KR20140019811A

KR20140019811A - 담즙산, 이들의 염 또는 유도체의 선택적 산화를 위한 신규한 공정

Info

Publication number: KR20140019811A
Application number: KR1020137028040A
Authority: KR
Inventors: 다니엘라 몬티; 에리카 엘리사 페란디; 세르지오 리바; 파우스토 포렌티니
Original assignee: 프로도티 케미시 에 엘리멘타리 에스.피.에이.
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2014-02-17
Also published as: KR101948948B1; EP2691516B1; ES2586389T3; JP2014511683A; WO2012131591A1; CN103517984A; ITMI20110534A1; EP2691516A1; JP5872671B2; CN103517984B

Abstract

보조인자 NAD(P)⁺의 재생성을 위한 공-기질로서의 알코올 데하이드로게나제 (ADH) 및 메틸 아세토아세테이트의 존재에서, NAD(P)⁺-의존성 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 (HSDH)에 의한 콜린산, 키노데옥시콜린산 또는 콜린산 메틸 에스테르와 같은 담즙산, 이들의 염 또는 유도체의 위치선택적 효소적 산화를 위한 신규한 공정이 제공된다.

Description

담즙산, 이들의 염 또는 유도체의 선택적 산화를 위한 신규한 공정{NEW PROCESS FOR THE SELECTIVE OXIDATION OF BILE ACIDS, THEIR SALTS OR DERIVATIVES}

본 발명은 예를 들면 콜린산 (3α,7α,12α-트리하이드록시-5β-콜란산, (I)), 콜린산 메틸 에스테르 (II) 및 키노데옥시콜린산 (3α,7α-디하이드록시-5β-콜란산, (III))과 같은, 시중에서 쉽게 입수가능한 도식 1에 나타난 일반식으로 예시되는 상이한 담즙산, 이들의 염 또는 유도체로부터 출발하여, 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid)을 상업적으로 제조하기 위한 신규한 공정에 관한 것이다.

우루소데옥시콜린산, 즉 식이 다음 식 (IV) (도식 2)에 나타나는 3α,7β-디하이드록시-5β-콜란산 (UDCA)은

일반적으로 인간 담즙에 소량으로 존재하는 화합물이고, 담즙의 콜레스테롤 용해 능력을 증가시킨다. UDCA는 이의 치료적 특성으로 알려져 있고: 실제로, 콜레스테롤 결석, 원발성 담즙성 간경변 및 경화성 담관염의 소멸과 같은, 간 부위의 기능부전의 치료를 위해 사용된다.

그러므로 UDCA의 상업적인 생산을 위한 방법을 손에 넣으려는 큰 관심이 존재한다.

UDCA의 제조는 현재 소의 담즙으로부터 추출된 콜린산으로부터 출발하여 중간체 12-케토-키노데옥시콜린산의 형성을 통한 화학적 합성에 의해 수행된다 (Hoffmann A.F., Acta Chem . Scand ., 1963, 17, 173-186; Sammuelson B., Acta Chem . Scand ., 1960, 14, 17-20).

우루소데옥시콜린산의 통상적인 화학적 합성 대신에 예를 들면 Bovara R., Carrea G., Riva S. and Secundo F. Biotechnology letters 1996, 18, 305-308에 기술된 것과 같은 다양한 합성 전략이 제안되었다. 이들 전략은 UDCA의 합성을 위해 콜린산 또는 키노데옥시콜린산의 상이한 산화 유도체(가령 예를 들어 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산, 12-케토-키노데옥시콜린산 및 7-케토-리토콜린산)를 이용한다.

콜린산 및 키노데옥시콜린산의 산화 유도체는 화학적 합성, 및 효소적 공정 둘 다에 의해 합성될 수 있다.

화학적 공정은 일반적으로 담즙산의 에스테르화, 산화를 요하지 않는 하이드록실 기의 선택적인 아세틸화, 및 선택된 하이드록실의 케톤으로의 산화를 포함한다. 그렇지만, 합성 공정을 통해 얻을 수 있는 수율 및 전환율은 산업적인 관점에서 완전히 만족스럽지 않다.

화학적 합성에 대한 대안으로서, 콜린산의 산화는 이후 화학량론적 양보다는 촉매적으로 반응될 수 있는 적절한 보조인자 재생성 시스템과 커플링된, NAD(P)H-의존성 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 효소 활성(HSDH)을 이용하는 효소적 경로에 의해 수행될 수 있다.

HSDH 활성은 거의 완전한 위치- 및 입체-선택성을 나타내고, 그러므로, 화학적 산화와 다르게, 이들이 촉매하는 반응은 산화를 요하지 않는 하이드록실 기의 예방적 보호 없이 수행될 수 있다.

HSDH에 의해 촉매되는 산화환원 반응이 가역적이기 때문에, 산화 반응과 커플링된 보조인자 재생성 시스템은 사용될 NAD(P)⁺의 양을 줄이기 위할 뿐 아니라, 반응 평형을 높은 전환 백분율까지 끌어올리기 위해 활용될 수 있다 (Kroutil W., Mang H., Edegger K., Faber K. Adv . Synth . Catal ., 2004, 346, 125-142).

암모니아의 존재에서 글루타메이트 데하이드로게나제에 의해 촉매되는 α-케토글루타르산의 환원적 아민화의 경우에서와 같이, 이차 데하이드로게나제에 의해 촉매되는 공-기질의 비가역적인 환원 반응과 산화 반응을 커플링함으로써 정량적인 전환을 얻을 수 있다. 보조인자 NAD(P)⁺의 재생성을 위한 글루타메이트 데하이드로게나제와 커플링된 담즙산의 산화 반응의 예는 예를 들면 Riva S., Bovara R., Pasta P., Carrea G. J. Org . Chem ., 1986, 51, 2902-2906; Bovara R., Carrea G., Riva S., Secundo F. Biotechnology letters, 1996, 18, 305-308에 기술되어 있다. 그러한 반응은 기질 콜린산 (12.5mM)의 낮은 농도로만 달성되었으며 공-기질 α-케토글루타르산의 높은 가격 및 산업 적용을 위한 글루타메이트 데하이드로게나제의 시중 부재로 인해, 대규모로 적용될 수 없다.

다른 데하이드로게나제에 의해 촉매되는 가역적인 환원 반응과 산화 반응이 커플링되는 경우에, 대신에, 반응 평형을 요망되는 생성물 쪽으로 유리하게 이동시킬 수 있는 과량의 공-기질의 사용이 요구된다.

예를 들면, NADH-의존성 락테이트 데하이드로게나제(LDH)에 의해 촉매되는 피루브산의 락트산으로의 환원반응과 커플링된 NADH-의존성 12α-HSDH로 수행되는 콜린산의 산화 반응에서(Fossati E., Carrea G., Riva S., Polentini F., EP 1 731 618), 정량적인 전환을 얻기 위해 공-기질은 100% 과량으로 사용되었다. 또한 상기 경우에 효소의 재사용을 위해 사용된 공-기질 피루브산의 높은 비용은 그러한 공정을 산업 규모로 적용하기에 만족스럽지 않다. 게다가, NADPH-의존성 LDH는 입수가 불가능하기 때문에, 그러한 보조인자 재생성 시스템은 NADH-의존성 HSDH에 의해 촉매되는 산화반응과만 커플링될 수 있다.

NADPH-의존성 알코올 데하이드로게나제 (ADH)를 통한 아세톤의 환원반응과 NADPH-의존성 12α-HSDH에 의해 촉매되는 콜린산의 산화반응의 커플링은 Fossati E., Polentini F., Carrea G., Riva S., Biotechnol . Bioeng ., 2006, 93, 1216-1220에 기술되어 있다. 상기 시스템은 알코올 데하이드로게나제, 및 공-기질 아세톤과 같은 커플링되는 효소 둘다의 높은 입수가능성으로 인해 경제적으로 유리하다. 그렇지만, 커플링되는 공정의 열역학적 평형은, 두 효소 반응이 둘다 완전히 가역적이기 때문에 매우 과량인 아세톤의 존재에서도 콜린산의 정량적인 전환을 허용하지 않는다. 최적화된 조건에서, 12-케토-키노데옥시콜린산 내 콜린산의 단지 92%의 전환만이 25% (부피/부피) 아세톤을 함유하는 반응 혼합물에서 수득되었다.

최근에, NAD(P)H-의존성 알코올 데하이드로게나제에 의한 전자-유인기, 가령 α-할로-케톤 또는 1,3-디케톤을 내포하는 케톤의 준-비가역적으로 생체촉매되는 환원이 기술되었다(Bisogno F. R., Lavandera I., Kroutil W., Gotor V. J. Org . Chem ., 2009, 74, 1730-1732; Lavandera I., Kern A., Resch V., Ferreira-Silva B., Glieder A., Fabian W.M.F., de Wildeman F., Kroutil W., Organic Letters, 2008, 10, 2155-2158). 이들 문서에서, 이들 환원 반응이 예를 들면 2-옥탄올과 같은 2차 라세미 알코올의 효소적 분해와 커플링되어 공-기질의 양이 화학량론적(약 1.5 당량)인 것에 가깝게 사용되는 효율적인 보조인자 재생성 시스템을 가질 수 있음이 시사된다.

보조인자 NAD(P)⁺ 의 재생성을 위한 공-기질로서의 알코올 데하이드로게나제(ADH) 및 메틸 아세토아세테이트의 존재에서, NAD(P)⁺-의존성 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH)에 의한 담즙산, 이들의 염 또는 유도체, 가령 콜린산, 키노데옥시콜린산 또는 콜린산 메틸 에스테르의 위치선택적인 효소적 산화를 위한 신규한 공정이 놀랍게도 이제 밝혀졌다.

관심의 기질, 예를 들면 2-옥탄올의 산화에서, 그리고 소모용 공-기질, 예를 들면 클로로아세톤의 환원에서, 하나의 단일 ADH가 모두 반응하는 전술된 문서와는 상이하게도, 본 신규한 공정에서는 두 가지 상이한 효소 활성, HSDH 및 ADH의 커플링이 성취되었다.

이는 공정에 수반되는 두 효소의 활성 및 안정성에 대한 최적 반응 조건뿐만 아니라 기질 담즙산과 메틸 아세토아세테이트의 용해성 및 화학적 안정성을 동시에 보장하기 위한 가장 적절한 조건을 찾을 필요성을 시사한다. 이러한 관점에서, 담즙산이 7.5-8.0보다 높은 pH에서 나트륨 또는 칼륨 염의 형태로 수용성인 반면, 메틸 아세토아세테이트는 특히 25-30℃보다 높은 온도에서, 염기성 pH에서 안정하지 않음을 강조하는 것이 매우 중요하다. 이후, 산화 반응의 전환 정도에 대한 HSDH 및 ADH 효소의 양, 기질 담즙산 및 공-기질 메틸 아세토아세테이트의 농도, 온도, 및 pH와 같은 상이한 변수들의 영향을 실험적으로 검증함으로써 본 명세서에 제시된 공정이 도달되었다.

특히, 본 발명의 공정에서 사용되는 NAD(P)⁺-의존성 HSDH는 바람직하게는 0.25 내지 12 U 범위의 효소 활성을 가지고, 여기서 효소 활성(U)은 12.5mM 콜린산, 0.2mM NAD(P)⁺ 및 100mM 인산칼륨 완충액, pH 9.0을 함유하는 어세이 용액에서 1분 안에 1 마이크로몰의 콜린산 기질을 각각 위치 7 또는 12가 산화된 상응하는 생성물로 전환할 수 있는 효소 7α-HSDH 또는 12α-HSDH의 양을 의미한다.

화합물 (I), (II) 및 (III), 이들의 염 또는 유도체는 바람직하게는 0.5% 내지 4% (중량/부피) 범위의 농도, 즉 12.5mM 내지 100mM 범위의 농도로 사용된다.

보조인자 NAD(P)⁺는 바람직하게는 촉매적 양인, 0.2 내지 0.8mM 범위의 농도로 사용된다.

공-기질 메틸 아세토아세테이트는 각각의 화합물 (I), (II) 또는 (III)에 대하여 2 당량과 동일한 양으로 사용된다. 특히, 공-기질 메틸 아세토아세테이트는 0.3% 내지 2.4% (부피/부피) 범위의 양으로 사용된다.

본 발명의 공정은 바람직하게는 실온, 즉 약 20℃에서 수행되고, 바람직하게는 pH 8에서 수행된다.

게다가, 문헌의 실시예는 반응을 배타적으로 수성 환경에서 기술한 반면에, 본 신규한 공정은 이상성 완충액/유기 용매 반응 시스템에도 적용가능하며, 이는 또한 콜린산 메틸 에스테르와 같은 담즙산 에스테르의 기질로서의 사용을 허용할 수 있다.

본 발명의 공정에서 사용되는 보조인자 재생성 시스템은 이것이, 비용이 높지 않으며, 제조 규모에서, 사용되는 특정한 HSDH, 즉 7α-HSDH, 12α-HSDH 또는 이들의 조합에 따라, 정량적인 전환, 즉 99.5% 이상의 담즙산, 이들의 염 또는 유도체 가령 콜린산 ((I), 반응식 3), 콜린산 메틸 에스테르 ((II), 반응식 4) 및 키노데옥시콜린산 ((III), 반응식 5)이 각각 선택적으로 산화 유도체로 전환되는 것을 가능하게 하는 효소 및 공-기질, 즉 각각 알코올 데하이드로게나제 및 메틸 아세토아세테이트를 사용한다는 점에서 종래의 것보다 훨씬 더 경제적이고 효율적이다.

반응식 3 내지 5에서, (V)로 나타난 화합물은 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산이고, (VI)로 나타난 화합물은 3α,7α-디하이드록시-12-케토-5β-콜란산이고, (VII)로 나타난 화합물은 3α-하이드록시-7,12-케토-5β-콜란산이고, (VIII)로 나타난 화합물은 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 메틸 에스테르이고 (IX)로 나타난 화합물은 7-케토-리토콜린산이다. 이들 도식의 포인트 b)는 각각의 포인트 a)에서 산화 반응과 커플링된, NAD(P)H-의존성 알코올 데하이드로게나제에 의한 메틸 아세토아세테이트의 환원 반응을 기술한다.

반응식 3. a) HSDH 에 의해 촉매된 산화 반응; b) 보조인자 NAD (P) ⁺ 의 재생성 시스템

반응식 4. a) HSDH 에 의해 촉매된 산화 반응; b) 보조인자 NAD (P) ⁺ 의 재생성 시스템

반응식 5. a) HSDH 에 의해 촉매된 산화 반응; b) 보조인자 NAD (P) ⁺ 의 재생성 시스템

본 발명의 공정의 한 양태에 따르면, 산화 반응은 촉매적 양의 NAD(P)⁺와 함께 콜린산 (I) 또는 키노데옥시콜린산 (III) 나트륨 염을 함유하는 수용액에, 예를 들어 반응식 3에 기술된 12α-HSDH 및 7α-HSDH 또는 반응식 5에 기술된 7α-HSDH와 같은 NAD(P)⁺-의존성 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH)를 부가하는 일상성(monophasic) 시스템으로 수행되며, NAD(P)H로부터 NAD(P)⁺로의 재생성은 NAD(P)H-의존성 알코올 데하이드로게나제(ADH)를 이용하는 메틸 아세토아세테이트의 메틸 3-하이드록시부티레이트로의 전환을 통해 수행된다.

사용되는 기질 및 효소적 활성에 따라서, 반응((I)의 유도체 (V), (VI) 및 (VII)로의 산화 그리고 (VI)의 유도체 (VII)로의 산화(반응식 3), 및 (III)의 유도체 (IX)로의 산화(반응식 5))은 4 내지 16시간 범위의 시간 동안 수행되며, 기질 담즙산 나트륨 염은 보통 pH 8.0 및 20℃에서 0.5% 내지 4% (중량/부피)(즉 12.5 내지 100mM) 범위의 농도로 사용되고, NAD(P)⁺는 촉매적 양인, 0.2 내지 0.8mM 범위의 농도로 사용되며, 메틸 아세토아세테이트는 대개 담즙산 염에 대하여 2 당량과 동일한 양, 결과적으로는 0.3 내지 2.4% (부피/부피) 범위의 양으로 사용된다. 7α-HSDH에 의해 촉매되는 콜린산 메틸 에스테르 (II)의 위치 7에서의 하이드록실의 산화반응(반응식 4)은 20℃에서 pH 8.0에서 인산칼륨 완충액/i-프로필 아세테이트 이상성 시스템에서, 동일한 보조인자 재생성 시스템을 이용하여 수행된다. 기질 (II)은 i-프로필 아세테이트 내에 4% (중량/부피)와 동일한 농도(즉 100mM)로 용해되고, 0.8mM와 동일한 농도의 NAD(P)⁺ 및 (II)에 대하여 2 당량과 동일한 양의 메틸 아세토아세테이트, 결과적으로는 2.4% (부피/부피)와 동일한 양을 함유하는, 동일한 부피의 pH 8.0 인산칼륨 완충액에 부가된다.

본 명세서에 기술된 신규한 공정은 여러 다양한 이유로 인해 전술된 공정에 비하여 유리하다.

화학적 공정과 비교할 때, 신규한 공정은 HSDH의 거의 완전한 위치선택성으로 인해 산화를 요하지 않는 하이드록실 기의 보호가 불필요하다는 점에서, 더 단순하며 경제적으로 유리하다. 게다가, 본 공정은 온화한 반응 조건(예를 들면 20℃의 온도, 대기압 및 8.0과 동일한 pH)에서 수행될 수 있고, 이는 경제적 및 환경적 이익을 둘다 가져온다.

전술된 효소적 공정과 비교할 때, ADH로 보통 사용되는 것에 비해 감소된 과량의 공-기질(예를 들면 Fossati E., Polentini F., Carrea G., Riva S., Biotechnol . Bioeng., 2006, 93, 1216-1220에 기술된 바와 같이 4% (중량/부피) 콜린산 용액의 산화를 위해 25% 대신에 2.4%의 (부피/부피) 공-기질)을 사용하기 때문에 본 공정은 경제적으로 더욱 유리하다. 동시에, 신규한 공정은, 이것이 일반적인 케톤, 예를 들면 아세톤을, 공-기질로서 이용할 경우에는 열역학적인 이유로 인해 도달하지 못하는, 99.5% 이상의 전환을 가능하게 한다는 점에서 더욱 효율적이다. 게다가, 본 발명의 재생성 시스템은 산업 규모로 적용을 위해 개발되고, 이후 HSDH 동일한 특이성을 가지고 HSDH와 적절히 커플링될 수 있는 NADH- 및 NADPH-의존성 ADH 둘다의 이용가능성으로 인해, 종래의 것보다 더욱 변통성이 있다.

상기 기술된 공정에서 사용되는 효소는 다음과 같은 미생물 공급원으로부터 얻을 수 있다:

- NADPH-의존성 7α-HSDH 효소는 예를 들면 McDonald I.A., Hutchinson D.M., Forrest T.P., J. Lipid Res ., 1981, 22, 458-466에 기술되어 있고(원고 진행중), E. coli에서 클로닝되고 과발현되는 Clostridium absonum로부터 얻을 수 있다.

- NADH-의존성 7α-HSDH 효소는 E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS 유래 재조합체인 Bacteroides fragilis로부터 얻을 수 있으며, 이는 예를 들면 Zhu D., Stearns J.E., Ramirez M., Hua L., Tetrahedron, 2006, 62, 4535-4539에 기술되어 있다.

- NADPH-의존성 12α-HSDH 효소는 ASA Spezialenzyme GmbH (독일)에 의해 시판되는 Clostridium sp.로부터 얻을 수 있다.

- 미생물 공급원으로부터의 NADH-의존성 12α-HSDH 효소는 Genzyme Biochemicals Ltd. (영국)에 의해 시판되는 것일 수 있다.

- NADPH-의존성 ADH 효소는 Thermoanaerobacter brockii로부터 얻을 수 있으며, 이는 Peretz M., Bogin O., Tel-Or S., Cohen A., Li G., Chen J.-S., Burstein Y., Anaerobe, 1997, 3, 259-270에 기술되어 있고, 또는 SIGMA-ALDRICH에 의해 시판되는 미생물 공급원으로부터 얻을 수 있다.

- NADH-의존성 ADH 효소는 SIGMA-ALDRICH에 의해 시판되는 말 간으로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 공정을 통해 수득된 산화 유도체는 UDCA의 합성((IV), 도식 2)에서, Giordano C., Perdoncin G., Castaldi G., Angew . Chem . Int . Ed ., 1985, 24, 499-500; Magni A., Piccolo O., Ascheri A., US 4,834,919; Arosio R., Rossetti V., Beratto S., Talamona A., Crisafulli E., EP 0 424 232 A2; Hattori M., Mikami K., JP 06002184에 기술된 바와 같은 화학적 경로에 의해, 또는 대안적으로, 예를 들면 Riva S., Bovara R., Pasta P., Carrea G. J. Org . Chem ., 1986, 51, 2902-2906; Bovara R., Canzi E., Carrea G., Pilotti A., Riva S., J. Org . Chem ., 1993, 58, 499-501; Bovara R., Carrea G., Riva S., Secundo F. Biotechnology letters, 1996, 18, 305-308; Pedrini P., Andreotti E., Guerrini A., Dean M., Fantin G., Giovannini P. P., Steroids, 2006, 71, 189-198; Monti D., Ferrandi E. E., Zanellato I., Hua L., Polentini F., Carrea G., Riva S., Adv . Synth . Catal ., 2009, 351, 1303-1311에 기술된 바와 같은, 7β-HSDH에 의해 촉매되는 7번 케토 기의 위치- 및 입체-선택적 환원을 통한 효소적 경로에 의해 사용될 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명의 비-제한적인 예시로서 간주되어야 한다.

실시예

실시예 1 - 말 간으로부터의 NADH -의존성 ADH( SIGMA -ALDRICH)의 존재에서 Bacteroides fragilis 유래 NADH -의존성 7α- HSDH 에 의해 촉매되는 콜린산 (I)의 위치 7에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 0.5%(w/v) 콜린산 나트륨 염(12.5mM, pH 8.0의 0.2M 콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(0.3% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 12 U의 E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS 유래 재조합체인 Bacteroides fragilis로부터의 NADH-의존성 7α-HSDH, 0.1 U의 말 간으로부터의 NADH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.8mM NAD⁺ (40 μl의 10mM NAD⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

콜린산 (I)의 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 (V)으로의 완전 전환 (≥ 99.5%)을 16시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

실시예 2 - 말 간으로부터의 NADH -의존성 ADH( SIGMA -ALDRICH)의 존재에서 NADH -의존성 12α- HSDH ( Genzyme )에 의해 촉매되는 콜린산 (I)의 위치 12에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 0.5%(w/v) 콜린산 나트륨 염(12.5mM, pH 8.0의 0.2M 콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(0.3% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 4 U의 미생물 공급원으로부터의 NADH-의존성 12α-HSDH(Genzyme), 0.05 U의 말 간으로부터의 NADH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.2mM NAD⁺ (10 μl의 10mM NAD⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

콜린산 (I)의 3α,7α-디하이드록시-12-케토-5β-콜란산 (VI)으로의 완전 전환(≥ 99.5%)을 16시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

실시예 3 - T. brockii 로부터의 NADPH -의존성 ADH( SIGMA -ALDRICH)의 존재에서 NADPH -의존성 12α- HSDH ( ASA )에 의해 촉매되는 콜린산 (I)의 위치 12에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 0.5%(w/v) 콜린산 나트륨 염(12.5mM, pH 8.0의 0.2M 콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(0.3% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 4 U의 NADPH-의존성 12α-HSDH (ASA), 10 U의 T. brockii 로부터의 NADPH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.2mM NADP⁺ (10 μl의 10mM NADP⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

실시예 4 - E. coli 유래 재조합체 인 NADPH -의존성 ADH( SIGMA - ALDRICH )의 존재에서 C. absonum 로부터의 NADPH-의존성 7α- HSDH 에 의해 촉매되는 콜린산 (I)의 위치 7에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 4% (w/v) 콜린산 나트륨 염(100mM, pH 8.0의 0.2M 콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(2.4% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 0.25 U의 E. coli 유래 재조합체인 C. absonum 로부터의 NADPH-의존성 7α-HSDH, 4 U의 E. coli 유래 재조합체인 NADPH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.8mM NADP⁺ (40 μl의 10mM NADP⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

콜린산 (I)의 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 (V)으로의 완전 전환(≥ 99.5%)을 16시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

실시예 5 - T. brockii 로부터의 NADPH -의존성 ADH( SIGMA -ALDRICH)의 존재에서 C. absonum 로부터의 NADPH -의존성 7α- HSDH 에 의해 촉매되는 콜린산 (I)의 위치 7에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 0.5%(w/v) 콜린산 나트륨 염(12.5mM, pH 8.0의 0.2M 콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(0.3% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 4 U의 E. coli 유래 재조합체인 C. absonum로부터의 NADPH-의존성 7α-HSDH, 10 U의 T. brockii로부터의 NADPH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.2mM NADP⁺ (10 μl의 10mM NADP⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

콜린산 (I)의 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 (V)으로의 완전 전환(≥ 99.5%)을 4시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

실시예 6 - E. coli 유래 재조합체인 NADPH -의존성 ADH ( SIGMA - ALDRICH )의 존재에서 C. absonum 로부터의 NADPH -의존성 7α- HSDH 에 의해 촉매되는 12- 케토 -키노데옥시콜린산 ( VI )의 위치 7에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 4%(w/v) 12-케토-키노데옥시콜린산 나트륨 염(100mM, pH 8.0의 0.2M 12-케토-키노데옥시콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(2.4% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 4 U의 E. coli 유래 재조합체인 C. absonum로부터의 NADPH-의존성 7α-HSDH, 4 U의 E. coli 유래 재조합체인 NADPH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.8mM NADP⁺ (40 μl의 10mM NADP⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

12-케토-키노데옥시콜린산 (VI)의 3α-하이드록시-7,12-디케토-5β-콜란산 (VII)으로의 완전 전환(≥ 99.5%)을 16시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

실시예 7 - E. coli 유래 재조합체인 NADPH -의존성 ADH ( SIGMA - ALDRICH )의 존재에서 C. absonum 로부터의 NADPH -의존성 7α- HSDH 및 NADPH -의존성 12α- HSDH ( ASA )에 의해 촉매되는 콜린산 (I)의 위치 7 및 12에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 0.5%(w/v) 콜린산 나트륨 염(12.5mM, pH 8.0의 0.2M 콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(0.6% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 2 U의 E. coli 유래 재조합체인 C. absonum로부터의 NADPH-의존성 7α-HSDH, 4 U의 NADPH-의존성 12α-HSDH (ASA), 4 U의 E. coli 유래 재조합체인 NADPH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.8mM NADP⁺ (40 μl의 10mM NADP⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

콜린산 (I)의 3α-하이드록시-7,12-디케토-5β-콜란산 (VII)으로의 완전 전환(≥ 99.5%)을 16시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

실시예 8 - E. coli 유래 재조합체 인 NADPH -의존성 ADH( SIGMA - ALDRICH )의 존재에서 C. absonum 로부터의 NADPH-의존성 7α- HSDH 에 의해 촉매되는 키노데옥시콜린산 ( III )의 위치 7에서의 하이드록실의 산화.

20℃ 및 pH 8.0에서 다음을 함유하는 0.5 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: pH 8.0의 2%(w/v) 키노데옥시콜린산 나트륨 염(50mM, pH 8.0의 0.2M 키노데옥시콜린산 나트륨 염 수용액을 희석하여 수득), 2 당량(1.2% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 4 U의 E. coli 유래 재조합체인 C. absonum로부터의 NADPH-의존성 7α-HSDH, 3 U의 E. coli 유래 재조합체인 NADPH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.6mM NADP⁺ (30 μl의 10mM NADP⁺ 수용액), 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0.

키노데옥시콜린산 (III)의 7-케토-리토콜린산 (IX)으로의 완전 전환(≥ 99.5%)을 16시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

실시예 9 - E. coli 유래 재조합체 인 NADPH -의존성 ADH( SIGMA - ALDRICH )의 존재에서 C. absonum 로부터의 NADPH-의존성 7α- HSDH 에 의해 촉매되는 콜린산 메틸 에스테르 ( II )의 위치 7에서의 하이드록실의 이상성 시스템의 산화.

20℃, pH 8.0및 1400 rpm에서 다음을 함유하는 1 ml의 총 부피에서 반응을 수행하였다: a) 0.5 ml의 콜린산 메틸 에스테르의 4% i-프로필 아세테이트 용액 (w/v) (100mM, 20 mg의 콜린산 메틸 에스테르를 0.5 ml의 i-프로필 아세테이트에 용해하여 수득); b) 0.5 ml의 50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0, 이는 다시 2 당량(2.4% (v/v))의 메틸 아세토아세테이트, 5.5 U의 E. coli 유래 재조합체인 C. absonum로부터의 NADPH-의존성 7α-HSDH, 4 U의 E. coli 유래 재조합체인 NADPH-의존성 ADH(SIGMA-ALDRICH), 0.8mM NADP⁺ (40 μl의 10mM NADP⁺ 수용액)를 함유함.

콜린산 메틸 에스테르 (II)의 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 메틸 에스테르 (VIII)로의 완전 전환(≥ 99.5%)을 16시간 내에 얻었다. 용리 시스템으로서 클로로포름/메탄올/아세트산 (10:1:0.5)을 이용하는 TLC 분석에 의해 전환의 정도를 평가하였다.

Claims

식

의 화합물 또는 이들의 염 또는 유도체의 위치 7 및/또는 12에서 위치선택적인 효소적 산화를 위한 공정이되, 메틸 아세토아세테이트 및 NAD(P)⁺-의존성 알코올 데하이드로게나제 (ADH)를 포함하는 보조-인자 NAD(P)⁺의 재생성 시스템의 존재에서, 상기 화합물을 NAD(P)⁺-의존성 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 (HSDH)와 반응시키는 단계를 포함하는 공정.
제1항에 있어서, NAD(P)⁺-의존성 HSDH는 0.25 내지 12 U 범위의 효소 활성을 가지는 공정.
제1항에 있어서, 식 (I), (II) 또는 (III)을 가지는 화합물, 이들의 염 또는 유도체는 0.5% 내지 4%(중량/부피) 범위의 농도를 가지는 공정.
제1항에 있어서, 식 (I), (II) 또는 (III)을 가지는 화합물, 이들의 염 또는 유도체는 12.5mM 내지 100mM 범위의 농도를 가지는 공정.
전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 보조인자 NAD(P)⁺는 촉매적 양인, 0.2mM 내지 0.8mM 범위의 농도로 사용되는 공정.
전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 공-기질 메틸 아세토아세테이트는 각각의 화합물 (I), (II) 및 (III)에 대해 2 당량과 동일한 양으로 사용되는 공정.
전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 공-기질 메틸 아세토아세테이트는 0.3% 내지 2.4% (부피/부피) 범위의 양으로 사용되는 공정.
전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 산화는 정량적인, 즉 99.5% 이상인 공정.
전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 실온, 즉 약 20℃에서 수행되는 공정.
전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 8과 동일한 pH에서 수행되는 공정.
제10항에 있어서, 바람직하게는 인산칼륨 완충액으로 이루어진 완충액 시스템을 더욱 포함하는 공정.
제1항에 있어서, 수성/유기 이상성 시스템에서 수행되는 것을 특징으로 하며, 여기서 유기 용매는 바람직하게는 i-프로필 아세테이트인 공정.
제11항 및 제12항에 있어서, 완충액 시스템은 인산칼륨 완충액이고 유기 용매는 i-프로필 아세테이트인 공정.
제1항에 있어서, 콜린산 또는 키노데옥시콜린산 염은 나트륨 염인 공정.
우루소데옥시콜린산 (IV)의 제조를 위한 공정이되, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 (IV)의 합성을 위한 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
우루소데옥시콜린산 (IV)의 제조를 위한 공정이되, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 3α,7α-디하이드록시-12-케토-5β-콜란산 (VI)의 합성을 위한 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
우루소데옥시콜린산 (IV)의 제조를 위한 공정이되, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 3α-하이드록시-7,12-케토-5β-콜란산 (VII)의 합성을 위한 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
우루소데옥시콜린산 (IV)의 제조를 위한 공정이되, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 7-케토-리토콜린산 (IX)의 합성을 위한 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
우루소데옥시콜린산 (IV)의 제조를 위한 공정이되, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 메틸 에스테르 (VIII)의 합성을 위한 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.