KR20140030419A - 실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도 - Google Patents

실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상온, 상압, 중성 부근의 약염기 조건의 수용액 하에서 실리카 전구체로부터 실리카를 중합할 수 있는 변형 녹색형광단백질을 제공한다. 또한, 이러한 변형 녹색형광단백질은 형광 특성과 자기조립 구조체를 형성할 수 있는 특성으로 인해 실리카 기반의 단백질 고정화, 바이오센서, 약물전달체 등에 사용할 수 있다.

Description

실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도{Modified green fluorescent protein capable of silica deposition and use thereof}
본 발명은 상온, 상압, 중성 부근의 약염기 조건의 수용액 하에서 실리카 전구체 화합물로부터 실리카를 중합할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
실리카는 특정 화학종들과 공유결합이 가능하기 때문에 새로운 하이브리드 소재 (유기-무기 복합체) 합성에 중요하고, 또한 생체 적합한 소재로서 각 개별 소재의 단점을 보완할 수 있는 우수한 특성을 갖고 있다. 현재 실리카의 공업적 생산 공정은 고온, 강산 또는 강염기 조건이 요구되고 환경적으로 유해한 부산물 생성의 문제점이 있다.
그러나 해양 생명체인 스펀지와 규조류의 추출물 또는 유전학적 정보를 바탕으로 실리카를 생합성 하는 효소 및 펩타이드가 발견됨으로써 이들에 의해 생산된 환경 친화적 바이오실리카 및 이의 다양한 용도로의 응용성으로 인해 전 세계적으로 해양 유래 바이오 실리카 복합 소재 개발이 이슈화되고 있다. 바이오실리카 소재는, 다양한 용도에 적합한 제형화가 가능하고, 에너지효율성, 기계적·화학적 물성, 생체적합성, 대량생산성이 뛰어날 것으로 기대되므로 바이오실리카 소재 확보를 위한 원천 기술의 보유는 매우 중요하다.
현재 스펀지, 규조류의 실리카 합성 메커니즘이 밝혀지면서 이들의 메커니즘을 응용한 생물학적 실리카 합성법들이 보고되고 있다. 실리카테인의 히스티딘과 세린 잔기가 실리카 합성 전구체의 가수분해와 중합에 중요한 역할을 하며, 실라핀의 경우에도 라이신과 세린 잔기가 반복적으로 존재하고 긴 사슬의 폴리아민들이 실리카 형성에 관여하는 것이 밝혀지면서 -SH, -OH 같은 친핵성 잔기, 수소결합을 이룰 수 있는 아민기들이 포함된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, 아민류, 폴리아민기가 많은 스퍼민, 인공적으로 합성된 펩타이드를 이용한 실리카 합성법이 보고되었다. 또한 트립신을 포함해 다양한 가수분해효소 (hydrolase)들의 실리카 합성 반응이 보고되었다.
녹색형광단백질(Green fluorescent protein; GFP)은 238개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서 1962년 일본의 시모무라 오사무에 의해 해파리의 형광물질로부터 발견되었고, 1994년 대장균에서 클로닝이 되어 대량 생산이 가능하게 되었다. 1996년 GFP의 3차 구조가 해석되어 발색단 형성과 주변 아미노산 잔기와의 상호작용을 이해함으로써 이들 잔기들을 변형시켜 형광세기를 증가시키거나 다양한 형광색을 나타내도록 다양한 변종 GFP를 생산하게 되었다. GFP 스스로 형광을 나타내는 성질 때문에 분자·세포 생물학 연구에 있어서 형광세기에 따른 유전자 발현상태를 조사하는 데 이용되기도 하며, 다른 단백질과 결합시켜 생세포 내에서의 이동을 조사하는 데 사용하기도 한다. 또한 이온들, pH 변화에 따른 형광변화를 이용하여 바이오센서로도 이용하고 있다.
1. Cha JN, Stucky GD, Morse DE, Deming TJ (2000) Biomimetic synthesis of ordered silica structures mediated by block copolypeptides. Nature 403:289-292. 2. Corma A, D1'az-Cabanas MJ, Moliner M, Rodr1'guez G (2006) Synthesis of micro- and mesoporous molecular sieves at room temperature and neutral pH catalyzed by functional analogues of silicatein. Chem Commun 27:3137-3139. 3. Roth KM, Zhou Y, Yang W, Morse DE (2004) Bifunctional small molecules are biomimetic catalysts for silica synthesis at neutral pH. J Am Chem Soc 127: 325-330. 4. Shaner N, Steinbach P, Tsien R (2005). A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods 2 (12):905-909. 5. Komorowski M, Finkenstadt B, Rand D (2010). Using a Single Fluorescent Reporter Gene to Infer Half-Life of Extrinsic Noise and Other Parameters of Gene Expression. Biophys J 98 (12):2759-2769. 6. Sun L, Shen X, Liu Y, Zhang G, Wei J, Zhang H, Zhang E, Ma F. (2010). The location of endogenous wild-type p53 protein in 293 T and HEK293 cells expressing low-risk HPV-6E6 fusion protein with GFP. Acta Biochim Biophys Sin. 42(3):230-235.
본 발명의 목적은 실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 (mGFP) 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질을 포함하는 실리카 합성용 조성물을 제공한다.
상기 실리카 합성용 조성물은 추가로, 실리카 전구체, 효소 또는 결합 펩타이드, 인지질, 하이드록시아파타이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 실리카 합성방법을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체를 제공한다.
상기 실리카 복합체는 추가로, 조직 특이적 결합성분, 약제학적 활성성분, 효소 또는 결합 펩타이드, 인지질, 하이드록시아파타이트 등이 결합되어 있을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체가 전기방사된 섬유를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체가 전기방사된 섬유를 포함하는 필터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 골대체제를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 포토닉스 소자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 바이오분자 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 새로운 바이오실리카 소재로서 변형 녹색형광단백질 (mGFP)을 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 GFP의 자체 발광능력을 이용하여 유용효소와 융합하여 효소의 고정화 및 고정화 정도와 안정성 등을 가시적으로 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면에 실리카가 코팅된 실리카 복합체를 약물전달체, 조영제 등에 사용할 수 있어 생세포 내에서의 추적이 가능하고 방출속도계산 등이 용이하다.
도 1은 본 발명의 변형 녹색형광단백질 (mGFP)의 DNA 서열과 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 변형 녹색형광단백질 (mGFP)와 GFP의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 3은 변형 녹색형광단백질 (mGFP)의 SDS-PAGE 전기영동(A), 웨스턴 블럿 (B) 및 정제 그림 (C)이다.
도 4는 변형 녹색형광단백질 (mGFP), GFP의 실리카 형성반응 후 (A), 원심분리하여 실리카 침전물 회수 (B)와 상청액 (C)을 비교한 그림이다.
도 5는 침전된 실리카 합성물의 양을 암모늄 몰리브데이트법으로 정량화 한 그래프 (A)와 상청액에 실리카에 결합되지 않고 남은 단백질 양을 비교한 그래프 (B)이다.
도 6은 변형 녹색형광단백질 (mGFP)에 의해 형성된 실리카 침전물의 형광현미경 사진도 (A) 및 주사전자현미경사진도 (B)를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 실리카 합성 시 녹색형광단백질의 열 안정성을 증가시키기 위해 도 2에 기재된 녹색형광단백질의 아미노산 서열 중 31번째 세린, 81번째 글루타민, 195번째 류신 잔기를 표면에 이온결합력을 높이는 아르기닌 잔기로, 151번째 아스파라진을 라이신 잔기로 치환시키고, 65번째와 100번째 페닐알라닌을 각각 시스테인과 세린 등으로 치환시켜 변형 녹색형광단백질 (mGFP)을 제조하고, 변형 전과 후를 비교하여 상온, 상압, 중성 부근 pH에서 실리카 전구체로부터 실리카를 침전시키는 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질을 포함하는 실리카 합성용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 변형 녹색형광단백질은 서열번호 2에 기재된 녹색형광단백질의 2, 31, 40, 43, 47, 65, 81, 100, 106, 107, 120, 125, 146, 150, 154, 164, 172, 195, 207-210, 222번째 아미노산 잔기들이 치환 또는 삭제된 것으로, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 실리카 합성 활성을 나타내는 특징이 있다.
상기 변형 녹색형광단백질은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 변형 녹색형광단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터, pETDuet, pQE80 등에 변형 녹색형광단백질 (mGFP)을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pETDuet, pQE80 등을 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 변형 녹색형광단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.
숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.
상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재조합 벡터 pETDuet-mGFP를 대장균 균주 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.
본 발명은 또한 상기 변형 녹색형광단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체의 배양물을 분리 정제하는 단계를 포함하는 변형 녹색형광단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 변형 녹색형광단백질은 통상의 배양방법에 따라 형질전환체를 배양하여 정제하는 것이 바람직하다. 상기 변형 녹색형광단백질은 재조합 벡터에 도입되는 인서트 즉, 코딩 유전자의 염기서열에 따라 사이토카인 생산능에 영향을 주지 않을 정도로 아미노산 서열의 일부에 얼마든지 변형이 있을 수 있다. 상기 변형은 결실, 삽입 또는 치환에 의한 변형을 의미한다.
본 발명은 또한 상기 변형 녹색형광단백질에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체를 제공한다.
상기 다클론성 항체의 제조방법은 특별히 제한하지는 않으나, 다음의 방법에 따라 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 변형 녹색형광단백질을 SPF (specific pathogen free) 동물에 1 내지 수회 주사하여 면역화시킨다. 최종 면역 후 일정 시간이 지난 뒤에 전혈하여 혈청만 취해 본 발명의 단백질에 대한 다클론성 항체를 얻는다.
상기 면역화 동물은 통상 면역화에 사용되는 동물이면 특별히 제한하지 않으나, 랫트인 것이 바람직하다. 상기 면역화를 위한 주사 횟수, 기간 및 투여방법은 당업자 수준에서 변형 또는 변경가능하므로 특별히 제한하지 않는다.
또한, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 상온 및 상압의 조건에서 약염기의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있다.
상기 실리카 전구체는 테트라에틸 오르토실리케이트, 테트라메틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드, 또는 테트라에틸 게르마늄 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 실리카 상에 효소 또는 결합 펩타이드를 고정하는데 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실리카 합성용 조성물은 효소 또는 결합 펩타이드를 더 포함할 수 있다.
이를 위해, 효소 또는 결합 펩타이드의 유전자에 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질 유전자를 결합시켜 융합 단백질을 제조할 수 있다.
상기 효소의 종류는 적용 용도에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 효소 또는 결합 펩타이드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 동시에 결합하거나, 리간드를 통해 고유의 성질에 영향을 미치지 않는 범위에서 그의 위치에 상관없이 결합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질은 고유의 성질에 영향을 미치지 않는 범위에서 그의 위치에 상관없이 결합되어 형성된 모든 융합 단백질을 의미한다.
또한, 상기 융합 단백질은 발현 및 정제 효율을 높이기 위해 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 동시에 His-Tag을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
상기 효소 또는 결합 펩타이드가 고정된 실리카는 상기 융합 단백질과 실리카 전구체를 반응시켜 실리카에 의해 상기 융합 단백질이 코팅되도록 하거나, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 효소 또는 결합 펩타이드를 일정 비율로 혼합하여 반응시켜 원심분리하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질과 실리카 전구체를 반응시켜 실리카를 합성할 때 침전물로 뭉치지 않고 단일막으로 도포될 수 있도록 인지질을 함께 사용할 수 있다.
상기 실리카 단일막은 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 얻을 수 있다.
또한, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체에 인지질을 적당한 비율로 혼합하여 유무기 복합체를 형성한 후 상기 유무기 복합체에 열이나 유기용매를 처리하여 유기물을 제거함으로써 다공성 실리카 구조체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 실리카 합성용 조성물은 유기물 외에 하이드록시아파타이트와 같은 무기물을 이용하여 실리카 합성에 사용함으로써 실리카 복합체를 제조할 수 있다.
상기 실리카 복합체는 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 하이드록시아파타이트를 반응시켜 얻을 수 있다.
상기 실리카 복합체는 골대체 소재 및 치아 대체 소재로 활용될 수 있으며 골세포분화 배지의 세포배양 코팅제, 3차원 스캐폴더에 활용될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 실리카 합성방법에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 상온 및 상압의 조건에서 약염기 즉, pH 6 에서 8의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있다.
본 발명의 실리카 합성방법을 보다 구체적으로 설명하면, 25mM Tris-HCl 용액(pH 6 내지 8)에 녹아 있는 실리카 전구체 및 본 발명의 변형 녹색형광단백질을 1 % 내지 10% 의 중량비로 혼합하고, 상온, 상압의 조건에서 반응시킨 후 원심분리하여 실리카를 침전시킨다.
상술한 바와 같이, 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질을 이용하여 상온, 상압의 조건에서 약염기의 수용액 하에서 다기능성 실리카를 합성할 수 있어 환경적으로 유해한 부산물의 생성에 따른 종래기술의 문제점을 해소할 수 있다.
또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 효소 또는 결합 펩타이드를 반응시키거나, 변형 녹색형광단백질과 효소 또는 결합 펩타이드의 융합 단백질과 실리카 전구체의 반응을 통해 효소 또는 결합 펩타이드가 고정된 실리카를 합성할 수 있다.
이 경우, 실리카에 의해 상기 융합 단백질이 코팅되도록 하거나, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 효소 또는 결합 펩타이드를 일정 비율로 혼합하여 반응시켜 원심분리하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 실리카를 합성할 때 침전물로 뭉치지 않고 단일막으로 도포될 수 있도록 실리카 단일막 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 상기 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 유무기 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 유무기 복합체에 열 또는 유기용매 처리하여 유기물을 제거하는 단계를 거쳐 다공성 실리카를 합성할 수 있다.
또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 유기물 외에 하이드록시아파타이트와 같은 무기물을 이용하여 실리카 합성에 사용함으로써 실리카 복합체를 제조할 수 있다.
상기 실리카 복합체는 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 하이드록시아파타이트를 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 변형 녹색형광단백질은 자기조립이 가능하여 실리카 합성 반응에 의해 자기 캡슐화 (autoencapsulation) 반응이 나타나 구형의 자기조립 구조체 형태를 띠며, 합성된 실리카는 상기 자기조립 구조체의 표면을 코팅하여 실리카 복합체를 형성할 수 있다.
상기 실리카 복합체는 복합 쉘 내에 빈 공동이 형성되는 캡슐형과 변형 녹색형광단백질이 코어부를 형성하고 실리카가 쉘부를 형성하는 코어-쉘 구조 둘 다를 가질 수 있다.
캡슐형을 위해서는 코어를 형성할 수 있는 구형단백질 예를 들어 12nm 정도의 구를 형성할 수 있는 페리틴 단백질과 융합하거나 코어-쉘 고분자 나노구형체와 융합하여 변형 녹색형광단백질에 의해 구형의 실리카 구조체를 형성 후 소결을 통해 내부를 태우면 캡슐형을 얻을 수 있다.
리포좀을 주형으로 할 경우 속이 빈 캡슐형 실리카를 얻을 수 있다. 또한 변형 녹색형광단백질이 코어-쉘 구조를 이룰 수 있으므로 이를 코어로 실리카가 쉘부를 형성하는 코어-쉘 구조를 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시켜 자기 캡슐화 (autoencapsulation)를 통해 상기 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 실리카 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 실리카 복합체는 상온 및 상압의 조건에서 pH 6 내지 8의 수용액 하에서 상기 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시켜 합성할 수 있다.
상기 실리카 전구체의 종류는 전술한 바와 같다.
상기 실리카 복합체에 있어서, 변형 녹색형광단백질의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에는 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결될 수 있는 조직 특이적 성분, 약제학적 활성 성분, 효소 또는 결합 펩타이드, 인지질, 또는 하이드록시아파타이트 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조직 특이적 결합성분은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분, 또는 종양 마커 등과 특이적으로 결합할 수 있는 물질일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 약제학적 활성성분은 siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물, 또는 신경계 약물 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 실리카 복합체에 있어서, 효소 또는 결합 펩타이드가 실리카 복합체에 고정되어 있는 경우, 형광단백질의 형광성에 의해 특정 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균 등을 검출할 수 있는 바이오센서로 사용할 수 있다.
상기 효소 또는 결합 펩타이드의 종류는 상술한 바와 같다.
상기 실리카 복합체에 인지질이 포함될 경우, 실리카 유무기 복합체를 형성하거나, 유기물 제거 과정을 통한 다공성 실리카 구조체가 형성될 수 있다.
상기 실리카 복합체에 하이드록시아파타이트가 포함될 경우, 무기물과의 실리카 기반 복합체가 형성될 수 있다.
따라서, 다양한 기능성 성분들이 결합된 본 발명의 실리카 복합체는 약물전달체, 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균 검출용 바이오센서, 골대체재, 세포배양 코팅제, 3차원 스캐폴드, 조영제, 진단 프로브 등에 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.
본 발명의 약물전달체는 코어-쉘 구조를 하고 있어 상술한 바와 같은 약제학적 활성성분을 운반하는데 특히 적합하다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약물전달체는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 약물전달체는 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약물전달체의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 약물전달체의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 복합체는 녹색형광단백질의 형광 특성으로 인해 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.
본 발명의 조영제 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 형광 실리카 복합체가 발산하는 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다.
상기 형광 실리카 복합체에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다.
자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 복합체는 녹색형광단백질에 의한 형광성을 가짐과 동시에 조직 특이적 결합성분이 연결되어 있어 표적지향이 가능하여 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 복합체는 약제학적 활성성분과 물리 화학적으로 결합하여 실리카 복합체의 형광성을 동시에 포함하고 있어 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 생체 분자의 분리, 진단 또는 치료 등의 나노 프로브 및 약물 또는 유전자 전달체(delivery vehicle) 등에 이용할 수 있다.
상기 실리카 복합체를 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서(magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 실리카 복합체는 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 변형 녹색형광단백질의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다.
또한, 본 발명의 실리카 복합체는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.　
보다 구체적으로 설명하면, 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 실리카 복합체에 결합시켜 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다.　당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다.
또한 상기 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다.
종양 마커가 "리간드"인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입할 수 있는데 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입될 수 있는데 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체가 적합할 것이다.
종양 마커가 "항원"인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입할 수 있는데 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원(prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 등이 있다. 이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물(예, 마우스, 랫트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다.　 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용 시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.
한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입할 수 있다.
또한, 핵산은 5' 및 3' 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 실리카 복합체와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al . Nucl . Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al . Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브에 관한 것이다.
상기 진단 프로브는 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브, 또는 방사선 동위원소 등을 사용할 수 있다.
상기 다중 진단 프로브는 예를 들면, 형광 실리카 복합체에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.
상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn 화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체가 전기방사된 섬유 또는 필터에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 복합체는 전기방사법을 이용하여 섬유상 바이오 실리카와 같은 구조체를 형성할 경우, 다양한 필터 및 기능성 섬유 제조에 사용될 수 있다.
또는, 유전공학적 방법으로 실리카 복합체에 기능성 단백질을 융합하여 전기방사할 경우 기능성이 부여된 섬유 제조가 가능하다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 골대체제, 치아대체제, 골세포분화배지의 세포배양코팅제 또는 3차원 스캐폴드 소재로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 복합체는 하이드록시아파타이트를 포함할 경우, 실리카 기반 복합체 형성을 통해 골대체제, 치아대체제, 골세포분화배지의 세포배양코팅제, 3차원 스캐폴드 등에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 포토닉스 소자에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 복합체는 반도체 기판 표면에 흡착되어 나노 스케일의 바이오 실리카를 형성할 수 있어 포토닉스 소자에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 바이오분자 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명의 실리카 복합체에 효소 또는 결합 펩타이드가 고정되는 것이 가능하여 핵산, 단백질, 다당류, 또는 병원균 등의 바이오분자 검출을 위한 바이오센서로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 변형 녹색형광단백질의 제조
도 1에 도시한 DNA 서열로 pQE80 벡터를 이용하여 BamHI 사이트와 HindIII 사이트에 삽입하였다. pETDuet 벡터를 이용할 경우에는 BamHI과 XhoI 사이트에 삽입하였다. pQE80 벡터를 이용할 경우 발현 균주는 Escherichia coli (E. coli) XL1-Blu를, pETDuet 벡터의 경우는 E. coli BL21 (DE3)를 사용하였다. GFP는 pET30b+ 벡터에 삽입되어 있으며 BL21(DE3)에서 발현시켜 정제하였다 (미도시됨).
GFP와 mGFP의 서열을 비교하였을 때 도 2의 GFP의 아미노산 서열 중 31번째 세린, 81번째 글루타민, 195번째 류신 잔기가 표면에 이온결합력을 높이는 아르기닌 잔기로, 151번째 아스파라진이 라이신 잔기로 치환되고, 65번째 및 100번째 페닐알라닌은 각각 시스테인과 세린으로 치환되었다. 그밖에 125번째 글루탐산이 라이신으로 반대로 210번째 라이신이 글루탐산으로 치환되었다. 222번째 류신이 히스티딘으로 치환되었고 벡터차이로 인해 2번째 아미노산인 글루타민은 삭제되었다.
재조합 mGFP의 생산은 mGFP 유전자를 함유한 pQE80 벡터로 형질전환된 XL1-Blue 콜로니 한 개를 50 mg/L의 암피실린이 들어 있는 LB 액체 배지 3 mL에 접종하여 37 ℃에서 배양시킨 다음, 대수기 증식기 상태의 균 배양액 0.1 mL를 50 mL의 LB (1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl) 배지에 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 4시간 배양시킨 후 최종 농도가 1mM 이 되도록 IPTG를 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다.
상기 IPTG를 첨가한 다음 37 ℃에서 3시간 동안 추가 배양시킨 다음 4 ℃, 4000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 균체를 수거한 후 완충용액(0.3M NaCl, 1mM PMSF 포함된 20mM 인산 완충용액(pH 8.0))으로 균체를 현탁한 후 라이소자임 0.5 mg/mL로 처리하여 실온에서 30분간 효소 반응시킨 후 냉동과 해동 (-70 ℃/37 ℃)을 각각 3차례씩 반복하였다.
얻어진 균체를 40W 하에서 10초씩 3회(1회마다 10초간 얼음에서 휴지) 반복으로 초음파 처리하여 균체를 파쇄하였고, 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 수거하였다. His-tag이 달린 mGFP는 최종 0.3M NaCl이 함유된 50mM 인산 완충용액(pH 8)으로 평형화된 cobalt affinity column 크로마토그래피(Clone tech사의 talone resin 사용)를 수행하여 N-말단 부위에 6개의 히스티딘 잔기가 연결된 재조합 mGFP 단백질을 100mM 이미다졸로 용출시켰다. 균체를 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상청액을 이용하여 각 mGFP의 발현 양과 분자량 확인을 위해 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 실시하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 예상 분자량은 약 27 kDa이며 전기영동 결과로도 이를 확인할 수 있었다. mGFP는 가용화 상태로 고 발현되었다. 항-His tag 항체를 이용하여 His-tag 단백질인 mGFP를 다시 확인하고 SDS-PAGE 상에 나타나는 고발현 밴드와 일치함을 확인하였다. Coblat affinity column을 이용하여 정제된 mGFP 용출액은 총 단백질 양의 약 23%에 해당하였으며 Amicon Ultra-0.5mL filter를 이용하여 용출 시 사용한 이미다졸을 제거하기 위해 인산완충용액으로 계속해서 교환하며 5번 이상 농축과정을 반복하였다. GFP도 동일한 방법으로 준비하였다.
이미다졸이 제거된 정제된 GFP와 mGFP의 실리카 합성 활성을 비교하였다. 촉매 단백질이 들어있지 않은 대조구로서 25mM Tris-HCl(pH6.8) 완충 용액과 1M의 TEOS (tetraethoxysilane)만 들어있는 조건 (none), mGFP 와 GFP를 이용하여 같은 조건으로 실리카 합성반응을 실시하였다. 25mM Tris-HCl (pH6.8) 반응 용액에 단백질 농도는 100 ㎍이 되도록 맞춘 후 최종 1M 농도의 TEOS를 넣고 상온에서 각 성분이 잘 섞이도록 교반하면서 10시간 이상 반응시켰다.
반응 결과 단백질이 없는 대조구와 GFP 대조구에서는 약간 흐릿하나 여전히 투명한 액체 상태를 나타낸 반면 mGFP 조건에서는 탁하고 젤 상태를 나타내었다 (도 4). 14000×g 에서 1분간 원심분리 후 실리카 합성물을 회수 하였다. 알코올로 2번, 증류수로 2번 침전물을 수세한 후 60 ℃ 드라이오븐에서 침전물을 건조시켰다. 건조된 실리카 침전물은 정량 분석을 위해 1M NaOH 용액에 넣어 95 ℃에서 30분간 반응시켜 분해시킨 후 몰리브데이트와 실리카가 반응하여 노란색의 발색 반응물을 형성하는 원리를 이용한 발색반응을 유도하였다. 이 반응에 사용된 용액들은 1M의 염산용액, 0.1N 황산용액에 녹인 2% 암모늄몰리브데이트 (SolA), 5% 옥살산 용액 (SolB), 10% 아세톤에 녹아있는 200mM 아스코브르산 용액과 0.6%의 SDS (sodium dodecyl sulfate) 용액을 1:1로 섞은 SolC 용액이며 각 용액의 기능은 첫째, HCl은 NaOH로 가수분해된 실리카를 중화하기 위해 첨가하고 둘째로 실리카를 발색시킬 몰리브테이트 용액인 SolA를 첨가하여 5분간 반응시킨 후 인산기와 몰리브데이트와의 결합을 막기 위해 옥살산 용액인 SolB를 넣어주었다. 마지막으로 SolC를 첨가하면 아스코브르산이 실리카와 몰리브데이트의 복합체를 환원시켜 노란색에서 푸른 색으로 변화시켜 색의 세기를 더 증폭 시켜주는 역할을 한다. 분석은 1M NaOH에 용해된 실리카 용액 50 ㎕, 1M HCl 50 ㎕, SolA 50 ㎕, SolB 50 ㎕ 그리고 SolC 50 ㎕ 을 차례로 넣어 주어 96-웰 플레이트를 이용하여 microplate reader 기에서 흡광도를 측정하였다. 표준 용액으로는 100 mg/mL Sodium metasilicate nonahydrate (Na2O3Si·9H2O)을 이용하였다. 실리카 농도와 발색 세기가 비례 관계인 것을 이용하여 700 nm에서의 흡광도를 읽어 합성된 실리카의 농도를 계산하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, mGFP에서는 mGFP의 실리카 합성 반응에 의한 자기 캡슐화 (autoencapsulation) 반응이 나타났다. 상청액에서는 초기 첨가했던 단백질양의 20% 미만의 단백질만 검출되었는데 이는 80% 이상의 mGFP가 실리카 합성에 참여하고 합성된 실리카에 고정화됨을 나타내었다.
반면, GFP는 완충용액 대조구에 비하면 약하지만 침전물이 존재하였으나 침전물은 단백질은 대부분 상청액에 존재하였고 이들은 실리카 형성반응과는 거의 무관한 것으로 사료되었다.
mGFP에 의한 실리카 합성체의 형광현미경 사진을 통해 mGFP가 TEOS로부터 실리카를 합성하며 자기 캡슐화 (autoencapsulation) 됨을 확인할 수 있으며 전자현미경 사진을 통해서도 구형의 실리카 구조체를 만들고 있음을 확인할 수 있었다 (도 6).
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Modified green fluorescent protein capable of silica deposition and use thereof <130> P120784 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified green fluorescent protein <400> 1 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Ile Thr Leu Lys Leu Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Cys 50 55 60 Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Phe Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Ile Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Arg Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Ile Leu 195 200 205 Glu Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu His Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Green fluorescent protein <400> 2 Met Gln Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

Claims (29)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질을 포함하는 실리카 합성용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    실리카 전구체를 더 포함하는 실리카 합성용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    실리카 전구체는 테트라에틸 오르토실리케이트, 테트라메틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 실리카 합성용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    효소 또는 결합 펩타이드를 더 포함하고, 상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 실리카 합성용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    인지질을 더 포함하는 실리카 합성용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    하이드록시아파타이트를 더 포함하는 실리카 합성용 조성물.
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 실리카 합성방법.
  8. 제7항에 있어서,
    반응은 상온 및 상압의 조건에서 pH 6 에서 8의 수용액 하에서 실시하는 실리카 합성방법.
  9. 제7항에 있어서,
    반응은 효소 또는 결합 펩타이드를 더 포함하고, 상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 실리카의 합성방법.
  10. 제7항에 있어서,
    반응은 인지질을 더 포함하는 실리카의 합성방법.
  11. 제7항 또는 제10항에 있어서,
    반응은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 실리카 단일막을 제조하거나, 상기 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 유무기 복합체를 제조한 후, 열 또는 유기용매를 처리하여 유기물을 제거하여 다공성 실리카를 합성하는 것인 실리카의 합성방법.
  12. 제7항에 있어서,
    반응은 하이드록시아파타이트를 더 포함하는 실리카의 합성방법.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체.
  14. 제13항에 있어서,
    항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조직 특이적 결합성분이 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
  15. 제13항에 있어서,
    siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약제학적 활성성분이 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
  16. 제13항에 있어서,
    효소 또는 결합 펩타이드가 추가로 결합되어 있고, 상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 실리카 복합체.
  17. 제13항에 있어서,
    인지질이 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
  18. 제13항에 있어서,
    하이드록시아파타이트가 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
  19. 제13항의 실리카 복합체; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물전달체.
  20. 제13항의 실리카 복합체; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물.
  21. 제13항의 실리카 복합체; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물.
  22. 제13항의 실리카 복합체; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물.
  23. 제13항의 실리카 복합체; 및
    진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브.
  24. 제13항의 실리카 복합체가 전기방사된 섬유.
  25. 제13항의 실리카 복합체가 전기방사된 섬유를 포함하는 필터.
  26. 제13항의 실리카 복합체를 포함하는 골대체제.
  27. 제13항의 실리카 복합체를 포함하는 포토닉스 소자.
  28. 제13항의 실리카 복합체를 포함하는 바이오분자 검출용 바이오센서.
  29. 제28항에 있어서,
    바이오분자는 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균인 바이오분자 검출용 바이오센서.
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