KR20140018814A - 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아래 일반식으로 표시되는 성분, 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 손상된 골 형성의 치료에 효과적일 뿐만 아니라 골다공증 등의 골 관련 질환 예방, 개선을 위해서도 안전하고 유효하게 사용될 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 손상된 골 형성의 치료에 효과적일 뿐만 아니라 골다공증 등의 골 관련 질환 예방, 개선을 위해서도 안전하고 유효하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 담즙산으로부터 유도되는 화합물, 그의 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하며, 염증 반응 억제, 지방 분화 억제 및 골 세포로의 분화를 촉진하여 골 관련 질환 예방 및 개선 효과를 나타내는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
뼈는 신체를 지지하는 단단한 조직으로 내부 골격을 구성하고 장기를 보호하는 기능을 한다. 골 조직은 뼈 기관의 단단한 부분을 구성함으로써 골격 계를 이루는 역할을 한다. 골 조직은 크게 치밀골질(compact osseous tissue)과 해면골질(sponge osseous tissue)로 이루어져 있는데 둘은 미세 구조 배열에 따라 나눠진다.
이러한 뼈에 결함이 생기게 되면 보통 골 이식 재료를 사용해 치료를 하게 된다. 이러한 골 이식 재료는 크게 세가지 종류로 나눌 수 있는데, 첫째 골 형성 재료(Osteogenerative material)는 환자 본인의 뼈를 사용하는 것으로, 환자 본인의 뼈를 이식하여 이식재 안에서 살아남은 본인의 골 세포가 신생 골을 형성한다. 첫번째 재료의 경우 효과는 좋지만 수술을 여러 번 해야 하는 단점이 있다. 두 번째는 골 전도성 재료(Osteoconductive material)로 골 세포가 자라 들어올 수 있는 매개체 역할을 하며 이식재의 흡수와 신생 골의 침착이 반복적으로 일어나 치유가 된다. 마지막 골 형성 유도성 재료(Osteoinductive material)는 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMPs)로, 이식재 내에 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMPs) 과 같은 물질이 주위에 있는 환자의 미분화 간엽세포들을 골세포 (Osteoblst) 등으로 분화할 수 있도록 도와주어 신생 골을 형성하는 방법이다.
상기 골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein; BMP)은 골 재생 또는 골 분화를 일으키는 강력한 성장인자로 알려져 있다. 몇몇 연구에서는 골 형성 단백질이 골수 줄기 세포를 자극해 골 세포로의 분화를 촉진시키는데 중요한 역할을 한다고 밝혀 내었다(Reddi, AH. J Bone Joint Surg Am 83A, S1, 2001). 하지만 여러 가지 문제점도 함께 가지고 있다. 골 형성 단백질은 짧은 반감기를 가지고 있으며 용액상태에 존재할 때는 활성을 쉽게 잃는다(Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Biomaterials 2005; 26:4856-65). 또한 지지체와 함께 이식했을 때 지속적인 방출이 어려워 대량의 골 형성단백질이 한꺼번에 빠져나올 가능성이 크다. 이렇게 될 경우 면역체계에 이상이 생기거나 뼈가 과다하게 자라는 등 사람에게 사용했을 때 치명적인 문제가 생길 수 있으므로 새로운 약물을 찾거나 더 효과적인 약물방출 시스템이 시급한 상황이다(Shields LB, Raque GH, Glassmas SD, et al. Spine 2006; 31:542-7).
간에 의해 분비되어 담낭에 저장되는 담즙은 담낭에 저장되며, 여러 목적을 위해 연구되어 왔는데, 예를 들면 간기능에 의해 쉽게 대사되는 약제의 생체이용성을 증가시키기 위하여(WO 90/12583), 포유동물에서 백혈구증다증 촉진을 억제하기 위하여(Shinoda et al., Chem. Pharm. Bull., 30, 4429-4434(1982)) 담즙 추출물을 이용하는 것을 들 수 있다. 그러나, 이러한 담즙 또는 이의 유도체가 골 관련 질환의 예방 및 치료에 효과가 있다는 사실에 대해서는 알려진 바 없다.
본 발명자는 손상된 골 대체를 위한 골 형성 촉진, 골다공증 등 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 대해 연구를 수행 하던 중 담즙산으로부터 유도되는 화합물 및 이의 유도체가 염증 반응 억제 및 지방 분화 억제를 통하여 골형성단백질을 사용한 경우와 유사하게 골 재생을 촉진한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Reddi, AH. J Bone Joint Surg Am 83A, S1, 2001
Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Biomaterials 2005; 26:4856-65
Shields LB, Raque GH, Glassmas SD, et al. Spine 2006; 31:542-7
Fernandez-Sanchez et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.2011;52(8):
Rivard, Andrew L et al. American Journal of Chinese Medicine, Vol.35, No.2(2007)279-295
본 발명은 담즙산으로부터 유도되는 화합물 및 그의 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 담즙산으로부터 유도되는 화합물 및 그의 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 골 관련 질환 예방 및 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 아래 [일반식]으로 표시되는 화합물, 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
[일반식]
상기 식에서 R1, R2, R3, R4, R5 는 H, OH, 알킬, 아릴, (CH2)nOH, CO2CH3 또는 CO2C(CH3)3 를 나타내고, R6는 H,NHCH2COOH, NH(CH2)2SO2OH, CH(CH3)O(CH2)nCH3 (n=1~3)를 나타낸다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에는 골 조직 재생 촉진 작용을 나타내는 한, 이들 화합물뿐만 아니라, 이의 염을 사용할 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 있어서, 상기 일반식으로 표시되는 화합물은 담즙으로부터 분리되는 특정 담즙산 성분들, 예를 들어 콜산, 글리코콜산, 데옥시글리코콜산, 우르소데옥시콜산, 콜레스테롤 설페이트, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산 및 타우로콜산 뿐만 아니라, 이들이 다른 아미노산(특히 글리신 또는 타우린)과 접합된 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 염을 사용할 수 있다.
상기 일반식으로 나타내어지는 화합물 중 타우로우로소데옥시콜리산(tauroursodeoxycholic acid; TUDCA) 은 담즙산의 일종으로 아래 화학식 1로 나타내어지고 콜레스테롤을 전구체로 하여 간으로부터 생성된다.
[화학식 1]
상기 타우로우루소데옥시콜릭산은 원발성 담즙성간경변 (Primary biliary cirrhosis) 치료제로 FDA의 승인을 받은 약물이다. 또한 여러 동물실험을 통해 뇌 신경계 퇴행성기전(Neurodegeneration)을 예방한다는 것이 알려져 있다. 헌팅턴 병(Huntington's Disease, Keene et al. 2002), 파킨슨씨 병(Parkinson's Disease, Duan et al. 2002), 및 급성기 뇌졸중(Acute stroke, Rodrigues et al. 2002) 에도 예방효과가 있다는 연구가 있다. 최근에는 막망색소변성증 (Retinitis pigmentosa, RP)에도 효과가 있다는 것이 밝혀졌다(Fernandez-Sachez L et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.2011; 52 (8): 4998-5008). 또한 세포사멸 억제를 통한 심근경색 예방(Rivard, Andrew L et al. American Journal of Chinese Medicine, Vol. 35, No. 2 (2007) 279-295), 지방 분화억제로 비만치료제로 각광받는 등 여러 가지 기능을 가진 약물이다. 그러나, 이러한 타우로우루소데옥시콜릭산이 골 관련 질환의 예방 및 치료에 효과가 있다는 사실에 대해서는 알려진 바 없다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 줄기 세포의 지방 세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 줄기 세포의 골 세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 MEK-1/2 를 활성화하고, 활성화된 MEK-1/2 에 의하여 줄기 세포의 골 세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 있어서, 상기 줄기 세포는 지방 유래 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 염증 반응을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 세포 사멸을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 골형성단백질(Bone morphoenetic protein; BMP)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 있어서, 상기 골형성단백질은 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12, BMP-13 및 BMP-52으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1개 또는 2개 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 있어서, 상기 일반식으로 나타내어지는 화합물은 전체 조성물 1 ml 당 20μg 내지 160μg 이 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 골다공증, 골 손실, 골 형성; 타입 II/연령 관련/노령 골다공증 진행 중의 골 형성, 발달 및 성장 기간 중 더 높은 최대 골 질량(peak bone mass) 달성, 절골 치료, 손상된 골 대체를 위한 인 비트로(in vitro)/인 비보(in vivo)에서의 새로운 골 형성 촉진을 위해 사용되는 것이 가능하다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 다양한 투여 형태, 예를 들어 정제, 캡슐제 등의 경구용 투여 형태 및 주사용 액제, 현탁액제, 에멀젼, 동결건조 제제 등의 비경구용 투여 형태로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 주사용 액제, 현탁액제로 제제화 될 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물은 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘(Magnesium stearate), 탈크(talc) 등과 같은 활택제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀(liquid paraffin) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 등이 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일(olive oil)과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물이 주사제인 경우에 상기 주사제의 투여량은 0.01 ~ 30 mg/kg 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 상기 일반식으로 표시되는 화합물 외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제 등을 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 상기 일반식 1로 표시되는 화합물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 골 대사의 개선 뿐만 아니라 골 대사성 질환의 개선, 경감, 예방에 매우 유용하다.
본 발명에 의한 화합물, 그의 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 약제학적 또는 식품 조성물은 담즙산으로부터 분리 유도되고, 염증 반응 억제, 세포사 억제 및 지방 세포로의 분화 억제, 골 세포로의 분화 촉진에 의하여 종래 골 형성 단백질과 동일한 수준의 골 조직 재생을 유도하는 효과를 나타내므로 손상된 골 형성의 치료에 효과적일 뿐만 아니라 골다공증 등의 골 관련 질환 예방, 개선을 위해서도 안전하고 유효하게 사용될 수 있다.
도 1 은 두개골 양쪽에 4mm 지름의 구명이 뚫려있는 골 결손 마우스 모델을 나타낸다.
도 2 는 샘플링한 두개골의 micro CT 사진을 나타낸다.
도 3 은 micro CT 사진을 이용하여 골 재생율을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 4 는 샘플링한 두개골 샘플을 Goldener's trichrome 염색법으로 염색한 결과를 나타낸다.
도 5 는 샘플링한 두개골 샘플을 Hematoxylin & Eosin 염색법으로 염색한 결과를 나타낸다.
도 6은 두개골 이식 지지체 샘플에 대해 면역염색(Immunohistochemistry staining)을 하고, 염증(inflammation) 관련 마커인 IL-1β(Interleukin-6β)와 TNFα(Tumor necrosis factor α)의 발현 결과를 현광현미경을 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 7 및 도 8 은 두개골 이식 지지체 샘플에 있어서 염증관련 마커인 IL-1β와 TNFα 유전자의 발현 결과를 RT-PCR 로 측정한 결과 및 정량화한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 지방세포로의 분화 정도를 RT-PCR 방법으로 지방세포 분화 관련 마커의 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10, 도 11은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 지방세포로의 분화 정도를 Oil red O 염색법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 12, 도 13은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 골세포로의 분화 정도를 Alizarin Red S 염색법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 14, 도 15 는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 골세포로의 분화 정도를 RT-PCR 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 타우로우루소데옥시콜릭산에 의한 골 분화가 유도되는 과정을 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 TUDCA 처리에 의한 세포사에 대한 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 18 및 도 19는 두개골 이식 지지체 샘플에 있어서 세포사 및 항세포사 관련 유전자의 발현 결과를 RT-PCR 로 측정한 결과 및 정량화한 결과를 나타낸다.
도 2 는 샘플링한 두개골의 micro CT 사진을 나타낸다.
도 3 은 micro CT 사진을 이용하여 골 재생율을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 4 는 샘플링한 두개골 샘플을 Goldener's trichrome 염색법으로 염색한 결과를 나타낸다.
도 5 는 샘플링한 두개골 샘플을 Hematoxylin & Eosin 염색법으로 염색한 결과를 나타낸다.
도 6은 두개골 이식 지지체 샘플에 대해 면역염색(Immunohistochemistry staining)을 하고, 염증(inflammation) 관련 마커인 IL-1β(Interleukin-6β)와 TNFα(Tumor necrosis factor α)의 발현 결과를 현광현미경을 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 7 및 도 8 은 두개골 이식 지지체 샘플에 있어서 염증관련 마커인 IL-1β와 TNFα 유전자의 발현 결과를 RT-PCR 로 측정한 결과 및 정량화한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 지방세포로의 분화 정도를 RT-PCR 방법으로 지방세포 분화 관련 마커의 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10, 도 11은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 지방세포로의 분화 정도를 Oil red O 염색법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 12, 도 13은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 골세포로의 분화 정도를 Alizarin Red S 염색법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 14, 도 15 는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 줄기 세포들의 골세포로의 분화 정도를 RT-PCR 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 타우로우루소데옥시콜릭산에 의한 골 분화가 유도되는 과정을 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에서 TUDCA 처리에 의한 세포사에 대한 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 18 및 도 19는 두개골 이식 지지체 샘플에 있어서 세포사 및 항세포사 관련 유전자의 발현 결과를 RT-PCR 로 측정한 결과 및 정량화한 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 비교예, 실시예, 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
타우로우루소데옥시콜릭산
담지
콜라겐스폰지
지지체 이식
6주령의 female ICR 마우스(Institue Research of Cancer. Orient bio, Korea)의 머리부분 피부를 절개하고, 도 1과 같이 두개골 양쪽에 치과용 드릴을 이용해 4mm의 골 결손 마우스 모델을 제작하였다.
하기 표 1에서와 같이 타우로우루소데옥시콜릭산과 BMP-2 를 증류수 25㎕에 녹인 후 그 용액을 콜라젠 지지체에 흡수시키고 동결건조하여 콜라겐 지지체에 담지시키고, 이와 같이 타우로우루소데옥시콜릭산 또는 BMP-2 가 담지된 콜라겐스폰지 지지체를 마우스 모델의 골 결손 부위에 이식하고, 대조군에는 아무것도 이식하지 않고 절개했던 피부를 봉합하였다.
| 구분 | 처리 용액 |
| 실시예 1-1 | 콜라겐스폰지 + TUDCA |
| 실시예 1-2 | 콜라겐스폰지 + TUDCA + BMP-2 1㎍/25㎕ |
| 실시예 1-3 | 콜라겐스폰지 + TUDCA + BMP-2 3㎍/25㎕ |
| 비교예 1-1 | 콜라겐스폰지 |
| 비교예 1-2 | 콜라겐스폰지 + BMP-2 1㎍/25㎕ |
| 비교예 1-3 | 콜라겐스폰지 + BMP-2 3㎍/25㎕ |
이후, 타우로우루소데옥시콜릭산을 체내에 장기간 공급해주기 위해 실시예 1-1 내지 1-3의 결손부위에 봉합 후 14일 동안 이틀에 한번씩 반복적으로 500μM의 타우로우루소데옥시콜릭산 용액을 25㎕씩 주사하였다. 반복적으로 주사한 결과 전체 주사량은 18.27 mg 였다.
<
실험예
1-1>
Micro
CT
를 이용한 결손 부위 골 재생 정도 평가
상기 실시예 1에서 타우로우루소데옥시콜릭산과 BMP-2 이 담지된 콜라겐 지지체를 골 결손 마우스 모델내에 이식하고 8주 후 골 결손 마우스 모델의 두개골을 얻은 후 Micro CT(Sky scan 1076-in vivo x-ray micro tomography)를 사용하여 두개골을 촬영하고, 골 재생율을 평가하였다.
도 2는 micro CT 사진을 나타낸다. 도 2 에서 대조군은 골이 거의 재생되지 않았으며, 타우로우루소데옥시콜릭산을 첨가한 실시예 1-1의 경우 타우로우루소데옥시콜릭산을 첨가하지 않은 비교예 1-1에 비해 골이 재생된 정도가 확연하게 차이가 나는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 2에서 타우로우루소데옥시콜릭산이 단독으로 쓰인 실시예 1-1이 타우로우루소데옥시콜릭산과 골형성 단백질 BMP-2를 함께 사용한 실시예 1-2, 1-3과 유사한 골 재생 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
<
실험예
1-2> 골
재생율
평가
상기 실험예 1의 micro CT 사진에서 골 결손 부위의 골 재생면적을 측정하여 정량적으로 골 재생율을 평가하였다. 평가된 골 결손 부위 골 재생면적을 하기 표 2와 도 3에 나타내었다.
| 구분 | 골 재생율(%) | |
| 대조군 | 미처리 | 14.5 |
| 실시예 1-1 | 콜라겐스폰지 + TUDCA | 85.5 |
| 실시예 1-2 | 콜라겐스폰지 + TUDCA + BMP-2 1㎍ | 67.9 |
| 실시예 1-3 | 콜라겐스폰지 + TUDCA + BMP-2 3㎍ | 83.5 |
| 비교예 1-1 | 콜라겐스폰지 | 52.2 |
| 비교예 1-2 | 콜라겐스폰지 + BMP-2 1㎍ | 64.5 |
| 비교예 1-3 | 콜라겐스폰지 + BMP-2 3㎍ | 75.3 |
상기 표 2에서 보는 바와 같이 대조군은 골 재생율이 14.5%로 거의 재생되지 않았으며, 콜라겐스폰지 지지체에 TUDCA 를 단독으로 첨가한 실시예 1-1의 골 재생율은 85.5%로 거의 대부분의 결손부위가 재생되었고, 특히 골형성 단백질 BMP-2 를 3㎍ 포함하는 실시예 1-3 의 83.5 % 보다도 높은 골 재생율을 나타내었다.
<
실험예
1-3> 골 재생 정도의 조직학적 평가
<
실험예
1-3-1> 두개골 샘플 제조
실험예 1 에서 8주 후 얻은 두개골을 조직학적으로 분석하였다. 두개골 샘플은 decalcifying solution(sigma Aldrich, USA)을 사용해 탈회 과정을 거쳤다. 이 후 에틸 알코올을 이용한 탈수 과정, 파라핀 침투를 용이하게 해주는 투명제(자일렌)를 이용한 투명과정 후 파라핀 침투를 하였다. 침투가 완료된 조직은 블록(block)을 만들기 위해 파라핀 포매(embedding)를 거친 후, 박절기(microtome)를 이용하여 조직을 얇게 떠 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 염색을 하였다.
<
실험예
1-3-2>
Goldner's
Trichrome
염색을 통한 재생 정도 평가
재생된 골의 질을 평가하는데 있어서는 micro CT 사진에서 측정하는 재생 면적뿐만 아니라 골 밀도, 강도, 골의 미네랄화 된 정도 마지막으로 골의 두께 등이 중요한 요소로 작용한다. Goldner's Trichrome 염색은 골 재생을 확인하기 위한 가장 일반적인 염색법으로, Goldner's Trichrome 염색을 통해 이러한 요소들을 확인할 수 있기 때문에 재생 된 골의 질을 효과적으로 평가할 수 있다.
도 4는 타우로우루소데옥시콜릭산을 첨가한 실시예와 타우로우루소데옥시콜릭산을 첨가하지 않은 비교예에 대한 Goldener's Trichrome 염색을 한 골 사진이다(Scale bar=1mm).
도 4에서 상기 실험예 2에서 골 재생 면적 측정을 통한 골 재생율 평가 결과와 마찬가지로 타우로우루소데옥시콜릭산을 첨가한 실시예가 첨가하지 않은 비교예에 비하여 높은 골 재생율을 나타낸다.
재생된 골의 두께도 타우로우루소데옥시콜릭산을 첨가한 실시예가 첨가하지 않은 비교예에 비하여 두껍고, Mineralized bone matrix(green)와 파골 세포의 식작용으로 생겨난 파괴된 경골의 파편들로 이루어진 라쿠나구조(red)도 많이 생성되어 재생된 골이 원래 골과 차이가 없는 양질의 골이 재생되었음을 확인할 수 있다. 이는 타우로우루소데옥시콜릭산이 골 재생에 있어서 BMP-2와 거의 유사하게 작용하하는 것을 보여주는 결과라고 할 수 있다.
<
실험예
1-3-3>
Hematoxylin
&
Eosin
염색을 통한 재생 정도 평가
Hematoxylin & Eosin 염색은 모든 조직에 기본적으로 사용하는 염색법이다. 이 염색법은 핵과 세포질을 잘 구분해 주는 장점이 있다.
도 5는 골조직의 Hematoxylin & Eosin 염색 사진이다. Goldner's Trichrome 염색과 같은 두개골 조직을 사용했기 때문에 재생율과 두께 및 모양은 같으며, Bone matrix에 Osteocyte(violet spot)들이 잘 발달되어 있는 것을 확인할 수 있다. (Scale bar=1)
이상과 같은 micro CT 사진, micro CT 정량 그래프, 조직학적 평가로부터 골 재생 촉진에 있어서 타우로우로소데옥시콜릭산은 골 형성 단백질 BMP-2 의 2~3 μg에 준하는 골 재생 효율을 보이며, 골 형성 단백질인 BMP-2와 같이 쓰였을 때 효과적으로 골 재생을 촉진하는 것을 확인할 수 있다.
<
실험예
1-4> 면역 염색법에 의한
TUDCA
처리에 따른 염증반응 평가
상기 실시예 1-3에서 제작된 두개골 이식 지지체 샘플에 대해 면역염색(Immunohistochemistry staining)을 하고, 염증(inflammation) 관련 마커인 IL-1β(Interleukin-6β)와 TNFα(Tumor necrosis factor α)의 발현 결과를 현광현미경을 이용하여 측정하였으며(Scale bar=100 ㎛), 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6 에서 TUDCA 미처리 군에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군에서 녹색의 IL-1β와 적색의 TNFα의 발현이 현저히 높은 것을 확인 할 수 있었다.
<
실험예
1-5>
RT
-
PCR
에 의한
TUDCA
처리에 따른 염증반응 평가
상기 실시예 1-3에서 제작된 두개골 이식 지지체 샘플에 있어서 염증관련 마커인 IL-1β와 TNFα 유전자의 발현 결과를 RT-PCR 로 측정하였다.
RT-PCR에 사용된 프라이머 세트는 IL-1β 프라이머 세트로 센스 프라이머: 5'-TTC TCT TCA GCC AAT CTT CAT-3' 및 안티센스 프라이머: 5'-ACA TTC AGC ACA GGA CTC TCT-3' (기원: NM_00576)의 서열과 TNFα 프라이머 세트로 센스 프라이머: 5'-CTG GGC AGG TCT ACT TTG GG-3' 및 안티센스 프라이머: 5'-CTG GAG GCC CCA GTT TGA AT-3' (기원: NM_000594.3) 을 사용하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7 에서 TUDCA 미처리 군에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군에서 IL-1β와 TNFα의 발현이 낮아진 것을 확인할 수 있다.
<
실험예
1-6> 염증 반응에 대한 정량적 평가
이미지 어날라이져 (Image J, USA)를 이용하여 상기 실험예 5 에서 측정된 도 7의 RT-PCR 결과에서 각 유전자의 발현의 정도를 Pixel 당 white color intensity의 값을 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 Pixel 당 white color intensity의 값으로 나눠준 값으로 정량하하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8 에서 TUDCA 미처리 군 (IL-1β: 0.509±0.024 , TNFα: 0.261±0.012)에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군 (IL-1β: 0.271±0.007, TNFα: 0.177±0.005)에서 IL-1β와 TNFα의 발현이 통계적으로 낮은 발현을 나타내었다.
이로부터 TUDCA 미처리 군에 비교해 TUDCA 처리의 경우 골 재생 시에 항염증 반응이 효과적으로 유도되는 것을 확인할 수 있다.
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실시예
2> 지방 세포로의 분화 억제
<
실시예
2-1> 인간 지방-유래 줄기세포의 분리 및 배양
차의과학대학 부속병원의 윤리위원회의 허가 아래, 환자로부터 동의를 받고, 지방흡입(liposuction) 방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 오염된 혈액을 제거하기 위해, 얻어진 지방 조직을 (phosphate buffered saline, PBS)(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 3회 세척하였다. 이어서 지방조직을 0.2 w/v% 소혈청알부민 함유 PBS와 2 mg/mL 타입 Ⅱ 콜라게네이즈(Sigma)로 45분 동안 37℃에서 소화시켰다. 70 ㎛ 필터로 여과하고, 여액을 원심분리한 후 부유하는 지방세포를 제거하였다.
분리된 지방-유래 줄기세포(ASCs)을 줄기세포 배양액[1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 10%의 우태아혈청 (FBS) (Invitrogen, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco BRL,Gaithersburg, MD)]에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 3회 또는 4회째 계대 배양된 세포를 이후 실험에서 사용하였다.
<
실시예
2-2> 지방세포로의 분화 억제 활성 평가
상기 실시예 2-1에서 얻어진 인간 지방-유래 줄기세포를 증식단계(Proliferation phase)와 지방세포로의 분화단계(Differentiation phase)로 나누어 배양하였다.
상기 실시예 2-1에서 얻어진 인간 지방-유래 줄기세포는 아래 표 3에 나타낸 바와 같이 5개의 군으로 나누었다. 비교그룹(Not induced 그룹)은 줄기세포 배양액에서 15일 배양하였고; 제1군(Group 1)은 줄기세포 배양액에 5일 동안 배양한 후, 지방세포 분화용 배지에서 10일 동안 배양하였고; 제2군은 TUDCA 50 μM를 첨가한 줄기세포 배양액에서 5일 동안 배양한 후, TUDCA의 처리없이 지방세포 분화용 배지에서 10일 배양하였고; 제3군(Group 3)은 TUDCA 처리없이 줄기세포 배양액에서 5일 배양한 후 TUDCA 50 μM를 첨가한 지방세포 분화용 배지에 10일 동안 배양하였고; 제4군(Group 4)은 TUDCA 50 μM를 증식단계와 분화단계 모두에서 첨가하여 배양하였다.
| 대조군 | 줄기세포 배양액 15일 |
| 그룹 1(G1) | 증식단계(줄기세포 배양액 5일) + 지방세포 분화단계(지방세포 분화용 배지 10일) |
| 그룹 2(G2) | 증식단계(줄기세포 배양액 5일 +50uM TUDCA) + 지방세포 분화단계(지방세포 분화용 배지 10일) |
| 그룹 3(G3) | 증식단계(줄기세포 배양액 5일) + 지방세포 분화단계(지방세포 분화용 배지 10일 + 50uM TUDCA) |
| 그룹 4(G4) | 증식단계(줄기세포 배양액 5일 +50uM TUDCA) + 지방세포 분화단계(지방세포 분화용 배지 10일 +50uM TUDCA) |
증식단계(Proliferation phase)에서는 인간 지방-유래 줄기세포를 1×104 cells/cm2의 밀도로 파종하고, 줄기세포 배양액[1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 10%의 우태아혈청(FBS)(Invitrogen, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco BRL,Gaithersburg, MD) 배양하였고, 지방세포로의 분화단계(Differentiation phase)에서는 지방세포 분화용 배지(StemProAdipogenesis Differentiation Kit, Gibco BRL) 중에서 배양하였다.
<
실험예
2> 지방세포로의 분화 억제 활성 측정
<
실험예
2-1> 지방세포 분화 관련
마커
발현 측정
상기 대조군 및 그룹 1 내지 그룹 4 의 줄기 세포들의 지방세포로의 분화 정도를 측정하기 위해 RT-PCR 방법으로 지방세포 분화 관련 마커의 발현을 측정하였다.
RT-PCR에 사용된 프라이머 세트는 PPARδ 프라이머 세트로는 센스 프라이머: 5'-AGA CAA CAG ACA AAT CAC CAT-3' 및 안티센스 프라이머: 5'-CTT CAC AGC AAA CTC AAA CTT-3' (기원: NM_138711)의 서열을 사용하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 실시예 2-4 의 세포들에서 대조군을 포함한 그룹 1 내지 그룹 3의 세포들에 비해서 지방세포 분화 초기 마커인 PPARγ의 발현이 낮은 것을 알 수 있다.
<
실험예
2-2> 지방세포로의 분화에 대한 평가
상기 실시예 2-1 의 그룹 1 내지 그룹 4의 줄기 세포들의 지방세포로의 분화 정도를 Oil red O 염색법을 통해서 측정하고, 지방세포 분화에 미치는 TUDCA의 영향을 확인하였다.
Oil red O 염색법은 Ramirez-Zacarias 등의 방법[Histochemistry 97, 493-497, (1992)]을 따라 실시하였다. 각 군의 세포를 PBS로 2회 세척하고 0.5 ㎖의 Oil Red O 용액(60% 이소프로판올 중 0.36% Oil Red O)을 첨가하여, 실온에서 15 분 동안 처리하였다. 염색액을 제거하고, 60% 이소프로판올로 3회 세척후 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 자색은 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 염색된 부착 세포를 나타내고, 적색 부분은 지질적하(Lipid drop)을 나타낸다(Scale bar=100 ㎛). 도 10에서 그룹 1 및 그룹 2 의 경우에는 지질적하가 상당히 많이 발생하였으며, 특히 증식 및 분화과정 모두에서 TUDCA를 처리하지 않은 그룹 1에서 적색으로 염색된 지질적하가 매우 많이 관찰되었다. 반면, 분화단계에서 TUDCA가 포함된 그룹 3 과 그룹 4 의 경우는 그룹 1 및 그룹 2 에 비해 지질적하가 상대적으로 적게 관찰되었다.
<
실험예
2-3>
지질적하에
대한 정량분석
Oil red O 추출 정량법을 이용해서 생성된 지질적하를 정량적으로 분석하였다. Oil red O 염색 후 현미경 관찰 이후에 각 군을 PBS로 2번 세척하고, 60% 이소프로판올로 지질적하를 추출하고, 500 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량분석 하고 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 그룹 1 및 그룹 2 의 경우에는 각각 0.300±0.033와 0.236±0.020의 흡광도를, 분화단계에서 TUCDA를 처리한 그룹 3 과 그룹 4 의 경우 각각 0.189±0.004, 0.162±0.013의 상대적으로 낮은 흡광도를 나타내었다. 그룹 3 과 그룹 4 사이의 통계수치를 제외한 모든 군 간에는 통계적으로 유의한 결과를 나타냈다 (*,p<0.01).
상기 Oil red O 염색법, Oil red O 추출 정량법, 및 RT-PCR 결과로부터, 지방-유래 줄기세포의 배양에 있어서는 특히 분화단계에서 TUDCA 처리할 경우, 지방세포로의 분화를 효과적으로 억제함을 확인할 수 있다.
<
실시예
3> 골 세포로의 분화 조절
<
실시예
3-1> 인간 지방-유래 줄기세포의 분리 및 배양
상기 실시예 2-1에서 얻어진 인간 지방-유래 줄기세포를 1×104 cells/cm2의 밀도로 파종하고, 본 발명에 의한 TUDCA 처리 유무에 따른 골세포 분화를 평가하였다.
실험 그룹의 골세포 분화 배양 방법은 표 4와 같다. 제 1군(Group 1)은 기본 골세포 분화 배양액으로 10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen, USA), 50 μg/mL 아스코르브산, 10 mM 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-Phosphate), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지를 기본 골세포 분화용 배지로서 사용하였다. 제 2군(Group 2)은 상기 기본 골세포 분화 배양액에 100 nM 덱사메타손을 추가한 배지로서 사용하였다. 제 3군(Group 3)은 상기 기본 골세포 분화 배양액에 10 nM TUDCA을 추가한 배지로서 사용하였다. 제 4군(Group 4)은 상기 기본 골세포 분화 배양액에 50 nM TUDCA을 추가한 배지로서 사용하였다. 제 5군(Group 5)은 상기 기본 골세포 분화 배양액에 100 nM TUDCA을 추가한 배지로서 사용하였다. 제 6군(Group 6)은 상기 기본 골세포 분화 배양액에 300 nM TUDCA을 추가한 배지로서 사용하였다. 배양은 3일 마다 교환하며 21일 동안 수행하였다.
| 대조군 (Group 1) |
10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen, USA), 50 μg/mL 아스코르브산, 10 mM 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-Phosphate), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지 |
| Group 2 | 10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen, USA), 50 μg/mL 아스코르브산, 10 mM 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-Phosphate), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지 +100 nM 덱사메타손 |
| Group 3 | 10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen, USA), 50 μg/mL 아스코르브산, 10 mM 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-Phosphate), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지 +10 nM TUDCA |
| Group 4 | 10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen, USA), 50 μg/mL 아스코르브산, 10 mM 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-Phosphate), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지 +50 nM TUDCA |
| Group 5 | 10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen, USA), 50 μg/mL 아스코르브산, 10 mM 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-Phosphate), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지 +100 nM TUDCA |
| Group 6 | 10% FBS, 1% 글루타맥스(Glutamax)(Invitrogen, USA), 50 μg/mL 아스코르브산, 10 mM 글리세롤 2-포스페이트(Glycerol 2-Phosphate), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지 +300 nM TUDCA |
줄기세포 배양액은 상기 실시예 2-1과 마찬가지로 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 10%의 우태아혈청(FBS)(Invitrogen, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco BRL,Gaithersburg, MD)]을 기본배지(Basal Medium, BM)으로 사용하였다.
<
실험예
3> 골세포로의 분화 측정
<
실험예
3-1> 칼슘 침착 평가
상기 실시예 3 의 그룹 1 내지 6의 세포들을 Alizarin Red S 염색법으로 칼슘염(Calcium salt) 침착 정도를 측정하여, 골세포로의 분화 정도를 측정하고, 골세포 분화에 미치는 TUDCA의 영향을 확인하였다.
Alizarin Red S 염색법은 Carl A. Gregory등의 방법[Analytical Biochemistry 329, 7784, (2004)]을 따라 실시하였다. 각 군의 세포를 PBS로 2회 세척하고 0.5 ㎖의 2% Alizarin Red S 용액 (극초순수에 2% Alizarin Red S)을 첨가하여, 실온에서 30 분 동안 처리한 후, 염색액을 제거하고, PBS로 3회 세척하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 적색 부분은 칼슘침착을 나타내고 검색 부분은 보다 더 많은 칼슘염 침착 정도를 나타낸다(Scale bar=100 ㎛). 도 12에서 실시예 3-1 과 비교하여 실시예 3-2 내지 실시예 3-6 의 경우 상당히 많은 칼슘염 침착 정도를 보였으며, 특히 증식 및 분화과정 모두에서 10 nM TUDCA 처리한 실시예 3-3에서 칼슘염 침착이 많이 관찰되어, TUDCA가 골 세포로의 분화를 유도하는 것을 알 수 있다.
<
실험예
3-2> 칼슘염(
Calcium
salt
)
침착정도의
정량적 평가
Alizarin Red S 염색법과 추출 정량법을 통해서 골 세포로의 분화 정도를 정량적으로 평가하고, 이로부터 골세포 분화에 미치는 TUDCA의 영향을 확인하였다 (n=4).
Alizarin Red S 염색법은 Carl A. Gregory등의 방법[Analytical Biochemistry 329, 7784, (2004)]을 따라 실시하였고, 정량적 방법은 C.M. Stanford등의 방법 [J. Biol. Chem. 270, 94209428, (1995)]에 의해 실시하였다. 각 군의 세포를 21일차의 골세포 분화 정도를 Alizarin Red S 염색법을 수행한 뒤 염색된 부분을 10% 세틸피리디늄클로라이드(Cetylpyridinium chloride) 용액을 이용하여 칼슘염(Calcium salt) 침착 정도를 정량적 평가하였으며(n=4), 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 대조군인 그룹 1 (0.329±0.049)과 비교해서 그룹 2 내지 그룹 6 (G2: 0.518±0.029, G3: 0.588±0.065, G4: 0.5366±0.043, G5: 0.0527±0.013, G6: 0.491±0.047)의 경우 칼슘염 침착 정도가 통계적으로 유의하게 높다는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
4> 인간
중간엽
줄기세포의 골 분화 유도
계대수 8의 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포(Lonza)를 alpha-MEM(gibco)을 이용하여 온도 37℃, CO2 5% 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 아래 표 5와 같은 조건으로 alpha-MEM을 포함하는 골분화 배지와 타우로우루소데옥시콜릭산을 섞은 배지를 이용하여 세포를 배양하였으며, 타우로우루소데옥시콜릭산을 처음 배지에 첨가한 날을 0일로 하여 3일째에 PBS로 2차 세척한 뒤 RNeasy mini kit(QIAGEN)를 사용하여 mRNA를 추출하였다. 이후, AccuPower RT Premix(BIONEER)를 사용하여 cNDA를 추출하였다.
| 대조군 | alpha-MEM |
| 비교예 4-1 | osteogenic media |
| 실시예 4-1 | alpha-MEM+TUDCA 10nM |
| 실시예 4-2 | alpha-MEM+TUDCA 100nM |
| 실시예 4-3 | alpha-MEM+TUDCA 300nM |
<
실험예
4-1> 골 분화 관련 유전자 발현 확인
상기 실시예 4 에서 얻어진 mRNA 와 cNDA를 이용하여 정량중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 수행하여 골 분화 관련 유전자인 RUNX2와 ALP 두 종류의 유전자의 발현량을 확인하고 그 결과를 아래 표 6 및 도 14에 나타내었다.
| RUNX2 | ALP | ||
| 대조군 | alpha-MEM | 1 | 1 |
| 비교예1 | osteogenic media | 1.963566 | 1.29556 |
| 실시예4-1 | alpha-MEM+TUDCA 10nM | 1.825278 | 2.108087 |
| 실시예4-2 | alpha-MEM+TUDCA 100nM | 1.868042 | 1.740225 |
| 실시예4-3 | alpha-MEM+TUDCA 300nM | 2.809475 | 2.779603 |
상기 표 6 및 도 14에서 골 분화를 유도하는 지표 유전자인 RUNX2의 경우, 골분화 배지, 10nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지, 100nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지, 300nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지에서 대조군과 비교하여 유전자 발현량이 확연히 증가한 것을 알 수 있었다.
또한 상기 표 6 및 도 14에서 골 분화 지표 유전자인 ALP 의 경우, 10nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지, 100nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지, 300nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지에서 대조군, 비교예 1인 골분화 배지, 두 종류의 군과 비교하여 유전자 발현량이 확연히 증가한 것을 알 수 있었다.
골 분화를 유도하는 지표 유전자인 RUNX2, ALP 의 발현량이 증가하는 것을 통해 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지는 인간 중간엽 줄기세포의 골분화를 유도한다는 것을 확인할 수 있다. 또한 골 분화를 유도하는 지표 유전자인 RUNX2와 ALP 모두 300nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지에서 뚜렷한 발현량을 보이는 것을 확인할 수 있다.
<
실험예
4-2>
MEK
-1/2 억제제인
U0126
첨가시 인간
중간엽
줄기세포 배양 및 골 분화 유도
계대수 6의 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포(Lonza)를 아래 표 7과 같은 alpha MEM(gibco) 및 MEK-1/2 억제제인 U0126 를 혼합한 배지에서 온도 37℃, CO2 5% 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 타우로우루소데옥시콜릭산을 처음 배지에 첨가한 날을 0일로 하여 3일째에 PBS로 2차 세척 한 뒤 RNeasy mini kit(QIAGEN)를 사용하여 mRNA를 추출하여 샘플링 하였다. 이후, AccuPower RT Premix(BIONEER)를 사용하여 cNDA를 추출하였다.
| RUNX2 | ALP | ||
| 대조군 | alpha-MEM | 1 | 1 |
| 실시예 4-3 | alpha-MEM+TUDCA 300nM | 2.809475 | 2.779603 |
| 실시예 4-4 | alpha-MEM+TUDCA 300nM+U0126 20μM | 1.048174 | 0.851401 |
<
실험예
4-2> 골 분화 관련 유전자 발현 확인
상기 실시예 4-2 에서 얻어진 mRNA와 cDNA 를 이용하여 정량중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 골 분화 관련 유전자인 RUNX2와 ALP 발현량을 확인하였으며 그 결과를 상기 표 7 및 도 15 에 나타내었다.
상기 표 7 및 도 15 에서 골 분화를 유도하는 지표 유전자인 RUNX2와 골 분화 지표 유전자인 ALP 의 경우 300nM의 타우로우루소데옥시콜릭산이 첨가된 배지에서 대조군과 비교하여 유전자 발현량이 확연히 증가하였지만 300nM의 타우로우루소데옥시콜릭산과 20μM의 MEK-1/2 억제제인 U0126이 첨가된 배지에서는 대조군과 유사한 정도로 유전자 발현량이 감소한 것을 알 수 있었다. 그 감소는 통계적으로 유의하였다(p<0.05)
이를 통해 MEK-1/2 억제제인 U0126이 타우로우루소데옥시콜릭산에 의한 골 분화 유도를 과정을 억제한다는 것을 알 수 있었으며, 즉 MEK-1/2가 활성화됨으로써 타우로우루소데옥시콜릭산에 의한 골 분화 과정이 일어난다는 것을 알 수 있었다.
도 16 은 본 발명의 타우로우루소데옥시콜릭산에 의한 MEK-1/2 및 ERK-1/2의 활성화 경로로 RUNX2 발현이 유도되고, 골 분화가 유도되는 과정을 나타낸 모식도이다. 본 발명에 의한 타우로우루소데옥시콜릭산에 의해 MEK-1/2가 활성화됨으로써 유사 분열물질-활성화단백질인산화효소(mitogen-activated proteinkinase, MAPK) 과정이 활성화되고 일련의 과정에 의해 골 재생이 유도됨을 나타낸다.
<
실시예
5>
TUDCA
처리에 따른
세포사
(
Apoptosis
) 평가
<
실시예
5-1>
TUNEL
assay
상기 실시예 1 에서와 같이 골 결손 마우스 모델에 콜라겐스폰지 지지체를 이식하고 1주일 동안에 2일에 한번씩 좌측에는 50uL의 PBS를 주입하고, 우측에는 500 uM TUDCA를 50uL 처리에 한 후, 상기 실시예 1-3 에서와 같이 슬라이드 샘플을 준비하고, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling) assay로 TUDCA 처리에 의한 세포사에 대한 영향을 평가하였다.
각 두개골 슬라이드 샘플에 TdT라는 효소를 이용하여 UTP(uridine triphosphate)를 DNA 조각 말단에 붙여 세포사 결과로 나타나는 DNA fregmentation을 현광현미경으로 확인하였으며 그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 TUDCA 미처리 군에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군에서 세포사의 정도를 확인할 수 있는 녹색의 TUNEL의 염색 정도가 높다는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
5>
TUDCA
처리에 따른
세포사
(
Apoptosis
) 평가
<
실시예
5-1>
TUNEL
assay
상기 실시예 1 에서와 같이 골 결손 마우스 모델에 콜라겐스폰지 지지체를 이식하고 1주일 동안에 2일에 한번씩 좌측에는 50uL의 PBS를 주입하고, 우측에는 500 uM TUDCA를 50uL 처리에 한 후, 상기 실시예 1-3 에서와 같이 슬라이드 샘플을 준비하고, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling) assay로 TUDCA 처리에 의한 세포사에 대한 영향을 평가하였다.
각 두개골 슬라이드 샘플에 TdT라는 효소를 이용하여 UTP(uridine triphosphate)를 DNA 조각 말단에 붙여 세포사 결과로 나타나는 DNA fregmentation을 현광현미경으로 확인하였으며 그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 TUDCA 미처리 군에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군에서 세포사의 정도를 확인할 수 있는 녹색의 TUNEL의 염색 정도가 높다는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
5-2>
RT
-
PCR
분석
상기 실시예 5-1 에서 제조된 두개골 이식 지지체 샘플에 세포사 유발 유전자(proapoptotic gene)로 알려진 Bax, Fas, FasL, 및 항세포사 유전자(antiapoptotic gene)인 Bcl-2 발현 정도를 RT-PCR 로 측정하였다.
RT-PCR에 사용된 프라이머 세트는 Bax 프라이머 세트로 센스 프라이머: 5'--CGG CGA ATT GGA GAT GAA CTG-3' 및 안티센스 프라이머: 5'-GCA AAG TAG AAG AGG GCA ACC-3' (기원: NM_007527.3)의 서열과 Fas 프라이머 세트로 센스 프라이머: 5'-GCT GCA GAC ATG CTG TGG ATC-3' 및 안티센스 프라이머: 5'-TCA CAG CCA GGA GAA TCG CAG-3' (기원: NM_007987.2)의 서열과 FasL 프라이머 세트로 센스 프라이머: 5'-TCC AGG GTG GGT CTA CTT ACT AC-3' 및 안티센스 프라이머: 5'-CCC TCT TAC TTC TCC GTT AGG A-3' (기원: NM_010177.4)의 서열과 Bcl-2 프라이머 세트로 센스 프라이머: 5'-ACC GTC GTG ACT TCG CAG AG-3' 및 안티센스 프라이머: 5'-GGT GTG CAG ATG CCG GTT CA-3' (기원: NM_177410.3)을 사용하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에서 TUDCA 미처리 군에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군에서 세포사 유발 유전자(proapoptotic gene)인 Bax, Fas, FasL의 발현이 현저히 낮았고, 또한 항세포사 유전자(antiapoptotic gene)인 Bcl-2의 발현은 TUDCA 미처리 군에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군에서 상대적으로 높은 발현을 나타내었다.
<
실시예
5-3>
세포사
영향에 대한 정량적 분석
상기 실시예 5-2 에서 측정된 세포사 유발 유전자(proapoptotic gene)인 Bax 와, 항세포사 유전자(antiapoptotic gene)인 Bcl-2 의 발현 정도의 비를 이미지 어날라이져 (Image J, USA)를 이용하여 항세포사 유전자 (antiapoptotic gene)인 Bcl-2의 Pixel 당 white color intensity의 값을 세포사 유발 유전자 (proapoptotic gene)인 Bax의 값으로 나눠준 값으로 정량화 하고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에서 TUDCA 미처리 군 (1.565±0.145)에 비교해서 500 uM TUDCA 처리된 군 (0.00004±0.00048)에서 Bax/Bcl-2 ratio가 통계적으로 유의하게 작다는 것을 알 수 있다.
상기 세포사관련 TUNEL assay와 RT-PCR의 결과로부터, TUDCA 미처리 군에 비교해 TUDCA 처리의 경우 골 재생 시에 효과적 항세포사 반응이 유도되었음을 확인할 수 있다.
Claims (15)
- 아래 일반식으로 표시되는 화합물, 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
[일반식]
상기 식에서 R1, R2, R3, R4, R5 는 H, OH, 알킬, 아릴, (CH2)nOH, CO2CH3 또는 CO2C(CH3)3 를 나타내고
R6는 H,NHCH2COOH, NH(CH2)2SO2OH, CH(CH3)O(CH2)nCH3 (n=1~3)를 나타낸다.
- 제 1 항에 있어서,
상기 일반식으로 표시되는 화합물은 콜산, 글리코콜산, 데옥시글리코콜산, 우르소데옥시콜산, 콜레스테롤 설페이트, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로우로소데옥시콜리산, 이들의 유도체, 및 이들의 염으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 일반식으로 표시되는 화합물은 아래 화학식 1로 표시되는 타우로우로소데옥시콜리산인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
[화학식 1]
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 줄기 세포의 지방 세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 줄기 세포의 골 세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 MEK-1/2 를 활성화하고, 활성화된 MEK-1/2 에 의하여 줄기 세포의 골 세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
상기 줄기 세포는 지방 유래 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 염증 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 골형성단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 9 항에 있어서,
상기 골형성단백질은 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12, BMP-13 및 BMP-52로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 9 항에 있어서,
상기 골형성단백질은 상기 조성물 1 ml 당 20μg 내지 160μg 가 포함되는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 골 관련 질환은 골다공증, 골 손실, 골 형성; 타입 II/연령 관련/노령 골다공증 진행 중의 골 형성, 발달 및 성장 기간 중 더 높은 최대 골 질량(peak bone mass) 달성, 절골 치료, 손상된 골 대체를 위한 인 비트로(in vitro)/인 비보(in vivo)에서의 새로운 골 형성 촉진인 것인 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물이 경구용 또는 비경구용인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물이 주사제인 경우에 상기 주사제의 투여량은 0.01 ~ 30 mg/kg 인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물.
- 제 1 항에 의한, 아래 일반식으로 표시되는 화합물, 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 골 관련 질환 예방 및 개선을 위한 식품 조성물.
[일반식]
상기 식에서 R1, R2, R3, R4, R5 는 H, OH, 알킬, 아릴, (CH2)nOH, CO2CH3 또는 CO2C(CH3)3 를 나타내고
R6는 H,NHCH2COOH, NH(CH2)2SO2OH, CH(CH3)O(CH2)nCH3 (n=1~3)를 나타낸다.
Priority Applications (1)
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| KR1020130092450A KR101567867B1 (ko) | 2012-08-03 | 2013-08-05 | 골 관련 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2018221966A1 (ko) * | 2017-06-01 | 2018-12-06 | 연세대학교 산학협력단 | 골 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물 |
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-
2013
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