하는 가스 기질의 발효 방법에 관한 것이다.
특정 미생물, 예컨대 클로스트리듐 (Clostridium) 속의 것을 이용한 적합한 영양분 및 미량 미네랄을 함유하는 배지 중에서의 일산화탄소 및 수소를 포함하는 가스 기질의 미생물 발효로부터 화학물질, 예컨대 아세트산 등의 유기산 및 에탄올 등의 알코올의 제조 방법이 제시된 바 있다. 예를 들어, Gaddy 등의 미국 특허 No.5,173,429 에는 합성 기체로부터 에탄올 및 아세테이트를 생성하는 혐기성 미생물인 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 49587 이 개시되어 있다. Gaddy 등의 미국 특허 No. 5,807,722 에는 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 55380 등의 혐기성 세균을 이용하여 폐 가스를 유기산 및 알코올 등의 유용한 생성물로 전환시키는 방법 및 장치가 개시되어 있다. Gaddy 등의 미국 특허 No. 6,136,577 에는 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 55988 및 55989 등의 혐기성 세균을 이용하여 폐 가스를 유기산 및 알코올 (특히 에탄올) 등의 유용한 생성물로 전환시키는 방법 및 장치가 개시되어 있다.
미국 특허 출원 No. 20070275447 에는 폐 가스로부터 바이오연료로서 유용한 생성물을 합성할 수 있는 클로스트리듐 균종 (Clostridium carboxidivorans, ATCC BAA-624, "P7") 이 개시되어 있다. 미국 특허 No. 7,704,723 에는 폐 가스로부터 바이오연료로서 유용한 생성물을 합성할 수 있는 클로스트리듐 균종 (Clostridium ragsdalei, ATCC BAA-622, "P11") 이 개시되어 있다.
WO 2007/117157 에는 일산화탄소를 함유하는 기질의 혐기성 발효에 의한 에탄올의 제조를 위한 클로스트리듐 오토에타노게넘 (Clostridium autoethanogenum (수탁번호 DSM 10061, DSMZ, 독일) 의 용도가 개시되어 있다. WO 2009/064200 에는 일산화탄소를 함유하는 기질의 혐기성 발효에 의한 에탄올의 제조를 위한 또다른 세균 (Clostridium autoethanogenum , 수탁번호 DSM 19630, DSMZ, 독일) 이 개시되어 있다.
당업계에 기재된 바와 같이, 알코올 등의 화학물질의 생산율은 발효 배지 중 미생물 세포의 밀도 ("세포 밀도") 에 좌우된다. 화학물질의 높은 생산율을 획득 및 유지하기 위해서는 생물반응기 내 적절한 높은 세포 밀도가 요구된다.
Gaddy 의 미국 특허 No. 6,136,577 에는 세포-재생을 사용하여 세포 밀도를 증가시키는 발효 공정에서의 에탄올 제조 공정이 개시되어 있다.
Gaddy 등의 미국 특허 No. 7,285,402 에는 과량의 H2 가 존재하는 보존 배양물을 이용한 스타트 업 과정에서 세포 밀도를 증가시키는 방법이 제시되어 있는 알코올의 제조를 위한 혐기성 미생물 발효 공정이 개시되어 있다.
보존 배양물로부터의 배치 (batch) 접종원을 이용한 스타트-업에 의해, 오염물질이 없는 건강한 접종원이 확보되지만, 특히 방법 파라미터, 예컨대 기체 속도 및 진탕 속도가 접종 직후 너무 빠르게 밀려 올라갈 경우, 이용된 세포 밀도가 다소 낮기 때문에 접종 과정으로서 항상 성공적인 것은 아니다.
현재, 가스 기질의 미생물 발효에서 세포 밀도를 증가시키기 위한 개선된 방법에 대한 요구가 당업계에 존재한다. 본 개시내용은 가스 기질의 미생물 발효 방법을 위한 보다 빠른 속도로 세포 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 하기를 포함하는 가스 기질로부터의 하나 이상의 알코올의 제조 방법을 제공한다: 생물반응기 내 수성 매질 내에 수소 (H2) 및 일산화탄소 (CO) 중 하나 이상을 포함하는 가스 기질을 발효시키는 것; 상기 방법은 수소 흡수를 조절함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것을 포함함; 이에서 수소 흡수를 조절하는 것은 수소의 주입률을 측정하는 것; 수소의 산출률을 측정하는 것; 및 가스 기질 및 수소 중 하나 이상의 주입률을 조절하는 것을 포함하고; 이에서 수소 흡수를 조절하는 것은 수소 흡수 대 가스 기질의 주입률의 몰비가 제 1 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 제공하는 것을 포함하고; 이에서 수소 흡수를 조절하는 것은 수소 흡수 대 수소의 주입률의 몰비가 제 2 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 제공하는 것을 포함하고; 이에서 상기 제 1 예비선택된 범위는 약 0.001 내지 약 1.0 범위를 포함하고; 상기 제 1 예비선택된 범위는 약 0.005 내지 약 0.5 범위를 포함하고; 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.01 내지 약 0.1 범위를 포함하고; 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.001 내지 약 1.0 범위를 포함하고; 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.005 내지 약 0.5 범위를 포함하고; 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.01 내지 약 0.1 범위를 포함함; 수성 매질의 흐름을 생물반응기에 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 흐름을 제거하는 것을 추가로 포함하고; 수성 매질의 연속 흐름을 생물반응기로 첨가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것을 추가로 포함하고; 비 CO 흡수의 변화율을 제어함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것을 추가로 포함하고, 이에서 비 CO 흡수의 변화율을 제어하는 것은 CO 의 주입률을 측정하고 것; CO 의 산출률을 측정하는 것; 세포 질량을 측정하는 것; 및 CO 의 주입률을 조절하는 것을 포함하고; 이에서 비 CO 흡수의 변화율은 비 CO 흡수의 예비결정된 단계를 포함하고; 이에서 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.001 내지 약 10.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하고; 이에서 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.01 내지 약 5.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하고; 이에서 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.1 내지 약 1.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하고; 이에서 상기 수성 매질은 하기를 포함하는 하나 이상의 미생물을 포함함: 생물학적으로 순수한 미생물, 자연 발생 미생물, 비-자연 발생 미생물, 유전자 변형에 의해 제조된 비-자연 발생 미생물, 자연 발생 미생물의 돌연변이, 비-자연 발생 미생물의 돌연변이, 재조합 미생물, 조작된 (engineered) 미생물, 인공적으로 합성된 미생물; 여기서 상기 생물반응기는 하나 이상의 반응기를 포함함; 여기서 상기 생물반응기는 세포 재생 유닛을 포함함; 여기서 상기 CO-함유 기질은 수소를 포함함; 추가로 상기 생물반응기에 영양 배지를 첨가하는 것을 포함함.
본 개시내용은 하기를 제공한다: 하기를 포함하는 가스 기질의 발효 방법: 생물반응기 내 수성 매질 내에 수소 (H2) 및 일산화탄소 (CO) 중 하나 이상을 포함하는 가스 기질을 가하는 것, 상기 수성 매질은 하나 이상의 미생물을 포함함; 상기 방법은 수소 흡수를 조절함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것을 포함하고; 이에서 수소 흡수는 수소의 주입률을 측정하는 것; 수소의 산출률을 측정하는 것; 및 가스 기질 및 수소 중 하나 이상의 주입률을 조절하는 것을 포함하고; 이에서 수소 흡수를 조절하는 단계는 수소 흡수 대 가스 기질의 주입률의 몰비가 제 1 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서, 수소 흡수를 조절하는 것은 상기 수소 흡수 대 수소의 주입률의 몰비가 제 2 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함하고; 상기 제 1 예비선택된 범위는 약 0.001 내지 약 1.0 범위를 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서, 상기 제 1 예비선택된 범위는 약 0.005 내지 약 0.5 범위를 포함하고, 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.01 내지 약 0.1 범위를 포함하고; 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.001 내지 약 1.0 범위를 포함하고; 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.005 내지 약 0.5 범위를 포함하고; 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위는 약 0.01 내지 약 0.1 범위를 포함한다.
본 발명의 구현예로서, 생물반응기에 수성 매질의 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 흐름을 제거하는 것. 구현예로서 생물반응기로의 수성 매질의 연속 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것.
본 개시내용의 구현예로서, 비 CO 흡수의 변화율을 제어함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것; 이에서 비 CO 흡수의 변화율을 제어하는 것은 CO 의 주입률을 측정하는 것; CO 의 산출률을 측정하는 것, 세포 질량을 측정하는 것, 및 CO 의 주입률을 조절하는 것; 이에서 비 CO 흡수의 변화율은 비 CO 흡수의 예비결정된 단계를 포함함; 이에서 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.001 내지 약 10.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함함; 이에서 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.01 내지 약 5.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함함; 이에서 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.1 내지 약 1.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함함.
구현예로서, 본 개시내용의 상기 미생물은 생물학적으로 순수한 미생물, 자연 발생 미생물, 비-자연 발생 미생물, 유전자 변형에 의해 제조된 비-자연 발생 미생물, 자연 발생 미생물의 돌연변이, 비-자연 발생 미생물의 돌연변이, 재조합 미생물, 조작된 미생물, 및 인공적으로 합성된 미생물을 비롯한 미생물 중 하나 이상을 포함하고; 여기서 상기 미생물은 아세토지늄 키비 (Acetogenium kivui), 아세토박테리움 우디 (Acetobacterium woodii), 아세토아나에로븀 노테라에 (Acetoanaerobium noterae), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 (Caldanaerobacter subterraneous), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 파시피쿠스 (Caldanaerobacter subterraneous pacificus), 카르복시도테르무스 히드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 클로스트리듐 아세티쿰 (Clostridium aceticum), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSM 23693), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 19630), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 10061), 클로스트리듐 써모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum), 유박테리움 리모섬 (Eubacterium limosum), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC 49587), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) ERI2 (ATCC 55380), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01 (ATCC 55988), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC 55889), 클로스트리듐 울투넨스 (Clostridium ultunense), 클로스트리듐 라그스달리 (Clostridium ragsdali) P11 (ATCC BAA-622), 알칼리바쿨룸 바키 (Alkalibaculum bacchi) CP11 (ATCC BAA-1772), 클로스트리듐 코스카티 (Clostridium coskatii), 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7 (ATCC PTA-7827), 지오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 모렐라 써마세티카 (Morrella thermacetica), 펩토스트렙토코커스 프로덕터스 (Peptostreptococcus productus), 클로스트리듐 드라케이 (Clostridium drakei), 재조합 미생물 (DSM 24138), 및 그 혼합물로부터 선택된 것을 포함하고; 이에서 상기 미생물은 하나 이상의 하나 이상의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주를 포함하고; 이에서 상기 미생물은 임의의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주로부터 임의의 숙주 생물 내에 하나 이상의 선택된 유전자를 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 유전자 변형 미생물을 포함하고; 이에서 상기 미생물은 임의의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주로부터의 하나 이상의 유전자를 임의의 숙주 생물 내에 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 유전자 변형 미생물을 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서 상기 생물반응기는 하나 이상의 반응기를 포함하고; 이에서 상기 생물반응기는 세포 재생 유닛을 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서 상기 CO-함유 기질은 수소를 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서 방법은 생물반응기에 영양 배지를 첨가하는 것을 포함한다.
도 1 은 가스 기질의 미생물 발효 방법의 한 구현예를 예시한 모식도를 포함한다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본 개시내용에 관한 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 이하의 용어는 하기와 같이 정의되며 이하에 정의되는 정의의 단수형 또는 복수형을 포함할 수 있다.
임의의 양을 수정하는 용어 "약" 은 예컨대 랩, 파일럿 플랜트, 또는 생산 설비에서 미생물 배양을 지속시키는 실제 조건에서 직면하는 양의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 혼합물 또는 수량에 이용된 성분 또는 측정치의 양은 "약" 에 의해 수정된 경우 생산 플랜트 또는 랩에서의 실험 조건에서 측정하는데 있어 전형적으로 이용되는 주의의 정도 및 편차를 포함한다. 예를 들어, 생성물의 성분의 양은 "약" 에 의해 수정된 경우 플랜트 또는 랩에서의 다수의 실험에서의 배치 (batch) 들 간의 편차 및 분석 방법에 있어 내재된 편차를 포함한다. "약" 에 의해 수정되든 되지 않든 간에, 해당 양은 그 양에 대한 균등 양을 포함한다. "약" 에 의해 수정된 본원에 언급된 양은 또한 본 개시내용에서 "약" 에 의해 수정되지 않은 양으로서 이용될 수도 있다.
용어 "아세토젠 (acetogen)" 또는 "아세트산생성 (acetogenic)" 은 혐기성 호흡의 생성물로서 아세테이트를 생성하는 세균을 지칭한다. 이들 유기물은 모든 공지의 아세토젠이 세균이기 때문에 또한 아세트산생성 균으로서 지칭되기도 한다. 아세토젠은 각종 서식지, 일반적으로는 혐기성 (산소 결핍) 인 곳에서 발견된다. 아세토젠은 에너지 및 탄소의 공급원으로서 각종 화합물을 이용할 수 있으며; 가장 잘 연구된 형태의 아세트산생성 대사는 탄소 공급원으로서의 이산화탄소 및 에너지 공급원으로서의 수소의 사용할 수 있다.
용어 "생물반응기", "반응기" 또는 "발효 생물반응기" 는 하나 이상의 용기 및/또는 타워 또는 배관 구조로 이루어진 발효 장치를 포함하며, 여기에는 연속 교반조 반응기 (CSTR), 버블 칼럼, 가스 리프트 (Gas lift) 발효조, 정적 (static) 혼합기, 또는 기-액 접촉에 적합한 다른 장치가 포함된다. 본 개시내용의 방법의 경우, 발효 생물반응기는 발효 브로스를 2 차 발효 생물 반응기에 투입하는 성장 반응기를 포함할 수 있으며, 상기 2 차 발효 생물 반응기에서는 대부분의 생성물, 에탄올이 생성된다.
용어 "세포 밀도" 는 발효 브로스의 단위 부피 당 미생물 세포의 질량, 예컨대 g/리터를 의미한다.
용어 "세포 재생" 또는 "세포 재생 시스템" 또는 "crs" 또는 "CRS" 는 발효 브로스 중의 고체 미생물 세포로부터 액체 (투과물) 를 분리하고, 상기 분리된 고체 미생물 세포의 전부 또는 일부를 상기 미생물을 이용하여 상기 발효 브로스를 생성하는 발효조로 되돌리는 방식을 의미한다. 일반적으로 상기 분리를 달성하는 데에는 여과 장치가 사용된다. 고체 미생물 미함유 투과물 스트림 및 농축된 고체 미생물의 스트림이 여과 장치로부터 생성된다. 고체 미함유 투과물 스트림은 특정 입자 크기 미만의 고체 입자들을 함유할 수 있다.
용어 "전환율" 은 주입 양 중 생성물(들)로 전환된 부분을 의미한다; 이는 다음의 식으로 제시된다: (주입 양 - 산출 양)/(주입 양).
용어 "에탄올 생산성" 은 1 일 단위 발효조 체적 당 생성된 에탄올의 양을 의미한다. 발효조 체적은 발효조 내 유효 체적 또는 액체 체적이다.
용어 "발효" 는 알코올 및 아세테이트로의 CO 의 발효를 의미한다. 수많은 세균이 부탄올 및 에탄올을 비롯한 알코올, 및 아세트산으로의 CO 의 발효를 실시할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 본 개시내용의 방법에 사용되기에 적합하다. 본 개시내용에 사용되기에 적합한 이러한 세균의 예로는 클라스트리듐 (Clostridium) 속의 것들, 예컨대 WO 2000/68407, EP 117309, 미국 특허 No. 5,173,429, 5,593,886, 및 6,368,819, WO 1998/00558 및 WO 2002/08438 에 기재된 것을 비롯한 균주 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii), WO 2007/117157 및 WO 2009/151342 에 기재된 것을 비롯한 균주 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 10061 및 19630), 및 각각 미국 특허 No. 7,704,723 및 ["Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas," Hasan Atiyeh, Oklahoma EPSCoR Annual State Conference 에서 발표, April 29, 2010] 에 기재된 것을 비롯한 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) (P11, ATCC BAA-622) 및 미국 특허 출원 No. 20070275447 에 기재된 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) (ATCC BAA-624) 를 포함한다. 다른 적합한 미생물으로는 모오렐라 에스피 (Moorella sp) HUC22-1 을 비롯한 모오렐라 (Moorella) 속의 것, 및 카르복시도테르무스 (Carboxydothermus) 속의 것을 포함한다. 각각의 이들 간행물의 개시내용은 본원에 전체가 참조로 인용된다. 또한, 다른 미생물이 당업자에 의해 개시내용의 방법에 사용되기 위해 선택될 수 있다. 또한, 2 개 이상의 세균의 혼합 배양이 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 하나의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게넘 (Clostridium autoethanogenum) 이다. 발효는 임의의 적합한 생물반응기, 예컨대 연속 교반조 반응기 (CTSR), 버블 칼럼 반응기 (BCR) 또는 살수층 반응기 (trickle bed reactor (TBR)) 에서 실시될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 일부 바람직한 구현예에서, 생물반응기는 미생물이 배양되는 제 1 성장 반응기, 및 상기 성장 반응기로부터 발효 브로스가 투입되고 대부분의 배양 생성물 (에탄올 및 아세테이트) 이 생성되는 제 2 발효 반응기를 포함할 수 있다.
용어 "발효 브로스" 는 발효 배지의 조성물이 원료 기질, 발효 생성물, 미생물(들) 및 유도된 성분, 화학적 첨가제, 영양분, 기체를 비롯하여 결국 발효 브로스가 되는 모든 것을 포함하는 것을 의미한다. 모든 3 개의 주요 상, 즉 고체, 액체 및 기체가 발효 브로스 및 그의 가능한 상호작용물에 존재한다.
용어 "유전자" 란 DNA 의 단편을 의미한다; 이는 코딩 DNA 의 이전 및 이후 영역 뿐만 아니라 엑손들 간의 인트론을 포함할 수 있고; 유전 형질의 단위일 수 있으며; 본 개시내용에서 용어 "유전자" 는 표현형/기능에 기여하는 DNA 단편; 세포를 RNA 로 전사하고, 적어도 일부를 단백질로 번역하는 DNA 단편; A, T, C 및 G 의 조합으로 이루어진 염기의 서열 (문자열) 을 포함한다. 일반적으로, 본 개시내용에 제시된 바와 같이, 상기 정의는 단수 의미 또는 복수 의미를 지칭할 수 있다.
용어 "미생물" 또는 "미생물체 (microbe)" 는 미생물, 곰팡이, 효모, 아키아 및 원생생물; 미세 식물 (녹조류라 불리는 것); 및 동물, 예컨대 플랑크톤, 플라나리아 및 아메바를 포함한다. 몇몇은 또한 바이러스를 포함하지만, 그 밖에는 이들을 비-생물체로서 여긴다. 미생물은 토양, 온천, 대양저 위에, 대기 중의 높은 곳 및 지각 내 암석 내부의 깊은 곳을 비롯해 액체 물이 존재하는 생물권의 모든 부분에서 생존한다. 미생물은 분해자로서 작용하기 때문에 생태계에서의 영양분 재순환에 있어 중요하다. 미생물체는 또한 전통적인 식품 및 음료 제조, 및 유전 공학에 기초한 현대 기술 모두에 있어서 생명공학자에 의해 개발된다. 여러 미생물들의 균주를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 혼합 균주 미생물이 본 개시내용에서 이용될 것으로 생각된다. 또한, 유도 진화는 본 개시내용에 이용될 수 있는 미생물을 선택적으로 선별할 수 있는 것으로 생각된다. (이들의 DNA 를 변형시키기 위해) 다양한 화학물질로 이들을 처리하는 것에 의한 존재하는 미생물의 균주의 돌연변이화는 우수한 능력을 가진 미생물을 생성할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 재조합 DNA 기술이 선택된 기존 미생물 균주를 이용해 미생물을 생성할 수 있는 것으로 생각된다. CO 및 물 또는 H2 및 CO2 를 에탄올 및 아세트산 생성물로 전환시킬 수 있는 미생물이 본 개시내용에서 이용될 것으로 생각된다. 유용한 미생물의 일부 예로는 아세토지늄 키비 (Acetogenium kivui), 아세토박테리움 우디 (Acetobacterium woodii), 아세토아나에로븀 노테라에 (Acetoanaerobium noterae), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 (Caldanaerobacter subterraneous), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 파시피쿠스 (Caldanaerobacter subterraneous pacificus), 카르복시도테르무스 히드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 클로스트리듐 아세티쿰 (Clostridium aceticum), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSM 23693), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 19630), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 10061), 클로스트리듐 써모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum), 유박테리움 리모섬 (Eubacterium limosum), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC 49587), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) ERI2 (ATCC 55380), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01 (ATCC 55988), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC 55889), 클로스트리듐 울투넨스 (Clostridium ultunense), 클로스트리듐 라그스달리 (Clostridium ragsdali) P11 (ATCC BAA-622), 알칼리바쿨룸 바키 (Alkalibaculum bacchi) CP11 (ATCC BAA-1772), 클로스트리듐 코스카티 (Clostridium coskatii), 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7 (ATCC PTA-7827), 지오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 모렐라 써마세티카 (Morrella thermacetica), 펩토스트렙토코커스 프로덕터스 (Peptostreptococcus productus), 클로스트리듐 드라케이 (Clostridium drakei), 재조합 미생물 (DSM 24138), 및 그 혼합물을 포함한다. 당업자는 이들 방법에 사용되기 위한 다른 미생물들을 선택할 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용에 제시된 바와 같이, 상기 정의는 단수 의미 또는 복수 의미를 지칭할 수 있다.
용어 "영양 배지" 는 선택된 미생물의 성장을 허용하는 비타민 및 미네랄 중 하나 이상을 함유할 수 있는 미생물 성장 배지를 포함한다. 본 발명의 용도에 적합한 각종 영양 배지의 구성성분은 국제 특허 출원 WO 2008/00558, 미국 특허 No. 7,285,402, 미국 특허 No. 5,807,722; 미국 특허 No. 5,593,886, 및 미국 특허 No. 5,821,111 등의 종래 간행물에 공지 및 보고되어 있다.
용어 "비 CO 흡수" 는 단위 시간 (분) 당 미생물 세포의 단위 질량 (g) 에 의해 소비된 mmole 로 나타낸 CO 의 양, 즉 mmole/g/min 을 의미한다.
용어 "기질" 은 발효 생성물을 생성하는 효소 또는 미생물에 의해 작용되는 물질을 의미한다. 예를 들어, 에탄올을 생성하는 효소에 의한 당 발효에서의 당, 카르복실산 및 알코올 중 하나 이상을 생성하는 미생물에 의한 합성가스 발효에서의 CO, CO2 및 H2 중 하나 이상이다.
용어 "합성가스 (syngas)" 또는 "합성 기체 (synthesis gas)" 란 다양한 양의 일산화탄소 및 수소를 함유하는 기체 혼합물에 주어지는 이름인 합성 기체를 의미한다. 제조 방법의 예로는 수소를 생성하는 천연 가스 또는 탄화수소의 스팀 개질, 석탄의 기화 및 일부 유형의 폐기물-에너지화에서의 기화 설비를 포함한다. 상기 명칭은 합성 천연 가스 (SNG) 의 제조에서 및 암모니아 또는 메탄올 제조를 위한 중간물로서의 그의 사용에서 유래한 것이다. 합성가스는 또한 Fischer-Tropsch 합성 및 이전의 Mobil 메탄올 가솔린화 공정을 통한 연료 또는 윤활제로서 사용되는 합성 석유의 제조에 있어서 중간물로서 사용된다. 합성가스는 수소, 일산화탄소, 및 매우 종종 일부 이산화탄소로 주로 이루어진다.
상세한 설명
본 개시내용은 하기를 포함하는 가스 기질 발효 방법을 제공한다: 생물반응기 내 수성 배지 내에 하나 이상의 수소 (H2) 및 일산화탄소 (CO) 를 포함하는 가스 기질을 첨가하는 것; 상기 수성 배지는 하나 이상의 미생물을 포함함; 상기 방법은 수소 흡수를 조절함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것을 포함함; 이에서 수소 흡수는 수소의 주입률을 측정하는 것; 수소의 산출률을 측정하는 것; 가스 기질 및 수소 중 하나 이상의 주입률을 조절하는 것을 포함함; 이에서 수소 흡수를 조절하는 것은 상기 수소 흡수 대 가스 기질의 주입률의 몰비가 제 1 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함함.
본 개시내용의 구현예로서 수소 흡수를 조절하는 것은 상기 수소의 흡수 대 수소의 주입률의 몰비가 제 2 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함하고; 이에서 상기 제 1 예비선택된 범위는 약 0.001 내지 약 1.0 의 범위를 포함함.
본 개시내용의 구현예로서 상기 제 1 예비선택된 범위는 약 0.005 내지 약 0.5 를 포함하고; 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위를 약 0.01 내지 약 0.1 을 포함하고; 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위를 약 0.001 내지 약 1.0 을 포함함; 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위를 약 0.005 내지 약 0.5 를 포함함; 이에서 상기 제 2 예비선택된 범위를 약 0.01 내지 약 0.1 을 포함함.
본 개시내용의 구현예로서, 수성 배지의 흐름을 생물반응기에 가하는 것; 생물반응기로부터 발효 브로스의 흐름을 제거하는 것. 구현예로서 수성 배지의 연속 흐름을 생물반응기에 가하는 것; 생물반응기로부터 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것.
본 개시내용의 구현예로서, 비 CO 흡수의 변화율을 제어함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것; 이에서 비 CO 흡수의 변화율을 제어하는 것은 CO 의 주입률을 측정하는 것; CO 의 산출률을 측정하는 것; 및 CO 의 주입률을 제어하는 것을 포함함; 이에서 비 CO 흡수의 변화율은 비 CO 흡수의 예비결정된 단계를 포함하고; 이에서 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.001 내지 약 10.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하고; 이에서 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.01 내지 약 5.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하고; 이에서 비 CO 흡수의 예비결정된 단계는 약 0.1 내지 약 1.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함함.
본 개시내용은 하기를 포함하는 알코올 생성물 혼합물의 연속 생산 방법을 제공한다: 일산화탄소를 포함하는 가스 기질을 생물반응기 내의 수성 배지에 첨가하는 것; 상기 수성 배지는 하나 이상의 미생물을 포함함; 상기 방법은 총 수소 흡수를 측정하는 것을 포함함; 상기 총 수소 흡수 대 상기 가스 기질의 공급된 양이 약 0.001 대 약 1.0 의 예비선택된 범위를 포함되게 하는 흐름-속도로 상기 가스 기질을 공급하는 것; 생물반응기로 수성 배지의 연속 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것을 추가로 포함함.
본 개시내용은 하기를 포함하는 알코올 생성물 혼합물의 연속 생산 방법을 제공한다: 일산화탄소를 포함하는 가스 기질을 생물반응기 내의 수성 배지에 첨가하는 것; 상기 수성 배지는 하나 이상의 미생물을 포함함; 상기 방법은 총 수소 흡수를 측정하는 것을 포함함; 상기 총 수소 흡수 대 상기 가스 기질의 공급된 양이 약 0.001 대 약 1.0 의 예비선택된 범위를 포함되게 하는 흐름-속도로 상기 가스 기질을 공급하는 것; 추가로 세포 밀도를 측정하는 것; 세포 밀도를 증가시키기 위해 가스 기질의 주입을 조절하는 것; 약 0.001 내지 약 10.0 mmol/min/gram 건조 세포의 예비 결정된 양으로 비 CO 흡수를 변화시키는 것을 포함하고; 추가로 생물반응기로 수성 배지의 연속 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것을 포함함.
본 개시내용은 하기를 포함하는 알코올 생성물 혼합물의 연속 생산 방법을 제공한다: 일산화탄소를 포함하는 가스 기질을 생물반응기 내의 수성 배지에 첨가하는 것; 상기 수성 배지는 하나 이상의 미생물을 포함함; 총 수소 흡수를 측정하는 것 및 상기 가스 기질에서의 총 수소 흡수 대 상기 수소의 공급된 양의 몰비가 예비선택된 범위를 유지하게 하는 흐름-속도로 수소를 포함하는 상기 가스 기질을 공급하는 것; 추가로 생물반응기로 수성 배지의 연속 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것을 포함함.
본 개시내용은 하기를 포함하는 알코올 생성물 혼합물의 연속 생산 방법을 제공한다: 일산화탄소를 포함하는 가스 기질을 생물반응기 내의 수성 배지에 첨가하는 것; 상기 수성 배지는 하나 이상의 미생물을 포함함; 세포 밀도 및 수소 흡수를 측정하는 것 및 단위 세포 질량 당 상기 가스 기질에서의 상기 비 수소 흡수 대 상기 수소의 공급된 양의 몰비가 예비선택된 범위를 유지하게 하는 흐름-속도로 수소를 포함하는 상기 가스 기질을 공급하는 것; 추가로 생물반응기로 수성 배지의 연속 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것을 포함함.
본 발명의 구현예로서, 상기 미생물은 하나 이상의 생물학적으로 순수한 혐기성 아세트산생성 균을 포함하고; 여기서 상기 미생물은 하나 이상의 자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함하고; 여기서 상기 미생물은 하나 이상의 비-자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함하고; 여기서 상기 미생물은 숙주 생물로서 혐기성 아세트산생성 균을 이용한 유전자 변형에 의해 제조된 하나 이상의 비-자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함하고; 여기서 상기 미생물은 숙주 생물 내에 혐기성 아세트산생성 균의 유전자를 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 비-자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함하고; 이에서 아세토지늄 키비 (Acetogenium kivui), 아세토박테리움 우디 (Acetobacterium woodii), 아세토아나에로븀 노테라에 (Acetoanaerobium noterae), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 (Caldanaerobacter subterraneous), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 파시피쿠스 (Caldanaerobacter subterraneous pacificus), 카르복시도테르무스 히드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 클로스트리듐 아세티쿰 (Clostridium aceticum), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSM 23693), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 19630), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 10061), 클로스트리듐 써모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum), 유박테리움 리모섬 (Eubacterium limosum), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC 49587), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) ERI2 (ATCC 55380), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01 (ATCC 55988), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC 55889), 클로스트리듐 울투넨스 (Clostridium ultunense), 클로스트리듐 라그스달리 (Clostridium ragsdali) P11 (ATCC BAA-622), 알칼리바쿨룸 바키 (Alkalibaculum bacchi) CP11 (ATCC BAA-1772), 클로스트리듐 코스카티 (Clostridium coskatii), 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7 (ATCC PTA-7827), 지오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 모렐라 써마세티카 (Morrella thermacetica), 펩토스트렙토코커스 프로덕터스 (Peptostreptococcus productus), 클로스트리듐 드라케이 (Clostridium drakei), 재조합 미생물 (DSM 24138), 및 그 혼합물로부터 선택된 것을 포함하고; 이에서 상기 미생물은 하나 이상의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주를 포함하고; 이에서 상기 미생물은 임의의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주로부터 선택된 숙주 생물 내에 하나 이상의 선택된 유전자를 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 유전자 변형 미생물을 포함하고, 이에서 상기 미생물은 임의의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주로부터의 유전자를 숙주 생물에 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 유전자 변형 미생물을 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서, 상기 생물반응기는 하나 이상의 반응기를 포함하고, 이에서 상기 생물반응기는 세포 재생 유닛을 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서 상기 CO-함유 기질은 수소를 포함한다.
본 개시내용의 구현예로서 방법은 생물반응기에 영양 배지를 첨가하는 것을 포함한다.
도 1 은 미생물을 이용한 발효에 의한 합성가스 등의 일산화탄소 (CO) 를 포함하는 가스 기질로부터 알코올 생성물 혼합물 등의 화학물질을 제조하는 공정을 나타내며, 상기 공정은 상기 미생물 세포 및 발효 배지를 포함하는 발효 브로스를 함유하는 생물반응기 (100) 를 포함한다. CO 를 포함하는 가스 기질을 포함하는 기체 스트림 (101) 을 발효 배지 (102) 의 스트림과 함께 생물반응기 내에 투입할 수 있다. 상기 미생물 세포 및 상기 생성물 화학물질(들)을 포함하는 발효 브로스의 스트림 (110) 을 상기 생물반응기로부터 제거할 수 있다. 상기 가스 기질을 포함하는 기체 스트림의 미사용 부분을 포함하는 발효조 오프-가스의 스트림 (120) 을 생물반응기로부터 배출시킨다. 한 구현예에서, 발효조 브로스의 스트림 (110) 은 세포 재생 장치 (200) 로 흐르며 여기서 세포가 농축되어 생물반응기로 되돌려진다 (220). 상기 세포 재생 장치로부터의 투과물 스트림 (210) 은 상기 화학물질(들) 의 회수 공정으로 향한다 (도면에 도시되지 않음). 한 구현예에서 발효조 브로스의 스트림 (110) 은 상기 알코올 생성물 혼합물의 회수 공정으로 향한다 (도면에 도시되지 않음).
한 구현예에서, 생물반응기 (100) 에는, 가스 기질을 포함하는 기체 스트림 간의 접촉을 촉진시키고 액체 발효 배지와 함께 가스 기질의 물질 전달을 증강시키기 위하여 진탕을 제공하는 진탕기 (105) 가 구비된다. 발효 공정 전반에 걸쳐 양호한 물질 전달 속도 및 이에 따른 생물반응기 내의 적절한 진탕을 갖는 것이 요망된다.
생물반응기에 도입된 가스 기질을 포함하는 기체 스트림 (101) 및 생물반응기를 떠나는 오프-가스 (120) 의 시료들을 수집하는 장비가 존재한다 (도 1 에는 도시되지 않음). 생물반응기의 발효 브로스의 시료들을 수집하는 장비가 존재한다 (도 1 에는 도시되지 않음). 상기 기체 및 액체 시료들을 일정 간격으로 수집하여 각종 기체 성분의 소비 또는 생성, 각종 생성물의 생성 및 발효 브로스의 광학 밀도를 분석한다.
이들 측정 값들은 이하의 식을 이용하여 비 일산화탄소 (CO) 흡수 (SCU) 및 생물반응기 내의 발효 브로스 중의 세포 밀도를 산출하는데 사용될 수 있다:
CO 흡수율, mmol/min = (mmol/min CO 주입) - (mmol/min CO 산출) (1)
H2 흡수, mmol/min = (mmol/min H2 주입) - (mmol/min H2 산출) (2)
세포 밀도, g/L = (광학 밀도)·(희석 인자)·(세포 질량 상수) (3)
세포 질량, g = (세포 밀도)·(생물반응기의 체적) (4)
비 CO 흡수, mmol/min/g = (CO 흡수) / (세포 질량) (5)
비 H2 흡수, mmol/min/g = (H2 흡수) / (세포 질량) (6)
세포 밀도는 발효조 브로스의 단위 체적 당 세포의 질량이다. 생물반응기의 체적은 진탕을 껐을 때의 생물반응기 내 액체 체적이다. 세포 질량 상수는 광학 밀도가 일 (1) 인 발효 브로스 1 리터 당 건조 미생물 세포의 질량 (g) 이다. 광학 밀도 (OD) 색차계 및 분광계에서 미생물의 현탁액에 의해 흡수되는 빛의 양의 측정값이다. 값은 탁도를 측정하는데 사용될 수 있고, 이는 순차적으로 용액 또는 발효 브로스에서의 미생물 세포의 질량 또는 수를 계산하는데 사용될 수 있다. 시료의 광학 밀도는 대개 식염수와 같은 적절한 용매를 사용하여 발효 브로스를 희석시킨 후 측정된다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 미생물은 하나 이상의 생물학적으로 순수한 혐기성 아세트산생성 균을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 미생물은 하나 이상의 자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 미생물은 하나 이상의 비-자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 미생물은 숙주 생물로서 혐기성 아세트산생성 균을 이용한 유전자 변형에 의해 제조된 하나 이상의 비-자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 미생물은 숙주 생물 내에 혐기성 아세트산생성 균의 유전자를 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 비-자연 발생 혐기성 아세트산생성 균을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 미생물은 아세토지늄 키비 (Acetogenium kivui), 아세토박테리움 우디 (Acetobacterium woodii), 아세토아나에로븀 노테라에 (Acetoanaerobium noterae), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 (Caldanaerobacter subterraneous), 칼다나에로박테르 서브테라니어스 파시피쿠스 (Caldanaerobacter subterraneous pacificus), 카르복시도테르무스 히드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 클로스트리듐 아세티쿰 (Clostridium aceticum), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (DSM 23693), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 19630), 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) (독일 DSMZ 의 DSM 10061), 클로스트리듐 써모아세티쿰 (Clostridium thermoaceticum), 유박테리움 리모섬 (Eubacterium limosum), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) PETC (ATCC 49587), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) ERI2 (ATCC 55380), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01 (ATCC 55988), 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC 55889), 클로스트리듐 울투넨스 (Clostridium ultunense), 클로스트리듐 라그스달리 (Clostridium ragsdali) P11 (ATCC BAA-622), 알칼리바쿨룸 바키 (Alkalibaculum bacchi) CP11 (ATCC BAA-1772), 클로스트리듐 코스카티 (Clostridium coskatii), 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) P7 (ATCC PTA-7827), 지오박터 설푸레두센스 (Geobacter sulfurreducens), 모렐라 써마세티카 (Morrella thermacetica), 펩토스트렙토코커스 프로덕터스 (Peptostreptococcus productus), 클로스트리듐 드라케이 (Clostridium drakei), 재조합 미생물 (DSM 24138), 및 그 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 미생물을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용의 방법에서 사용되는 미생물은 하나 이상의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 하나 이상의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주를 포함한다.
한 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 사용된 미생물은 임의의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주로부터 선택된 숙주 생물 내에 하나 이상의 선택된 유전자를 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 유전자 변형 미생물을 포함한다.
한 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 사용된 미생물은 임의의 클로스트리듐 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxidivorans) 균주, 또는 임의의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주로부터 하나 이상의 유전자를 임의의 숙주 생물 내에 삽입함으로써 제조된 하나 이상의 유전자 변형 미생물을 포함한다.
본 개시내용의 방법에서, 비 수소 흡수는 원하는 비 수소 흡수로 점차적으로 감소된다.
본 개시내용의 한 구현예에 있어서, 방법은 총 수소 흡수를 측정하는 것 및 총 수소 흡수 대 수소를 포함하는 상기 가스 기질의 공급된 양의 몰비가 예비선택된 범위에 포함되게 하는 흐름-속도로 수소를 포함하는 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함한다.
한 구현예에 있어서, 상기 총 수소 흡수 대 수소를 포함하는 상기 가스 기질의 공급된 양의 몰비의 값의 예비선택된 범위는 약 0.1 % 내지 약 1.0 % 의 범위를 포함한다.
한 구현예에 있어서, 방법은 발효 배지의 흐름을 공급하는 것을 추가로 포함한다.
한 구현예에 있어서, 방법은 값의 특정된 범위에서 투과물 제거와 함께 세포 재생을 사용하는 것을 포함한다.
한 구현예에 있어서, 상기 수소를 포함하는 가스 기질은 또한 CO 를 포함한다. 한 구현예에 있어서, 방법은 세포 밀도 및 비 CO 흡수를 측정하는 것 및 가스 기질의 주입을 조절함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것을 포함하고, 이에서 비 CO 흡수는 예비결정된 값의 단계에서 증감된다.
한 구현예에 있어서, 방법은 세포 밀도 및 비 CO 흡수를 측정하는 것의 하위-방법을 추가로 포함하고, 세포 밀도가 표적 세포 밀도보다 작은 경우 표적 비 CO 흡수를 선택하는 것 및 비 CO 흡수가 상기 표적 비 CO 흡수와 동일하게 되도록 가스 기질을 포함하는 기체 스트림의 흐름을 조절하는 것이 달성될 수 있다.
한 구현예에 있어서, 원하는 세포 밀도가 달성되거나 원하는 비 CO 흡수가 달성되거나 원하는 에탄올 생산성이 달성되거나 발효 브로스에서의 원하는 에탄올 농도가 달성될 때까지 상기 하위-공정이 반복된다.
본 개시내용의 방법의 한 구현예는 총 수소 흡수를 측정하는 것 및 상기 총 수소 흡수 대 수소를 포함하는 상기 가스 기질에서의 상기 수소의 공급된 양의 몰비가 예비선택된 범위에서 유지되게 하는 흐름-속도로 수소를 포함하는 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 한 구현예는 미생물 세포 질량 및 비 수소 흡수를 측정하는 것 및 상기 비 수소 흡수 대 단위 미생물 세포 질량 당 수소를 포함하는 상기 가스 기질의 공급된 양의 몰비가 예비선택된 범위에서 유지되게 하는 흐름-속도로 수소를 포함하는 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 한 구현예는 미생물 세포 질량 및 비 수소 흡수를 측정하는 것 및 상기 비 수소 흡수 대 단위 미생물 세포 질량 당 수소를 포함하는 상기 가스 기질에서의 수소의 상기 수소의 공급된 양의 몰비가 예비선택된 범위에서 유지되게 하는 흐름-속도로 수소를 포함하는 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함한다.
상기 총 수소 흡수 대 수소를 포함하는 상기 가스 기질에서의 상기 수소의 공급된 양의 몰비의 값의 상기 예비선택된 범위는 약 0.1 % 내지 약 1.0 % 의 범위를 포함한다.
상기 총 수소 흡수 대 단위 미생물 세포 질량 당 수소를 포함하는 상기 가스 기질의 공급된 양의 몰비의 값의 상기 예비선택된 범위는 약 0.1 % 내지 약 1.0 % 의 범위를 포함한다.
상기 비 수소 흡수 대 단위 미생물 세포 질량 당 수소를 포함하는 상기 가스 기질에서의 수소의 공급된 양의 몰비의 값의 상기 예비선택된 범위는 약 0.1 % 내지 약 1.0 % 의 범위를 포함한다.
상기 표적 비 CO 흡수의 값은 약 0.1 내지 약 10.0 mmol CO/min/g 건조 미생물을 포함할 수 있다. 상기 원하는 비 CO 흡수의 값은 약 0.1 내지 약 10 mmol/min/g 의 범위를 포함할 수 있다.
상기 표적 세포 밀도의 값은 약 0.1 내지 약 50 g/L 의 범위를 포함할 수 있다. 상기 원하는 세포 밀도의 값은 0.5 내지 50 g/L 의 범위를 포함할 수 있다.
상기 원하는 에탄올 생산성의 값은 1 내지 50 g/L/day 의 범위를 포함한다.
상기 발효 브로스에서의 원하는 에탄올 농도는 1 내지 20 g/L 의 범위를 포함한다.
전형적으로, 실험실 스케일의 생물반응기, 예컨대 New Brunswick Bioflow I 생물반응기에서, 1 분당 300 - 900 회전 (rpm) 의 범위의 진탕 속도는 바람직한 물질 전달율을 위한 적절한 진탕을 제공한다. 한 구현예에서, 500 - 700 rpm 의 범위의 진탕 속도가 이용된다. 한 구현예에서, 550 - 650 rpm 의 범위의 진탕 속도가 이용된다. 한 구현예에서, 약 600 rpm 의 진탕 속도가 이용된다.
한 구현예에서, 보다 큰 스케일의 생물반응기, 예컨대 약 100 내지 500 리터 크기의 생물반응기의 경우, 약 50 내지 약 500 rpm 의 범위의 진탕 속도가 진탕에 이용된다. 한 구현예에서, 약 100,000 내지 약 1,000,000 리터 크기의 상업적인 스케일의 생물반응기의 경우, 약 1 내지 약 50 rpm 의 범위의 진탕 속도가 진탕에 이용된다. 여러 구현예에서, 큰 생물반응기는 작은 생물반응기에 비해 작은 rpm 이 요구된다.
한 구현예로서, 본 개시내용은 25 내지 50 ℃ 의 범위의 생물반응기 내 온도 제어를 제공한다.
본 개시내용의 방법의 한 구현예에서, 상기 생물반응기는 1 개의 반응기를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 한 구현예에서, 상기 생물반응기는 2 개 이상의 반응기를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 한 구현예에서, 상기 생물반응기는 세포 재생 유닛을 포함한다.
한 구현예에 있어서, 가스 기질의 주입률에 대한 수소 흡수는 최적 성장을 유지하기 위해 변화한다. 추가의 구현예로서 CO 및 H2 조성은 각각 38 % 및 25 % 를 포함하고, 주입 가스에서 H2 흡수 대 총 가스 분자 주입의 원하는 표적 몰비는 11 내지 14 (예를 들어 제 1 예비선택된 범위) 를 포함하고; 이에서 CO 및 H2 조성은 각각 30 % 및 15 % 를 포함하고, 주입 가스에서 H2 흡수 대 총 가스 분자 주입의 원하는 표적 몰비는 3 내지 4.5 (예를 들어 제 2 예비선택된 범위) 를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 한 구현예에 있어서, CO 를 포함하는 가스 기질을 포함하는 상기 기체 스트림은 또한 수소를 포함한다. 한 구현예에 있어서, CO 를 포함하는 가스 기질을 포함하는 상기 기체 스트림은 합성가스를 포함한다. 한 구현예에 있어서, CO 를 포함하는 가스 기질을 포함하는 상기 기체 스트림은 제강소 오프-가스를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 CO 를 포함하는 가스 기질을 포함하는 기체 스트림은 바이오매스를 포함하는 탄소질 물질의 기화에 의해 수득된 합성가스를 포함한다.
한 구현예에서, 하나 이상의 성장 또는 시드 (seed) 발효조는 세균 세포의 접종원의 초기 공급을 제공한다. 한 구현예에서, 하나 이상의 성장 또는 시드 발효조는 본 개시내용의 방법과 관련하여 생물반응기에 세균 세포를 지속적으로 공급한다. 본 개시내용의 한 구현예에서, 상기 방법은 세포 재생을 포함한다.
영양 배지는 선택된 미생물의 성장을 허용하는 비타민 및 미네랄 중 하나 이상을 함유할 수 있는 미생물 성장 배지를 포함한다. 표 1 은 본 개시내용에 의해 고려되는 영양 배지의 구현예를 제공한다. 본 개시내용에 적합한 다른 영양 배지가 당업계에 공지되어 있다. 또한, 당업계에 개시되어 있지는 않지만 표 1 에 기재된 각종 성분들로부터 유래되는 영양 배지가 본 발명에 의해 이용될 수 있다. 본 개시내용은 영양 배지의 개선된 조성에 대해 제공한다.
[표 1]
Figure pct00001
* Na+ 농도는 오직 NaCl 로부터의 것이다. 다른 성분, 예컨대 Na2WO4·2H2O 로부터의 Na+ 는 포함하지 않는다.
** Ca+2 농도는 판토텐산, 칼슘 염 (즉, 칼슘 d-판토테네이트) 으로부터의 칼슘을 포함하지 않는다.
실시예
비교 실시예 (US 7,285,402 의 실시예 11 참조)
반응기 접종용 보존 배양물을 제조하기 위해, 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) 균주 C-01 (ATCC 수탁 번호. 55988) 의 배양물을, 염 및 비타민 중 1 g/L 효모 추출물 및 1 g/L 트립티케이스를 함유하는 풍부한 배지 중에서 CO, CO2 및 H2 상의 150 mL 세럼병에서 성장시켰다. 사용된 비타민 농도는 50.5 mg/L 칼슘 판토테네이트, 20.6 mg/L d-비오틴 및 50.6 mg/L 티아민 HCl 을 함유하는 수용액의 배지 1 L 당 0.4 mL 이다. 병을 진탕 인큐베이터 중에서 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 배양물은 육안 관찰에 의한 측정시 급속 생장기로 성장하였다. 각 접종에 대하여, 대략 90 mL 의 보존 배양물을 세럼병으로부터 1 리터의 배지로 옮기었는데, 이는 9 체적% 접종을 나타낸다. 성공적인 접종을 이하에 기재한다. 상기 개요한 절차를 성공적 접종을 수득하도록 수 차례 반복할 수 있다.
성공적 접종을 수득하기 위해, 90 mL/L 의 접종원을 0.4 mL/L 비타민 및 염을 함유하는 기본 배지의 1 리터 배치에 첨가하였다 (t=0). 진탕 속도는 240 rpm 이었고, pH 는 5.3 이었고, 온도는 38.5 ℃ 이었고, 기체 체류 시간 (연속 기체 흐름) 은 110 분이었다. 기체 투입물은 62% H2, 31% CO 및 7% C2H6 를 함유하였다. 13 시간 후 (t=13 hr), 일부 CO 전환이 확인되었으며, t=23 hr 에서 진탕 속도를 240 rpm 에서 300 rpm 으로 증가시켰다. 기체 체류 시간은 t=27 hr 에서 100 분으로 감소하였고, 기체 체류 시간의 추가적인 감소가 t=46 hr 에서 이루어졌다. 진탕 속도를 또한 t=28 hr, 59 hr, 72 hr 및 85 hr 에서 100 rpm 씩 증가시켰다.
t=110 hr 까지, 상기 시스템을 80 분의 기체 체류 시간 및 600 rpm 의 진탕 속도로 작동시켰다. 세포 농도는 0.5 g/L 이고, CO 전환은 35% 이었다. 여전히 H2 전환은 없었지만, 소량의 에탄올 및 아세테이트 (각각 약 1 g/L) 가 배치 배양 브로스에 축적되었다. 지금까지의 활동은 반응기 내 세포 성장에 역점을 둔 것이었다.
기본 배지에서와 동일한 농도를 이용한 배지 흐름을 t=120 hr 에서 0.4 ml/min 의 속도로 시작하였다. 이후, 시스템을 과잉 H2 하에 조심스럽게 유지하면서, 기체 속도, 진탕 속도 및 배지 속도의 명목상 (nominal) 증가 프로그램을 개시하였다. t=210 hr 까지, 에탄올 농도는 17 g/L 이고, 아세테이트 농도는 1 g/L 이고, 세포 농도는 1.6 g/L 이고, CO 전환은 거의 100% 이고, H2 전환은 90% 이었다. 에탄올 생산성은 11.4 g/L-일에 도달되었다.
점진적인 기체 속도 증가 프로그램을 다시 시작하였다. 비타민 첨가 속도를 0.7 mL/L 배지가 되게 하기 위하여 병행적인 비타민 증가가 이루어졌다. t=610 hr 까지, 반응기는 20 g/L 에탄올 및 약 2 g/L 아세테이트를 생성하였다. CO 전환은 거의 100% 이었고, H2 전환은 85% 이었다. 에탄올 생산성은 14 g/L 일에 도달하였다.
실시예 1 - 7 을 위한 발효 배지는 표 1 에 제시된 것들로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.
실시예 1: 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) PETC; 반응기로의 4.5 % 의 총 가스 흐름에서 수소의 흡수 퍼센트의 유지에 의한 반응기에의 박테리아의 밀도의 증가
발효 배지를 함유하는 New Brunswick bioflow I 반응기를 0.34 g/L 의 활발히 성장하는 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) PETC 균주를 이용해 시작하였다. 반응기의 진탕 속도를 실험 시작시에 500 rpm 으로 설정하였다. 이 진탕 속도를 실험 전반에 걸쳐 유지하였다. 생물반응기 내 온도를 실험 전반에 걸쳐서 약 38 내지 약 39 ℃ 범위로 유지하였다. 생물반응기 내로의 합성가스 투입물 및 생물반응기로부터의 오프-가스 및 생물반응기 중의 발효 브로스의 시료들을 일정 간격 (예를 들어 1 간격) 으로 취하였으며, 다양한 가스 성분의 소비 또는 생산, 브로스 아세트산 농도, 브로스 에탄올 농도 및 배양물의 광학 밀도에 대해 분석하였다.
총 H2 흡수 대 합성가스 주입의 몰비는 4.5 % 에서 설정되었다. 상기 몰비 (4.5 %) 에 해당하는 요구되는 합성가스 흐름은 식 (1) - (6) 을 사용하여 계산되었다. 생물반응기에는 상기 계산된 속도로 합성가스가 공급되었다.
본 실시예에서는 배양물의 안정성을 증가시키기 위해 임의의 시점에서의 최대 가스를 현재 가스 흐름값의 30 % 로 제한하였다. 또한 배양물이 임의의 시점에서 반응기로 제공되는 CO 의 70 % 를 활용하지 않는 경우 가스를 증가시키지 않았다.
세포 재생 시스템 (CRS) 를 접종 21 시간 후 반응기에 부착하였다.
세포 재생 시스템 매질 (영양분) 의 접촉 후 반응기로의 흐름이 1.1 ml/min 의 속도로 시작되었고, 세포 재생 시스템을 통해 1 ml/min 투과물이 반응기로부터 배출되었다.
배양물에서의 아세트산 및 에탄올의 제한양의 축적을 방지하고, 배양물로 충분한 양의 영양분을 공급하기 위해 반응기에 대한 수정이 이루어졌다. 세포 질량은 시간에 따라 증가되었고, 반응기에의 접종 후 46 시간 내에 3.2 g/L 의 세포 질량에 도달하였다. 이 시점에서 배양물은 6.9 g/L 의 에탄올 및 4.86 g/L 의 아세트산을 생성하였다.
본 특정 실험에서 배양물의 pH 는 실험에 걸쳐 4.78 내지 5.00 로 유지되었다.
세균이 반응기에서 활발히 성장하기 시작한 후 (반응기의 세포 밀도가 초기 세포 밀도보다 약 50% 넘게 도달했을 때) 배양 브로스의 아세트산 농도가 소정 값 아래인 경우 배양물을 (배지 중에 이미 있는 비타민 이외의) 비타민 조성물로 보충시켰다. 배양물에 비타민 칵테일을 첨가하는데 있어서 사용된 기준은 다음과 같았다: 배양 브로스 아세트산이 약 2.5 g/L 미만인 경우, 배양물 1 리터 당 약 0.34 mL 의 비타민을 첨가하고, 배양 브로스 아세트산이 약 2 g/L 미만인 경우, 배양물 1 리터 당 약 0.67 mL 의 비타민을 첨가하고, 배양 브로스 아세트산이 약 1.5 g/L 미만인 경우, 리터 당 약 1 mL 의 비타민을 첨가하였다. 이들 시험에 사용된 비타민 조성물은 다음과 같았다:
비오틴 0.08 - 1 μM
티아민 HCl 0.12 - 1.5 μM
칼슘 d-판토테네이트 0.15 - 2 μM
비오틴, 티아민 및 칼슘 판토테네이트 이외에 ATCC 비타민 보충물 (카탈로그 No. MD-VS) 을 최종 농도 1 % 가 되도록 PETC 예시물에 첨가하였다.
실시예 2: 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01: 반응기로의 3 % 의 총 가스 흐름에서 수소의 흡수 퍼센트의 유지에 의한 반응기에의 미생물의 밀도의 증가
발효 배지 약 1.5 리터 (예를 들어 약 1.45 내지 약 1.6 리터 범위) 를 함유하는 New Brunswick bioflow I 반응기를 약 0.38 g/L 의 활발히 성장하는 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01 균주를 이용해 시작하였다. 반응기의 진탕 속도를 실험 시작시에 600 rpm 으로 설정하였다. 이 진탕 속도를 실험 전반에 걸쳐 유지하였다. 생물반응기 내 온도를 실험 전반에 걸쳐서 약 36 내지 약 37.5 ℃ 범위로 유지하였다. 생물반응기 내로의 합성가스 투입물 및 생물반응기로부터의 오프-가스 및 생물반응기 중의 발효 브로스의 시료들을 일정 간격 (예를 들어 1 시간 간격) 으로 취하였으며, 다양한 가스 성분의 소비 또는 생산, 브로스 아세트산 농도, 브로스 에탄올 농도 및 배양물의 광학 밀도에 대해 분석하였다.
총 H2 흡수 대 합성가스 주입의 몰비는 약 3 % 에서 설정되었다. 상기 몰비 (3 %) 에 해당하는 요구되는 합성가스 흐름은 식 (1) - (6) 을 사용하여 계산되었다. 생물반응기에는 상기 계산된 속도로 합성가스가 공급되었다. 생물반응기에는 상기 계산된 값으로 합성가스가 공급되었다. 접종 12 시간 후, 반응기로의 발효 배지의 흐름은 0.1 ml/min 의 속도로 시작되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 250 시간). 접종 약 32 시간 후 반응기로의 발효 배지의 흐름은 0.3 ml/min 의 속도로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 75 시간). 접종 약 47 시간 후 반응기의 브로스 에탄올 농도가 9.4 g/L 에 도달하는 경우 세포 재생 시스템 ("crs" 또는 "CRS") 을 반응기에 부착시켰다. 반응기에서의 CRS 의 부착 후, 발효 배지 흐름은 0.3 내지 0.8 로 증가되었고, 0.5 ml/min 의 세포 무함유 투과물의 흐름을 CRS 를 통해 반응기로부터 배출하였다. 상기 양의 투과물을 사용하여 추출 배양물을 접종 후 56 시간까지 12 g/L 에탄올 이하로 유지하였다.
세포 질량은 시간에 따라 증가하여 생물반응기의 접종 후 약 56 시간 이내에 2.8 g/L 의 세포에 도달하였다.
실시예 3: 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01: 반응기로의 4.5 % 의 총 가스 흐름에서 수소의 흡수 퍼센트의 유지에 의한 반응기에의 미생물의 밀도의 증가
발효 배지 약 1.5 리터 (예를 들어 약 1.5 내지 약 1.675 리터 범위) 를 함유하는 New Brunswick bioflow I 반응기를 약 0.37 g/L 의 활발히 성장하는 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01 균주를 이용해 시작하였다. 반응기의 진탕 속도를 실험 시작시에 600 rpm 으로 설정하였다. 이 진탕 속도를 실험 전반에 걸쳐 유지하였다. 생물반응기 내 온도를 실험 전반에 걸쳐서 약 36 내지 약 37.5 ℃ 범위로 유지하였다. 생물반응기 내로의 합성가스 투입물 및 생물반응기로부터의 오프-가스 및 생물반응기 중의 발효 브로스의 시료들을 일정 간격 (예를 들어 1 간격) 으로 취하였으며, 다양한 가스 성분의 소비 또는 생산, 브로스 아세트산 농도, 브로스 에탄올 농도 및 배양물의 광학 밀도에 대해 분석하였다.
총 H2 흡수 대 합성가스 주입의 몰비는 4.5 % 에서 설정되었다. 상기 몰비 (4.5 %) 에 해당하는 요구되는 합성가스 흐름은 식 (1) - (6) 을 사용하여 계산되었다. 생물반응기에는 상기 계산된 속도로 합성가스가 공급되었다. 생물반응기에는 상기 계산된 값으로 합성가스가 공급되었다. 접종 13 시간 후, 반응기로의 발효 배지의 흐름은 0.1 ml/min 의 속도로 시작되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 250 시간). 접종 47.5 시간 후 반응기로의 발효 배지의 흐름은 0.23 ml/min 의 속도로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 116 시간). 접종 71.42 시간 후 반응기로의 발효 배지의 흐름은 0.315 ml/min 의 속도로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 85 시간). 본 특정 실험에서 세포 재생 시스템을 반응기에 부착시키지 않았다.
세포 질량은 시간에 따라 증가하여 생물반응기의 접종 99 시간 이내에 2.75 g/L 에 도달하였다. 이 시점에서 배양물은 11.6 g/L/day 의 에탄올을 생산하였다.
실시예 4: 클로스트리듐 오토에타노게넘 (Clostridium autoethanogenum):
발효 배지를 함유하는 New Brunswick bioflow I 반응기를 0.46 g/L 의 활발히 성장하는 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) CO-1 균주를 이용해 시작하였다. 반응기의 진탕 속도를 실험 시작시에 600 rpm 으로 설정하였다. 이 진탕 속도를 실험 전반에 걸쳐 유지하였다. 생물반응기 내 온도를 실험 전반에 걸쳐서 약 36 내지 약 37.5 ℃ 범위로 유지하였다. 생물반응기 내로의 합성가스 투입물 및 생물반응기로부터의 오프-가스 및 생물반응기 중의 발효 브로스의 시료들을 일정 간격 (예를 들어 1 간격) 으로 취하였으며, 다양한 가스 성분의 소비 또는 생산, 브로스 아세트산 농도, 브로스 에탄올 농도 및 배양물의 광학 밀도에 대해 분석하였다.
총 H2 흡수 대 합성가스 주입의 몰비는 4.5 % 에서 설정되었다. 상기 몰비 (4.5 %) 에 해당하는 요구되는 합성가스 흐름은 식 (1) - (6) 을 사용하여 계산되었다. 생물반응기에는 상기 계산된 속도로 합성가스가 공급되었다.
본 실시예에서, 배양물의 안정성을 증가시키기 위해 임의의 시점에서 배양물이 반응기로 제공되는 CO 의 80 % 를 활용하지 못하는 경우 가스를 증가시키지 않았다.
접종 8.37 시간 후, 반응기로의 배지 흐름은 0.1 ml/min 의 속도로 시작되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 233 시간). 접종 후 20.40 시간에서 반응기로의 발효 배지의 흐름은 0.21 ml/min으로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 109 시간). 접종 후 42.15 시간 후 반응기로의 발효 배지의 흐름은 0.32 ml/min으로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 75.5 시간).
접종 43.75 시간 후 반응기의 브로스 에탄올 농도가 12.5 g/L 에 도달하는 경우 세포 재생 시스템 (CRS) 를 반응기에 부착시켰다. 반응기에의 CRS 의 부착 후, 배지 흐름은 0.6 ml/min으로 증가되었고, 0.3 ml/min 의 투과물을 CRS 를 통해 반응기로부터 배출하였다 (대략적인 세포 체류 시간 : 80.5 시간). 상기 양의 투과물을 사용하여 추출 배양물을 접종 후 57 시간까지 19 g/L 에탄올 이하로 유지하였다. 반응기에서의 에탄올의 급속 축적을 제거하기 위해 이러한 변형 (CRS 의 도입) 이 시스템에 이루어졌다.
도 1 에 도시된 바와 같이 세포 질량은 시간에 따라 증가하여 생물반응기의 접종 58 시간 이내 3.7 g/L 의 세포 질량에 도달하였다. 이 시점에서 배양물은 18.4 g/L/day 의 에탄올을 생산하였다.
실시예 5: 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-O1
발효 배지 약 1.5 리터 (예를 들어 약 1.45 내지 약 1.65 리터 범위) 를 함유하는 New Brunswick bioflow I 반응기를 약 0.3 g/L 의 활발히 성장하는 클로스트리디움 륭달리이 (Clostridium ljungdahlii) C-01 균주를 이용해 시작하였다. 반응기의 진탕 속도를 실험 시작시에 600 rpm 으로 설정하였다. 이 진탕 속도를 실험 전반에 걸쳐 유지하였다. 생물반응기 내 온도를 실험 전반에 걸쳐서 약 36 내지 약 37.5 ℃ 범위로 유지하였다. 하기 시료들을 취하여 상기한 간격 (예를 들어 1 내지 4 시간 간격) 으로 분석하였다: 생물반응기 내로의 합성가스 투입물; 생물반응기로부터의 오프-가스; 생물반응기 중의 발효 브로스. 시료 분석을 제공하였다: 다양한 가스 성분의 소비, 다양한 가스 성분의 생산, 아세트산 농도, 에탄올 농도 및 발효 브로스의 광학 밀도.
따라서 비 CO 흡수 (SCU) 를 상기 기재된 식 (1) - (6) 을 사용하여 측정하였다.
초기에 합성 가스 주입의 값은 약 1.4 mmol/min/g 의 SCU 값에 해당하는 상기 식을 사용하여 계산하였고, 합성가스의 흐름은 세포 밀도가 증가하여 약 1.5 g/L 의 값에 도달할 때까지 상기 계산된 값으로 유지시켰다.
반응기의 세포 밀도가 예측하기 위한 약 1.5 g/L 설정 SCU 값에 도달되는 경우 가스를 약 1.2 mmol/min/g 으로 낮추었다. 이후 반응기의 세포 질량이 예측하기 위한 약 2.5 g/L 설정 SCU 값에 도달하는 경우 가스를 약 1.0 mmol/min/g 으로 낮추었다. 세포 질량이 시간에 따라 증가하여 반응기의 접종 후 약 79 시간 이내에 약 2.8 g/L 의 예상된 세포 질량에 도달하였다. 이 시점에서 배양물은 약 20 g/L 초과의 에탄올을 생성하였다.
접종 13.97 시간 후, 반응기로의 배지 흐름은 약 0.2 ml/min 의 속도로 시작되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 약 125 시간). 접종 28.08 시간 후 반응기로의 배지 흐름은 약 0.5 ml/min으로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 약 52 시간). 실험 과정에서 pH 는 약 4.5 로 유지되었다.
출발 과정에 걸쳐 설정 SCU 의 점차적인 감소는 낮은 SCU 로 배양물의 점차적인 변화를 촉진시켜 반응기의 생산 모드 (정상 상태) 과정에서 낮은 SCU (약 0.7 내지 약 0.9 mmol/min/g) 로 유지되었다.
상기 언급한 과정이 약 80 시간 이하에서 일어나 반응기의 세포 질량의 목표값 (약 2.8 g/L) 에 도달되었다.
실시예 6: 클로스트리듐 오토에타노게넘 (Clostridium autoethanogenum)
발효 배지 약 1.5 리터 (예를 들어 약 1.45 내지 약 1.65 리터 범위) 를 함유하는 New Brunswick bioflow I 반응기를 약 0.47 g/L 의 활발히 성장하는 클로스트리듐 오토에타노게넘 (Clostridium autoethanogenum) 을 이용해 시작하였다. 반응기의 진탕 속도를 실험 시작시에 약 600 rpm 으로 설정하였다. 이 진탕 속도를 실험 전반에 걸쳐 유지하였다. 생물반응기 내 온도를 실험 전반에 걸쳐서 약 36 내지 약 37.5 ℃ 범위로 유지하였다. 하기 시료들을 취하여 상기한 간격 (예를 들어 1 내지 4 시간 간격) 으로 분석하였다: 생물반응기 내로의 합성가스 투입물; 생물반응기로부터의 오프-가스; 생물반응기 중의 발효 브로스. 시료 분석을 제공하였다: 다양한 가스 성분의 소비, 다양한 가스 성분의 생산, 아세트산 농도, 에탄올 농도 및 발효 브로스의 광학 밀도.
따라서 비 CO 흡수 (SCU) 를 상기 기재된 식 (1) - (6) 을 사용하여 측정하였다.
초기에 합성 가스 주입의 값은 약 0.4 mmol/min/g 의 SCU 값에 해당하는 상기 식을 사용하여 계산하였고, 합성가스의 흐름은 세포 밀도가 증가할 때까지 상기 계산된 값으로 유지시켰다. 약 0.4 mmol/min/g 의 표적 SCU 값에 해당하는 가스 흐름은 약 19 시간 동안 유지되었다. 접종 후 19 내지 21 시간의 기간 동안 표적 SCU 값은 약 0.5 mmol/min/g 이었다. 표적 SCU 값은 접종 약 21 시간 후 약 0.6 으로 설정되었다. 세포 밀도가 시간에 따라 증가하여 반응기의 접종 후 약 79 시간 이내에 약 3 g/L 에 도달하였다. 이 시점에서 배양물은 약 15 g/L 초과의 에탄올을 생성하였다. 접종 약 26 시간 후, 반응기로의 배지 흐름은 약 0.1 ml/min에서 시작되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 약 240 시간). 접종 약 50 시간 후 반응기로의 배지 흐름은 약 0.2 ml/min으로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 약 119 시간). 접종 71 시간 후 반응기로의 배지 흐름은 약 0.5 ml/min으로 증가되었다 (대략적인 세포 체류 시간 : 약 50 시간). 실험 과정에서 pH 는 약 4.5 로 유지되었다.
실시예 7: 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum) (ATCC 33266): 반응기로의 4.5 % 의 총 가스 흐름에서 수소의 흡수 퍼센트의 유지에 의한 반응기에의 박테리아의 밀도의 증가
본 실험에서 H2 흡수 스타트-업 방법을 비-클로스트리듐성 (non-clostridial) 아세토젠을 이용해 시험하였다.
본 실험을 앞서 언급한 발효 배지 중에 0.78 g/L 의 활발히 성장하는 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum) 을 함유하는 New Brunswick bioflow I 반응기에서 시작하였다. 실험 시작시에 반응기의 진탕 속도를 700 rpm 으로 설정하였다. 이 진탕 속도를 실험 전반에 걸쳐 유지하였다. 생물반응기 내 온도를 실험 전반에 걸쳐서 약 38 내지 약 38.6 ℃ 사이에서 유지하였다. 생물반응기 내로의 합성가스 투입물 및 생물반응기로부터의 오프-가스 및 생물반응기 중의 발효 브로스의 시료들을 일정 간격 (예를 들어 1 간격) 으로 취하였으며, 다양한 가스 성분의 소비 또는 생산, 브로스 아세트산 농도, 브로스 에탄올 농도 및 배양물의 광학 밀도에 대해 분석하였다.
총 H2 흡수 대 합성가스 주입의 표적 몰비를 4.5 % 로 설정하였다. 상기 몰비 (4.5 %) 에 해당하는 요구되는 합성가스 흐름을 식 (1) - (6) 을 사용하여 계산하였다. 생물반응기를 상기 계산된 속도에서 합성가스를 사용하여 공급하였다.
본 실시예에서 배양물의 안정성을 증가시키기 위해 임의의 시점에서의 최대 가스를 현재 가스 흐름값의 30 % 로 제한하였다. 또한 배양물이 임의의 시점에서 반응기로 제공되는 CO 의 80 % 를 활용하지 않는 경우 가스를 증가시키지 않았다.
반응기에의 성장 배지 (영양분) 흐름은 1 ml/min 의 속도로 출발되었고, 세포 재생 시스템 (CRS) 를 통해 반응기에 부착되었고, 1 ml/min 투과물이 반응기로부터 배출되었다.
반응기의 세포 밀도는 시간에 따라 증가하고, 반응기의 접종 후 34 시간 이내에 5.12 g/L 의 세포 질량에 도달하였다. 이 시점에서 배양물은 10.81 g/L 의 에탄올 및 3.96 g/L 의 아세트산을 생산하였다. 본 특정 실험에서 배양물의 pH 는 실험에 걸쳐 4.67 내지 5.00 을 유지하였다.
본 개시내용의 수많은 수정 및 변경이 특정 구현예, 실시예, 청구의 범위, 출원서 등에 포함된 본 개시내용의 범위를 벗어나는 일 없이 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 모든 공개된 문헌들은 본원에 참조로 포함된다.

Claims (23)

  1. 수소 (H2) 및 일산화탄소 (CO) 중 하나 이상을 포함하는 가스 기질을 생물반응기 내 수성 배지 내에 발효시키는 것을 포함하는, 가스 기질로부터 하나 이상의 알코올을 생성하는 방법으로서; 상기 방법이 수소 흡수를 조절함으로써 세포 밀도를 증가시키는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 수소 흡수를 조절하는 것이 수소의 주입률을 측정하는 것; 수소의 산출률을 측정하는 것; 및 가스 기질 및 수소 중 하나 이상의 주입률을 조절하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 수소 흡수를 조절하는 것이 상기 수소 흡수 대 가스 기질의 주입률의 몰비가 제 1 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 수소 흡수를 조절하는 것이 상기 수소 흡수 대 수소의 주입률의 몰비가 제 2 예비선택된 범위를 포함하도록 상기 가스 기질을 공급하는 것을 포함하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 제 1 예비선택된 범위가 약 0.001 내지 약 1.0 의 범위를 포함하는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 제 1 예비선택된 범위가 약 0.005 내지 약 0.5 의 범위를 포함하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 제 2 예비선택된 범위가 약 0.01 내지 약 0.1 의 범위를 포함하는 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 제 2 예비선택된 범위가 약 0.001 내지 약 1.0 의 범위를 포함하는 방법.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 제 2 예비선택된 범위가 약 0.005 내지 약 0.5 의 범위를 포함하는 방법.
  10. 제 4 항에 있어서, 상기 제 2 예비선택된 범위가 약 0.01 내지 약 0.1 의 범위를 포함하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 생물반응기로 수성 배지의 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 흐름을 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 생물반응기로 수성 배지의 연속 흐름을 가하는 것; 생물반응기로부터의 발효 브로스의 연속 흐름을 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 비 CO 흡수의 변화율의 제어에 의해 세포 밀도를 증가시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 비 CO 흡수의 변화율의 제어가 CO 의 주입률을 측정하는 것; CO 의 산출률을 측정하는 것; 세포 질량을 측정하는 것; 및 CO 의 주입률을 조절하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 비 CO 흡수의 변화율이 비 CO 흡수의 예비결정된 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계가 약 0.001 내지 약 10.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계가 약 0.01 내지 약 5.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하는 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 비 CO 흡수의 예비결정된 단계가 약 0.1 내지 약 1.0 mmol/min/gram 건조 세포의 범위를 포함하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 수성 배지가 하기를 포함하는 미생물 중 하나 이상을 포함하는 방법: 생물학적으로 순수한 미생물, 자연 발생 미생물, 비-자연 발생 미생물, 유전자 변형에 의해 제조된 비-자연 발생 미생물, 자연 발생 미생물의 돌연변이, 비-자연 발생 미생물의 돌연변이, 재조합 미생물, 조작된 미생물, 인공적으로 합성된 미생물.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 생물반응기가 하나 이상의 반응기를 포함하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 생물반응기가 세포 재생 유닛을 포함하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 CO-함유 기질이 수소를 포함하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 상기 생물반응기에 영양 배지를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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