KR20140020288A - 망을 둘러싸는 조직 작제물 - Google Patents

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Abstract

신체 내부에 존재하는 힘에 충분히 견딜 수 있도록 강하면서도 생체적합성 표면을 보유하는 스캐폴드가 설명된다. 이 스캐폴드는 다층 생체 기질로 긴밀하게 둘러싸여진 망의 층(예를 들어, 스테인레스 스틸 또는 니티놀)으로 형성된다. 생체 기질은 세 개의 층, 즉 금속망상에 직접 형성된 제 1 층(평활근 세포), 제 1 층상에 형성된 제 2 층(섬유아세포/근섬유아세포), 및 제 2 층상에 형성된 제 3 층(내피 세포) 등을 포함할 수 있다. 스캐폴드는 심장판막이나 혈관이식편같은 다양한 조직으로서 작용하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 망과 해당 생체 기질은 스캐폴드가 조직 심장판막으로서 작용하도록 판막편으로서 형성될 수 있다.

Description

망을 둘러싸는 조직 작제물{MESH ENCLOSED TISSUE CONSTRUCTS}
우선권 주장
본 출원은 2011년 3월 23일에 출원된 "심장판막, 혈관 및 그 외의 작제물의 3차원 제조용 자체 재생형 혼성 조직 구조물(A SELF-REGENERATIVE HYBRID TISSUE STRUCTURE FOR 3D FABRICATION OF HEART VALVES, BLOOD VESSELS AND OTHER CONSTRUCTS)"이라는 명칭의 미국 가출원 제 61/466,882호; 2011년 6월 13일에 출원된 "혼성 조직 배양 심장판막(HYBRID TISSUE ENGINEERED HEART VALVE)"이라는 명칭의 미국 가출원 제 61/496,369호; 2011년 9월 28일에 출원된 "배양 심장판막 제조용 및 그 외의 용도의 스캐폴드(Scaffold for Fabrication of Engineered Heart Valves and Other Applications)"라는 명칭의 미국 가출원 제 61/540,330호; 2012년 1월 19일에 출원된 막의 조직 배양용 금속망 스캐폴드(METAL MESH SCAFFOLD FOR TISSUE ENGINEERING OF MEMBRANES)"라는 명칭의 미국 가출원 제 61/559,694호의 정규출원이다.
발명의 배경
(1) 기술 분야
본 발명은 조직 배양 방법, 보다 구체적으로 금속망을 둘러싸는 다층 조직으로 구성된 스캐폴드의 제조에 관한 것이다.
(2) 관련 기술의 설명
개조 및 재생할 수 있는 능력을 갖는 막형상 조직 구조물의 배양은 조직 배양의 분야에서 현재 해결되지 않은 주제다. 성장, 복구 및 개조 가능한 능력을 갖는 심장판막편같은 기능성 생육 막조직을 만들기 위해 최소의 성공으로 몇 가지 시도가 이루어졌다. 시노카(Shinoka) 등은 두 개의 부직형 폴리글리콜산 망 시트로 둘러싸인 폴리글락틴(polyglactin) 직조망으로 구성된 생체흡수성 폴리머상에 양(羊)의 섬유아세포 및 내피세포를 순서적으로 종균접종함으로써 단일편의 심장판막을 제조하였다. (Shinoka, T., Breuer, C. ., Tanel, R.E., Zund, G., Miura, T., Ma, P.X., Langer, R., Vacanti, J.P., and Mayer J.E. Tissue engineering heart valves: Valve leafet replacement study in a lamb model. Ann Thorac Surg, 60, 13, 1995 참조). 회스트럽(Hoerstrup) 등은 체외 시스템에서 펄스 복제기를 사용하여 만들어진 양의 근섬유아세포 및 내피세포로 순서적으로 종균접종된 부직형 폴리글리콜산 망, 즉 생체흡수성 폴리머를 사용하여 세 개 편으로 된 심장판막을 제조하였다. (Hoerstrup, S.P., Sodian, R., Daebritz, S., Wang, J., Bacha, E.A., Martin, D.P., Moran, A.M., Guleserian, K.J., Sperling, J.S., Kaushal, S., Vacanti, J. P., Schoen, F.J., and Mayer, J.E. Jr. Functional living trileaflet heart valves grown in vitro. Circulation, 102, 44, 2000 참조). 소디안(Sodian) 등은 폴리히드록시옥타노에이트(polyhydroxyoctanoate) 재료에 양의 동맥혈관 세포를 종균접종하에 제조된 세 개 편으로 된 심장판막을 구성하였다. (Sodian, R., Hoerstrup, S.P., Sperling, J.S., Daebritz, S., Martin, D.P., Moran, A.M., Kim, B.S., Schoen, F.J., Vacanti, J.P., and Mayer, J.E. Jr. Early in vivo experience with tissue-engineered trileafet heart valves. Circulation, 102, suppl III, 2000 참조). 서더랜드(Sutherland) 등은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem)와 폴리글리콜산 및 폴리-L-락트산으로 만들어진 생체분해성 스캐폴드를 사용하여 체외 자가이식 반월심장판막(autologous semilunar heart valves in vitro)을 만들었다. (Sutherland, F.W., Perry, T.E., Yu, Y., Sherwood, M.C., Rabkin, E., Masuda, Y., Garcia, A., McLellan, D.L., Engelmayr, G.C., Sacks, M.S., Schoen, F.J., and Mayer J.E. Jr. From stem cells to viable autologous semilunar heart valve. Circulation, 111 , 2783, 2005 참조). 전술한 시도돌의 결점들로는 구조적 취약성, 단기간의 기능성 및 막 작제물의 제한된 기계적 특성이 포함된다.
스캐폴드는 배양 조직의 중요한 구성부품으로서, 배양 조직이 체외에 형성될 수 있게 하며 호스트에 이식되었을 때 체내에 안정 상태를 유지한다. 조직막용 스캐폴드를 개발하기 위해 몇 가지 시도들이 이루어졌다. 가장 널리 사용된 방법은 생체분해성의 자연유래 또는 합성 폴리머를 수반하는데, 이 폴리머는 생체 기질이 형성되는 동안 정상적인 대사활동에 의해 궁극적으로 분해된다. 생육 가능한 조직을 갖기 위해 스캐폴드 분해 속도는 조직 형성 속도에 비례하여 시간 경과에 따른 기계적 안정성을 보장할 수 있어야 한다. 효소분해의 불충분한 제어 및 낮은 기계적 성능은 자연유래 폴리머의 두 가지 주요한 한계점이다. 반면에, 합성 폴리머는 구조 및 작용에 대하여 정확하게 제조될 수 있다. 그러나, 이들 대부분은 체내에서 분해될 때 독성 화학물질을 생성하며, 수용체 결합 리간드(receptor-binding ligand)가 부족하기 때문에 세포의 부착 및 증식에 대한 좋은 환경을 제공하지 않을 수 있다.
스캐폴드를 제조하는 다른 선택 사항은 폴리머 재료에 비하여 몇 가지 이점을 갖는 비세포화 이종 조직(decellularized xenogenic tissue)을 사용하는 것이다. 비세포화 조직은 본질적으로 세포에 대한 내인성 템플레이트로서 작용하는 세포외 기질(ECM) 단백질로 구성된 독특한 스캐폴드를 제공한다. 그러나, 비세포화 과정은 세포의 흔적과 그 부스러기들을 완전히 제거할 수 없다. 이들 잔류물은 면역원성 반응의 가능성을 높일 뿐만 아니라 조직이 석회화(calcification)되기 쉽게 한다.
보다 적게 개발되었기는 하지만 다른 전략은 완전히 생체 기질 구성물을 갖는 스캐폴드를 만드는 것을 수반한다. 이 시도는 폴리머 재료 또는 비세포화 이종 조직을 사용하는 것에 비하여 이점을 갖는다. 예를 들어 세포상해성 분해(cytotoxic degradation) 생성물을 갖지 않는 세포 내측성장을 쉽게 수용할 수 있는 이종원으로부터 다량이 제조될 수 있다. 그러나, 이 전략은 스캐폴드의 기계적 취약성 및 복합조직 구조물을 만들 수 있는 가능성의 낮음 때문에 제한된다.
따라서, 신체 내부에 존재하는 힘에 충분히 견딜 수 있게 강하면서도 생체적합성 표면을 갖는 조직 작제물에 대한 계속되는 요구가 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 신체 내부에 존재하는 힘에 충분히 견딜 수 있게 강하면서도 생체적합성 표면을 갖는 스캐폴드에 관한 것이다. 스캐폴드는 다층 생체 기질로 긴밀하게 둘러싸인 망의 층(예를 들어, 스테인레스 스틸 또는 니티놀)으로 형성된다. 생체 기질은 금속망상에 직접 형성된 제 1 층(평활근 세포), 제 1 층상에 형성된 제 2 층(섬유아세포/근섬유아세포), 및 제 2 층상에 형성된 제 3 층(내피 세포)같은 임의의 원하는 개수의 층을 포함할 수 있다.
스캐폴드는 심장판막이나 혈관이식편같은 다양한 조직으로서 작용하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드가 조직 심장판막으로서 작용하도록 망과 해당 생체 기질이 판막편으로서 형성될 수 있다. 이 측면에서, 스캐폴드는 적어도 두 개의 직립 기둥을 구비한 안장형상의 베이스를 갖는 가요성 프레임을 포함하며, 그 판막편은 각각 기둥 사이에 연장되는 주변 자유부와 베이스에 부착된 고정부를 갖는다.
다른 측면에서, 스캐폴드는 혈관이식편으로서 형성된다. 이 면에서, 망의 층은 관형 와이어망이며, 생체 기질은 그 속에 망을 완전히 감추도록 망 주위에 형성된다.
당업자라면 알 수 있듯이, 본 발명은 또한 여기서 설명한 스캐폴드의 형성 방법에 관한 것이다. 이 방법은 망의 층을 준비하는 단계와 기질이 망의 층을 긴밀히 둘러싸도록 망의 층의 주위에 생체 기질을 성장시키는 단계 같은 다수의 단계를 포함한다.
다른 면에서, 망의 층을 준비하는 단계는, 망의 층을 폴리싱하는 기술, 망의 층을 산세하는 기술, 망의 층을 초음파 세정하는 기술, 및 망의 층을 글로우 방전하는 기술로 구성된 그룹에서 선택된 어느 준비기술이나 임의의 조합을 더 포함한다.
추가적으로, 망의 층을 준비하는 단계는 매끈한 면을 제공하여 생체적합성 및 세포 부착성 향상을 보장하는 이온빔 표면개질 단계를 더 포함한다.
또 다른 면에서, 망의 층 주위로 생체 기질을 성장시키는 단계는 상호 연결된 기공망의 발달을 보장하기 위해 망의 층을 피복하는 첨가제로서 콜라겐을 제공하는 단계를 더 포함한다.
다른 면에서, 망의 층 주위에 생체 기질을 성장시키는 단계는 망의 층상에 세 종류의 세포를 순서적으로 종균접종하는 단계를 더 포함한다. 망의 층상에 세 종류의 세포를 순서적으로 종균접종하는 단계에 있어서, 세 종류의 세포는 평활근 세포, 섬유아세포/근섬유아세포, 및 내피세포다. 또한, 각 층의 콜라겐에는 TGF-β1을 포함한 사이토킨이 첨가될 수 있다. 따라서 전술한 바와 같이, 본 발명은 스캐폴드와 이런 스캐폴드를 형성하는 다양한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적, 특징 및 이점들은 첨부 도면을 참조하는 본 발명의 바람직한 면의 이후의 상세한 설명으로 명백해질 것이다.
도 1A는 본 발명의 일 면의 스캐폴드의 묘사를 보여준다.
도 1B는 본 발명의 일 면의 심장판막 조직을 모방하는 스캐폴드의 세포의 세 개 층을 보여주는 도면이다.
도 2는 조직을 발달시키기 위한 3차원(3D) 세포배양법에서의 단계들을 보여주는 개략도다.
도 3A는 약 1 cm2 의 표면적을 갖는 스테인레스 스틸 망의 화상이다.
도 3B는 세포 배양 3개월 후의 배양된 조직의 도면이다.
도 4A는 평활근 세포가 망위에 부착된 것을 보여주는 망의 제 1 층의 주사전자현미경 사진이다.
도 4B는 도 4A의 확대도다.
도 5A는 섬유아세포 및 근섬유아세포를 포함한 세포의 제 2 층을 배양한 후의 주사전자현미경사진 화상이다.
도 5B는 세포외 기질과 금속망상에 형성된 세포의 층을 보여주는데, 검은 화살표는 단일 섬유아세포를 지시한다.
도 6A는 TGF-β를 첨가하지 않은 세포 배양의 평면도를 보여준다.
도 6B는 TGF-β를 첨가하지 않은 세포 배양의 평면도를 보여준다.
도 6C는 세포 배양에 TGF-β를 첨가한 세포 배양의 평면도를 보여준다.
도 6D는 세포 배양에 TGF-β를 첨가한 세포 배양의 평면도를 보여준다.
도 7A는 스테인레스 스틸 망을 긴밀하게 둘러싸는 조직의 층을 보여주는 주사전자현미경사진 화상이다.
도 7B는 스테인레스 스틸 망을 긴밀하게 둘러싸는 조직의 세 개 층을 보여주는 주사전자현미경사진 화상이다.
도 7C는 스테인레스 스틸 망을 긴밀하게 둘러싸는 조직의 세 개 층을 보여주는 주사전자현미경사진 화상이다.
도 7D는 스테인레스 스틸 망을 긴밀하게 둘러싸는 조직의 세 개 층을 보여주는 주사전자현미경사진 화상이다.
도 8A는 미국 주화 페니에 대한 1센티미터 x 1센티미터 니티놀 망의 비교를 묘사하는 도해다.
도 8B는 셀 배양 3주후에 니티놀 망상에 배양된 조직을 보여준다.
도 9A는 니티놀 망 스캐폴딩을 묘사하는 심장판막의 도해다.
도 9B는 본 출원에서 설명한 조직으로 만들어진 심장판막편을 갖는 심장판막의 도해다.
도 9C는 본 출원에서 설명한 조직으로 만들어진 심장판막편을 갖는 심장판막의 도해다.
도 9D는 심장판막으로서 사용될 수 있는 세 개의 판막편을 갖는 스캐폴드의 개략부를 묘사하는 도해다.
도 9E는 심장판막을 다양한 관점에서 도시한 도해다.
도 9F는 도 9A 및 도 9D에 도시한 세 개의 편을 갖는 스캐폴드의 화상이다.
도 10A는 혈관의 개략도다.
도 10B는 본 출원에 설명된 조직으로 형성된 혈관의 개략도다.
이하 예로서 첨부 도면에 도시된 본 발명의 실시형태들을 상세히 참조한다.
이하에 본 발명을 이들 실시형태와 함께 설명하겠지만, 이들 실시형태들은 본 발명을 이들 실시형태에 한정하려는 것이 아님을 이해할 수 있을 것이다. 한편, 본 발명은 첨부하는 청구범위에 의해 규정되는 본 발명의 정신 및 범위에 포함될 수 있는 대체예, 수정예 및 등가예를 포함하는 것이다. 또한, 이후의 본 발명의 실시형태의 상세한 설명에서, 본 발명의 철저한 이해를 위해 많은 특정의 상세사항을 개시한다. 그러나 당업자라면 이런 특정의 상세사항 없이도 본 발명을 실시할 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 다른 예에서는 본 발명의 실시형태를 불필요하게 애매하지 않게 하기 위해 잘 알려진 방법, 과정 및 구성요소들은 상세하게 설명하지 않았다.
앞에서 설명하고 도 1A에 도시한 바와 같이, 본 발명은 금속망에 둘러 싸여진 다층 조직으로 구성된 스캐폴드(100)에 관한 것이다. 이는 도 1B에도 도시되어 있는데, 이 도면은 스캐폴드(100)가 세포(예를 들어, 서로 다른 세포 종류)의 층들(예를 들어, 세 개 층) 같은 생체 기질로 둘러싸인 금속망(102)의 여분층으로 만들어짐을 도시한다. 본 발명은 서로 다른 세포 종류의 세 개 층을 포함하는 스캐폴드(100)로서 설명하지만 스캐폴드(100)는 단일층, 또는 임의의 어떤 적절한 수의 층, 그리고 단일 세포 종류 또는 서로 다른 세포 종류로 형성될 수 있으므로 본 발명이 상기 세 개 층을 포함하는 스캐폴드에 한정되는 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 추가로, 금속망(102)은 생체 재료나 생체 기질로 덮이는 것으로 설명하지만, 본 발명은 금속망(102)이 당업자에게 알려진 합성 재료(폴리머 등)로 둘러싸일 수도 있으므로 그것에 한정되는 것은 아니다. 비제한적 예로서, 합성재료를 금속망 위에 성형할 수 있다.
그러나, 바람직하게는 생체 재료의 세 개 층은 평활근 세포(muscle cell)의 제 1 층(104)을 포함한다. 제 2 층(106)은 섬유아세포(fibroblast) 및 근섬유아세포(myofibroblast)로 구성될 수 있으며 제 3 층(108)(외층)은 내피세포(endothelial cell)로 구성될 수 있다. 이들 세 개 층은 각 층이 금속망(102)을 완전히 둘러싸도록 금속망(102) 주위로 삼차원적으로 둘러싼다. 이 접근방법은 생체 스캐폴드를 사용하면서도 신체 내부로의 이식후에 다양한 유형의 하중에 견딜 수 있는 금속망(102)으로 구성된 강한 세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 근간을 개발한다는 모든 이점들을 갖으려고 하는 것이다. 추가적으로 이런 망 패턴은 형성된 조직의 구조 통합을 보장하고 세포와 망(102)이 양측면의 ECM 구성부가 서로 상호 작용할 수 있도록 한다. 형성된 조직은 신체 내부의 생리적 스트레스에 대하여 생체역학적으로 탄력적이 되도록 한다. 일 측면에서, 스캐폴드(100)는 체외 및 체내에서 계속적으로 개조되고 성숙될 수 있는 생체 조직이다. 예를 들어, 스캐폴드(100)는 계속하여 성장하고 성숙될 수 있는 생체 조직(후술함)을 갖는데, 망(102)은 체내에 이식되었을 때 생물학적으로 활성을 갖게 된다.
일 측면에서, 스캐폴드(100)의 세포의 3개 층은 심장판막 구조를 모방할 수 있다. 이 3개 층은 심장판막엽의 심실층, 해면질층 및 섬유층을 모방하고 있다. 이런 유형의 스캐폴드는 심장판막엽, 혈관이식편(vascular grafts) 등같은 어떠한 막조직의 제조에도 사용될 수 있다.
본 발명은 도 1A 및 도 1B에 도시한 바와 같은 독특한 혼성 스캐폴드(100)에 관한 것이지만, 본 발명은 또한 (서로 다른 세포 종류의 3개 층으로 둘러싸인 금속망의 여분층으로 만들어진) 신규의 스캐폴드의 제조 방법도 포함한다. 예를 들어, 도 2는 다층 조직을 제조하는 방법의 개략도를 보여준다. 본원에서 상술된 3차원적 세포배양기술을 통하여 세포의 모든 층들을 사각형상의 스테인레스 스틸 망에 종균접종하여 ECM 또는 결합 조직을 만들었다.
다층 조직을 제조하는 방법은 다음과 같다. 스캐폴드를 제조하는 제 1 단계는 금속망 스캐폴드를 준비하는 것이다. 금속망은 조직에 대한 스캐폴딩으로서 동작할 수 있는 임의의 적절한 재료다. 비제한적 예로서, 금속망은 개구 크기가 0.0088"인 80 EPI(end per inch) x 80 PPI(pick per inch)를 목표로 하여 0.0037"의 둥근 와이어로 직조된 T316 스테인레스 스틸의 평면 망이 될 수도 있다. 이런 망의 비제한적 예는 미국 캘리포니아주 버클리 텐스 스트리트 2831에 소재하는 TWP, Inc. 에서 판매되는 망이다. 금속망은 5분 동안 520℃에서 가열한 후에 워터 켄칭(water quenching)하였다. 표면을 폴리싱하고, 염산세(hydrochloric acid wash)를 이용하고, 15분동안 에탄올 속에서 초음파 세정을 하고 40초동안 글로우 방전을 하여 다단계로 산화막을 제거하였다. 마지막으로, 금속망을 세포 배양에 사용될 1평방센티미터의 면적을 갖는 조각으로 절단하였다.
금속망을 세정하고 조각으로 절단한 후에, 이온빔 표면개질법을 이용하여 종균한 표면을 얻고 생체적합성과 스테인레스 스틸 망에 대한 세포 부착성의 향상을 보장한다. 금속망을 습식 금속현미경적 폴리싱(wetted metallographic polishing) 고급 실리콘 카바이드(SiC) 페이퍼로 기계적으로 폴리싱하였다. 그 후, 금속망을 산세하고 초음파 진동욕(ultrasonic vibrobath) 중에서 탈지하고 증류수로 헹구었다. 세포 배양 전에 샘플들을 1 x 1014 이온/cm2 의 유속량의 150 keV 에너지로 He+ 이온빔으로 조사하였다.
일 측면에서, 조직의 성장은 성장인자 및 재료를 추가하여 도와줄 수도 있다. 예를 들어, 소와 쥐의 꼬리 콜라겐을 함유하는 혼합물을 사용하여 금속망을 피복하여 세포 성장, 영양분 공급 및 대사폐기물의 제거에 필수적인 상호 연결된 기공 네트워크를 발달시키게 된다. 추가로 배지는 기질 생산을 촉진시키기 위해 반드시 여기에 한정되는 것은 아니지만 아스코르빈산을 포함한 첨가제를 보충할 수도 있다. 게다가 TGF-β1을 포함하는 단백질(사이토카인)을 각 층의 콜라겐겔에 첨가하여 세포외 기질 생성 속도를 증대시킬 수도 있다. 스캐폴드의 생물학적 부분에 대해서는 임의의 콜라겐 타입 자체나 혼합물 형태 외에 피브린이나 합성 스캐폴드 같은 그 외의 생물학적 스캐폴드도 사용할 수 있다. 표적 조직과 사용된 세포에 따른 성장 인자는 내피 세포 대신에 내피 전구 세포를 사용하는 경우에 혈관내피 증식 인자(VEGF; vascular endothelial growth factor) 같이 서로 다를 수 있다.
금속망을 준비한 후에 세 가지 다른 종류의 세포를 금속망에 순서적으로 종균접종하여 삼차원 조직 스캐폴드를 구성하였다. 비제한적 예로서, 심장판막 내피세포로서 작용하도록 심장판막 간질세포(VIC; interstitial cell) 및 내피세포의 역할을 충족시키기 위해 예비검정을 위해 평활근 세포, 섬유아세포 및 근섬유아세포의 세 가지 다른 세포 종류를 격리시켜서 사용하였다. 세포를 배양하기 위한 기본 배지는 DMEM(예를 들어, 미국, 캘리포니아주 92006, 패러데이 에이브 1600에 소재하는 Invitrogen Corporation에서 제조하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco), 10% 소태아 혈청(일리노이주, 록포드, HyClone), 1% 페니실린/스트렙토마이신(캘리포니아주, 칼스바드, Gibco) 및 1% L-글루타민(캘리포니아주, 칼스바드, Gibco)를 함유하며, 성장 및 증식을 촉진하기 위해 적절한 성장인자를 첨가하였다. 배양된 세포를 2일 내지 3일마다 공급하고 컨플루언스(confluence)일 때 1회 내지 3회 분할하였다. 세포들은 3회 내지 5회 계대배양일 때 실험에 사용하였다.
각 금속망을 정돈된 외형을 갖는 조직배양후드 내에서 소와 쥐의 꼬리 콜라겐(캘리포니아주, 칼스바드, Gibco)의 혼합물로 피복하였다. 액체 콜라겐 혼합물을 NaOH로 중화시켰다. 먼저 무세포 콜라겐 용액을 캐스팅한 다음에 여기에 각 세포 종류당 총 3 x l06 세포를 첨가하여 세포로 종균접종된 콜라겐 작제물을 준비한 후에 콜라겐을 응고시켰다. 그 용액중에 스테인레스 스틸 망을 배치한 후에, 작제물을 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양하여 중합시켰다. 이 방법은 콜라겐 작제물이 겔 형성 후에 균일한 세포 밀도(3 x 106 cells/cm2)를 갖도록 한다. 이 조직 작제물을 2일마다 배지를 교체하면서 37℃에서 배양하였다. 자연적인 생체내 판막편과 유사한 표현형(phenotype)을 얻기 위해 다음 층의 세포들을 2주의 시간 간격으로 작제물 위에 도포하고 다음 층을 본 단락의 개시부에 설명한 유사한 방법으로 더 깊은 층의 주위에 작제하였다. 또한 배지에는 기질 생성을 촉진하기 위한 첨가제로서 아스코르빈산(예를 들어, 미국, 미저리주, 세인트 루이스, 스프루스 스트리트 3050에 소재하는 Sigma-Aldrich Inc.에서 생산)도 보충하였다. 세포외 기질 생산속도를 향상시키기 위해, 각 층의 콜라겐 겔에 TGF-β1 10 ng/ml(예를 들어, 미국, 미네소타주 55413, 미네아폴리스, 맥킨리 플레이스 노디스트 614에 소재하는 R&D Systems Inc.에서 생산)을 각 층의 콜라겐 겔에 첨가하였다. 이들 배양물은 나중에 TGF-β 를 보충하지 않은 대조군과 비교하였다.
일 측면에서, 조직은 막의 강한 조성이 필수적인 용도, 즉 심장판막 및 혈관이식편에 적합할 수 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 추가의 이해를 위해, 도 3A 및 도 3B는 망의 축척과 해당 조직을 묘사하는 이미지를 제공한다. 예를 들어, 도 3A는 표면적이 약 1 평방센티미터인 스테인레스 스틸 망(102)의 이미지다. 추가로 도 3B는 세포를 3달 배양한 후의 배양 조직(100)을 육안으로 본 도면이다. 도 3B에 도시된 외표면은 내피층 또는 제 3 층이다. 제 3 층을 종균접종하면 금속망(102)이 완전히 감추어져서 작제물 주위로 매끈한 융합성의 표면이 형성된다. 제 3 층이 금속망(102)을 감추게 되지만, 금속망(102)은 여전히 조직 내부에서 보일 수 있다.
도 4A 및 도 4B는 세포의 제 1 층의 주사전자현미경사진(SEM) 화상이다. 도 4A는 금속망(102) 위에 부착되어 있는 평활근 세포(400)를 보여준다. 도 4B는 배양 기간 중에 단단히 채워진 조직의 제 1 층(즉, 평활근 세포(400))을 보여주는데, 이는 그 발현으로서 알파-SMA의 발현을 확증해준다.
도 5A는 섬유아세포/근섬유아세포를 포함하는 세포의 제 2 층을 배양한 후에 취한 SEM 화상의 평면도다. ECM의 형성과 작제물 주위의 융합층의 형성을 볼 수 있다. 다른 방법으로서, 도 5B는 SEM 화상의 측면도를 보여준다. 도 5B에서 화살표는 하나의 섬유아세포(500)를 지시한다. 도 5A 및 도 5B는 모두 제 2 층속의 섬유아세포(500)를 보여준다. TGF-β를 첨가하여 제 2 층 속에 섬유아세포 또는 근섬유아세포를 갖는 세포의 수를 증가시켰다.
도 6A 내지 도 6D는 TGF-β를 첨가하지 않고서 8주의 종료시의 세포 배양의 공초점현미경(confocal microscopy) 화상을 보여준다. 도 6A는 TGF-β 의 첨가가 없는 대조군을 평면도로 보여준다. 도 6B는 TGF-β를 첨가한 대조군을 측면도로 보여준다. 다른 방법으로서, 도 6C는 세포 배양물에 TGF-β를 첨가한 세포 배양물의 평면 화상이다. 도 6D는 TGF-β를 세포 배양물에 첨가한 세포 배양물을 보여주는 측면 화상이다. 도 6A 내지 도 6D에 도시한 바와 같이, 대조군과 대비하여 TGF-β를 첨가하였을 때보다 큰 세포외 기질 침적이 관찰된다. 작제물내의 핵의 DAPI(즉, 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 염색법에 의하면 TGF-β군에서는 금속망의 표면에서의 세포의 개수가 점차 증가하였으며, TGF-β로 처리된 군에서는 최종적으로 금속망 주위에 보다 두꺼운 조직이 형성되었음을 보여준다.
도 7A 내지 도 7D는 스테인레스 스틸 망을 긴밀하게 둘러싸는 조직의 세 개 층을 묘사하는 8주후에 취한 SEM 화상을 보여준다. 도 7A는 융합 방식으로 작제물을 덮고 있는 내피 표면, 즉 매끈한 구조물(108)을 보여준다. 도 7B는 8주 후에 조직이 세 개의 서로 다른 세포층을 순서대로 보여주는 것을 나타내는데, 108은 표면내피층, 106은 중간의 섬유아세포 및 근섬유아세포층이며, 104는 평활근 세포의 기층이다. 도 7C 및 도 7D는 금속망(102)이 조직막과 긴밀하게 합체된 것을 보여주는데, 도 7C는 금속망(102)의 개구 구멍을 통해 세포(104)가 관통하는 것을 도시한다. 제 2 층 및 제 3 층을 추가하면 금속망을 덮는 ECM(주로 콜라겐 및 다당(glycosaminoglycan))의 생성을 향상시켜서 양쪽 실험군에서 내피 세포 라이닝을 갖는 융합성의 매끈한 표면을 형성함을 알 수 있다.
전술한 바와 같이, 금속망은 조직용 스캐폴딩으로서 작용할 수 있는 임의의 적절한 재료다. 또한, 금속망은 어떤 형태도 될 수 있으며, 그 비제한적 예로는 꼬아지거나 편평한 형태를 포함한다(예를 들어, 금속망은 펀칭가공된 와이어망이나 직조 패턴을 갖는 망의 시트로서 제작된다). 다른 면에서, 스캐폴드용 스테인레스 스틸 금속망 대신에 니티놀 금속망 스캐폴드를 사용할 수도 있다. 축척 비교를 위해 도 8A는 미국의 1센트 주화(802)에 대한 1 x 1 센티미터의 니티놀 망(800)의 다중 시트를 보여준다. 조직의 생성에 있어서, 니티놀 금속망은 스테인레스 스틸 금속망에서 사용되는 것과 동일한 공정으로 산으로 에칭된다. 이 비제한적 예에서, 금속망(800)은 직경이 240 미크론이고 중심 거리가 320 미크론인 구멍망으로서 에칭된 두께 76 미크론의 초탄성 니티놀 시트로 만들어진다. 심장판막편 용도에서는 두께가 25 미크론인 시트가 사용되는데, 이는 원하는 판막편의 탄성반동을 제공한다. 이 측면에서, 금속망(800)은 심장판만편의 형상으로 절단된다. 니티놀 망은 스테인레스 스틸 망에서 설명한 것과 동일한 방식으로 세포로 종균접종된다. 3개월동안 성장한 결과의 스캐폴드(100)의 예가 도 8B에 도시되어 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 스캐폴드는 임의의 적절한 조직이 기초가 되는 항목에 합체될 수 있는데, 그 비제한적 예로는 혈관이식편이 포함된다. 다른 비제한적 예로서 그리고 도 9A 내지 도 9C에 도시한 바와 같이, 스캐폴드는 자연적인 심장판막을 모방하는 조직 심장판막에 합체될 수도 있다. 이 조직 심장판막은 안장 형상의 베이스(901)와 베이스를 적어도 두 개의 부분(또는 도시와 같이 세 개의 부분)으로 분할하는 적어도 두 개의 직립 기둥(902)을 갖는 가요성 프레임을 본 출원에서 설명한 조직으로 형성된 조직편(903)과 함께 포함한다. 기둥(902)은 왜곡되지 않은 베이스의 직경의 양단부에 형성될 수 있으며, 도시한 바와 같이 세 개(또는 그 이상)의 기둥(902)이 베이스 둘레에 일정한 간격으로 배치되어 있다.
조직편(903)은 각각 기둥(902)의 팁 사이에서 연장되는 자유부(906)와 기둥(902)의 대응 측변과 베이스(901)의 인접부에 고정되거나, 시일링되거나 또는 봉합된 고정부로 구성된 주변부를 갖는다. 조직편(903)은 초탄성 니티놀 망(또는 스테인레스 스틸 또는 임의의 다른 적절한 망 재료) 같은 망 재료로 만들어지지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 초탄성 망은 조직편(903)의 형상을 규정하는 구조물로서 작용하며, 정렬되거나 정렬되지 않은 구멍을 갖는 망 같은 구조물이 될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 망은 펀칭가공된 와이어망 시트나 직조 패턴을 갖는 시트로 제조될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
도 9A 내지 도 9C에 도시한 심장판막을 사용하기 위해서는, 안장형상의 베이스(901)가 바람직하게는 중간봉합링(904)을 통하여 방실 개구(auriculoventricular orifice)의 주위에 부착되어 있으며, 따라서 베이스는 자연 심장판막의 경우에서처럼 실질적으로 원형의 형상으로부터 방실 개구의 형상으로 동시에 변형할 수 있다. 심장판막의 교체에 있어서, 기둥(902)은 왜곡되지 않은 베이스의 주위에 일정한 간격으로, 또는 필요에 따라서는 예를 들어 대동맥판막(aortic valve)의 교체에서 관상동맥구(coronary ostia)의 신체구조적 조건에 따라서 다른 간격으로 배치될 수도 있다.
가요성 프레임(즉, 안장형상의 베이스(901) 및 적어도 두 개의 직립 기둥(902))은 임의의 적절한 가요성을 가지면서도 내구성이 있는 재료로 형성된다. 비제한적 예로서, 가요성 프레임은 바람직하게는 폴리에스테르 직포(woven polyester cloth)(912)로 덮인 엘질로이(Elgiloy)(다크론(Dacron)직포 또는 그 외의 임의의 적절한 피복재 등, 그러나 이것에 한정되지 않음)로 형성되는데, 그 차별적인 가요성은 프레임 재료의 두께를 기둥의 각측변으로 다르게 하고/하거나 엘질로이의 두께를 기둥의 각 부분에서 다르게 함으로써 부여된다. 접합면팁과 조직편의 자유 가장자리부에서의 폐쇄부하충격을 줄이기 위해서 방실 개구 및 접합면에서 유연하도록 설계된다. 봉합링(904)은 실리콘 고무 및 부직 폴리에스테르의 삽입체를 포함할 수 있다. 봉합링(904)에는 적어도 두 개의 대조적인 표식 봉합선(905)이 위치한다. 표시 봉합선(905)은 보철물을 이식하기 위한 적절한 배향을 돕기 위한 것이다. 기둥(902)은 바람직하게는 각 측변이 안장형상의 베이스(901)의 각각의 아치형부에 합쳐지는데, 이 합쳐짐은 바람직하게는 하나의 기둥(902)의 둥근 팁으로부터 다른 기둥(902)의 둥근 팁까지 연속적인 곡선으로 되어 있음에 의해 이루어진다.
예를 들어, 3개의 편을 갖는 판막에서, 각 판막편(903)의 형상은 바람직하게는 원추형의 표면의 일부에 해당하는데, 이 부분은 세 개의 평면의 원추면에서 60도의 각도로 서로 교차함에 의해 규정된다. 이 원추면상에 주변부를 갖는 세 개의 평면은 길이가 각각 안장형상의 베이스의 주위 길이와 프레임의 기둥의 팁 사이의 거리에 대응한다. 전방 교차부는 원추의 정점쪽으로 오목하고 원추의 양측에서 전술한 세 개의 평면과 교차하는 곡면의 원추면에 포함된다. 평면의 간격과 곡면의 곡률은 원추면상의 곡면의 전개부의 길이와 곡률이 안장형상의 베이스의 하나의 아치형부의 곡선과 기둥의 인접측변의 연속적인 혼합 형태와 일치하여 판막편 재료의 몰딩 성형이나 스트레스 고정이 필요하지 않도록 설정된다.
심장판막의 스캐폴드 특성을 좀더 이해하기 위해, 도 9A는 판막편(903)은 판막편(903)의 하측 베이스 구조물인 금속망(니티놀 망(800) 등)을 갖는 심장판막을 도시한다. 구체적으로 도 9A는 생체 기질이 없는 심장판막과 그 스캐폴드를 도시한다. 도 9A는 망 패턴과 그를 통과하는 구멍의 비제한적 예를 도시하기 위한 금속망(800)의 확대도(910)를 포함한다. 또한, 도 9B에 도시한 바와 같이, 니티놀 망(800)의 상면에는 세 개의 층이 성장된다. 구체적으로, 평활근 세포의 제 1 층(104), 섬유아세포 및 근섬유아세포의 제 2 층(106), 및 내피세포의 제 3 층(108)이 도시되어 있다. 마지막으로, 도 9C는 각 판막편(903)의 외층이 제 3 층(108)(또는 내피 세포)인 심장판막을 도시한다.
적절한 베이스 구조물을 더 이해하기 위해, 도 9D는 도 9A에 도시된 바와 같은 심장판막의 구성부분들을 도시한다. 도 9D에는 안장형상의 베이스(901) 및 적어도 두 개의 직립 기둥(902)을 포함하는 가요성 프레임이 도시되어 있다. 또한 도 9D에는 봉합링(904)이 봉합재(914)와 함께 도시되어 있다. 또한 망 패턴의 예를 도시하기 위해 망의 확대도(910)를 포함하여 판막편(903)이 도시되어 있다.
도시한 바와 같이, 판막편(903)들은 생리학적 혈압을 받을 때 서로 부착되어 치수적으로 안정하고 일관된 접합형 판막편 준조립체(916)를 형성할 수 있다. 그리고 준조립체(916)의 각 판막편(903)은 전형적으로는 하나의 접합팁(즉, 기둥(902))으로부터 판막편(903)의 선단 주변부의 주위로 균일하게 인접 접합팁의 팁(기둥(902))까지 프레임(즉, 안장형상의 베이스(901) 및 기둥(902))과 일직선상에 정렬되어 개별적으로 봉착되어 있다. 프레임(베이스(901, 902))은 통상적으로 헝겊으로 덮이지만 다른 방법으로서 생체조직으로 덮일 수 있다. 봉착된 봉합부(914)는 유사하게 정렬된 스테플처럼 작용하는데, 이들 전부는 미리 정렬된 각 판막편(903)의 전체 선단을 따라서 작용하는 토우 부하력(toe loading force)을 동등하게 취한다. 이렇게 형성된 결과의 구조적 조립체(즉, 도 9D의 상단에 도시되고 도 9A에도 도시된 심장판막(918))는 접합부 사이의 전체 판막편 선단 위로 응력을 균등하게 분포시킴으로써 판막편 봉합계면에서의 응력 및 잠재적 피로를 줄여준다. 따라서, 판막편이 개별적으로 부착되고 선단의 주변 스티칭이 접합부의 선단 앞에서 끝나서 잠재적 응력점을 형성하는 일부 생체인공판막(bioprosthetic valve)과는 달리, 이렇게 제조된 밸브 조립체는 접합부 사이에 균일한 스티칭을 가지고 일관되게 정렬된 접합형 판막편 대응 엣지를 갖는다. 이는 도 9E에도 도시되어 있는데, 이 도면은 판막 조립체(즉, 세 개의 판막편을 갖는 심장판막) 및 그 판막편 대응 엣지의 형상을 명확하게 도시하기 위해 세 개의 판막편을 갖는 심장판막을 다양한 관점에서 도시한다. 마지막으로 추가의 도시를 위해 도 9F는 도 9A 및 도 9D에 도시된 세 개 판막편의 스캐폴드를 도시한다.
도 10A 및 도 10B는 스캐폴드를 합체하도록 형성될 수 있는 조직에 기반한 항목의 또 다른 예를 제공한다. 예를 들어, 도 10A는 실제의 혈관의 다양한 구성부를 나타내는 혈관의 개략도다. 이와는 달리, 도 10B는 혈관으로서 형성된 스캐폴드를 도시한다. 도시한 바와 같이, 본 예의 스캐폴드는 혈관의 형상을 모방하도록 관형의 와이어망 형태로 제공된 베이스 니티놀 망(800)을 포함한다. 해당 조직은 니티놀 망(800) 주위로 성장한다. 따라서, 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 신체 내에 존재하는 힘들에 대하여 충분히 견딜 수 있도록 강하면서도 생체적합성 표면을 갖는 다양한 스캐폴드를 형성할 수 있다.

Claims (29)

  1. 망의 층을 포함하는 것을 포함하는 조직막 형성용 스캐폴드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 망은 합성재료로 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 망은 체내에 이식되었을 때 생물학적으로 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 망은 생체 기질을 형성하는 생물학적 재료로 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 생체 기질은 금속망의 각 측면에서 세 개의 세포층으로 형성되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 세 개의 세포층은 금속망상에 바로 형성된 제 1 층, 제 1 층상에 형성된 제 2 층, 및 제 2 층상에 형성된 제 3 층을 포함하는데, 제 1 세포층은 평활근 세포층이고, 제 2 세포층은 섬유아세포/근섬유아세포층이며, 제 3 세포층은 내피세포층인 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 망은 일종의 금속으로 형성되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 망과 해당 생체 기질은 스캐폴드가 조직 심장판막으로서 작용할 수 있도록 판막편으로서 형성되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 적어도 두 개의 판막편을 포함하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  10. 제 9 항에 있어서, 적어도 두 개의 직립 기둥을 갖는 안장형상 베이스를 갖는 가요성 프레임을 더 포함하며, 상기 판막편은 각각 기둥 사이에 연장되는 주변 자유부와 베이스에 부착된 고정부를 갖는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  11. 제 10 항에 있어서, 세 개의 직립 기둥을 갖는 베이스를 갖는 프레임을 더 포함하며, 상기 판막편은 프레임에 부착되고 그리고 기둥 사이에 부착되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  12. 제 8 항에 있어서, 적어도 두 개의 기둥을 갖는 안장 형상의 베이스를 갖는 가요성 프레임을 더 포함하며, 상기 판막편은 각각 기둥 사이에 연장되는 주변 자유부와 베이스에 부착된 고정부를 갖는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  13. 제 8 항에 있어서, 세 개의 직립 기둥을 갖는 베이스를 갖는 프레임을 더 포함하며, 상기 판막편은 프레임과 부착되고 기둥 사이에 부착되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 망의 층은 관형의 와이어망이며, 망의 주위에는 생체 기질이 형성되어 망을 그 속에 완전히 또는 부분적으로 감추며, 따라서 스캐폴드는 혈관이식편으로서 작용하는 혈관의 형상으로 형성되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 망은 심장판막편의 형상으로 절단되는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  16. 제 15 항에 있어서, 다수의 판막편이 서로 부착되어 심장판막 형상을 형성하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 망은 꼬아지거나 편평한 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  18. 조직막 형성용 스캐폴드로서, 상기 스캐폴드는, 베이스와 상기 베이스를 적어도 두 개의 부분으로 분할하는 두 개의 직립 기둥을 포함하며, 또한 기둥의 팁 사이에 연장되는 자유부와 기둥의 대응 측변과 베이스의 인접부에 고정되거나, 시일링되거나 또는 봉합된 고정부로 구성된 주변부를 각각 갖는 판막편도 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 판막편은 망형상 구조물로 만들어지는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  20. 제 19 항에 있어서, 각 판막편의 형상은 각각 길이가 베이스의 주변 길이에 대응하는 원추면상의 주변부를 갖는 적어도 두 개의 평면의 원추면상의 교차점에 의해 규정되는 원추면의 일부에 대응하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드.
  21. 스캐폴드의 형성 방법으로서,
    망의 층을 준비하는 단계, 및
    생체 기질이나 합성 기질이 망의 층을 긴밀하게 둘러싸도록 생체 기질을 망의 층 주위로 성장시키거나 망의 층을 합성 기질로 둘러싸는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 망의 층을 준비하는 단계는,
    망의 층을 폴리싱하는 기술,
    망의 층을 산세하는 기술,
    망의 층을 초음파 세정하는 기술, 및
    망의 층을 글로우 방전하는 기술로 구성된 그룹에서 선택된 어느 준비기술이나 임의의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 망의 층을 준비하는 단계는 매끈한 면을 제공하여 생체적합성 및 세포 부착성 향상을 보장하는 이온빔 표면개질 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 망의 층 주위로 생체 기질이나 합성 기질을 성장시키는 단계는 조직의 내측성장을 보장하기 위해 첨가제로서 표면개질하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 망의 층 주위로 생체 기질을 성장시키는 단계는 상호 연결된 기공망의 발달을 위해 망의 층을 피복하는 첨가제로서 콜라겐을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 망의 층 주위에 생체 기질을 성장시키는 단계는 망의 층상에 세 종류의 세포를 순서적으로 종균접종하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 망의 층상에 세 종류의 세포를 순서적으로 종균접종하는 단계에 있어서, 세 종류의 세포는 평활근 세포, 섬유아세포/근섬유아세포, 및 내피세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 망의 층상에 세 종류의 세포를 순서적으로 종균접종하는 단계에 있어서, 각 층의 콜라겐에 TGF-β1을 포함한 사이토킨이 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 스캐폴드를 형성함에 있어서, 스캐폴드는 심장판막 및 혈관이식편으로 구성된 그룹에서 선택된 항목으로서 작용하도록 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
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