KR20140017626A - 살충제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자낭균문의 진균로부터의 살충성 지질 및 지질 분획, 및 이와 함께 상기 지질 및 지질 분획을 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법을 제공한다. 지질 및 지질 분획, 또는 상기 지질 및 이와 함께 선택적으로 하나 이상의 살충제 또는 곤충병원성 진균을 포함하는 곤충병원성 제제를 포함하는 조성물을 사용하는, 곤충 예컨대 식물병원성 곤충의 방제 방법도 또한 제공한다.

Description

살충제 및 이의 용도{INSECTICIDAL AGENTS AND USES THEREOF}

본 발명은 일반적으로 생물 분야, 더욱 바람직하게는 사상균(filamentous fungi)에서 얻은 지질에 관한 특정 구현예, 상기 지질을 포함하는 조성물, 및 상기 지질 및 조성물의 생물학적 방제제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 상기 지질 및 상기 지질을 포함하는 조성물을 사용하여, 식물병원성 곤충을 포함하여 곤충의 방제 방법도 또한 제공한다.

곤충 및 곤충 개체군을 방제할 수 있는 능력은, 인간 및 동물의 건강, 농업, 및 넓은 범위의 경제 활동에서 매우 중요하다. 예를 들어, 곤충은 수많은 인간 질병을 위한 벡터이다: 모기(mosquito)는 말라리아(malaria), 웨스트 나일병(West Nile disease) 및 뎅기열(Dengue fever)을 위한 벡터이고, 진드기(tick)는 리케차병(rickettsial disease), 예컨대 티푸스(typhus), 아프리카 진드기열병(African tick bite fever), 및 라임병(Lyme disease)의 벡터이며, 한편 빈대는 흑사병(plague)의 벡터이다. 유사하게, 해충 및 병원체(총괄적으로, "식물병원체")에 의해 유발된 식물병 또는 손실은, 식물-기반 농업 및 산업에 중요한 경제적 비용을 초래한다. 손실은 수확의 전후 모두에서 생산된 것들의 부패를 통하여, 식물 자체의 손실, 또는 생장 및 생산 능력의 감소를 통하여 발생할 수 있다.

전통적으로, 곤충, 예컨대 식물 해충 및 병원체에 대한 대규모 방제는 화학적 살충제의 응용을 통하여 추구되었고, 물리적 방법(예를 들어, 포집(trapping), 채집(picking), 차단벽(barriers))을 통해서도 이용되었다. 화학물질의 사용은 수많은 단점들이 있다. 곤충, 예컨대 식물 해충 및 병원체는 시간이 지나면서 내성 개체군을 생성하여, 화학물질에 대한 내성(resistance)을 발달시킨다. 바로 살충제에 대한 내성은 식물-기반 농업 및 원예업과 같은 산업의 생존에 가장 큰 도전 과제이다.

문제는 특히 수많은 경제적으로 중요한 식물병원성 곤충에 대하여 나타난다. 꽃노랑총채벌레(western flower Thrip)의 개체군은, 전세계적으로 하기의 예들을 포함하는 대부분의 살충제 군에 대해 내성을 보이는 것으로 보고되었다: 아세페이트(acephate), 아바멕틴(abamectin), 클로르피리포스(chlorpyrifos), 엔도설판(endosulfan), 메토밀(methomyl), 메티오카르브(methiocarb), 오메토에이트(omethoate), 피라조포스(pyrazophos) 및 타우플루발리네이트(taufluvalinate). 양파 총채벌레(Onion Thrip)의 개체군은 뉴질랜드에서 델타메트린(deltamethrin)에 내성을 갖게 되었고, 지역재래종 집단(local population)은 디아지논(diazinon) 및 디클로르보스(dichlorvos)에 내성을 갖는 것으로 보고되었다. 양파 총채벌레는 미국에서 많은 살충제에 내성을 갖는 것으로 보고되었다(Grossman, 1994). 온실가루이(Greenhouse Whitefly)는 보고된 바와 같이, 유기염소, 유기인산염, 카바메이트, 및 피레트로이드(pyrethroid) 살충제에 대한 내성이 발달했다(예를 들어, Georghiou 1981, Anis & Brennan 1982, Elhag & Horn 1983, Wardlow 1985, 및 Hommes 1986). 내성은 또한 더욱 새로운 살충제, 부프로페진(buprofezin) 및 테플루벤주론(teflubenzuron)에 대해서도 보고되었다(Gorman et al. 2000).

화학 잔기들은 또한 환경 유해물질이 되어, 건강상 염려를 일으킬 수도 있다. 지난 20년간에 걸친 미생물 살충제와 같은 생물학적 방제에 대한 관심이 부활한 것은, 화학적 독성에 관한 염려에 대한 공중의 압력에서 직접 유래하였다. 생물학적 방제는 잠재적으로 현재의 방법보다 더욱 효율적이고 특이적일 뿐만 아니라, 화학 물질에 대한 의존성도 감소시키는, 식물 병원체의 방제에 대한 대체 수단을 제시한다. 상기 생물학적 방제 방법은, 대중의 수용 정도가 더 크고, 환경 오염을 감소시키며, 지속성(sustainability)을 증가시키는 장점을 갖는, 화학적 살충제에 대한 "천연의" 대체물로서 인식된다.

생물학적 방제의 기작들은 범위가 넓다. 효과적으로 입증된 하나의 기작은, 식물병원성 곤충을 방제하기 위한 박테리아와 같이, 길항 미생물을 사용하는 것이다. 예를 들어, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 대규모 생산으로, 뉴질랜드 오클랜드에서 사과나방(painted apple moth)의 방제에 대한 이러한 박테리아-살충제의 사용이 가능하게 되었다.

그러나, 생물학적 방제 제제(BCA)의 성공적인 응용예는 거의 없었으며, 지금까지 BCA는 점점 크게 증가하는 승인 사항(acceptance)을 만족시키지 못하여, 경제적이지 못하다고 인식되었다.

따라서, 식물병원성 곤충을 포함한 곤충을 효과적으로 방제할 수 있는 제제 및 방법에 대한 필요성이 있으며, 특히 더 빨리 작용하는 제제는 곤충 방제의 유효성을 높이고, 빈도가 낮거나 강도가 낮은 적용이 가능하며, 또는 결과적으로 현재의 시판 살충제보다 더욱 낮은 독성을 갖는다.

따라서 본 발명의 목적은 상기 필요성에 조금이라도 도움이 되기 위하여, 식물병원성 곤충을 포함하는 곤충 및 곤충 개체군의 조절에 유용한 하나 이상의 제제 및 그 방법, 또는 적어도 공중에 유용한 선택 사항을 제공하는 것이다.

본 발명은 살충성 지질 및 이의 제조 방법을 제공한다. 살충제로서 알려진 이들 지질의 비유사성(dissimilarity)은, 새로운 부류의 살충성 제제의 존재를 나타낸다.

따라서, 제 1 측면에서, 본 발명은 자낭균 문(Ascomycota)의 진균에서 분리한 하나 이상의 살충성 지질, 또는 하나 이상의 살충성 지질 분획에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질은 비-산성 지질이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 살충성 분획은 비-산성 분획이다.

특정의 예시적 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질 또는 하나 이상의 살충성 지질 분획은 살충 효과가 있다.

제 2 측면에서, 본 발명은 자낭균 문 진균으로부터의, 분리, 정제되거나, 또는 실질적으로 순수한 살충성 지질에 관한 것이다.

하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은 자낭균 문 진균으로부터의, 분리, 정제되거나, 또는 실질적으로 순수한 살충성 비-산성 지질에 관한 것이다.

제 3 측면에서, 본 발명은 자낭균 문 진균으로부터 분리한 하나 이상의 살충성 지질 또는 하나 이상의 살충성 지질 분획을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

제 4 측면에서, 본 발명은 자낭균 문 진균으로부터의, 분리, 정제되거나 또는 실질적으로 순수한 살충성 지질 분획에 관한 것이다.

하나의 예시적 구현예에서, 본 발명은 자낭균 문 진균으로부터의, 분리, 정제되거나 또는 실질적으로 순수한 비-산성 지질 분획에 관한 것이다.

본 발명은 본 명세서에서 기재한 하나 이상의 지질과, 이와 함께 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물 및 제제, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 지질과 하나 이상의 진균을 포함하는 조성물 및 제제를 제공한다. 상기 조성물은 상기 지질들을 생성하는 세포의 세포 추출물, 세포 현탁액, 세포 균질액, 세포 용해물, 세포 상등액, 세포 여과물, 또는 세포 펠렛일 수 있다. 특정 실시예에서, 조성물은 자낭균 문의 진균으로부터의 비-산성 분획을 포함한다. 특정의 예시적 구현예에서, 조성물은 예를 들어 정제 또는 첨가에 의하여, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획이 풍부하다. 다른 예시적 구현예에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 첨가된 지질 또는 지질 분획을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 조성물은 상기에서 설명한 하나 이상의 지질 또는 하나 이상의 지질 분획이 첨가된, 세포 추출물, 세포 현탁액, 세포 균질액, 세포 용해액, 세포 상층액, 세포 여과액, 또는 세포 펠렛이다.

추가적 측면에서, 본 발명은 곤충, 예컨대 흡즙 곤충(sucking insect), 또는 딱정벌레(coleopteran), 쌍시류(dipteran), 또는 나비목(lepidopteran) 곤충에 대한 살충 활성을 갖는, 지질 또는 지질 분획의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 세포, 예컨대 자낭균 문의 하나 이상의 진균들의 배양액, 예를 들어 뷰바리아 바시아나(Beauvaria bassiana) 균주 K4B3 세포의 배양액과 같은 적합한 세포 배양액으로부터, 본 명세서에서 기재한 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을 분리하는 것에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 세포는 균사체 생장을 도와줄 수 있는 조건에서 배양되거나, 배양되었다. 상기 지질은 세포 배양액 또는 상등액에서, 또는 세포 배양액으로부터 유래하며 천연 형태로 사용되는 세포로부터의 포자 현탁액에서 분리되거나, 또는 그렇지 않으면 특정 응용에 적합하도록 정제 또는 농축시킬 수 있다.

곤충 개체군의 방제 방법도 또한 본 발명에 의해 제공된다. 그 방법은 일반적으로 비-산성 지질을 포함하는 상기에서 설명한 지질, 또는 비-산성 분획을 포함하는 상기에서 설명한 지질 분획의 살충 유효량을, 상기 개체군과 접촉시키는 방법에 관여한다. 상기 방법은 일정 면적 내의 목표 곤충을 죽이거나, 또는 그 수를 감소시키는데 사용될 수 있으며, 또는 민감성(susceptible) 곤충에 의한 습격을 방지하기 위하여 환경 영역에 예방적으로 제공될 수 있다.

또 다른 추가적 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 생물학적 방제 조성물의 생산 방법을 제공한다:

자낭균 문의 하나 이상의 진균의 배양액을 제공하는 단계,

본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획의 생성에 적합한 조건 하에서 상기 배양액을 유지하는 단계; 및

i) 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 담체와 결합시키는 단계, 또는

ⅱ) 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 본 명세서에 기재한 하나 이상의 곤충병원성 진균과 결합시키는 단계, 또는

ⅲ) 본 발명의 하나의 이상의 지질 또는 지질 분획을, 진균으로부터 분리하는 단계, 또는

iv) 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 적어도 부분적으로 정제 또는 분리하는 단계, 또는

v) (i) 내지 (iv)의 것들 중 둘 이상의 조합.

본 발명은 추가로 본 발명의 지질 또는 지질 분획, 또는 하나 이상의 곤충, 예컨대 하나 이상의 식물병원성 곤충의 방제를 위한 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

추가적 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 곤충의 방제 방법으로써, 하나 이상의 곤충들을, 본 발명의 지질 또는 지질 분획, 또는 이의 기능적 변이체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 하나 이상의 곤충, 예컨대 하나 이상의 식물병원성 곤충의 방제 방법으로써, 본 발명의 지질 또는 지질 분획 또는 이의 기능성 변이체를, 식물 또는 주변에, 선택적으로 본 명세서에서 설명한 하나 이상의 곤충병원성 진균과 함께 적용하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제에 대한 곤충의 내성을 전체적으로 또는 부분적으로 반전시키는 방법으로, 곤충을 본 발명의 지질 또는 지질 분획과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

선택적으로, 본 발명은 곤충을, 본 발명의 지질 또는 지질 분획, 및 이와 함께 하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제 또는 이들의 조합과 접촉시키는 단계를 포함한다.

다양한 구현예에서, 투여되는 하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제는, 곤충이 내성을 갖거나, 내성을 가질 것으로 예측되거나, 또는 내성을 갖게 되는 것과 동일하다.

추가적 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획과 접촉한 하나 이상의 곤충을, 하나 이상의 상기 곤충을 방제하는데 효과적인 양의 살충제 또는 곤충병원성 제제로서 방제하는 방법을 제공한다.

하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제가, 본 발명의 지질 또는 지질 분획의 투여에 앞서, 이와 동시에, 그 후에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획, 및 하나 이상의 살균제 또는 곤충병원성 제제는 동시에, 연속적으로, 또는 별개로 투여될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제에 대한 곤충의 내성을, 전체적으로 또는 일부 반전시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 곤충을, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획, 및 본 발명의 곤충병원성 진균, 선택적으로 다른 살충제 또는 곤충병원성 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 방법은 하나 이상의 곤충을 곤충병원성 진균 및 본 발명의 하나 이상의 지질과 접촉시키는 단계를 포함한다.

하기의 구현예는 본 명세서의 어떠한 관점과도 관련된다.

하나의 구현예에서, 하나 이상의 진균은 하기의 아강(subclass)의 하나 이상의 진균을 포함하는, 동충하초강(Sordariomycetes)이다:

동충하초아강(Hypocreomycetidae), 예컨대 코로노포라균목(Coronophorales), 동충하초목(Hypocreales), 멜라노스포라균목(Melanosporales), 또는 미크로아스트스균목(Microascales)의 하나 이상의 진균; 검댕이침버섯아강(Sordariomycetidae), 예컨대 볼리니아균목(Boliniales), 칼로스패리아균목(Calosphaeriales), 흑단추버 섯목(Chaetosphaeriales), 코니오채타균목(Coniochaetales), 검댕이침버섯목(Diaporthales), 마그나포르타균목(Magnaporthales), 오피오스토마타균 목(Ophiostomatales), 구멍공버섯목(Sordariales)의 하나 이상의 진균; 콩꼬투리버섯아강(Xylariomycetidae), 예컨대 콩꼬투리버섯목(Xylariales)의 진균 및 코랄리오나스테타균목(Koralionastetales), 룰워르티아균목(Lulworthiales), 멜리올라균목(Meliolales), 필라코라균목(Phyllachorales), 및 트리코르패리아균 목(Trichosphaeriales)의 진균.

하나의 구현예에서, 하나 이상의 진균은 예를 들어 동충하초과(Bionectriaceae), 맥각균과(Clavicipitaceae), 점버섯과(Hypocreaceae), 알보리수버섯과(Nectriaceae ), 니에슬리아시아균과(Niessliaceae ), 또는 잠자리동충하초과(Ophiocordycipitaceae)의 하나 이상의 진균과 같은 동충하초목(Hypocreales)이다.

하나의 구현예에서, 하나 이상의 진균은 하기의 속(genera)의 하나 이상의 진균을 포함하는 맥각균과(Clavicipitaceae) 이다:

아키큘로스포리움(Aciculosporium ), 아스코폴리포루스 ( Ascopolyporus ), 아트킨소넬라(Atkinsonella ), 아트리코르디셉 ( Atricordycep ), 발란시아 ( Balansia ), 베르켈레라( Berkelella ), 카비말룸 ( Cavimalum ), 셉시클라바 ( Cepsiclava ), 클라비셉스( Claviceps ), 코르디세피오이데우스 ( Cordycepioideus ), 코르디셉 ( Cordyceps ), 듀시엘라(Dussiella ), 에피클로에 ( Epichlo ё), 에피크레아 ( Epicrea ), 헬민타스쿠스( Helminthascus ), 헤테로에피클로에 ( Heteroepichlo ё), 하이페르데르미 움( Hyperdermium ), 하이포크렐라 ( Hypocrella ), 콘라디아 ( Konradia ), 로큘리스트로마( Loculistroma ), 메타코르디셉스 ( Metacordyceps ), 모엘레리엘라 ( Moelleriella ), 마이코말무스(Mycomalmus ), 마이리오제노스포라 ( Myriogenospora ), 네오바리아( Neobarya ), 네오클라비셉스 ( Neoclaviceps ), 네오코르디셉스 ( Neocordyceps ), 파레피클로에(Parepichlo ё), 피토모르디셉스 ( Phytocordyceps ), 포도크렐라( Podocrella ), 레지오크렐라 ( Regiocrella ), 로마노아 ( Romanoa ), 쉬미쥬오마이세 스( Shimizuomyces ), 스패로코르디셉스 ( Sphaerocordyceps ), 스트레오크레 아( Stereocrea ), 토루비엘라 ( Torrubiella ), 워케피엘디오마이세스( Wakefieldiomyces ), 아칸토마이세스 ( Akanthomyces ), 아쉐르소니아( Aschersonia ), 뷰베리아 ( Beauveria ), 차우노피크니스 ( Chaunopycnis ), 코랄로사 이토스트로마(Corallocytostroma ), 큘리시노마이세스 ( Culicinomyces ), 드레크메리 아( Drechmeria ), 에펠리스 ( Ephelis ), 기벨룰라 ( Gibellula ), 합토실리 움( Haptocillium ), 하르포스포리움 ( Harposporium ), 히르수텔라 ( Hirsutella ), 히메노스틸베(Hymenostilbe ), 이사리아 ( Isaria ), 레카니실리움 ( Lecanicillium ), 마리안내( Mariannaea ), 메타리지움 ( Metarhizium ), 미크로힐룸 ( Microhilum ), 네오문키아( Neomunkia ), 네오티포디움(Neotyphodium ), 노무라애 ( Nomuraea ), 패실로마이세스( Paecilomyces ), 포코니아 ( Pochonia ), 폴리세팔로마이세스 ( Polycephalomyces ), 슈도기벨룰라(Pseudogibellula ), 심플리실리움 ( Simplicillium ), 소로스포렐 라( Sorosporella ), 톨리포클라디움(Tolypocladium ) 또는 우스틸라기노이디아(Ustilaginoidea ).

예를 들면, 하나 이상의 진균은 예를 들어 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 뷰베리아 브롱니아르티 ( Beauveria brongniartii ), 뷰베리아 펠리나( Beauveria felina ), 또는 뷰베리아 글로불리페라(Beauveria globulifera)의 하나 이상의 균주를 포함하는 뷰베리아 속이다.

추가적 구현예에서, 하나 이상의 진균은 하기의 속으로부터의 하나 이상의 진균을 포함하는 점버섯과이다:

아피시오스트로마(Aphysiostroma ), 클라도보트리움(Cladobotryum ), 글리오클라디움(Gliocladium ), 히포크레아(Hypocrea ), 히포크레옵시스(Hypocreopsis ), 히포마이세스(Hypomyces ), 마이코고네(Mycogone ), 포도스트로마(Podostroma ), 프로토크레아(Protocrea ), 로게르소니아(Rogersonia ), 사라워쿠스(Sarawakus ), 세페도이움( Sepedonium ), 스패로스틸벨라(Sphaerostilbella ), 스포로파고마이세 스(Sporophagomyces ), 스테파노마(Stephanoma ) 또는 트리코데르마(Tricoderma ).

하나의 구현예에서, 하나 이상의 진균은 하기의 하나 이상의 것들을 포함하는 트리코데르마 속이다:

트리코데르마 아크레시범 ( Tricoderma aggressivum ), 트리코데르마 아스페렐럼( Tricoderma asperellum ), 트리코데르마 아트로비리데 ( Tricoderma atroviride ), 트리코데르마 아우레오비리데( Tricoderma aureoviride ), 트리코데르마 아우스트로코 닌지( Tricoderma austrokoningii ), 트리코데르마 브레비콤팩툼( Tricoderma brevicompactum), 트리코데르마 칸디둠 ( Tricoderma candidum ), 트리코데르마 카리 배움 바르 . 애쿠아토리아 ( Tricoderma caribbaeum var . aequatoriale ), 트리코데르마 카리배움 바르 . 카리배움 ( Tricoderma caribbaeum var . caribbaeum ), 트리코데르마 카톱트론 ( Tricoderma catoptron ), 트리코데르마 크레메움 ( Tricoderma cremeum ), 트리코데르마 세라미쿰 ( Tricoderma ceramicum ), 트리코데르마 세리넘( Tricoderma cerinum), 트리코데르마 클로로스포룸 ( Tricoderma chlorosporum ), 트리코데르마 크로모스페르뭄( Tricoderma chromospermum ), 트리코데르마 신나모메움( Tricoderma cinnamomeum), 트리코데르마 시트리노비리데 ( Tricoderma citrinoviride ), 트리코데르마 크라숨 (T richoderma crassum ), 트리코데르마 크레메움 ( Tricoderma cremeum ), 트리코데르마 딩글레예아( Tricoderma dingleyeae ), 트리코데르마 도로테 아( Tricoderma dorotheae ), 트리코데르마 에푸숨 ( Tricoderma effusum ), 트리코데르마 에리나세움( Tricoderma erinaceum ), 트리코데르마 에스토니쿰( Tricoderma estonicum), 트리코데르마 페르딜레 ( Tricoderma fertile ), 트리코데르마 겔라티노수스( Tricoderma gelatinosus ), 트리코데르마 하넨세 ( Tricoderma ghanense ), 트리코데르마 하마툼 ( Tricoderma hamatum ), 트리코데르마 하르지아눔( Tricoderma harzianum), 트리코데르마 헬리쿰 ( Tricoderma helicum ), 트리코데르마 인트리카툼( Tricoderma intricatum ), 트리코데르마 코니랑브라 ( Tricoderma konilangbra ), 트리코데르마 코닌기( Tricoderma koningii ), 트리코데르마 코닌지옵시 스( Tricoderma koningiopsis ), 트리코데르마 론지브라치아툼( Tricoderma longibrachiatum), 트리코데르마 론지필레 ( Tricoderma longipile ), 트리코데르마 미누티스포룸( Tricoderma minutisporum ), 트리코데르마 오블론지스포룸( Tricoderma oblongisporum), 트리코데르마 오발리스포룸 ( Tricoderma ovalisporum ), 트리코데르마 페테르세니 ( Tricoderma petersenii ), 트리코데르마 필로스타히디스( Tricoderma phyllostahydis), 트리코데르마 필루리페룸 ( Tricoderma piluliferum ), 트리코데르마 플레우로티콜라 ( Tricoderma pleuroticola ), 트리코데르마 플레우로툼( Tricoderma pleurotum ), 트리코데르마 폴리스포룸 ( Tricoderma polysporum ), 트리코데르마 슈도코닌지( Tricoderma pseudokoningii ), 트리코데르마 푸베센스( Tricoderma pubescens), 트리코데르마 레에세이 ( Tricoderma reesei ), 트리코데르마 로게르소니( Tricoderma rogersonii ), 트리코데르마 로시쿰 ( Tricoderma rossicum ), 트리코데르마 사투르니스포룸 ( Tricoderma saturnisporum ), 트리코데르마 시넨시스( Tricoderma sinensis ), 트리코데르마 시누오숨 ( Tricoderma sinuosum ), 트리코데르마 종 MA 3642, 트리코데르마 종 PPRI 3559, 트리코데르마 스피랄레( Tricoderma spirale), 트리코데르마 스트라미네움 ( Tricoderma stramineum ), 트리코데르마 스트리고숨 ( Tricoderma strigosum ), 트리코데르마 스트로마티쿰( Tricoderma stromaticum ), 트리코데르마 수로툰둠 ( Tricoderma surrotundum ), 트리코데르마 타이와넨세( Tricoderma taiwanense ), 트리코데르마 타일랜디 쿰( Tricoderma thailandicum), 트리코데르마 텔레포리콜룸 ( Tricoderma thelephoricolum ), 트리코데르마 테오브로미콜라 ( Tricoderma theobromicola ), 트리코데르마 토멘토숨 ( Tricoderma tomentosum ), 트리코데르마 벨루티눔( Tricoderma velutinum), 트리코데르마 베렌스 ( Tricoderma virens ), 트리코데르마 비리데( Tricoderma viride ), 트리코데르마 비리데넨스 ( Tricoderma viridescens ); 또는 히포크레아 필로스타키디스(Hypocrea phyllostachydis)를 포함하는 하나 이상의 점버섯(Hypocrea) 종.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 진균은 뷰베리아 바시아나 K4B3(NMIA 수탁번호 V08/025855), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NMIA 수탁번호 NM05/44593), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움 균주 K4V2 (NMIA 수탁번호 NM05/44594), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주; 레카니 실리움 무스카리움 균주 K4V4 (NMIA 수탁번호 NM06/00007), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B1 (NMIA 수탁번호 NM05/44595), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B2 (NMIA 수탁번호 NM06/00010), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주; 레카니실리움 론지스포룸 ( Lecanicillium longisporum ) 균주 KT4L1 (NMIA 수탁번호 NM06/00009), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주; 및 패실 로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus) 균주 K4P1 (NMIA 수탁번호 NM06/00008), 또는 이의 식별 특성들을 갖는 균주로부터 선택된 하나 이상의 균주이다.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질은, 비-산성 지질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질에는 실질적으로 산성 지질이 없거나, 또는 실질적으로 유리 지방산이 없다.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질 분획은, 비-산성 지질 분획이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질 분획에는 실질적으로 산성 지질이 없거나, 또는 실질적으로 유리 지방산이 없다.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질 분획은, 비-산성 지질 분획이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질 분획에는, 실질적으로 산성 지질이 없거나, 또는 실질적으로 유리 지방산이 없다.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질 분획은, 비-산성 지질을 약 10%, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 중량% 이상 포함한다.

다양한 구현예에서, 지질 분획 중의 비-산성 지질 대 산성 지질의 w/w 비율은, 약 5:4, 4:3, 3:2, 2:1, 5:3, 5:2, 3:1, 4:1, 또는 5:1 이상이다.

하나의 구현예에서, 지질은 극성 지질이다.

다양한 구현예에서, 하나 이상의 살충성 지질 분획은, 극성 지질을 약 10 중량%, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 중량% 이상 포함한다.

다양한 구현예에서, 지질 분획 중의 극성 지질 대 비극성 지질의 w/w 비율은, 약 5:4, 4:3, 3:2, 2:1, 5:3, 5:2, 3:1, 4:1, 또는 5:1 이상이다.

다양한 구현예에서, 지질 분획은 본 명세서의 도 4에서 볼 수 있거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 분획 1, 분획 5, 또는 분획 6이거나, 또는 이의 식별 특성을 갖는다.

다양한 구현예에서, 지질 분획은 본 명세서의 도 7에서 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 분획 2, 분획 4, 또는 분획 5이거나, 또는 이의 식별 특성을 갖는다.

다양한 구현예에서, 지질 분획은 본 명세서의 도 8에서 볼 수 있거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9이거나, 또는 이의 식별 특성을 갖는다.

다양한 구현예에서, 지질 분획은 본 명세서의 도 8에서 볼 수 있거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9이거나, 또는 이의 식별 특성을 갖는다.

다양한 구현예에서, 지질 분획은 본 명세서의 도 10에서 볼 수 있거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 분획 2, 분획 3, 분획 4b, 분획 5a, 분획 5b, 또는 분획 6이거나, 또는 이의 식별 특성을 갖는다.

다양한 구현예에서, 분획 2, 분획 3, 분획 4b, 분획 5a, 분획 5b, 또는 분획 6의 식별 특성은, 도 12a 내지 도 12f 중 어느 하나에서 나타난 바와 같은, MALDI-TOF 질량 분광분석(MS) 프로파일이다.

하나의 구현예에서, 지질 분획은 본 명세서의 도 10에서 볼 수 있거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 분획 3이거나, 또는 이의 식별 특성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 식별 특성은 도 13에서 나타난 바와 같은, NMR 스펙트럼이다.

하나의 구현예에서, 지질이 하기의 것들 중 어느 하나 이상이거나, 또는 지질분획이 이를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진다:

a. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 86인 지질 또는

b. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 147인 지질, 또는

c. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 445인 지질, 또는

d. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 656인 지질, 또는

e. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 454인 지질, 또는

f. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질, 또는

g. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 393인 지질, 또는

h. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질 또는

i. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 693인 지질, 또는

j. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 695인 지질, 또는

k. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 717인 지질, 또는

l. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 531인 지질, 또는

m. MS/MS에 의한 질량이 m/z 86.02인 지질, 또는

n. MS/MS에 의한 질량이 m/z 146.97인 지질, 또는

o. MS/MS에 의한 질량이 m/z 444.82인 지질, 또는

p. MS/MS에 의한 질량이 m/z 655.94인 지질, 또는

q. MS/MS에 의한 질량이 m/z 454.19인 지질, 또는

r. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.66인 지질, 또는

s. MS/MS에 의한 질량이 m/z 393.39인 지질, 또는

t. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.67인 지질, 또는

u. MS/MS에 의한 질량이 m/z 692.69인 지질, 또는

v. MS/MS에 의한 질량이 m/z 694.72인 지질, 또는

w. MS/MS에 의한 질량이 m/z 716.71인 지질, 또는

x. MS/MS에 의한 질량이 m/z 531.34인 지질.

하나의 구현예에서, 지질은 MS에 의한 질량이 m/z 86.02인 지질이거나, 또는 지질 분획이 이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 지질은 MS에 의한 질량이 m/z 146.97인 지질이거나, 또는 지질 분획이 이를 포함한다.

다양한 구현예, 특히 자낭균 문의 하나 이상의 진균들의 배양액을 포함하거나 이로부터 유래한 조성물에 대한 구현예에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획이 강화된다. 특정 구현예에서, 강화되지 않은 조성물, 예컨대 강화되지 않은 배양액 또는 생장 배지에 존재하는 양에 비해, 약 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 % 이상이 강화된다. 다른 구현예에서, 강화되지 않은 조성물에 존재하는 양에 비하여, 약 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 또는 100배 이상 강화된다.

특정 구현예에서, 강화는 첨가에 의한다. 다른 구현예에서, 강화는 정상 생장 조건 하에서 생산되는 것에 비하여, 하나 이상의 지질 또는 지질 분획의 생산 증가에 도움이 되는 조건(예를 들어, 본 명세서에서 구체적으로 설명한 지질 분획의 식별 특성 중 하나의 존재에 대한, 생장 배지의 에세이에 의해 증명됨) 하에서 진균을 배양함으로서 가능하다.

다양한 구현예에서, 자낭균 문의 진균으로부터의 조성물, 또는 이로부터 얻거나 얻을 수 있는 분리균은, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 중량% 이상의 지질, 바람직하게는 비-산성 지질을 포함하며, 유용한 범위는 이들 범위 중 어떠한 범주 내(예를 들어, 약 1 내지 약 99%, 약 5 내지 약 99%, 약 10 내지 약 99%, 약 15 내지 약 99%, 약 20 내지 약 99%, 약 25 내지 약 99%, 약 30 내지 약 99%, 약 35 내지 약 99%, 약 40 내지 약 99%, 약 45 내지 약 99%, 약 50 내지 약 99%, 약 55 내지 약 99%, 약 60 내지 약 99%, 약 65 내지 약 99%, 약 70 내지 약 99%, 약 75 내지 약 99%, 약 80 내지 약 99%, 약 85 내지 약 99%, 또는 약 90 내지 약 99 중량%)에서도 선택될 수 있다.

본 발명에서 유용한 어떠한 조성물 또는 분리균도, 자낭균 문의 하나 이상의 진균들을 포함하는 배양액으로부터 얻거나 또는 얻을 수 있는 조성물 및 분리균을 포함하며, 자낭균 문의 하나 이상의 진균들이 있거나, 또는 있었으나 이후 제거된 배양액으로부터 얻을 수 있다고 이해되어야 한다.

하나의 구현예에서, 본 발명에서 유용한 조성물은 약 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100mg/mL 이상의 지질, 바람직하게는 비-산성 지질을 포함하며, 유용한 범위는 상기 값들 중 어떠한 범위 내(예를 들어, 약 0.01 내지 약 1.0, 약 0.01 내지 약 10, 약 0.01 내지 약 20, 약 0.01 내지 약 30, 약 0.01 내지 약 40, 약 0.01 내지 약 50, 약 0.01 내지 약 60, 약 0.01 내지 약 70, 약 0.01 내지 약 80, 약 0.01 내지 약 90, 약 0.01 내지 약 100, 약 0.1 내지 약 1.0, 약 0.1 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 20, 약 0.1 내지 약 30, 약 0.1 내지 약 40, 약 0.1 내지 약 50, 약 0.1 내지 약 60, 약 0.1 내지 약 70, 약 0.1 내지 약 80, 약 0.1 내지 약 90, 약 0.1 내지 약 100, 약 0.7 내지 약 1.0, 약 0.7 내지 약 10, 약 0.7 내지 약 20, 약 0.7 내지 약 30, 약 0.7 내지 약 40, 약 0.7 내지 약 50, 약 0.7 내지 약 60, 약 0.7 내지 약 70, 약 0.7 내지 약 80, 약 0.7 내지 약 90, 또는 약 0.7 내지 약 100mg/mL)에서도 선택할 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 지질을 생산하는 예시적인 진균 세포로는, 2008년 9월 23일자로, 오스트레일리아 국립표준연구소(NMIA)에 수탁번호 V08/025855로 기탁된 뷰바리아 바시아나 균주 K4B3, 또는 이의 식별 특성을 갖는 배양액; 뷰바리아 바시아나 균주 AM2, 뷰바리아 바시아나 균주 F480, 트리코데르마 분리균 1328을 포함하는 트리코데르마 종, 및 메타리지움 종, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주를 포함한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 살충성 지질 또는 지질 분획의 제조 방법에 관한 것이다:

자낭균 문의 하나 이상의 진균들의 배양액에 대한 유기용매 추출물을 제공하는 단계,

하나 이상의 산성 지질로부터 하나 이상의 비-산성 지질을 적어도 부분적으로 분리하는 단계, 및

하나 이상의 비-산성 지질 또는 지질 분획을 회수하는 단계.

하나의 구현예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 살충성 지질 또는 지질 분획을 제조하는 방법에 관한 것이다:

하나 이상의 자낭균 문의 진균 배양액의 유기 용매 추출물을 제공하는 단계,

하나 이상의 비-극성 지질로부터 하나 이상의 극성 지질을 적어도 부분적으로 분리하는 단계, 및

하나 이상의 극성 지질 또는 극성 지질 분획을 회수하는 단계.

특정 구현예에서, 자낭균 문의 진균으로부터 살충 활성을 갖는 지질 또는 지질 분획의 제조하는 방법은, 본질적으로 본 명세서에서 기재한 바와 같다.

하나의 예시적 구현예에서, 유기 용매는 클로로포름이거나, 또는 이를 포함한다. 예를 들어, 유기 용매는 메탄올 및 클로로포름을 포함한다.

다양한 구현예에서, 유기 용매는 단쇄 알킬 알콜을 포함하는 알칸올, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소-프로판올, 또는 부탄올이지만 이에 제한되지 않으며, 또는 클로로포름이다.

다양한 구현예에서, 유기 용매는 본 명세서에서 설명한 담체를 포함하는, 농업적으로 허용가능한 담체이다.

다양한 구현예에서, 분리 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피에 의한다. 하나의 예시적 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE-Sephadex에 의한다.

본 발명의 조성물은 분말, 더스트(dust), 펠렛, 과립, 스프레이, 에멀전, 콜로이드, 용액 등으로 제제화되며, 지질을 포함하는 세포 배양액의 건조(desiccation), 동결 건조(lyophilization), 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강(sedimentation), 또는 농축과 같은 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다. 하나 이상의 상기 살충성 지질을 포함하는 예시적 조성물에 대한 일부 구현예에서, 지질은 약 1 중량% 내지 약 99 중량%의 농도로 존재한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 본 명세서에서 설명한 B. 바시아나 세포의 하나 이상의 배양액으로부터 얻을 수 있다. 예시적인 살충성 지질 제제는, 적합한 뷰바리아 바시아나 균주 K4B3 세포를 균사체 생성에 효과적인 조건 하에서 배양하는 단계, 적어도 부분적으로 정제된 균사체를 제공하는 단계, 및 균사체로부터 하나 이상의 지질을 얻는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다.

추가적 구현예에서, 본 발명은 살충성 지질 조성물의 제조 방법을 제공한다. 예시적 구현예에서, 상기 지질은 살충제로서의 용도로 제제화되며, 농업 환경 등을 포함하는 환경 중에서 곤충 개체군을 방제하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 국소 적용 또는 곤충에 의한 지질 조성물의 섭취에 의해, 곤충 또는 곤충 개체군을 죽이는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 제제는 다시 국소 적용 또는 곤충에 의한 펩티드 조성물의 섭취에 의해, 곤충 또는 곤충 개체군을 길항하는데 사용될 수 있다. 특정 예에서, 본 발명의 지질을 토양에, 또는 식물, 나무, 관목의 표면 또는 근처에, 기타 화초, 가축, 주거지, 농장 시설, 건물 등의 근처에 적용하기 위해 제제화하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 지질 및 하나 이상의 진균을 포함하는 조성물에 관한 다양한 구현예에서, 상기 하나 이상의 진균은 생식적으로 살아있는(reproductively viable) 형태 및 양으로 존재한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명한 하나 이상의 지질, 하나 이상의 진균에서 얻을 수 있는 포자, 및 이와 함께 하나 이상의 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 생물학적 방제 조성물이며, 더욱 바람직하게는 상기 생물학적 방제 조성물은 살충성 조성물이다.

바람직하게는, 상기 생물학적 방제 조성물은 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

바람직하게는, 상기 하나 이상의 담체는 농업적으로 허용가능한 담체이며, 더욱 바람직하게는 충진 자극제, 케이킹-방지제, 습윤제, 유화제, 및 항산화제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 상기 조성물은 각각의 충진 자극제, 케이킹 방지제, 습윤제, 유화제, 및 항산화제 중 하나 이상을 포함한다.

바람직하게는, 상기 충진 자극제는 탄수화물 공급원, 예컨대 설탕, 과당, 포도당, 또는 전분을 포함하는 이당류이고, 상기 케이킹 방지제는 탈크, 실리콘 디이옥사이드, 칼슘 실리케이트, 또는 케일런 점토(kaelin clay)로부터 선택되며, 상기 습윤제는 탈지 분유 분말이고, 상기 유화제는 레시틴과 같은 콩으로 만든 유화제, 또는 모노디글리세리드와 같은 식물성 유화제이고, 및 상기 항산화제는 소듐 글루타메이트 또는 시트르산이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 진균의 생식 활성을 도움을 주거나, 또는 2주 초과, 바람직하게는 약 한 달, 약 2달, 약 3달, 약 4달, 약 5달 초과, 더욱 바람직하게는 약 6달 초과의 기간 동안, 살충 효력을 유지할 수 있는 안정한 조성물이다.

특정 구현예에서, 조성물은 진균의 단일 균주를 포함한다. 하나의 예시적 구현예에서, 진균은 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 (2008년 9월 23일에 NMIA 수탁번호 V08/025855로 기탁됨)이다.

대안적으로는, 조성물은 상기 진균 중 다수의 균주를 포함한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 지질과 함께, 생식적으로 살아있는 형태 및 양으로, 뷰베리아 바시아나 K4B3 (NMIA 수탁번호 V08/025855), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움 균주 K4V1 (NMIA 수탁번호 NM05/44593), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V2 (NMIA 수탁번호 NM05/44594), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V4 (NMIA 수탁번호 NM06/00007), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B1 (NMIA 수탁번호 NM05/44595), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B2 (NMIA 수탁번호 NM06/00010), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론지스포럼 균주 KT4L1 (NMIA 수탁번호 NM06/00009), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스 균주 K4P1 (NMIA 수탁번호 NM06/00008), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주로부터 선택된 하나 이상의 균주, 및 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 담체를 포함하는 생물학적 방제 조성물이다.

하나의 구현예에서, 생물학적 방제 조성물의 생산 방법은, 하기의 단계를 포함한다:

뷰베리아 바시아나 K4B3 (V08/025855)의 배양액을 제공하는 단계;

본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획의 생산에 적합한 조건 하에서, 상기 배양액을 유지시키는 단계; 및

i) 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 담체와 결합시키는 단계, 또는

ⅱ) 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 본 명세서에서 설명한 하나 이상의 곤충병원성 진균과 결합시키는 단계,

ⅲ) 뷰베리아 바시아나 K4B3 (V08/025855)로부터 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을 분리하는 단계, 또는

ⅳ) 뷰베리아 바시아나 K4B3 (V08/025855)로부터의 하나 이상의 지질을 적어도 부분적으로는 정제 또는 분리하는 단계, 또는

v) 상기 (i) 내지 (iv)의 것들 중 둘 이상의 조합.

특정 구현예에서, 방법은 유지 단계 이후 하나 이상의 세포 용해 단계를 부가적으로 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 분리는 원심분리 또는 여과에 의한다.

다양한 구현예에서, 분리는 진균, 예를 들어 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 99% 초과 또는 약 100%의 뷰베리아 바시아나 K4B3 (V08/025855)를 제거하는데 효과적이다.

따라서, 하나의 특히 고려된 구현예에서, 방법은 뷰베리아 바시아나 K4B3 (V08/025855)의 배양액을 제공하는 단계, 본 발명의 하나 이상의 분비된 지질 또는 지질 분획의 생산에 적합한 환경 하에서 상기 배양액을 유지하는 단계, 및 뷰베리아 바시아나 K4B3 (V08/025855)로부터 본 발명의 하나 이상의 분비된 지질 또는 지질 분획을 분리하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 담체는 농업적으로 허용가능한 담체이고, 바람직하게는 하나 이상의 담체는 충진 자극제, 케이킹 방지제, 습윤제, 유화제, 및 항산화제로 이루어지는 군에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 상기 조성물은 각각의 충진 자극제, 케이킹 방지제, 습윤제, 유화제, 및 항산화제 중 하나 이상을 포함한다.

다양한 구현예에서, 식물병원성 곤충은 노린재목(Hemiptera)이다.

바람직하게는, 상기 하나 이상의 식물병원성 곤충은 모기(mosquito), 배추좀나방(diamond moth back)을 포함하는 나방, 총체벌레(Thysanoptera), 진딧물, 나무이(Psyllid), 비늘벌레(Scale) 또는 가루이(노린재목)로 이루어지는 군에서 선택된다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 지질 또는 지질 분획 또는 이의 기능성 변이체는, 본 명세서에서 설명한 조성물 중에 존재할 수 있다.

하나의 구현예에서, 조성물은 본 발명의 2 이상의 지질을 포함한다.

다양한 구현예에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 지질, 및 이와 함께 하기의 것들을 포함한다:

i) 하나 이상의 뷰베리신(beauvericin);

ⅱ) 하나 이상의 바시아노리드(bassianolide);

ⅲ) 하나 이상의 곤충병원성 진균;

ⅳ) 상기 (i) 내지 (ⅲ) 중 어느 둘 이상의 것들.

하나의 구현예에서, 본 발명의 지질 또는 조성물은 식물 또는 이의 주변에 직접 적용된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 용매와 함께 혼합되고 (예를 들어 물과 함께) 유화되며, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 적용된다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 곤충, 예컨대 하나 이상의 식물병원성 곤충의 방제 방법으로서, 본 발명의 조성물을 식물 또는 이의 주변에 적용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 지질 또는 조성물은, 예를 들어 식물이 식물병원체에 의해 감염 또는 이에 노출되기 전에, 예방적으로 적용된다. 하나의 구현예에서, 조성물은 감염이 확립되거나, 또는 병원체가 존재할 경우, 예컨대 식물이 식물 병원체에 의해 감염 또는 이에 노출되거나, 또는 식물병원체가 식물 또는 이의 주변에 존재할 경우에 적용된다.

바람직하게는, 조성물은 적용에 앞서, 지질의 최종 농도가 약 0.5gm/L 내지 약 10gm/L, 더욱 바람직하게는 약 1gm/L가 되도록 물과 혼합된다.

바람직하게는, 적용에 앞서 건조 보호제, 예컨대 Deep Fried^TM, Fortune^TM 또는 Fortune Plus^TM가, 약 1ml/L의 최종 농도가 되도록 혼합된다.

하나 이상의 곤충병원성 진균을 포함하는 조성물에 대하여, 예시적인 농도 범위는 약 1×10²개 내지 약 1×10¹²개 포자/ml, 약 1×10²개 내지 약 1×10¹¹개 포자/ml, 약 1×10²개 내지 약 1×10¹⁰개 포자/ml, 약 1×10²개 내지 약 1×10⁹개 포자/ml, 약 1×10³개 내지 약 1×10⁹개 포자/ml, 약 1×10⁴개 내지 약 1×10⁹개 포자/ml, 바람직하게는 약 1×10⁵개 내지 약 5×10⁸개 포자/ml, 및 더욱 바람직하게는 약 1×10⁶개 내지 약 2×10⁸개 포자/ml이다. 특정 구현예에서, 조성물은 적용시, 10⁷개 포자/ml 이상, 5×10⁷개 포자/ml 이상, 또는 10⁸개 포자/ml 이상을 포함한다.

하나 이상의 진균이 조성물에 존재하는 다양한 구현예에서, 조성물은 헥타르당 약 1×10⁸ 내지 약 1×10¹⁵ 감염 단위(IU), 헥타르당 약 1×10⁹ 내지 약 1×10¹⁵ IU, 헥타르당 약 1×10¹⁰ 내지 약 1×10¹⁵IU, 헥타르당 약 1×10¹¹ 내지 약 1×10¹⁵ IU, 바람직하게는 헥타르당 약 1×10¹⁰ 내지 약 1×10¹⁴IU, 더욱 바람직하게는 헥타르당 약 5×10¹⁰ 내지 약 1×10¹⁴IU, 더욱더 바람직하게는 헥타르당 약 1×10¹¹ 내지 약 5×10¹¹IU의 비율로 적용될 수 있다.

하나의 구현예에서, 감염 단위(infectious unit)는 포자, 예컨대 내생포자(endospore)이고, 조성물은 헥타르당 약 1×10⁸개 내지 1×10¹⁵개 포자, 헥타르당 약 1×10⁹개 내지 1×10¹⁵개 포자, 헥타르당 약 1×10¹⁰개 내지 약 1×10¹⁵개 포자, 헥타르당 약 1×10¹¹개 내지 1×10¹⁵개 포자, 바람직하게는 헥타르당 약 1×10¹⁰개 내지 약 1×10¹⁴개 포자, 더욱 바람직하게는 헥타르당 약 5×10¹⁰개 내지 약 1×10¹⁴개 포자, 더욱더 바람직하게는 헥타르당 약 1×10¹¹개 내지 5×10¹¹개 포자의 비율로 적용된다.

편리하게, 상기 적용 비율은 약 10⁸개 포자/ml 이상으로 조성물을 제제화하고, 상기 조성물을 약 1L/헥타르 이상의 비율로 적용함으로서 얻을 수 있다. 본 명세서에서 논의한 바와 같이, 상기 적용 비율은 상기 조성물을 대용량의 농업적으로 허용가능한 용매, 예컨대 물에 용해함으로서 편리하게 얻을 수 있다.

바람직하게는, 조성물은 적용에 앞서 물과 혼합된다. 하나의 구현예에서, 조성물은 약 100L 물/Ha 이상, 약 150L/Ha 이상, 약 200L/Ha 이상, 약 250L/Ha 이상, 약 300L/Ha 이상, 약 350L/Ha 이상, 약 400L/Ha 이상, 약 450L/Ha 이상, 또는 약 500L/Ha 이상으로 물과 혼합된다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 적용에 앞서 약 1×10¹¹ 내지 약 5×10¹¹개 포자/500L 물의 최종 농도가 되도록 물과 혼합되어, 500L/헥타르의 비율로 적용된다.

바람직하게는, 상기 적용은 스프레이에 의한다.

바람직하게는, 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 (NMIA 수탁번호 V08/025855) 또는 이의 식별 특성을 갖는 배양액을 포함하는 조성물이, 헥타르당 약 1×10¹⁰개 내지 약 1×10¹⁵개 포자, 바람직하게는 헥타르당 약 1×10¹²개 내지 약 1×10¹⁴개 포자, 더욱 바람직하게는 헥타르당 약 5×10¹²개 내지 약 1×10¹⁴개 포자, 더욱 바람직하게는 헥타르당 약 1 ~ 3×10¹³개 포자의 비율로 적용된다.

편리하게, 상기 적용 비율은 상기 조성물을 약 10⁷개 포자/mg 이상으로 제제화하고, 상기 조성물을 약 1kg/헥타르 이상의 비율로 적용함으로서 얻을 수 있다. 본 명세세에서 논의한 바와 같이, 상기 적용 비율은 상기 조성물을 대용량의 농업적으로 허용가능한 용매, 예컨대 물에 용해시킴으로서 편리하게 얻을 수 있다.

본 발명은 어떠한 식물 또는 이의 주변에도 적용할 수 있다. 예시적 식물로는, 특정 구현예에서는 단자엽식물 또는 쌍자엽식물, 예컨대 알파파, 보리, 카놀라, 옥수수, 면화, 아마, 케이폭, 땅콩, 감자, 귀리, 쌀, 호밀, 수수, 대두, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 담배, 토마토, 밀, 잔디풀(turf grass), 목초, 산딸기류, 열매, 꼬투리열매(legume), 채소, 관상용 식물, 관목, 선인장(cactuses), 다육 식물(succulent), 및 나무가 있다.

추가적 예시 구현예에서, 식물은 메꽃과( Convolvulaceae ), 히들로레아과( Hydroleaceae ), 몬티니아과 ( Montiniaceae ), 가지과 ( Solanaceae ), 및 스피노클레아과( Sphenocleaceae)를 포함하는 가지목 ( Solanales ) 식물로부터 선택된 식물, 및 수선화과( Amaryllidaceae ), 아스파라거스과 ( Asparagaceae ), 아스텔리아과( Asteliaceae ), 블란드포르디아과 ( Blandfordiaceae ), 보리아과 ( Boryaceae ), 도리안테스과( Doryanthaceae ), 노란별수선과 ( Hypoxidaceae ), 붓꽃과( Iridaceae ), 익시올리리아과( Ixioliriaceae ), 라나리아과 ( Lanariaceae ), 난초과( Orchidaceae ), 테코필라에아과( Tecophilaeaceae ), 크산토로이아과 ( Xanthorrhoeaceae ), 및 크세로네마과( Xeronemataceae )를 포함하는 아스파라거스목 ( Asparagales ) 식물로부터 선택된 식물을 포함하여, 어떠한 식물도 가능하다.

본 발명이 속하는 당업계의 통상의 기술자들에게는, 본 발명의 구성 상의 많은 변경, 및 구현예와 그 적용을 달리하는 것 자체가, 첨부된 청구항에서 정의한 바와 같은 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는다는 것을 암시할 것이다. 본 명세서의 개시 내용과 설명은 순수하게 예시 목적이며, 어떤 의미에서도 제한되는 것으로 고려되지 않는다. 특허 명세서, 다른 외부 문헌, 또는 정보원에 대해 참고한 이 명에서에서, 이는 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 맥락을 제공하기 위한 것이다. 달리 구체적으로 기재되지 않으면, 상기 외부 문헌에 대한 참조가 어떠한 분야이든 간에 상기 문헌, 또는 상기 정보원이 당업계에 속하거나, 또는 당업계의 일반적 상식의 일부를 구성하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서에서 개시한 수의 범위(예컨대, 1 내지 10)에 대한 참고는, 또한 그 범위(예컨대, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 내의 모든 유리수, 및 그 범위 내의 모든 범위의 유리수(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)를 포함하므로, 본 명세서에서 기재된 모든 범위의 모든 소범위가 이하에서 명확히 기재되는 것으로 의도된다. 구체적으로 의도된 것들의 실시예 만이 있으며, 열거된 최저치와 최대치 사이의 절대값에 대한 모든 가능한 조합은 비슷한 방식으로 이러한 응용에서 명확히 기재된 것으로 고려된다.

도 1은 원심분리한 물질의 박층 크로마토그래피(TLC)를 나타낸다. 두 개의 다른 샘플의 로딩 및 지질 표준 물질(오른쪽 레인)을 분석한다.
도 2는 개시 물질에 비교한, 산성/비-산성 분획의 TLC를 나타낸다. 산성 분획(A)는 진한 지방산 밴드를 보이며, 비산성 분획(NA)은 다수의 상이한 지질 밴드를 포함한다.
도 3은 산성/비-산성 분획에 대한 바이오에세이 결과를 나타낸다.
도 4는 6개의 크로마토그래피 분획에 대한 TLC를 나타낸다. 오른쪽 패널은 모든 지질을 나타내는데 최적화된 조건을 사용하여, 분획 1, 5 및 6를 반복한 것이다.
도 5는 6개의 크로마토그래피 분획에 대한 바이오에세이 결과를 나타낸다.
도 6은 11개의 메탄올 크로마토그래피 분획에 대한 TLC를 나타낸다.
도 7은 크로마토그래피 분획에 대한 바이오에세이 결과를 나타낸다.
도 8은 분취용 TLC 플레이트 1로부터의 분획에 대한 분석용 TLC를 나타낸다.
도 9는 (플레이트 1로부터의) 분취용 TLC 분획들의 바이오에세이 결과를 나타낸다.
도 10은 분취용 TLC 플레이트 2로부터의 분획들에 대한 분석용 TLC를 나타낸다.
도 11은 (플레이트 2로부터의) 분취용 TLC 분획들의 바이오에세이 결과를 나타낸다.
도 12는 분획 2, 3, 4b, 5a, 5b(상부에서 하부로)의 MALDI-TOF MS를 나타낸다.
도 13은 분획 3의 저질량 범위 MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 진딧물에 대한 바이오에세이 결과를 보여준다.
도 15는 진딧물에 대한 K4B3 균사체 배양액(복제 튜브)에 대한 클로로포름 추출액의 바이오에세이를 나타낸다.
도 16은 진딧물에 대한 바이오에세이 결과를 보여준다.
도 17은 배추좀나방에 대한 바이오에세이 결과를 보여준다.
도 18은 본 명세서의 실시예 5에서 설명한 뷰베리아 바시아나 균주 AM2, F480, 및 K4B3으로부터 추출한 총 지질에 대한 바이오에세이에서, 20시간(20 ℃)에서의 복숭아혹진딧물(green peach aphid)의 누적 사망률(%)을 나타낸다. 샘플 1-9은 K4B3 지질의 다양한 분획이다.
도 19는 본 명세서의 실시예 5에서 설명한 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 (뷰베리아), 트리코데르마 및 메타리지움로부터의 다양한 지질 분획에 대한 바이오에세이에서, 21시간((20 ℃)에서의 복숭아혹진딧물의 누적 사망률(%)을 나타낸다. K4B3-지질 1 및 K4B3-지질 2는 동일한 배치의 배양액에서 반복 분리한 것들이며, 메탄올은 음성 대조군이다.
도 20는 도 19 및 본 명세서의 실시예 5에서 설명한 바이오에세이에서의, 복숭아혹진딧물의 누적 사망률(%)을 나타낸다.
도 21은 본 명세서의 실시예 5에서 설명한 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 (뷰베리아), 트리코데르마 및 메타리지움로부터의 다양한 지질 분획에 대한 바이오에세이에서, 배추좀나방 유충의 누적 사망률(%)을 나타낸다.
도 22는 본 명세서의 실시예 5에서 설명한 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 (FS 및 Beaublast), 및 트리코데르마로부터의 다양한 지질 분획에 대한 바이오에세이에서, 21시간(20 ℃)에서의 복숭아혹진딧물의 사망률(%)을 나타낸다. 시험 분획은 메탄올-추출 (-MeOH) 및 클로로포름 추출 (-Chloro) 분획, 및 음성 대조군으로서 메탄올과 물을 포함한다.

본 발명은 부분적으로는 식물병원성 곤충과 같은 곤충에 대한 효력을 가지며, 자낭균 진균의 다양한 균주들(뷰베리아 종 및 트리코데르마 종 포함)로부터 분리된 하나 이상의 지질, 및 상기 지질의 식물병원성 곤충과 같은 곤충에 대한 방제 용도에 관한 것이다.

개념

"생물학적 방제제(biological control agent)(BCA)"라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 하나 이상의 생물, 통상적으로 하나 이상의 병원체, 예컨대 하나 이상의 식물병원체, 예컨대 식물병원성 곤충에 대한 길항제로서 작용하거나 또는 하나 이상의 병원체, 에컨대 하나 이상의 식물병원체를 방제할 수 있는 생물학적 제제, 또는 이로부터 유래한 제제를 말한다. 길항작용(Antagonism)은 다수의 형태를 취한다. 하나의 형태에서, 생물학적 방제제는 단순히 방충제(repellent)로서 작용할 수 있다. 다른 형태에서, 생물학적 방제제는 병원체에 불리한 환경을 조성할 수도 있다. 추가의 바람직한 형태에서, 생물학적 방제 제제는 병원체에 기생, 이를 무능화, 불임화, 생장 저해, 전파 및 분포 저해, 및/또는 죽일 수 있다. 따라서, 길항 기작은 항생 작용(antibiosis), 기생(parasitism), 부동화(immobilisation), 불임(infertiity), 및 독성(toxicity)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 하나 이상의 병원성 곤충의 길항제로부터 유도되거나 길항제로서 작용하는 제제는, 곤충병원성 효력 또는 살충 활성을 갖는다고 할 수 있다. 나아가, 식물병원성 곤충을 포함하는 곤충의 길항제인 생물학적 제제는, 곤충병원성 제제라고 할 수 있다.

본 명세서에서 사용될 때, "생물학적 방제 조성물(biological control composition)"라 함은, 하나 이상의 병원체, 예컨대 하나 이상의 식물병원체의 길항제인 하나 이상의 생물학적 방제제로 이루어져 있거나, 또는 이를 포함하는 조성물이다. 상기 방제 제제는, 방충제로 작용하는 제제, 병원체에 불리하게 환경을 조성하는 제제, 및 병원체를 무력화, 불임화 및/또는 죽일 수 있는 제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

따라서, 본 명세서에서 사용될 때, "항-식물병원성 조성물(anti-phytopathogenic composition)"은 하나 이상의 식물병원체의 길항제인 하나 이상의 제제로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 본 명세세어서 항-식물병원성 효력을 갖는다고 고려된다.

"포함하는(comprising)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, "적어도 일부분이 이로써 이루어지는(consisting at least in part of)"을 의미한다. 본 명세서에서 "포함하는(comprising)"이라는 말을 포함하는 문장을 해석할 때, 상기 용어에 의해 상기에서 쓰여진(prefaced) 것 또는 것들과 다른 특징도 또한 존재할 수 있다. "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"와 같은 관련 용어들도 동일한 방식으로 해석될 것이다.

"방제(control)" 또는 "방제하는(controlling)"이라 함은, 본 명세서에서 사용될 때, 일반적으로 하나 이상의 병원체에 의한 감염, 예컨대 하나 이상의 식물병원체에 의한 감염을 예방, 감소 또는 박멸하거나, 또는 상기 감염의 속도 및 정도를 억제, 예컨대 식물 또는 이의 주변에서 식물병원체 개체군을 감소시키는 것을 포함하며, 상기 감염 또는 개체군의 예방 또는 감소는 처치되지 않은 감염 또는 개체군에 비하여 통계학적으로 유의적이다. 치료적 처치(curative treatment)도 또한 고려된다. 바람직하게는, 상기 방제는 병원체 개체군에 대한 사망률을 증가시킴으로서 이루어진다.

"곤충병원성 활성(entomopathogenic activity)" 및 "곤충병원성 효력(entomopathogenic efficacy)"이란 말은 본 명세서에서 상호 호환하여 사용되며, 특정 제제, 예컨대 특정 미생물 또는 상기 특정 미생물로부터 유래한 제제의, 하나 이상의 병원성 곤충, 예컨대 하나 이상의 식물병원성 곤충에 길항할 수 있는 능력을 말한다.

다양한 구현예에서, 상기 곤충병원성 효력은 하나 이상의 곤충, 예컨대 식물병원성 곤충에, 바람직하게는 상기 곤충과 접촉한 후 14일 이내, 더욱 바람직하게는 7일 이내에 기생 및 무력화, 이의 불임화, 생장 저해, 또는 죽일 수 있는 능력이며, 더욱더 바람직하게는 하나 이상의 식물병원성 곤충을 7일 이내에 죽일 수 있는 능력이다. 대안적으로, 상기 곤충병원성 효력은 하나 이상의 곤충병원성 미생물, 예컨대 하나 이상의 곤충병원성 진균의 생장을 도와주거나 또는 촉진하는 능력이다.

따라서, 본 명세서에서 사용될 때, "곤충병원성 조성물(entomopathogenic composition)"은 통상 하나 이상의 병원성 곤충의 길항제인 하나 이상의 제제로 이루어지거나 이를 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 본 명세서에서 곤충병원성 효력을 갖는다고 고려된다.

"살충 활성(insecticidal activity)" 및 "살충 효력(insecticidal efficacy)"이란 어구 본 명세서에서 상호호환하여 사용되며, 특정 제제, 예컨대 특정 미생물로부터 유래된 것들의, 하나 이상의 곤충, 예컨대 하나 이상의 식물병원성 곤충을 무력화, 불임화, 생장 저해 또는 죽일 수 있는 능력을 말한다.

다양한 구현예에서, 상기 살충 효력은 하나 이상의 곤충, 예컨대 식물병원성 곤충을, 바람직하게는 곤충과 접촉한 후 14일 이내, 더욱 바람직하게는 7일 이내에 무력화, 불임화, 생장 저해 또는 살충할 수 있는 능력이며, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 곤충을 7일 이내에 죽일 수 있는 능력이다.

특정 구현예에서, 곤충병원성 활성은 살충 활성이다. 예를 들어, 본 발명의 지질 또는 지질 분획의 특정 구현예는 살충성을 갖는다.

따라서, 본 명세서에서 사용될 때, "살충성 조성물(insecticidal composition)"은, 통상 하나 이상의 곤충을 무력화, 불임화, 생장 저해 또는 죽일 수 있는 하나 이상의 제제로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 본 명세서에서 살충 효력을 갖는다고 고려된다.

"기능성 변이체(functional variant)"라 함은, 하나 이상의 지질 또는 지질 분획에 대하여, 예컨대 본 명세서의 실시예에서 예시된 하나 이상의 지질 분획에 대하여 본 명세서에서 사용될 때, 구체적으로 식별된 개체(entity)와는 다른 지질 또는 지질 분획을 말하며, 예를 들어 상기에서 하나 이상의 기, 예컨대 하나 이상의 지방산기가 삭제, 치환 또는 첨가되지만, 특이적으로 식별된 개체(entity)의 생물학적 활성, 예컨대 특이적으로 식별된 지질 또는 지질 분획에 의해 유도된 하나 이상의 생물학적 효과를 유도하는 능력을 적어도 부분적으로 갖는다. 기능성 변이체는 동일 또는 다른 종에서 생성될 수 있고, 상동체(homologue), 유사체(paralogue) 및 상사체(orthologue)를 포함할 수 있다.

본 발명의 경우, 기능성 변이체는 바람직하게는 특이적으로 식별된 지질 또는 지질 분획의 살충 활성의 적어도 일부분을 유지할 것이다.

본 발명의 지질 또는 지질 분획에 의해 유도된 하나 이상의 생물학적 효과, 예컨대 살충 효력을 결정하기 위한 방법 및 에세이가 당업계에 잘 공지되어 있고, 상기 방법 및 에세이는 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획의 하나 이상의 기능성 변이체를 식별 또는 증명하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 지질의 살충 능력, 또는 그렇지 않으면 목표 곤충 생장을 길항화하는 능력, 예컨대 본 명세서의 실시예에서 기재된 것들에 대한 에세이는, 지질의 하나 이상의 기능성 변이체를 식별하는데 적합하다.

본 명세서에서 사용될 때, "식별 특성(identifying characteristic)"이라 함은, 예를 들어 분광분석(spectrometry) 프로파일 상의 특정 피크의 유무, 크로마토그래피 에세이 상의 일정한 이동성 또는 유출 프로파일을 갖는 화합물 또는 분획의 유무, 예컨대 TLC 상의 일정한 이동성을 갖는 밴드의 유무와 같은 물리화학적 특성을 포함하는 개체가 갖고 있고 이에서 결정될 수 있는 하나 이상의 특성을 포함한다.

본 명세서에서 사용될 때, "지질(lipid)"은 불수용성이며, 통상 4 내지 36개 탄소수 길이 범위의 탄화수소 사슬을 갖는 하나 이상의 지방산, 카르복실산을 포함하는 매우 환원된 탄소-풍부 물질을 포함한다. 지질은 트리아실글리세롤, 글리세로인지질 및 스핑고지질을 포함하는 인지질, 당지질 및 스테롤을 포함한다.

"지방산 분획(lipid fraction)"은 본 명세서에서 사용될 때, 하나 이상의 지방산, 유리 지방산, 또는 이들 모두를 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 분획은 비분획화 원 물질에 존재하는 총 지질의 서브 세트를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진다. 통상, 지질 분획은 측정가능하며 식별가능한 조성물, 예를 들어 특징적인 크로마토그래피 프로파일 또는 질량 스펙트로그래피 프로파일을 포함한다. 지질 분획의 예들이 본 명세서에 제시되어 있다.

"식물(Plant)"이라 말은 본 명세서에서 사용될 때, 전체 식물 뿐만 아니라, 식물 일부, 절단부 뿐만 아니라, 뿌리, 잎, 꽃, 씨, 줄기, 유합 조직(callus tissue), 너트 및 과실, 구근, 수관, 구경, 낱알, 꺾꽂이, 근경, 또는 어린 가지를 포함하는 식물의 산물에까지 확장되며, 식재 전, 생장 기간 동안, 및 수확시 또는 수확 후이든 간에 이의 어떠한 식물 물질도 포함된다. 본 발명의 적용으로 이득을 볼 수 있는 식물은, 넓은 범위의 농업 및 원예 작물에 미친다. 본 발명의 조성물은 또한 유기 생산계에서의 적용에 특히 적합하다.

살충성 제제, 예컨대 살충성 지질 또는 곤충병원성 진균 균주에 대하여 사용될 때, "살충 효력을 보유하는(retaining insecticidal efficacy)" 또는 "곤충병원성 효력을 보유하는(retaining entomopathogenic efficacy)"이란 어구 및 이의 문법적 동일어 및 이의 파생어는, 제제가 여전히 유용한 살충 또는 곤충병원성 활성을 갖는다는 것을 의미하도록 의도된다. 바람직하게는, 보유 활성이 원래 활성의 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% 이상 또는 100%이고, 유용한 범위는 이들 범위 중 어떠한 값(예를 들어, 약 35 내지 약 100%, 약 50 내지 약 100%, 약 60 내지 약 100%, 약 70 내지 약 100%, 약 80 내지 약 100%, 및 약 90 내지 약 100%)에서도 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 지질 기능성 변이체 또는 분획은 살충 활성을 유지해야 하며, 즉 발명의 특이적인 지질 또는 지질 분획의 살충 활성의 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% 이상 또는 100%를 유지해야 한다. 따라서, 본 명세서에서 기재한 지질 분획 중 하나의 기능성 변이체, 예컨대 실시예에서 예시한 지질 분획의 변이체는, 각각의 지질 분획의 살충 활성의 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% 이상 또는 100%를 보유해야 한다. 유사하게, 본 발명의 바람직한 조성물은 자신이 포함하는 곤충병원성 제제(들)의 유용한 곤충병원성 활성 유지를 도와줄 수 있고, 이상적으로는 본 명세서에서 고려된 방법을 사용하여 적용될 때까지 곤충병원성 활성을 유지한다고 할 수 있다.

본 명세서에서, "안정한(stable)"이란 말은 본 발명의 조성물과 관련하여 사용될 때, 수 주일 동안, 바람직하게는 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 더욱 바람직하게는 약 5주, 더욱더 바람직하게는 약 6주 이상 동안, 살충 또는 곤충병원성 효력을 지지할 수 있는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 하나 이상의 곤충병원성 진균을 추가적으로 포함하는 조성물에 관하여 사용될 때, "안정한(stable)"이란 말은, 수 주일, 바람직하게는 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 더욱 바람직하게는 약 5주, 더욱더 바람직하게는 약 6주 이상 동안, 곤충병원성 진균의 생식적으로 살아있는 것(reproductive viability)을 도와줄 수 있는 조성물을 말한다.

"(특정 균주의) 식별 특성을 갖는 균주(strain having the identifying characteristics of [a specified strain])" 또는 "(특정 균주의) 식별 특성을 갖는 배양액(culture having the identifying characteristics of [a specified culture])"은, 특정 균주의 상동체 또는 돌연변이체를 포함하는데, 특정 균주와 매우 밀접한 관련이 있거나(예를 들어, 공통의 조상을 가짐) 또는 이로부터 유래되지만, 통상 하나 이상의 유전형 또는 표현형 특징에서 특정 균주와 다를 것이다. 돌연변이체는 일반적으로 유전적 차이의 평가를 통하여 식별가능하다. 상동체는 유전적, 생화학적 및 형태적 차이, 및 분지학(cladistics) 분석을 포함하는 분류학적 방법을 사용하여 식별가능하다. 그러나, (특정 균주의) 식별 특성을 갖는 균주(특정 균주의 상동체 또는 돌연변이체 포함)는 곤충병원성 효력을 유지할 것이고, 다른 균주와 차별화될 것이며, 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 모균주의 상동체 또는 돌연변이체로서 식별될 것이다.

"주변(surroundings)"이란 말은, 진균에 대한 식물, 본 발명의 방법 및 조성물에 대하여 사용될 때, 토양, 물, 낙엽(leaf litter), 및/또는 식물 또는 이의 뿌리, 수관 등에 인접한, 또는 그 주위의 생장 배지, 인근 식물, 상기 식물의 절단부, 지지부, 식물에 투여될 물, 및 종자 코팅을 포함한 코팅을 포함한다. 이는 보호 코팅, 상자 및 포장지와 같은 저장, 포장 또는 가공 재료, 및 식재, 유지 또는 수확 장비를 추가로 포함한다.

식물병원체의 방제

본 발명은 많은 국가, 예를 들어 미국, 뉴질랜드, 및 유럽의 많은 국가의 원예 분야가 식물병원성 병해충에 대한 살충 내성이 증가하는 문제에 직면했다는 것을 인정한다. 이는 규제 장벽에 기인하여 새로운 화학적 살충제의 이용가능성이 감소함으로서 더욱 심각해지고 있다.

진균 유래의 살충성 지질의 생물학적 방제제로서의 용도는, 이러한 문제에 대한 해결책을 제시한다. 효과적인 생물학적 방제제는 목표하는 식물병원성 곤충 또는 곤충 개체군을 무력화 또는 죽일 수 있는 능력에 따라서 선별될 수 있다. 도움이 되는(conducive) 조건 하에서, 식물병원성 곤충 예컨대 진딧물, 총체벌레 및 가루이는, 식물 및 토양, 낙엽, 인근 식물, 지지체 등을 포함하는 이의 주변에 대해 감염할 수 있다. 진균 유래의 살충성 지질 및 이로부터 유래한 제제는, 식물병원성 곤충을 무력화 및/또는 죽일 수 있도록 적용되며, 이로 인하여 병원체의 질병 유발 능력을 예방 또는 제한할 수 있다. 들판의 진균 유래의 이들 살충성 지질의 효력은, 결국 종종 달라지는 기후 조건 예컨대 중단된 우기 및 건조시에 살충 효력을 유지하는 그들의 능력에 의존한다. 곤충병원성 진균 유래의 제제, 예컨대 본 명세서에서 기재한 지질의 효력은, 통상적으로 생존력(viability) 유지를 요구하지 않으며, 오히려 살충 효력의 유지를 요구한다.

곤충, 예컨대 식물병원성 곤충에 대해 효과가 있어서 본 발명에 따른 사용에 적합한 본 발명의 지질 또는 지질 분획은, 본 발명의 지질 또는 이의 기능성 변이체에 비교되는 대조군 처리에 대하여 통계적 유의량 만큼, 목표 곤충 종의 개체군을 감소시키는데 효과적인 것으로 식별되었다. 상기 지질 또는 지질 분획은 살충 효력을 갖는다고 고려될 수 있다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, 목표하는 곤충 개체군의 감소는 다양한 길항 기작에 의할 수 있다. 예를 들어, 지질은 식물병원성 곤충을 무력화, 불임화, 생장 또는 발달의 저해, 및/또는 바람직하게는 이들을 죽일 수 있거나, 또는 존재하는 하나 이상의 곤충병원체, 예컨대 조성물에 존재하는 곤충병원성 진균의 생장 또는 곤충병원성 효력을, 본 발명의 지질 또는 지질 분획과 함께 (별도로, 동시에, 또는 연속으로) 도와주거나 또는 촉진할 수 있다. 엄밀히 말해, 본 발명의 지질 또는 지질 분획은 식물병원성 곤충에 기생, 이를 무력화, 불임화 및/또는 바람직하게는 죽일 수 있는 곤충병원체, 예컨대 곤충병원성 진균의 능력을 가능하게 하거나, 또는 도와줄 수 있다. 본 발명의 지질 또는 지질 분획은 또한 환경, 예를 들어 하나 이상의 진균이 적용되는 식물 또는 이의 주변을 식물병원성 곤충에 불리하게 조성함으로서, 목표하는 곤충의 개체군을 감소시킬 수 있다. 이러한 구현예에서, 지질 또는 지질 분획은 방충제로서 작용하며, 식물 또는 이들의 환경에 근접하여 목표 곤충의 효과적인 개체군을 감소시킨다고 고려할 수 있다.

하나의 구현예에서, 지질은 본 명세서에서 정의한 기능성 변이체이다.

바람직하게는, 본 발명의 적합한 지질 또는 지질 분획 또는 이의 기능성 변이체는, 대조군 처리에 대한 관련 식물 종의 퍼센트 감소율로서 표현될 때, 약 5% 살충 효력, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상의 살충 효력을 보인다. 실례로서, 본 명세서에 기재된 방법이 다양한 목표 곤충에 대해 효과적인 뷰베리아 지질 분획 분리균을 식별하는데 사용되며, 본 명세서에 기재된 것들과 유사한 공정을 다른 진균 및 곤충 종에 대해서 사용할 수도 있다.

비록 살충 효력이 생물학적 방제제로서의 용도에 적합하다고 고려되는, 지질 또는 지질 분획의 원칙적인 필수 조건이기는 하나, 지질 또는 지질 분획은 생물학적 방제제로서의 용도에 적합한 부가적 특성을 가질 수도 있다.

예를 들어, 지질 또는 지질 분획은 합당한 기간 동안 효과적인 형태(effective form)로 저장되어, 궁극적으로는 목표 식물 또는 이의 주변에 대해 생물학적 방제제로서 유효한 형태 및 농도로 적용되도록 해야 한다.

당업계의 통상의 기술자들은, 본 발명의 지질 또는 지질 분획 및 조성물들이 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획의 하나 이상의 기능성 변이체(본 명세서에서 예시한 것들 포함)를 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 방법들이 이를 사용할 수 있다는 것을 인정할 것이다. 지질 또는 지질 분획 및 이의 기능성 변이체의 조합도, 또한 본 명세서에서 유용하다.

지질의 분리 방법

본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획의 생산 및 분리에 대한 예시적 방법이, 본 명세서에 기재되어 있다. 이들은 자낭균 문, 예컨대 B. 바시아나 K4B3을 포함하는 뷰베리아 종, 또는 트리코데르마 종의 하나 이상의 진균들의 배양액으로부터 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을 분리하는 것을 포함한다.

대안적으로, 본 발명의 지질 또는 지질 분획(이의 기능성 변이체 포함)은, 당업계에서 잘 알려진 지질 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

곤충병원성 진균을 포함하는 조성물

곤충병원성 진균을 수입하는 것은, 종종 문제가 발생하고, 비용이 들며, 특정 정규 요법 하에서 불가능하지 않은 경우 실용적이지 못하다. 예를 들어, 일정 국가를 벗어나서 사용가능한 곤충병원성 진균은, 규제 및 법정 제한(regulatory and legislative preclusions) 때문에, 상기 국가 내에서는 원예가들이 입수할 수 없다. 본 발명은 따라서 상기 진균으로부터 곤충병원성 효력을 갖거나, 또는 곤충병원성 진균 (또는 다른 곤충병원체)의 생장을 도와주거나, 촉진시킬 수 있는 제제를 식별 및 제조할 수 있고, 폭넓은 환경 조건 하에서 상기 곤충병원체가 번성하도록 도와줄 수 있거나, 또는 이의 둘 다가 가능한 탁월한 장점이 있다는 것을 인정한다.

상기 진균의 분리균은, 예를 들어 식물, 이들의 주변 및 상기 식물의 병원체로부터 편리하게 얻을 수 있다. 특정 구현예에서, 상기의 진균의 분리균은 목표 곤충으로부터 얻을 수 있거나, 또는 상기 진균을 포함하는 생물학적 방제제 또는 상기 진균을 포함하는 조성물이 이후 적용되는 식물 종 (또는 이의 주변)으로부터 얻을 수 있다.

다른 조건(다른 온도 및 다른 배지 또는 다른 물질 포함) 하에서, 상기 진균의 생장을 결정하는 방법은, 당업계에 잘 공지되어 있다. 마찬가지로, 본 발명의 지질의 진균 생장에 대한 긍정적인 영향, 예컨대 상기 지질(들)의 부재 하에서 관찰되는 것들에 비해, 상기 지질의 존재 하에서 상기 진균의 병독성(virulence) 또는 곤충병원성 효력이 증가한다는 것이, 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 온도, 또는 다양한 식물, 환경, 또는 목표 생물에서 진균의 생장에 영향을 줄 수 있는, 본 발명의 지질의 능력을 결정하기 위한 방법에 대한 예들이 본 명세서에 기재되어 있다.

곤충병원성 효력이 분리균의 생물학적 방제제 용도에 적합하다고 고려되는 원칙적인 필수 조건이기는 하지만, 진균 분리균은 생물학적 방제제 용도에 적합한 부가적 특성을 가져야 한다.

예를 들어, 진균은 합당한 시기에 살아있는 형태로서 저장되어, 궁극적으로는 셍물학적 방제제로서 유효한 형태 및 농도로, 목표 식물 또는 이의 주변에 적용될 수 있어야 한다.

진균은 또한 식물 또는 이의 주변에 적용되어 생물학적 방제제 용도로 적합한 감염 임계치(infection threshold)를 얻을 수 있어야 한다. 본 명세서에서 사용될 때 감염 임계치라 함은, 진균이 목표 식물 또는 이의 주변에 곤충병원성 효력을 갖도록 확립되는데 필요한 진균의 농도를 말한다. 자명한 바와 같이, 감염 임계치를 얻기 위하여, 진균의 일부 분리균은 비실용적이거나 또는 살아있지 않아 높은 비율로 적용할 것이 요구된다. 나아가, 일부 진균 분리균은 적용되는 농도 또는 비율에 무관하게, 감염 임계치를 얻을 수 없다. 적합한 곤충병원성 진균은, 상기 조성물이 약 1kg/1000L/헥타르의 비율로 적용되는 경우 10¹⁰개 포자/헥타르 이하의 비율로 적용되거나, 10⁷개 포자/㎎ 이하의 조성물 농도로 적용될 때 감염 임계치를 얻을 수 있다.

감염 임계치의 결정 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 상기 방법의 예들이 본 명세서에 제시되어 있다. 특정 구현예에서, 감염 임계치는 예를 들어 목표 식물, 이의 주변, 및/또는 상기 식물의 병원체로부터 얻은 하나 이상의 샘플을 분석하고, 상기 샘플 상의 또는 그 내부의 진균의 존재 또는 양을 결정함으로써, 직접적으로 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, 감염 임계치는 예를 들어 하나 이상의 식물병원성 곤충 개체군의 감소를 관찰함으로서, 간접적으로 결정될 수도 있다. 상기 방법들의 조합도 또한 예상된다.

뷰베리아 바시아나는 예를 들어 메뚜기, 진딧물, 총체벌레, 나방 및 몇몇 다른 종들을 포함한 미성숙 또는 성숙한 곤충을 공격하는 토양 진균이다. 통상, B. 바시아나는 곤충, 예컨대 진딧물, 천공충(borer), 및 총체벌레의 사체로부터 분리될 수 있고, 또한 토양으로부터 분리할 수도 있다. 예시적인 곤충병원성 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3는 본 발명의 특정 구현예에서 사용될 수 있으며, 오스트레일리아 뉴사우스 웨스트시 핌블 수아킨 스트리트 1 소재의 오스트레일리아 국립표준연구소(NMIA, 전 오스트레일리아 연방 분석연구소(AGAL))에, 2008년 9월 23일자로 기탁되었다. 분리균은 수탁번호 V08/025855를 부여받았다.

따라서, 하나의 측면에서 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 지질, 또는 이를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및 이와 함께 생식적으로 살아있는 형태 및 양의 B. 바시아나 균주 K4B3(NMIA 기탁번호 V08/025855), 또는 균주 K4B3(NMIA 수탁번호 V08/025855)의 식별 특성을 갖는 뷰베리아를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다.

B. 바시아나 균주 K4B3는 중단된 우기, 건조시에 생존할 수 있으며, 식물병원성 곤충, 예컨대 들판의 진딧물, 나비 유충(caterpillar), 가루이, 나방, 바로아 응애(varroa mite), 매미, 및 총체벌레(이에 제한되지 않음)를 콜로니화, 무력화 및 죽일 수 있는 특히 효과적인 생물학적 방제제이다.

본 발명의 다른 구현예에서, B. 바시아나 K4B3가 본 명세서에서 식별된 하나 이상의 지질을 포함하는 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

하나의 구현예에서, 방법은 하나 이상의 지질의 생산에 적합한 조건 하에서 뷰베리아 바시아나 K4B3(V08/025855)로 배양액을 유지하는 단계; 및 뷰베리아 바시아나 K4B3(V08/025855)로부터 하나 이상의 지질을 분리하는 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 조성물은 본 명세서에서 설명한 2 이상의 지질을 포함한다. 분명히, 이들 지질 중 어떠한 것도 뷰베리아에 대한 공지의 살충제, 예컨대 뷰베리신, 뷰베리신-F, 및 바시아노리드에 대해 유의한 식별성 또는 동일성을 갖지 않는다. 하나의 구현예에서, 조성물은 본 명세서에서 설명한 2 이상의 지질을 포함하는 상승 조성물(synergistic composition)이다.

다른 구현예에서, 조성물은 추가적으로 약 1mgL^-1 미만의 뷰베리신, 약 0.5mgL^-1 미만의 뷰베리신, 약 0.1mgL^-1 미만의 뷰베리신, 약 0.05mgL^-1 미만의 뷰베리신, 약 0.01mgL^-1 미만의 뷰베리신, 약 0.005mgL^-1 미만의 뷰베리신, 약 0.001mgL^-1 미만의 뷰베리신, 약 0.0005mgL^-1 미만의 뷰베리신, 또는 약 0.0001mgL^-1 미만의 뷰베리신을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 부가적으로 약 1mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 약 0.5mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 약 0.1mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 약 0.05mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 약 0.01mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 약 0.005mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 약 0.001mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 약 0.0005mgL^-1 미만의 뷰베리신-F, 또는 약 0.0001mgL^-1 미만의 뷰베리신-F을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 부가적으로 약 1mgL^-1 미만의 바시아노리드, 약 0.5mgL^-1 미만의 바시아노리드, 약 0.1mgL^-1 미만의 바시아노리드, 약 0.05mgL^-1 미만의 바시아노리드, 약 0.01mgL^-1 미만의 바시아노리드, 약 0.005mgL^-1 미만의 바시아노리드, 약 0.001mgL^-1 미만의 바시아노리드, 약 0.0005mgL^-1 미만의 바시아노리드, 또는 약 0.0001mgL^-1 미만의 바시아노리드를 포함한다.

다양한 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 지질, 및 이와 함께 하나 이상의 뷰베리신, 예컨대 뷰베리신-A, 뷰베리신-D, 뷰베리신-E, 또는 뷰베리신-F, 또는 하나 이상의 바시아노리드, 또는 이들의 조합을 포함하는 상승 조성물이다.

예를 들어, 조성물은 부가적으로 약 0.1mgL^-1 초과의 뷰베리신, 약 0.5mgL^-1 초과의 뷰베리신, 약 1mgL^-1 초과의 뷰베리신, 약 5mgL^-1 초과의 뷰베리신, 약 10mgL^-1 초과의 뷰베리신, 약 50mgL^-1 초과의 뷰베리신, 또는 약 100mgL^-1 초과의 뷰베리신을 포함한다.

다른 실시예에서, 조성물은 부가적으로 약 0.1mgL^-1 초과의 바시아노리드, 약 0.5mgL^-1 초과의 바시아노리드, 약 1mgL^-1 초과의 바시아노리드, 약 5mgL^-1 초과의 바시아노리드, 약 10mgL^-1 초과의 바시아노리드, 약 50mgL^-1 초과의 바시아노리드, 또는 약 100mgL^-1 초과의 바시아노리드를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기재한 하나 이상의 지질 및 본 명세서에 기재한 하나 이상의 곤충병원성 진균과 함께, 하나 이상의 뷰베리신, 예컨대 뷰베리신-A, 뷰베리신-D, 뷰베리신-E, 또는 뷰베리신-F, 또는 하나 이상의 바시아노리드, 또는 이들의 조합을 포함하는 상승 조성물이다.

본 발명의 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3는, 단독으로, 또는 본 명세서에서 설명한 다른 곤충병원성 진균과 함께 사용될 수 있다. 다른 곤충병원성 진균의 예들은 하기에서 좀더 상세하게 설명할 것이다.

뷰베리아 바시아나 균주 K4B1는, 뉴질랜드 봄베이의 소나무숲 내의 천공충 유충으로부터 분리하였다. 이 B. 바시아나 분리균은 특허 절차를 위한 부다페스트 조약에 따라서, 2005년 3월 16일자로 오스트레일리아 뉴 사우스 웨일즈 핌블 수아킨 스트리트 1 소재의 오스트레일리아 국립표준연구소에 기탁되었다. 분리균은 수탁번호 NM05/44595를 부여받았다.

뷰베리아 바시아나 분리균 K4B1은, 총체벌레 성충에 대한 선호도를 보이며, 또한 총체벌레 유충 및 번데기, 진딧물, 및 가루이에 대해 병원성이 있다. K4B1의 분생자(conidia)는 크림형 응집체를 형성한다.

뷰베리아 바시아나 분리균 K4B2은, 뉴질랜드 아카 아카 플랫츠의 해바라기에 있던 나비목 유충으로부터 분리되었다. 이 B. 바시아나 분리균은 특허 절차를 위한 부다페스트 조약에 따라서, 2006년 3월 3일자로 오스트레일리아 국립표준연구소에 기탁되었다. 이 분리균은 수탁번호 NM06/00010를 부여받았다.

뷰베리아 바시아나 분리균 K4B2은, 콩 루퍼 유충(soybean looper caterpillar) 및 흰나비 및 조밤나방(army worm caterpillar)을 포함하는 나비 유충(caterpillar)에 대한 선호도를 보인다. 이 분리균은 또한 총체벌레 유충, 성충, 및 번데기, 진딧물 및 가루이에 대해 병원성이 있다. K4B2의 분생자는 노란색 더스트형 응집체를 형성한다.

NMIA 수탁번호 V08/025855, NMIA 수탁번호 NM05/44595, NMIA 수탁번호 NM06/00010 및 B. 바시아나의 다른 적합한 분리균도, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 이의 기능성 변이체 또는 이의 절편과 함께 사용될 수 있으며, 이는 특히 중단된 우기, 건조시에 생존할 수 있고, 식물 병원성 곤충 예컨대 들판의 진딧물, 나비 유충, 가루이, 나방, 바로아 응애 및 총체벌레(이에 한정되지 않음)를 콜로니화, 무력화 및 죽일 수 있는 효과적인 생물학적 방제제이다. 이들 B. 바시아나의 분리균에 의한 가루이, 총체벌레 및 진딧물의 사망 정도는, 일반적으로 상기에서 설명한 살충제를 통상 사용한 경우만큼 양호하다. 이들 살충제에 대한 내성이 발달되었다; 이들의 경우 또는 다른 경우에, B. 바시아나 분리균을 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법은 곤충 방제에 대한 효과적인 대안을 제공한다. 이러한 식물 질병의 방제에 대한 강력한 활성과 함께, B. 바시아나에 의해 유발되는 식물 병원성이 나타나지 않음은, 이들 종의 분리균이 생물학적 방제제 용도를 위해 바람직한 특성을 갖는다는 것을 입증한다.

트리코데르마 종은 이전에 어떠한 살충 활성 또는 효과가 있다고 보지 않았다. 트리코데르마 배양액은 통상적으로 25-30℃에서 빠르게 생장하나, 35℃에서는 생장하지 않는다. 콜로니들은 콘밀(cornmeal) 덱스트로스 아가(CMD)와 같은 배지 상에서 처음에는 투명하거나, 또는 포테이토 덱스트로스 아가(PDA)와 같은 좀더 풍부한(richer) 배지 상에서는 흰색이었다. 균사체는 통상적으로 CMD 상에서는 분명하지 않으며, 분생자는 통상적으로 1주 이내에 녹색 또는 노란색 또는 드물게는 흰색 음영의 빽빽하거나 또는 느슨한 다발을 형성한다. 노란색 색소를 아가, 특히 PDA 상에 분비할 수 있다. 일부 종들은 특징적인 달콤한 향 또는 '코코넛' 향을 생성한다.

분생자(conidiophores)는 매우 분지되어(branched) 정의 또는 측정하기 어렵고, 느슨하거나 빽빽한 다발을 형성하며, 종종 뚜렷한 동심원 형태 또는 소수의 기균사(aerial hyphae)를 따라서 전달된다. 분생자의 주요 분지들은 짝을 짓거나 짝짓지 않은 측면의 분지를 생성하며, 가장 긴 분지가 끝부분(tip)으로부터 떨어져 있고, 종종 경자(phialide)가 끝부분에 가까운 주요 축에서 직접 생성된다. 분지는 재분지 할 수 있고, 제 2 분지는 종종 짝을 이루며, 가장 긴 제 2의 분지는 주요 축에 가장 가깝다. 모든 제 1 또는 제 2 분지는 주요 축에 대하여 90° 내지 거의 90°로 형성된다. 통상의 트리코데르마 분생자는 짝지은 분지를 갖고 있는데,피라미드 측면을 갖는다. 통상적으로, 분생자는 하나 또는 몇 개의 경자(phialide)에서 끝난다. 일부 종(예를 들어, T. polysporum)에서, 주요 분지는 길고, 단순하거나 분지형, 갈고리형(hooked), 직선형 또는 구불구불한 모양, 중격형(septate), 박막형의 불임성 또는 최종적으로 임성(fertile)의 신장부로서 끝난다. 주요 축은 경자의 지저부와 동일한 폭을 갖거나, 또는 훨씬 더 넓을 수 있다.

경자(phialide)는 통상 가운데 부분이 커지나, 원통형 또는 거의 구형(nearly subglobose) 일 수 있다. 경자는 윤생(whorl)의 다른 멤버에 비하여 90°의 각도로 윤생 내에 유지될 수 있거나, 또는 (글리오클라디움(gliocladium)과 유사하게) 다발털(penicillate)이 다양하게 나있을 수 있다. 경자는 넓은 주요 축 상에 빽빽히 무리를 이룰 수 있거나(예를 들어, T. polysporum, T. hamatum), 또는 고립되어 있을 수 있다(예를 들어, T. longibrachiatum).

분생자는 통상적으로 건조하지만, 일부 종(예를 들어, T. virens, T. flavofuscum)에서는 선명한 녹색 또는 황색의 액체 방울로 유지될 수 있다. 대부분 종의 분생자는 타원형이다(3~5 × 2~4 ㎛(L/W ≥ 1.3)); 구형의 분생자(L/W < 1.3)는 드물다. 분생자는 통상 부드러우나, 작게 사마귀 모양으로 결절이 있는(tuberculate) 분생자도 몇몇 종에서 알려져 있다.

신아나모르프(synanamorph)도 또한 통상적인 트리코데르마 농포를 갖는 몇몇 종에 의해 형성된다. 신아나모르프는 수직으로 분지되며, 각각의 경자의 끝부분에서 선명한 녹색의 액체 방울로 맺힌 고립된 분생자 자루(conidiophore)에 의해 인식된다.

후막포자(Chlamydospore)는 모든 종에서 생성될 수 있으나, 모든 종이 20℃에서 10일 이내에 후막포자를 생성하는 것은 아니다. 후막포자는 통상 단일 세포로서 대략 구형(subglobose)이며, 짧은 균사(haphae)로 끝난다; 그들은 또한 균사 세포 내에 형성될 수 있다. 일부 종의 후막포자는 다세포이다(예를 들어, T. stromaticum).

레카니실리움 무스카리움은 동시류(homopteran) 곤충 및 다른 절지류(anthropod)의 군을 포함하는 넓은 숙주 범위를 갖는 곤충병원성 진균이다. L. 무스카리움는 다양한 형태학적 및 생화학적 특성을 갖는 분리균을 포함하는 종들의 복합체로서 간주된다. 통상적으로, L. 무스카리움은 진딧물, 총체벌레, 가루이, 및 깍지벌레(mealy bug)와 같은 곤충의 사체로부터 분리될 수 있고, 또한 토양으로부터도 분리가능하다.

레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V1는, 뉴질랜드 푸커코허의 온실 토마토 작물의 가루이로부터 분리된다. 이 L. 무스카리움 분리균은 특허 절차를 위한 부다페스트 조약에 따라서, 2005년 3월 16일자로 오스트레일리아 국립표준연구소에 기탁되었다. 분리균은 수탁번호 NM05/44593를 부여받았다.

K4V1는 추가적 식별 특성을 갖는다 - 가루이 비늘곤충(whitefly scale) 60% 분생자 1.0×1.0 마이크론, 총체벌레 유충(nymph) 30% 분생자 2.0×1.0 마이크론, 총체벌레 번데기 10% 분생자 2.5×1.3 마이크론. 균사체 엽상체의 밑면이 드문드문 주름져서, 균사체 엽상체(thallus)는 아가로부터 매우 용이하게 제거된다.

L. 무스카리움 균주 K4V2는, 뉴질랜드 루아카카의 오이 온실의 가루이로부터 분리하였다. 이 L. 무스카리움 분리균은 특허 절차를 위한 부다페스트 조약에 따라서, 2005년 3월 16일자로 오스트레일리아 국립표준연구소에 기탁되었다. 이 분리균은 수탁번 NM05/44594를 부여받았다.

K4V2는 추가적 식별 특성을 갖는다 - 50% 분생자 2.0×1.5㎛, 30% 분생자 2.0×1.0㎛, 20% 분생자 1.0×1.0㎛, 가루이 성충에 병원성 있음, 반면 출아 포자는 진딧물에 대해 병원성 있음. 균사체 엽상체의 밑면이 주름이 많이 져서, 균사체 엽상체는 아가 표면으로부터 제거하기 어렵다.

L. 무스카리움 균주 K4V4는, 실외 유기 타마릴로(tamarillo) 작물로부터 분리하였다. 이 L. 무스카리움 분리균은 특허 절차를 위한 부다페스트 조약에 따라서, 2006년 3월 3일자로 오스트레일리아 국립표준연구소에 기탁되었다. 이 분리균은 수탁번호 NM06/00007를 부여받았다.

K4V4는 추가적 식별 특성을 갖는다 - 50% 분생자 1.0×0.5㎛, 가루이 비늘곤충 및 성충에 대해 병원성이 있고, 낮은 습도 65-75%, 고온 28-32℃에서 매우 공격적이다. 일반적으로, v.1 > 75%. 50% 분생자 0.5×0.5㎛. 균사체 엽상체의 밑면이 드문드문 주름져서, 균사체 엽상체는 커스터드 옐로우 내지 담황색의 색소를 배지 상에 확산시킨다.

NMIA 수탁번호 NM05/44593, NMIA 수탁번호 NM05/44594, NMIA 수탁번호 NM06/00007 및 다른 적합한 L. 무스카리움의 분리균은, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 이의 기능성 변이체와 함께 사용되며, 특히 중단된 우기, 건조시에 생존가능하며, 들판의 진딧물, 가루이, 깍지벌레, 바로아 응애, 및 총체벌레(이에 한정되지 않음)와 같은 식물병원성 곤충을 콜로니화, 무력화 및 죽일 수 있는 특히 효과적인 생물학적 방제제이다.

레카니실리움 론지스포룸은 진딧물에 특히 병원성을 갖는 곤충병원성 진균이다. 레카니실리움 론지스포룸 균주 KT4L1는, 뉴질랜드 오클랜드 프랭클린의 보리싹 진딧벌 유지식물(Barley grass Banker plant)의 진딧물로부터 분리되었다. 이 L. 론지스포룸 분리균은 특허절차를 위한 부다페스트 조약에 따라서, 2006년 3월 3일자로 오스트레일리아 국립표준연구소에 기탁되었다. 이 분리균은 수탁번호 NM06/00009를 부여받았다.

분리균 KT4L1는 하기의 식별 특성을 갖는다: 100% 분생자 6.0×2.1 ㎛, 분생자 엽상체는 황백색 내지 황색으로 자라며, 대략 계속 덩어리(lumsy)로 설명될 수 있다. 균사체 엽상체는 밝은 적갈색으로 아가 상에 확산된다.

NMIA 수탁번호 NM06/00009 및 다른 적합한 L. 론지스포룸의 분리균은, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 이의 기능성 변이체와 함께 사용되며, 중단된 우기, 건조시에 생존가능하며, 진딧물과 같은 들판의 식물병원성 곤충을 콜로니화, 무력화 및 죽일 수 있는 특히 효과적인 생물학적 방제제이다.

패실로마이세스 푸모소로세우스는 감염되어 죽은 곤충 및 일부 토양에서 발견되는 곤충병원성 진균이다. P. 푸모소로세우스(P. fumosoroseus )는 통상적으로 가루이, 총체벌레, 진딧물, 및 나비유충에 감염한다.

패실로마이세스 푸모소로세우스의 K4P1 균주를 뉴질랜드 런시먼의 양배추에 존재하는 배추좀나방 유충으로부터 분리하였다. 이 P. 푸모소로세우스 분리균은 특허 절차의 목적을 위한 부다페스트 조약에 따라서, 2006년 3월 3일자로 오스트레일리아 국립표준연구소에 기탁되었다. 분리균은 수탁번호 NM06/00008를 부여받았다.

NMIA 수탁번호 NM06/00008 및 P. 푸모소로세우스의 다른 적합한 균주는, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 기능성 변이체와 함께 사용될 수 있고, 특히 중단된 우기, 건조시에 생존 가능하며, 식물병원성 곤충, 예컨대 가루이, 바로아 응애, 및 나비 유충(Lepidoptera caterpillar)(이에 제한되지 않음)을 콜로니화, 무력화, 및 죽일 수 있는 특히 효과적인 생물학적 방제제이다.

상기에서 논의한 바와 같이, 많은 식물병원성 곤충이 다수의 살충제에 대해 내성을 키워왔다; 이들의 경우 또는 다른 경우에, 선택적으로 상기에서 기재한 것들과 같은 하나 이상의 진균 분리균을 포함하거나 또는 함께 주입되는 본 발명의 조성물은, 곤충 방제에 효과적인 대안을 제공한다. 식물 질병의 방제에 대한 강력한 활성, 및 이 제제들에 의해 유도되는 식물 병원성이 관찰되지 않는다는 점은, 본 발명의 지질 및 존재하는 경우 이들 종의 진균 분리균이 생물학적 방제제 용도로서 바람직한 특성을 갖는다는 것을 보여준다.

본 발명은 하나 이상의 곤충병원성 진균 및 하나 이상의 담체와 함께, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획, 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.

조성물은 곤충병원성 진균의 다수의 균주들을 포함할 수 있으며, 특정 구현예에서 다수의 균주들은 다수의 식물병원성 종, 또는 단일 식물병원체의 다수의 상이한 발달 단계, 또는 이의 조합을 목표로 하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 식물병원성 곤충의 번데기 형태는 하나의 진균 균주를 목적으로 할 수 있는 반면, 식물병원성 곤충의 성충 형태는 다른 진균 균주를 목적으로 하며, 여기에서 양쪽 균주는 본 발명의 조성물에 포함된다. 다른 구현예에서, 3종 이하의 균주가 바람직하며, 종종 단일 균주도 바람직할 것이다.

적합하게는, 조성물은 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V1 (NMIA 수탁번호 NM05/44593), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V2 (NMIA 수탁번호 NM05/44594), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V4 (NMIA 수탁번호 NM06/00007), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B1 (NMIA 수탁번호 NM05/44595), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B2 (NMIA 수탁번호 NM06/00010), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론지스포룸 균주 KT4L1 (NMIA 수탁번호 NM06/00009), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 및 패실로마이세스 푸모소 로세우스 균주 K4P1 (NMIA 수탁번호 NM06/00008), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주로 이루어지는 군에서 선택되는 진균을 포함한다.

본 발명의 하나 이상의 지질 또는 이의 기능성 변이체, 및 레카니실리움 무스카리움 균주 K4V1 (NM05/44593) 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주를 포함하는 조성물, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 이의 기능성 변이체 및 레카니실리움 무스카리움 균주 K4V2 (NM05/44594) 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주를 포함하는 조성물, 및 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 이의 기능성 변이체 및 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V1 (NM05/44593) 모두 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주를 포함하는 조성물, 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 이의 기능성 변이체 및 레카니실리움 무스카리움 균주 K4V2 (NM05/44594) 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주를 포함하는 조성물이 특히 고려된다.

곤충병원성 진균을 포함하는 조성물의 예들은 당업계에 잘 알려졌으며, 예를 들어, Mycotech Corporation 사에 대한 WO95/10597 (PCT/US94/11542로서 공개됨), 농무부 장관에 의해 대표되는 미국에 대한 WO2003/043417(PCT/US2002/037218로서 공개), McCabe 등에 대한 미국 특허 제 4,530,834호, 및 Wright 등에 대한 미국 특허출원 제 10/657,982호 (US 2004/0047841로서 공개됨)에 기재된 것들을 포함하며, 상기의 각각은 본 명세서에서 전체로서 참조된다.

식물 또는 이의 주변에 대한 적용에 적합하도록, 상기 하나 이상의 담체는 농업적으로 허용가능한 담체이며, 더욱 바람직하게는 충진 자극제, 케이킹 방지제, 습윤제, 유화제, 항산화제로 이루어지는 군에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 상기 조성물은 각 충진 자극제, 케이킹 방지제, 습윤제, 유화제, 및 항산화제 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 상기 충진 자극제는 탄수화물원, 예컨대 이당류(예를 들어, 설탕, 과당, 포도당, 또는 전분 포함)이고, 상기 케이킹 방지제는 탈크, 실리콘 디이옥사이드, 칼슘 실리케이트, 또는 케일런 점토에서 선택되며, 상기 습윤제는 탈지분유 분말이고, 상기 유화제는 레시틴과 같이 콩으로 만든 유화제, 또는 모노디글리세리드와 같은 식물계 유화제이고, 상기 항산화제는 소듐 글루타메이트 또는 시트르산이다. 그러나, 당업계에 잘 알려진 다른 예들도 조성물의 살충 또는 곤충병원성 효력 및 필요한 진균 활력에 도움을 줄 수 있는 능력이 유지되는 경우 치환될 수 있다.

바람직하게는, 상기 조성물은 생물학적 방제 조성물이다. 생물학적 방제제로서 유효하도록 요구되는, 조성물에 존재하는 본 발명의 살충성 지질 또는 지질 분획의 농도는, 최종 용도, 식물의 생리적 조건; 병원체 감염의 종류(곤충 종 포함), 농도 및 정도; 온도, 계절, 습도, 생장 계절의 시기(stage) 및 식물의 연령; 적용되는 종래의 살충제 또는 다른 처리(살진균제 포함)의 수 및 종류; 및 식물 처리(예컨대, 잎 따기(deleafing) 및 가지치기(pruning))에 따라 가변적이고, 모두 조성물의 제제화에 고려될 수 있다.

살충성 조성물

지질 조성물 및 사용 방법

본 발명자들은 본 명세서에 기재된 지질 조성물에서 들판의 작물, 풀, 과실 및 채소, 잔디, 나무, 및/또는 관상용 식물에 대한 국소적 및/또는 전신적 적용을 위한, BCA 조성물로서의 특별한 유용성을 발견할 것이라는 점을 고려하였다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 지질은 곤충을 죽이거나, 또는 곤충 개체군을 방제하기 위한 스프레이, 더스트, 분말, 또는 다른 수성의 분무 또는 에어로졸로서 제제화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 지질 조성물은 예방적으로 사용되거나, 또는 대안적으로 일단 목표 곤충이 처리될 특정 환경에서 식별된 경우 환경에 투여될 수도 있다. 지질 조성물은 개별적인 지질을 포함하거나, 또는 본 명세서에서 기재된 지질들의 다양한 조합을 포함할 수 있다.

응용 방법과는 무관하게, 활성 지질 성분(들)의 양은 살충-유효량으로 적용되며, 이는 상기 인자, 예컨대 방제될 특이적 목표 곤충, 특이적 환경, 위치, 식물, 작물 또는 처리될 농업적 지점, 환경 조건 및 방법, 비율, 농도, 안정성, 및 살충-활성 지질 조성물 적용량에 따라서 달라질 것이다. 조성물은 또한 기후 조건, 환경적 고려사항, 및/또는 적용 빈도 및/또는 병충해의 심각성에 따라서 달라질 수 있다.

기재된 조성물은 하나 이상의 지질, 이의 기능성 변이체 또는 기능성 절편 및, 이와 함께 선택적으로 진균 세포 및/또한 포자 현탁액을, 원하는 농업적으로-허용가능한 담체와 함께 제제화함으로서 만들어질 수 있다. 조성물은 투여에 앞서 적당한 수단, 예컨대 동결, 동결-건조, 탈수로서, 수성 담체, 배지 또는 적합한 희석제, 예컨대 식염수 또는 다른 완충제 중에서 제제화될 수 있다. 제제화된 조성물은 더스트 또는 과립 물질, 또는 (식물 또는 미네랄) 오일 중 현탁액, 또는 물 또는 오일/물 에멀전 형태로, 또는 습윤 분말로서, 또는 다른 농업적 응용에 적합한 담체 물질과 함께일 수 있다. 적합한 농업적 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. "농업적으로-허용가능한 담체(agriculturally-acceptable carrier)"라는 말은, 살충제 제제화 기술에서 통상 사용되는 모든 어쥬번트, 불활성 성분, 분산제, 계면활성제, 점착부여제(tackifier), 결합제 등에 미친다; 이들은 살충제 조성물 분야의 통상의 기술자에 잘 알려져 있다. 조성물은 하나 이상의 고체 또는 액체 어쥬번트와 혼합되며, 다양한 수단, 예를 들어 균질화 혼합, 블렌딩 및/또는 살충 조성물을 적합한 어쥬번트와 함께 종래의 제제화 기술을 사용하여 분쇄(grinding)하여 제조된다.

조성물은 하나 이상의 진균 균주를 포함할 수 있고, 하나 이상의 박테리아 종 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 예시적인 박테리아 종은 B. 튜린지엔시스(B. thuringiensis ), B. 메가테리움 (B. megaterium ), B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 세레우스 (B. cereus ), E. coli (E. 콜리 ), Salmonella spp.( 살로넬라 종), Agrobacterium spp.(아그로박테리움 종), 또는 Pseudomonas spp.(슈도모나스 종)과 같은 것들을 포함한다.

오일 유동성 현탁액( oil flowable suspension )

하나의 예시적 구현예에서, 생물농약(bioinsecticide) 조성물은 본 발명의 하나 이상의 지질, 이의 기능성 변이체 또는 기능성 절편 및, 이와 함께 선택적으로 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 신규 단백질을 발현하는 하나 이상의 진균 세포를 포함하는 하나 이상의 진균 세포의 오일 유동성 현탁액을 포함한다.

수분산성 과립

또 다른 중요한 예시적 구현예에서, 생물농약 조성물은 수 현탁성 과립을 포함한다. 이 과립은 본 발명의 하나 이상의 지질, 이의 기능성 변이체 또는 기능성 절편 및, 이와 함께 선택적으로 본 발명의 지질 또는 지질 분획을 생산하는 하나 이상의 진균 세포를 포함하는 하나 이상의 진균 세포를 함께 포함한다.

분말, 더스트 , 및 포자 조성물

세번째 중요한 예시적 구현예에서, 생물농약 조성물은 습윤 분말, 더스트, 포자 제제, 세포 펠렛, 또는 콜로이드성 농축물을 포함한다. 이 분말은 본 발명의 하나 이상의 지질, 이의 기능성 변이체 또는 기능성 절편, 및 이와 함께 선택적으로 본 명세서에서 기재한 지질 또는 지질 분획을 생산하는 하나 이상의 진균 세포를 포함하는 하나 이상의 진균 세포를 포함한다. 살충성 조성물의 상기 건조 형태는, 습윤 즉시 용해되도록 제제화될 수 있거나, 또는 대안적으로 방출조절성(controlled-release), 서방성(sustained-release), 또는 다른 시간-의존적 방식으로 용해된다. 상기 조성물은 목표 곤충에 적용되거나 또는 이에 의해 섭취될 수 있으며, 이는 엄밀히 곤충의 수, 또는 일정 환경에 대한 상기 곤충의 전파(spread)를 조절하는데 사용될 수 있다.

수성 현탁액 및 진균 세포 여과액 또는 용해액

4번째 중요한 예시적 구현예에서, 생물농약 조성물은 본 발명의 하나 이상의 지질, 이의 기능성 변이체 또는 기능성 절편 및, 이와 함께 선택적으로 본 명세서에 기재된 본 발명의 지질 또는 지질 분획을 생산할 수 있는 하나 이상의 진균 세포를 포함하는 하나 이상의 진균 세포의 수성 현탁액을 포함한다. 상기 수성 현탁액은 적용에 앞서 희석된 농축 스톡 용액으로, 또는 선택적으로 적용 준비된 희석 용액(diluted solution ready-to-apply)으로 제공될 수 있다.

살충성 조성물이 관심 대상의 지질을 생성할 수 있는 손상되지 않은 세포를 포함하는 경우, 상기 세포는 다양한 방식으로 제제화될 수 있다. 그들은 다양한 불활성 물질, 에컨대 무기 미네랄(필로실리케이트, 카보네이트, 설페이트, 포스페이트 등) 또는 식물성 물질(분말 옥수수대, 왕겨, 호두 껍질 등)과 혼합됨으로서, 습윤 분말, 과립 또는 더스트로서 사용가능하다. 조성물은 전착제-점착제 어쥬번트, 안정화제, 다른 살충성 첨가제, 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 액상 제제는 수계 또는 비수계일 수 있고, 포말(foam), 현탁액, 유화성 농축액(emulsifiable concentrates) 등으로 사용될 수 있다. 성분들은 유동제(rheological agents), 계면활성제, 유화제, 분산제, 또는 고분자를 포함할 수 있다.

대안적으로, 신규한 살충성 지질은 천연적으로 또는 시험관내 재조합 발현 시스템에 의해 제조될 수 있으며, 뒤이어 현장 적용을 위해 분리될 수 있다. 상기 지질 또는 지질 분획은, 조 세포 용해액, 현탁액, 콜로이드 등 중 어느 하나에 포함될 수 있거나, 또는 대안적으로 활성 생물살생 제제로 제제화되기 전에, 정제, 제련, 완충, 및/또는 추가 가공될 수 있다. 마찬가지로, 특정 환경 하에서, 지질을 생성하는 배양액으로부터 지질 또는 포자를 분리하고, 활성 생물농약 조성물로서 상기 지질 또는 포자의 용액, 현탁액, 또는 콜로이드성 제제를 적용하는 것이 바람직할 수 있다.

다중 기능성 제제

예를 들어 다수의 곤충 종에 대한 방제가 필요한 경우의) 특정 구현예에서, 하나 이상의 화학적 살충제(예컨대 화학적 해충박멸제, 살선충제, 살진균제, 살바이러스제, 살미생물제, 살아메바제, 살충제 등), 및/또는 이들, 또는 다른 살충 활성 또는 살충 특이성을 갖는 하나 이상의 지질 또는 지질 분획, 예컨대 본 명세서에서 밝힌 살충성 지질 또는 지질 분획을 추가로 포함한다. 살충성 지질 또는 지질 분획은 또한 다른 처리, 예컨대 비료, 살초제(weed killer), 동결방지제(cryoprotectant), 계면활성제, 세제(detergent), 살충 비누, 휴면 오일(dormant oil), 고분자, 및/또는 제제의 단독 적용에 이후 목표 부위에 대해 장기 투여가 가능하게 되는 완효성(time-release) 또는 생분해성 담체 제제와 함께 사용될 수 있다. 마찬가지로, 조성물은 식용의 "미끼"로 제조되거나, 또는 곤충 "덫"이 되어, 살충성 제제의 목표 곤충에 의해 섭취될 수 있다.

본 발명의 살충성 조성물은 또한 환경적 부위에 대해 단독으로, 또는 하나 이상의 추가적 살충제, 해충박멸제, 화학물질, 비료, 또는 다른 화합물과 함께, 연속으로 또는 동시에 적용하여 사용할 수 있다.

진균을 포함하는 조성물

생물학적 방제제 용도를 위하여, 본 발명의 곤충병원성 진균은 조성물 내에 존재하는 경우 생식적으로 살아있는 형태이어야 한다. 본 명세서에서 사용될 때 "생식적으로 살아있는(reproductively viable)"이란 말은, 진균의 균사체 및 포자 형태를 포함한다. 예를 들어, 대부분의 목적에서, 진균 균주는 바람직하게는 포자 (분생자 또는 출아포자)의 형태로 조성물에 포함된다. 포자는 본 명세서에서 설명한 모든 진균 균주로부터 얻을 수 있으며, 당업계의 공지된 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 지질, 이의 기능성 변이체 또는 기능성 절편, 및 이와 함께 선택적으로 본 명세서에서 설명한 진균 균주로부터 얻은 하나 이상의 포자를 포함하는 하나 이상의 진균 세포를 포함하는 조성물은, 본 발명의 추가적 측면을 형성한다. 조성물 중의 진균 포자의 농도는, 조성물이 투입되는 용도에 따라서 달라질 것이다. 예시적인 농도 범위는 약 1×10⁶개 내지 1×10¹²개 포자/ml, 바람직하게는 약 1×10⁷개 내지 2×10¹⁰개, 더욱 바람직하게는 1×10⁷개 내지 1×10⁸개 포자/ml이다.

이론적으로, 하나의 감염 단위는 숙주에 감염하기에 충분하여야 하나, 실제 상황에서는 감염 단위의 최소수가 감염을 개시하는데 필요한 것이기도 하다. 화학적 해충박멸제에서 자주 사용되는 치사량(lethal dose, LD)이란 개념은, 곤충병원성 활성의 특정 요소가 곤충병원성 진균에 의한 식물 또는 이의 주변의 콜로니화(colonization)에 의존하는 미생물 해충박멸제에는 적당하지 않다. 감염량(infective dose, ID) 또는 감염 농도(IC)의 개념은, 좀더 명확하거나 응용가능하다. ID 또는 IC라 함은, 감염이 시작되는데 필요한 감염 단위의 실제 수, 또는 병원체에 노출되어 죽게 만드는 감염 단위의 수를 말한다. 따라서, 병원체에 대해 현장 또는 온실에 적용되는 감염 단위의 수는, 방제 정도에 영향을 미칠 것이다. 원하는 농도의 항-식물병원성 진균을, 적절한 위치 및 적당한 시간에 적용하여 해충에 대한 양호한 방제를 이룰 수 있는 것이 중요하다: 이것은 감염 임계치(infection threshold)로 알려져 있다.

적용을 위해 제제화된 조성물 중의 진균 포자의 농도가, 예를 들어 저장을 위해 제제화된 조성물에서보다 더 낮을 수 있다는 것은 명백하다. 본 출원인은 본 명세서에서 설명한 곤충병원성 진균에 대해서는, 약 1L/헥타르의 비율로 적용되는 경우 감염 임계치가 스프레이 용액으로 약 10⁷개 포자/ml에서 나타난다고 결정하였다. 따라서, 하나의 실시예에서, 적용을 위해 제제화된 조성물은 바람직하게는 약 10⁷ 포자/ml 이상의 농도를 갖는다. 다른 실시예에서, 저장용으로 제제화된 조성물(예를 들어, 적용에 적합한 조성물로 제제화 가능한 습윤가능 분말과 같은 조성물)은, 바람직하게는 약 10¹⁰개 포자/g의 농도를 갖는다. 저장을 위해 제제화되며, 뒤이어 적용에 적합한 조성물로 제제화된 조성물의 포자 농도는, 상기 적용을 위한 조성물이 충분히 농축되어, 감염 임계치에 도달하도록 적용할 수 있도록 하는데 적합해야 한다는 것은 명백하다.

특정 구현예에서, 조성물은 약 2주 초과, 바람직하게는 약 1달, 약 2달, 약 3달, 약 4달, 약 5달 초과, 더욱 바람직하게는 6달 초과의 기간 동안 (예를 들어, 하나 이상의 지질의) 살충 효력을 도와줄 수 있는 안정된 조성물이다. 본 명세서에서 설명한 하나 이상의 곤충병원체, 예컨대 곤충병원성 진균을 사용하는 구현예에서 사용하기에 적합하도록, 조성물은 바람직하게는 곤충 병원체의 생식적으로 살아있는 것 또는 곤충병원성 효력을 약 6개월 넘는 기간 동안 유지하도록 도와줄 수 있다.

본 발명의 살충성 지질은 종래의 고체 기질 및 당업계에 잘 알려진 액체 발효 기술을 사용하여, 생물학적 방제제 용도로서 충분한 양으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 지질 및 지질 분획은 이들의 생장 기술을 사용하여 충분한 양으로 생산될 수 있으며, 예시적인 기술들이 본 명세서의 실시예에 제시되어 있다. 생장은 일반적으로 호기 조건 하에서 생물의 생장에 만족스러운 어떠한 온도에서도 유효하다. 예를 들어, B. 바시아나에 대해서는, 10 내지 32℃, 바람직하게는 25 내지 30℃의 온도 범위, 및 가장 바람직하게는 23℃가 바람직하다. 생장 배지의 pH는 약산성 내지 중성으로, 즉 약 5.0 내지 7.0이고, 가장 바람직하게는 5.5이다. 배양 시간은 분리균이 23℃에서 배양될 때 약 21일이며, 정지기(stationary growth phase)에 도달하기에 충분하고, 정상 광주기에서 이루어질 것이다.

선택된 균주로부터의 포자는 영양막 배양(nutrient film), 액침 배양(submerged culture), 및 벼 기질 생장 기술(rice substrate growing technique)을 사용하여, 현장 적용(field application)을 위해 대량 생산될 수 있다. 포자는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 종래의 여과 또는 침전 방법(예를 들어, 원심분리)에 의하여 수확되거나, 또는 사이클론 시스템을 사용하여 건조 수확된다. 포자는 즉시 사용되거나 저장되며, 생식적으로 살아있는 것이 유지되는 한 0℃ 내지 6℃, 바람직하게는 2℃로 냉각된다. 그러나 본 발명의 조성물에 포함되지 않을 경우, 일반적으로 수확한 지 2주 이내에 사용하는 것이 바람직하다.

유사하게, 필요한 경우, B. 바시아나 K4B3에 의해 생성된 하나 이상의 지질이, 당업계의 공지의 방법, 예를 들어 분획화(fractionation), 여과 또는 침전 방법(예를 들어, 원심분리)를 사용하여, (예를 들어, 세포내 지질에 대한) 하나 이상의 세포-용해 단계와 함께, 또는 그렇지 않든 간에(예를 들어, 생장 배지로 분비되는 지질에 대해서), B. 바시아나 K4B3로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 담체, 바람직하게는 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서 담체, 예컨대 농업적으로 허용가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 본 발명에서 유용한 담체는, 농업용 조성물을 제조하기 위해 통상적으로 사용되는 어떠한 물질도 포함한다.

하나의 구현예에서, 농업적으로 허용가능한 담체는, 충진제, 용매, 부형제, 계면활성제, 현탁제, 전착제/점착제(speaders/stickers)(접착제), 항소포제, 분산제, 습윤제, 이동 감소제(drift reducing agents), 조제(auxilary), 어쥬번트 또는 이들의 혼합물을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물은 예를 들어, 농축액, 용액, 스프레이, 에어로졸, 침지조(immersion bath), 담지(dip), 에멀전, 습윤 분말, 용해성 분말, 현탁 농축액, 더스트, 과립, 수분산성 과립, 미세캡슐, 페이스트, 겔 및 확립된 공정에 의한 다른 제제 형태로서, 제제화될 수 있다.

이들 공정은 활성 성분을 농업적으로 허용가능한 담체 기질, 예컨대 충진제, 용매, 부형제, 계면활성제, 현탁제, 전착제/점착제(접착제), 항소포제, 분산제, 습윤제, 이동 감소제, 조제 및 어쥬번트와 혼합 및/또는 분쇄(milling)하는 단계를 포함한다.

하나의 구현예에서, 고체 담체는 미네랄토, 예컨대 실릭산, 실리카 겔, 실리케이트, 탈크, 카올린, 아타펄거스 점토(attapulgus clay), 석회석(limestone), 석회(lime), 백악(chalk), 볼(bole), 황토(loess), 점토, 백운암(dolomite), 규조토(diatomaceus earth), 알루미나 칼슘 설페이트, 마그네슘 설페이트, 산화 마그네슘, 토양 소성제(ground plastics), 비료 예컨대 암모늄 설페이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 니트레이트 및 요소, 및 식물 산물 예컨대 곡물 가루(grain meals), 수피 가루(bark meal), 우드밀(wood meal), 및 견과류 껍질 가루(nutshell meal), 셀룰로스 분말 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 과립용 고체 담체로서는 하기의 것들이 적당하다: 분쇄 또는 분할된(fractionated) 천연 암석, 예컨대 방해석(calcite), 대리석(marble), 경석(pumice), 해포석(sepiolite) 및 백운암; 무기 또는 유기 밀의 합성 과립; 유기물질, 예컨대 톱밥, 코코넛 껍질, 옥수수 속대, 옥수수 껍질 또는 담배 줄기의 과립; 규조토(kieselguhr), 트리칼슘 포스페이트, 분말 코크, 또는 점착성 카본 블랙; 수용성 고분자, 수지, 왁스; 또는 고체 비료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 고체 조성물은, 필요한 경우 하나 이상의 양립가능한 습윤제, 분산제, 유화제 또는 착색제를 포함하며, 이는 또한 고체인 경우 희석제로도 작용할 수 있다.

하나의 구현예에서, 담체는 또한 액체, 예컨대 물, 알콜, 특히 부탄올 또는 글리콜, 뿐만 아니라 이들의 에테르 또는 에스테르, 특히 메틸글리콜 아세테이트; 케톤, 특히 아세톤, 시클로헥사논, 메틸에틸 케톤, 메틸이소부틸케톤, 또는 이소포론; 석유 유분(petroleum fractions), 예컨대 파라핀 또는 방향족 탄화수소, 특히 자일렌 또는 알킬 나프탈렌; 미네랄성 또는 식물성 오일; 지방족 염화 탄화수소, 특히 트리클로로에탄 또는 메틸렌 클로리드; 방향족 염화 탄화수소, 특히 클로로벤젠; 수-용해성 또는 강한 극성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭시드, 또는 N-메틸피롤리돈; 액화 가스; 또는 기타 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

하나의 구현예에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 및/또는 양성(amphoteric) 계면활성제를 포함하며, 이들은 분사(spraying)되는 동안 용액 중에 남아 응집할 수 있는 능력을 촉진시킨다.

전착제/점착제(Spreader/sticker)는 본 발명의 조성물이 식물 표면에 부착하는 능력을 촉진시킨다. 계면활성제, 전착제/점착제의 예로서는, 트윈 및 트리톤(Rhom and Hass Company 사), Deep Fried^TM, Fortune^®, Pulse, C. Daxoil^®, Codacide oil^®, D-C. Tate^®, Supamet Oil, Bond^®, Penetrant, Glowelt^®, 및 Freeway, Citowett^®, Fortune Plus^TM, Fortune Plus Lite, Fruimec, Fruimec lite, 방향족 설폰산, 예컨대 리그닌설폰산, 페놀설폰산, 나프탈렌 설폰산, 및 지방산의 의 알칼리 금속, 알칼리토금속 및 암모늄염, 알킬 및 알킬아릴 설포네이트, 및 알킬, 라우릴 에테르 및 지방산 알콜 설페이트, 및 설페이트화 헥산데칸올, 헵타데칸올, 및 옥타데칸올의 염, 지방산 알콜 글리콜 에테르의 염, 설포네이트화 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데히드의 축합 산물, 나프탈렌 및 나프탈렌설폰산과 페놀 및 포름알데히드의 축합 산물, 폴리옥시에틸렌 올틸페놀 에테르, 에톡시화 이소옥틸페놀, 에톡시화 옥틸페놀 및 에톡시화 노닐페놀, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴 폴리에테르 알콜, 이소트리데실 알콜, 지방산 알콜 에틸렌 옥시드 축합물, 에톡시화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 에톡시화 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알콜 폴리글리콜 에테르 아세탈, 소르비톨 에스테르, 리그닌-아황산 펄프 폐액 및 메틸 셀룰로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 농업적 계면활성제, 예컨대 트윈은 바람직하게 공지의 프로토콜에 의해 조성물에 포함된다.

습윤제는 조성물에서 물의 표면 장력을 감소시켜, 일정량의 조성물이 적용될 수 있는 표면적을 넓힌다. 습윤제의 예로서는, 폴리아크릴산의 염, 리그노설폰산의 염, 페놀설폰산 또는 나프탈렌설폰산의 염, 에틸렌 옥시드와 지방산 알콜 또는 지방산 또는 지방산 에스테르 또는 지방산 아민의 다중 축합물, 치환된 페놀 (특히 알킬페놀 또는 아릴페놀), 설포숙신산 에스테르의 염, 타우린 유도체(특히 알킬타우레이트), 알콜 또는 에틸렌 옥시드와 페놀의 축합물의 인산염, 지방산과 폴리올의 에르테르, 또는 상기 화합물의 설페이트, 설포네이트 또는 포스페이트 기능성 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물의 바람직한 적용 방법은, 핸드건(handgun) 또는 시판용 에어블라스트(airblast)에 의해, 희석 또는 농축 용액을 스프레이하는 것이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 농업용 제제, 예컨대 해충박멸제, 살충제, 항진드기제(acaracide), 살진균제 또는 살박테리아제 (상기 살진균제 또는 살박테리아제는 조성물에 존재하는 어떠한 진균 또는 박테리아에도 해롭거나 독성이 있지 않은 경우임), 제초제(herbicides), 항생제, 항미생물제(antimicrobial), 살선충제, 살설치류제(rodenticide), 곤충병원체, 페로몬, 유인제(attractant), 식물 생장 조절자, 식물 호르몬, 곤충 생장 조절자, 화학불임제(chemosterilant), 미생물성 해충 방제제, 방충제(repellent), 바이러스, 섭식자극제(phagostimulent), 식물 영양분, 식물 비료 및 생물학적 방제제와 함께 사용될 수 있다. 다른 농업적 제제와 함께 사용될 때, 두 개의 제제는 별도로, 동시에 또는 연달아서 투여할 수 있다. 이들 농업적 제제의 구체예들은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 많은 것들은 이미 시판 중이다.

식물 영양소의 예로서는, 질소, 마그네슘, 칼슘, 붕소, 칼륨, 구리, 철, 인, 망간, 몰리브덴, 코발트, 붕소, 구리, 규소, 셀레늄, 니켈, 알루미늄, 크롬 및 아연을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

항생제의 예로서는, 옥시테트라실린(oxytetracyline) 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

항진균제의 예로서는, 하기 부류의 항진균제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다: 카르복사미드, 벤즈이미다졸, 트리아졸, 히드록시피리딘, 디카르바미드, 페닐아미드, 티아디아졸, 카르바메이트, 시아노-옥심, 신남산 유도체, 모르폴린, 이미다졸, 베타-메톡시 아크릴레이트, 및 피리딘/피리미딘.

항진균제의 추가적 예로서는, 천연 항진균제, 유기 항진균제, 황계 항진균제, 구리/칼슘 항진균제 및 식물 숙주 방어의 유도인자(elicitor)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

천연 살진균제의 예로서는 전유(whole milk), 유청(whey), 지방산 또는 에스테르화 지방산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

유기 항진균제의 예로서는, 생물학적 방제제, 천연 산물, 유도인자(이들 중 일부는 천연 산물로서 분류될 수도 있음), 및 황 및 구리 살진균제 (제한적 용도로 한정)와 같은 유기농 인증 표준 물질을 통과한 어떠한 살진균제도 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

황 항진균제의 예는, Kumulus^TM DF (BASF 사, 독일)이다.

구리 항진균제의 예는, Kocide^® 2000 DF (Griffin Corporation 사, 미국)이다.

유도인자의 예로서는, 키토산, Bion^TM BABA (DL-3-아미노-n-부탄산, β-아미노부티르산) 및 Milsana^TM (Western Farm Service, Inc.사, USA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 무기 살진균제를 사용할 수 있다. 무기 살진균제의 예로서는, Bravo^TM (조롱박에서, PM 방제용); Supershield^TM(Yates 사, 뉴질랜드) (장미에서, 보트리티스균 ( Botrytis ) 및 PM 방제용); Topas^® 200EW (포도 및 조롱박에서, PM 방제용); Flint^TM(사과 및 조롱박에서, PM 방제용); Amistar^® WG (곡물에서, 녹병(rust) 및 PM 방제용); 및 Captan^TM, Dithane^TM, Euparen^TM, Rovral^TM, Scala^TM, Shirlan^TM, Switch^TM 및 Teldor^TM (포도에서, 보트리티스균 방제용)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

해충박멸제(pesticide)의 예로서는, 아족시스트로빈(azoxystrobin), 비테르타놀(bitertanol), 카르복신(carboxin), Cu₂O, 시목사닐(cymoxanil), 시프로코나졸(cyproconazole), 시프로디닐(cyprodinil), 디클로플루아미드(dichlofluamid), 디페노코나졸(difenoconazole), 디니코나졸(diniconazole), 에폭시코나졸(epoxiconazole), 펜피클로닐(fenpiclonil), 플루디옥소닐(fludioxonil), 플루퀴코나졸(fluquiconazole), 플루실라졸(flusilazole), 플루트리아폴(flutriafol), 푸랄락실(furalaxyl), 구아자틴(guazatin), 헥사코나졸(hexaconazole), 하이멕사졸(hymexazol), 이마잘릴(imazalil), 이미벤코나졸(imibenconazole), 이프코나졸(ipconazole), 크레족심-메틸(kresoxim-methyl), 만코제브(mancozeb), 메탈락실(metalaxyl), R-메탈락실(R-metalaxyl), 메트코나졸(metconazole), 옥사디실(oxadixyl), 페푸라조에이트(pefurazoate), 펜코나졸(penconazole), 펜시쿠론(pencycuron), 프로클로라즈(prochloraz), 프로피코나졸(propiconazole), 피로퀼론(pyroquilone), SSF-109, 스피록사민(spiroxamin), 테부코나졸(tebuconazole), 티아벤다졸(tiabendazole), 톨리플루아미드(tolifluamide), 트리아족시드(triazoxide), 트리아디메폰(triadimefon), 트리아디메놀(triadimenol), 트리플루미졸(triflumizole), 트리티코나졸(triticonazole) 및 유니코나졸(uniconazole)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 설명한 진균 균주 이외의 생물학적 방제제의 예는, 울로클라 디움 오데만시(Ulocladium oudemansii)를 포함하는 BotryZen^TM 생물학적 방제제이다.

조성물은 또한 넓은 범위의 첨가제, 예컨대 활성 성분을 강화하는데 사용되며, 포자 활력, 발아 및 생존성을 개선시키는 소위 "스트레스" 부가제(stressing additive)로 불리는 안정화제 및 침투제(penetrant), 예컨대 염화 칼륨, 글리세롤, 염화 나트륨 및 포도당을 포함할 수 있다. 첨가제는 또한 장기 저장에서 미생물 활력을 유지하는데 도움을 주는 조성물, 예컨대 비정제 옥수수유, 및 외측에 오일 및 왁스, 내부에 물, 소듐 알지네이트 및 분생자를 포함하는 혼합물의 역 에멀전(invert emersion)을 포함할 수 있다.

당업계의 통상의 기술자들에게는 자명한 바와 같이, 사용된 어떠한 부가제도 생물학적 방제제의 효력을 방해하지 않는 양으로 존재한다는 것이 중요하다.

담체, 방부제, 계면활성제 및 습윤제, 전착제, 및 영양분을 포함하는 적합한 조성물의 예가, US 5780023에서 제공되며, 이는 본 명세서에서 전체로서 참조된다.

출원인은 또한 통상 사용되는 많은 살진균제가 본 명세서에서 기재한 곤충병원성 진균(존재하는 경우)에 역작용을 일으키지 않는다고 결정하였다. 따라서 상기 진균을 포함하는 본 발명의 조성물은 또한 상기 살진균제를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 조성물을 별도로 사용할 수 있으나, 방제 프로그램 상에서는 상기 살충제들과 함께 사용할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획 또는 하나 이상의 이의 기능성 변이체, 및 본 명세서에서 기재한 하나 이상의 곤충병원성 진균을 포함하는 조성물의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 곤충병원성 진균의 생식적으로 살아있는 형태를 제공하는 단계, 및 상기 생식적으로 살아있는 형태의 상기 곤충병원성 진균을 본 발명의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획 또는 이의 기능성 변이체 및 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 담체와 결합하는 단계를 포함한다.

조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 하나의 제제는 식물 또는 이의 주변에 살분(dust)될 수 있는 본 발명의 조성물의 분말 형태를 포함한다. 추가의 형태에서, 조성물은 물과 같은 희석제와 혼합되어 스프레이, 포말, 겔을 형성하거나 또는 침지되어, 공지의 프로토콜을 사용하여 적절히 적용된다. 현재 바람직한 구현예에서, 상기에서 설명한 바와 같이 제제화된 조성물은, 가압 스프레이를 사용하여, 1000L/ha 이하의 물에서, 약 1gm/L 또는 약 1 내지 3kg/ha로 물과 혼합된다. 바람직하게는, Deep Fried^TM 또는 Fortune Plus^TM이, 약 1ml/L로 UV 및 건조 보호제로서 조성물에 첨가된다. L. 무스카리움, L. 론지스포룸, 또는 P. 푸모소로세우스를 포함하는 조성물을 비슷한 방식으로 적용할 수 있다.

주사, 문지르기(rubbing) 또는 솔질(brushing)과 같은 다른 적용 방법을 위한 조성물도 또한 사용가능하며, 사실 공지된 선행기술이다. 토양, 물, 또는 종자 코팅과 같은 식물 주변 또는 환경에 대한 조성물의 간접적인 적용도 잠재적으로 가능하다.

상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명의 조성물(본 명세서에 기재된 곤충병원성 진균을 포함)의 농도는 효과적인 생물학적 방제제가 되도록 적용되며, 이는 식물의 최종 용도, 하기의 생리학적 조건에 따라서 달라질 수 있다; 병원체 감염의 유형(곤충 종을 포함), 농도 및 정도; 온도, 계절, 습도, 생장 계절의 시기(stage), 및 식물의 연령; 적용되는 종래의 살충제 또는 다른 처리(살진균제 포함)의 수 및 유형; 및 식물 처리(예컨대, 잎 따기(leaf plucking) 및 가지치기(pruning)).

살분, 살수(sprinkling), 토양 소킹(soaking), 토양 주입, 종자 코팅, 묘목 코팅, 옆면 살포(foliar spraying), 통기(aerating), 미스팅(misting), 분무(atomizing), 훈증(fumigating), 연무(aerosolizing) 등을 포함한 다른 적용 기술도 또한 가능하며, 이는 특정 환경, 예컨대 뿌리 또는 줄기 침입을 유발하는 곤충, 또는 다치기 쉬운 채소 또는 관상용 식물에 대한 적용을 위해서도 요구될 수 있다. 이들 적용 공정도 또한 당업계의 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 살충 조성물은 또한 일정 영역(area)에 대한 방지 또는 예방적 적용을 위해 제제화될 수 있으며, 특정 환경에서는 애완 동물, 가축, 동물 깔개(bedding), 또는 농장 설비, 외양간, 주거지, 또는 농업용 또는 산업용 설비 등에, 또는 이의 근처에서 적용될 수 있다.

환경, 전신, 국소 또는 엽면 시용(foliar application)에 사용되는 살충 조성물의 농도는, 특정 제제의 특성, 적용 수단, 환경 조건 및 항균 활성(biocidal activity)의 정도에 따라서 매우 다양할 것이다. 통상적으로는, 생물 살충 조성물은 약 1중량% 이상의 농도로 적용 제제에 존재할 것이며, 99중량% 이하일 수 있다. 지질 조성물의 건조 제제 약 1% 내지 약 99중량% 이상의 지질 또는 지질 분획 조성물일 수 있으며, 액체 제제는 일반적으로 약 1중량% 내지 약 99중량% 이상의 활성 성분을 포함한다. 이와 같이, 다양한 제제들이 약 5중량% 내지 약 95중량% 이상의 살충성 지질을 포함하는 제제, 및 약 10% 내지 약 90% 이상의 살충성 지질을 포함하는 제제를 포함하여 제조될 수 있다. 당연히, 약 15중량% 내지 약 85중량% 이상의 살충성 지질을 포함하는 조성물, 및 약 20중량% 내지 약 80중량% 이상의 살충성 지질을 포함하는 제제도, 또한 본 명세서의 범주 내에 속한다고 고려된다.

살충성 지질을 포함하는 온전한(intact) 진균이 포함된 조성물의 경우, 제제는 특정 구현예에서 약 10² 내지 약 10⁴ 세포/mg을 포함하는 제제를 사용하는 것이 바람직하기는 하지만, 약 10⁴ 내지 약 10⁸ 세포/mg를 포함하는 것이 일반적이거나, 또는 더욱 농축된 조성물을 원하는 경우, 약 10⁸ 내지 약 10¹⁰ 또는 10¹¹ 세포/mg을 포함하는 조성물이 또한 제제화될 수 있다. 대체적으로는, 세포 페이스트, 포자 농축물, 또는 지질 또는 지질 분획 현탁 농축액을, 약 10¹² 내지 10¹³ 세포/mg 등량의 활성 지질을 포함하도록 제조할 수 있으며, 상기 농축액은 적용에 앞서 희석될 수 있다.

상기에서 설명한 살충성 제제는, 필요에 따라서 특정 식물 또는 목표 영역에, 하나 이상의 제제를, 약 50g/헥타르 내지 약 500g/헥타르의 활성 성분, 또는 대안적으로는 약 500g/헥타르 내지 약 1000g/헥타르의 단위에 걸친 헥타르당 통상의 필드 적용 비율로 투여될 수 있다. 특정 예에서, 심지어 약 1000g/헥타르 내지 약 5000g/헥타르 이상의 활성 성분의 적용률로, 살충제를 목표 부위에 적용하는 것이 바람직할 수도 있다. 사실상, 약 50g의 활성 지질/헥타르 내지 약 10,000g/헥타르 범위의 모든 적용이, 상기 살충제를 사용하여 목표 해충의 관리, 방제 및 살충에 유용하다고 고려된다. 이와 같이, 약 100g/헥타르, 약 200g/헥타르, 약 300g/헥타르, 약 400g/헥타르, 약 500g/헥타르, 약 600g/헥타르, 약 700g/헥타르, 약 800g/헥타르, 약 900g/헥타르, 약 1kg/헥타르, 약 1.1kg/헥타르, 약 1.2kg/헥타르, 약 1.3kg/헥타르, 약 1.4kg/헥타르, 약 1.5kg/헥타르, 약 1.6kg/헥타르, 약 1.7kg/헥타르, 약 1.8kg/헥타르, 약 1.9kg/헥타르, 약 2.0kg/헥타르, 약 2.5kg/헥타르, 약 3.0kg/헥타르, 약 3.5kg/헥타르, 약 4.0kg/헥타르, 약 4.5kg/헥타르, 약 6.0kg/헥타르, 약 7.0kg/헥타르, 약 8.0kg/헥타르, 약 8.5kg/헥타르, 약 9.0kg/헥타르, 심지어 많게는 약 10.0kg/헥타르 초과의 비율로 활성 지질이 본 명세서에서 상기 설명한 조성물에 대한 특정 농업, 산업 및 국내 응용에 사용될 수 있다.

예를 들어, 특정 응용에서, 본 명세서에서 설명한 진균을 포함하는 조성물은, 헥타르당 약 1×10¹⁰개 내지 약 1×10¹⁵개 포자, 바람직하게는 헥타르당 약 1×10¹²개 내지 약 1×10¹⁴개 포자, 더욱 바람직하게는 헥타르당 약 5×10¹²개 내지 약 1×10¹⁴개 포자, 더욱더 바람직하게는 헥타르당 약 1 ~ 3×10¹³개 포자의 비율로 적용될 수 있다.

추가적 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 식물병원성 곤충을 방제하는 방법으로서, 본 명세서에서 설명한 지질 또는 지질 분획을 식물 또는 이의 주변에 적용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

하나의 구현예에서, 적용은 본 명세세에서 예시된 하나 이상의 지질 분획 및 이와 함께 본 명세서에서 기재한 하나 이상의 다른 곤충병원성 진균의 적용이다.

바람직하게는, 상기 하나 이상의 다른 진균은 B. 바시아나 균주 K4B3 (NMIA 수탁번호 V08/025855) 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V1 (NMIA 수탁번호 NM05/44593), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무 스카리움 균주 K4V2 (NMIA 수탁번호 NM05/44594), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움 균주 K4V4 (NMIA 수탁번호 NM06/00007), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B1 (NMIA 수탁번호 NM05/44595), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나 균주 K4B2 (NMIA 수탁번호 NM06/00010), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론지스포룸 균주 KT4L1 (NMIA 수탁번호 NM06/00009), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스 균주 K4P1 (NMIA 수탁번호 NM06/00008), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주로 이루어지는 군에서 선택된다.

다시, 본 발명의 다수의 지질들은, 하나 이상의 식물병원성 곤충 종에 대한 활성을 갖는 곤충병원성 진균의 다수 균주와 함께 이든 아니든 간에, 방제 공정에서 사용될 수 있다.

어린 묘목이 통상적으로 가장 병충해의 피해에 취약하다. 따라서, 비상 상황에서 적용하는 경우, 본 발명의 조성물을 새로 식재한 작물에 대해, 비상시가 되기 전에 적용하는 것이 고려된다.

작물 주기 중 동일 또는 다른 시점에서 반복된 적용을 하는 것도 또한 고려된다. 본 발명의 살충성 지질, 본 발명의 살충성 지질을 포함하는 조성물은, 제철에 앞서 또는 이후에 적용될 수 있다. 이는 개화 시기에 걸쳐, 또는 결실 도중에도 가능하다. 본 발명의 살충성 지질, 또는 본 발명의 살충성 지질을 포함하는 조성물은 또한, 곤충 콜로니화를 방지하기 위하여, 수확 직전 또는 수확 후에, 빠르게 콜로니화하는 괴사성 또는 노화성 잎들, 열매, 줄기, 기계 수확된 줄기 등에 적용할 수 있다. 본 발명의 살충성 지질, 또는 본 발명의 살충성 지질을 포함하는 조성물은, 또한 휴면 조직 상에서 곤충 생장을 느리게 하기 위하여, 겨울에 동면 식물에 적용할 수도 있다.

적용은 발아 전후 및 수확 전후에 할 수 있다. 그러나, 처리는 바람직하게는 개화 내지 수확 사이에 한다. 효력을 증가시키기 위하여, 본 발명의 살충성 지질 또는 본 발명의 조성물의 다수 적용(예를 들어, 개화기부터 결실기에 걸쳐 2회 내지 6회의 적용)이 또한 바람직하다.

본 발명의 살충성 지질 또는 조성물의 재적용(Reapplication)도, 또한 비온 후에 고려되어야 한다. 또한 곤충 감염 예측 모델 또는 감염 분석 데이터를 사용하여, BCA 적용은 곤충 감염 위험 시기에 맞출 수도 있다.

다양한 예시적 구현예에서, 본 발명의 지질 또는 지질 분획, 및 상기 지질 또는 지질 분획을 포함하는 본 발명의 조성물은, 식물 또는 이의 환경에 해롭지 않으며, 이들은 살충 효력을 얻을 수 있는 투여 비율로 적용된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 살충성 지질 또는 이를 포함하는 조성물을, 예를 들어 상기에서 설명한 바와 같이 가압 스프레이를 사용하여 용액 중에 적용하였다. 식물 일부에는 흘러내리기(run off) 바로 전까지 가볍게 스프레이 해주어야 한다. 적용은 식물의 어떠한 부위 및/또는 이의 주변, 예컨대 전체 식물 수관에, 꽃 및 발육중인 과실이 집중된 수관에, 또는 뿌리, 구근(tuber) 등에 인접하거나 그 주위의 식물 줄기 및/또는 토양, 물 또는 배양 배지에 실시될 수 있다.

바람직하게는, 조성물은 안정하다. 본 명세서에서 사용될 때, "안정한(stable)"이라 함은, 수 주일, 바람직하게는 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 바람직하게는 약 5주, 더욱 바람직하게는 약 6주 이상 살충 효력을 도와줄 수 있는 조성물이다. 바람직하게는, 조성물은 특수한 조건, 예컨대 냉장 또는 냉동 저장을 요구하지 않고도 안정하다.

적용된 조성물은 식물병원성 곤충을 방제한다. 식물병원성 곤충은 식물의 일부분을 공격하고, 생장률, 개화, 열매맺기, 생산을 감소시켜서, 감염된 식물을 고사시킬 수 있는, 수확 전후의 많은 질병에 관여한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 식물병원성 곤충은 그 자체로 식물 병원체인 곤충 및 다른 식물병원체, 예컨대 식물병원성 진균 및 박테리아를 위한 벡터로서 작용할 수 있는 곤충을 포함한다. 다른 식물병원체에 대한 벡터로 작용하는 숙주 곤충을 방제함으로서, 식물 질병의 발생률 및/또는 심각성을 최소화할 수 있다는 것은 자명할 것이다.

뉴질랜드에서 자라는 다수의 중요 원예 작물을 해치는 주요 식물병원성 곤충을, 하기의 표 1에 제시하였다.

주요 해충
작물	개체수	경작 면적 (ha)	주요 해충
체리		550	진딧물
감자	321	10,611	진딧물, 가루이
토마토(실내)	390	167	가루이, 나비유충
브라시카 (Brassicas)	227	3,746	가루이, 나비유충
애호박	181	6,560	가루이, 진딧물
타마릴로	175	270	가루이, 진딧물
딸기	125	361	진딧물, 총체벌레
오이(실내)		55	진딧물, 총체벌레, 가루이
양파	150	5,488	총체벌레
토마토(실외)	80	609	가루이, 나비유충, 총체벌레
고추	142	87	총체벌레, 진딧물, 가루이, 나비유충
상추	252	1,287	진딧물, 총체벌레
호박	125	1,033	가루이, 진딧물

본 발명의 지질 및 지질 분획, 조성물 및 방법을 사용하는, 노린재류(Hemiptera ), 예컨대 가루이, 총체벌레, 진딧물, 및 나비유충의, 상기에서 정리한 작물에 대한 방제가 특히 고려된다. 본 발명의 지질 또는 지질 분획을, 단독으로, 또는 하나 이상의 B. 바시아나 진균 균주, 또는 L. 무스카리움 , 패실로마이세스 푸모소로세우스 및 이들을 포함하는 본 발명의 조성물과 함께 사용하여, 바로아 응애를 방제하는 것 또한 특히 고려된다.

본 발명의 방법은 수확 전 또는 후의 식물 및 식물 산물에 특히 적용한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 상기에 나열된 종류의 저장 산물, 에컨대 과실, 채소, 꽂이꽃(cut flower) 및 종자에 적용될 있다. 적합한 적용 기술은 상기에서 밝힌 것들, 특히 스프레이법을 포함한다.

조성물은 식물에 대한 직접 적용과는 대조적으로, 토양 또는 종자를 처리 또는 사전 처리하는데 잠재적으로 사용될 수 있다. 조성물은 식물 가공 재료, 예컨대 보호 코팅, 상자 및 포장지에서의 용도도 발견할 수 있다.

본 발명에는, 또한 본 발명의 지질 또는 본 발명의 조성물로 직접 처리한 식물, 식물 산물, 토양 및 종자도 포함된다.

본 발명은 상술한 바에 있으며, 또한 하기에 실시예로만 주어지며 본 발명의 범주를 제한할 목적이 아닌 구성을 검토한다.

실시예 1 - 곤충 방제의 바이오에세이

본 실시예는 다양한 지질 또는 지질 분획의 살충 효력을 결정하기 위한, 확고한 바이오에세이의 개발에 대해 설명한다.

목표 곤충의 에세이를 개발하고, 1) 이용 가능성(availability), 2) 취약성(susceptibility) 및 3) 사용 용이성(ease to use)의 범주를 사용하여 평가하였다.

항온실의 양배추 식물에서 키운 목표 곤충 Myzus persicae (복숭아흑진딧물, 노린재 목)을 모든 시험에 사용하였다. 진딧물을 지질 분획 샘플과 함께 배양하기 위하여, 진딧물을 잎과 아가 사이에서 습윤제로서 0.05% 트윈 80을 사용하는 1% 물 아가 플레이트 표면상의 양배추 잎 조각으로 옮겼다. 혼합 연령의 진딧물을, 보통 30-50 마리/패트리 디쉬로 사용하였다.

수동 Paasche 에어브러쉬를 마이크로 부피를 취하도록 조작하여, 300㎕의 시험 또는 대조군 용액을 분무(atomise)하도록 사용하였다. 이어서, 처리된 진딧물과 함께 플레이트를 20℃, 12시간 광조건:12시간 암조건에서 유지하고, 매일 체크하였다. 죽은 것들은 제거하였다. 접종된 진딧물은 신생 진딧물이 % 사망률에 포함되는 것을 피하기 위하여 스프레이한 직후 카운팅하였으나, 배양 도중 신생 유충(neonate nymph)을 제거하는 수고는 하지 않았다.

실시예 2 - 살충성 지질의 식별

본 실시예는 뷰바리아 바시아나 K4B3로부터의 다양한 범위의 살충성 지질 분획의 식별 및 제조에 대해 설명한다.

방법

샘플

유기 용매-추출 K4B3 균사체 샘플을 공급하고, 이를 연구에 사용하였다.

분석용 TLC

분석용 TLC는 Macala 등(1983)이 설명한 용매 시스템을 사용하여 개발된 Merck 고성능 박층 크로마토그래피 (HPTLC) 플레이트 상에서 실시하였다. 플레이트를 황화 구리- 인산에 담지하고, 170℃에서 15 내지 30분 동안 가열함으로서 시각화하였다.

SAX 산성/ 비산성 분획화

비산성 지질로부터 산성 지질을 음이온 교환 분리하기 위하여, Waters AccellPlus QMA 고체상 추출 카트리지를 사용하였다. 카트리지는 먼저 클로로포름-메탄올-0.8M 소듐 아세테이트(30:60:8)로 컨디셔닝한 후, 클로로포름-메탄올-물(30:60:8)로 세척하였다. 샘플을 후자의 용매 혼합물 중에 로딩하고, 이는 또한 비-잔류(비산성) 분획을 용출하는데 사용된다. 잔류된 산성 지질을, 클로로포름-메탄올-0.8M 소듐 아세테이트(30:60:8)로 용출하였다.

WAX 산성/ 비산성 분획화

비산성 지질로부터 산성 지질을 좀더 큰 규모로 분리하기 위하여, 클로로포름-메탄올-0.8M 소듐 아세테이트(30:60:8)로 컨디셔닝한 후, 클로로포름-메탄올-물(30:60:8)로 평형화한 DEAE-Sephadex A50 (Pharmacia 사제)로 자가-패킹한 것을 제외하고는, 상기에서 설명한 공정을 뒤이어 실시한다.

정상 크로마토그래피

클로로포름 상에서 자가 패킹한 실리카겔 60(BDH, 120 메쉬) 상에서, 정상 크로마토그래피 실시하였다. 샘플을 클로로포름 중에 로딩하고, 클로로포름(7배 이하의 층부피), 클로로포름-아세톤(9:1, 7배 이하의 층부피) 및 최종적으로 메탄올 (7배 이하의 층부피)로 용출하였다.

분취용 TLC

분취용 TLC는 클로로포름으로 2:1 또는 3:1의 비율로 희석한 클로로포름-메탄올-아세트산-포름산-물(35:15:6:2:1)과 함께 전개된 20×20cm 실리카겔 플레이트 (Merck, 두께 2 mm) 상에서 실시되었다. 클로로포름 중의 요오드 용액 중에, 전개된 플레이트의 각각의 수직 윤곽선을 약 1cm 담금으로서 밴드를 찾는다. 그 후 매개 부위(intervening region)를 플레이트로부터 긁어내고, 분리된 성분을 메탄올로서 실리카겔로부터 용출시켰다.

MALDI - TOF / TOF 질량 분광분석

Bruker Daltonics Ultraflex Ⅲ MALDI-TOF/TOF를 사용하여, 화합물의 질량 결정 및 MS/MS 분획화를 실시하였다. MALDI 메트릭스로서, 알파-시아노-히드록시신남산을 사용하였다. 샘플을 메트릭스와 혼합하여, Bruker Anchorchip 목표 플레이트에 떨어뜨렸다(spot). Bruker 펩티드 측정 믹스를 사용하여 측정을 실시하였다.

NMR

Varian 500 MHz NMR을 정상 크로마토그래피로부터의 메탄올-용출 분획의 분획 3의 분석에 사용하였다.

결과 및 논의

원심 분리 분획화

개시 물질을 원심분리하였다. 원심분리된 미립자 물질 및 여과된 상층액을 바이오에세이에서 시험하였다. 모든 생물 활성이 미립자 물질 내에 포함된 것으로 발견되었다. 물질은 지방 유사 점성(fat-like consistency)을 가지며, 물에 잘 녹지 않는다. 물질을 현미경 분석시, 구조가 명확히 확정 또는 식별될 수 없다고 나타났다.

박층 크로마토그래피(TLC)는 지질의 존재를 시험하기 위해 실시되었다. 도 1은 전개된 TLC 플레이트를 나타낸다. 샘플은 지질 표준물질과 유사하게 이동하는 풍부한 성분을 확실히 포함한다. 강한 지방산 성분이 특히 분명하다.

산성/ 비산성 분획화

지질은 SAX SPE (강한 음이온 교환 고체상 추출)를 사용하여, 산성 및 비산성 분획으로 분리하였다. 양쪽 분획을 TLC 상에서 전개하고(도 2), 바이오에세이에서 시험하였다. 결과는 비산성 분획으로부터 산성 분획을 단지 불완전하게 분리했음에도 불구하고, 비 산성 분획에서 더 강한 활성이 분명히 나타난다는 것을 보여준다(도 3).

정상 크로마토그래피

비산성 샘플을 정상 크로마토그래피를 사용하여 극성에 따라서 분획하였다. 6개의 분획을 모아서, TLC 상에서 전개하고(도 4), 바이오에세이에서 시험하였다(도 5). 분획 1이 접종 2일 후 활성을 나타내기는 하지만, 분획 5에서 더욱 강한 활성이 발견되었다. 이는 다중 화합물로부터의 생물 활성을 강하게 암시한다.

분획 1은 클로로포름으로 용출되었으며 주로 극성이 낮은 성분을 포함하는 반면, 분획 5는 메탄올로 용출되었고 극성이 높은 물질의 많은 부분을 포함하였다.

상기와 같이 제조된 샘플은 적당한 양의 산성 지질을 포함한다(도 4). 따라서, 대체의 음이온 교환 크로마토그래피 매체(DEAE-Sephadex)를 사용한 새로운 산성/비산성 분획화 기술을 실시하여, 본질적으로 모든 산성 지질을 효과적으로 제거하였다(도 6의 2번 레인에서 나타남).

더욱 작은 소-분획들을 모아서, 메탄올로 용출하는 분획에 집중하여 새로운 정상 크로마토그래피를 실시하였다. 11개 분획을 모아서, TLC를 사용하여 분석하였다(도 6). 일부 분획(4~5 및 7~11)은 바이오에세이에서 시험하기 위하여 합쳤다 (도 7). 분획 2 및 4-5에서 가장 높은 생물 활성을 나타내었다.

분취용 TLC

추가로 활성 화합물(들)을 정제하기 위하여, 분취용 TLC를 실시하여, 비교적 다량의 각각 분리된 밴드를 모을 수 있게 되었다. 분취용 TLC 플레이트로부터 9개의 밴드를 모아서, 분석 TLC에 의해 분석하였고(도 8), 이는 성공적으로 분획화된 것을 보여주었다. 불행하게도, 회전 증발 도중 분획 3이 유실되었다.

8개의 분획을 바이오에세이에서 분석하였다(도 9). 분획 4 및 5가 가장 높은 활성을 보였고, 다음이 분획 2 및 9였다. 확실히, 분획 3은 분획 4 및 5가 미량(minor) 성분으로 존재하는 TLC 상에서 진한 밴드를 나타내며, 그럼에도 불구하고 이후의 분석에 직접적인 바이오에세이 데이터가 포함되지 않는다.

극성 지점에서의 분리를 최대화하도록 최적화한 조건에서, 새로운 분취용 TLC를 실시하였다(이전 분획 2~5).

새로운 분리로 6개의 분획을 제공하였다: 2, 3, 4b, 5a, 5b 및 6 (이들 분획의 넘버링은 이전의 분리에서와 일관된다). 샘플들은 분석 TLC를 사용하여 조사하였고(도 10), 이전의 분취용 TLC에서 얻은 것들보다 더욱 성분 분리가 잘된 것으로 나타났다. 바이오에세이에서 가장 강한 활성은, 분획 3, 4b, 5a 및 5b에서 관찰되었다(도 11). 이들 분획에 대한 바이오에세이 결과는, 이전의 결과들과 매우 일관되었다(도 9).

질량 분광분석

분획 2, 3, 4b, 5a 및 5b는 MALDI-TOF 질량 분광분석기(MS)를 사용하여 분석하였다(도 12). 다수의 흥미로운 피크가 관찰되었고, 이들을 MS/MS (분획화) 분석을 위해 선택하였다(표 2).

MS/MS를 위해 선택된 피크들
1 분획	2 m/z
3 2	4 444.82 5 655.94
6 3	7 454.19
8 4b	9 750.66
10 5a	11 393.39 12 750.67
13 5b	14 692.69 15 694.72 16 716.71 17 531.34

분획 3은 TLC 및 MS 모두에서 가장 순수한 화합물로 나타나므로, 추후 연구를 위해 분획들 중 가장 먼저 선택되었다. 나아가, 이 분획은 바이오에세이 분석을 위해 제출된 바와 같이, 최저 절대량(중량)의 물질을 포함하나(다른 분획의 양에 대해 대략 50%의 양), 분획 4b, 5a 및 5b에서와 동일한 수준의 생물 활성을 보인다.

분획 3의 NMR 분석은 저분자량 화합물에 대한 증거를 제공한다. 사실, 저질량 범위에서, MS 분석(도 13)은 m/z 86.02 및 146.97의 후보 질량을 나타낸다. 이런 이유로, 분획 3이 생물 활성에 영향을 주는 하나 이상의 화합물을 포함한다는 결론을 얻었다.

개선된 제조 프로토콜

활성 화합물의 특성에 대해 통찰해봄으로서, 화합물 제조 프로토콜의 개선점에 대한 초기의 제안을 제공할 수 있다. 이 프로토콜은 실험실 수준(50ml)로 적용되어, 바이오에세이에서 시험되었다. 이 최적화된 제조법의 활성은 매우 높은 것으로 확인되었다.

추가 분획화

메탄올 추출 샘플 상의 지방 잔여물을, 이 고체 분획이 활성 화합물을 포함하는지 여부를 확립하기 위해, 바이오에세이에 의해 시험하였다. 진딧물에 대해서는, K4B3-MeOH 샘플로부터의 이 고체 분획이, 액체 부분보다 더욱 활성이 있는 것으로 밝혀졌다(도 14). 이 바이오에세이는 B. 바시아나 K4B3의 다른 배양액으로부터 균사를 여과한 후에는 거의 활성이 없음을 입증하였다.

K4B3 균사체 배양액으로부터의 클로로포름 추출

클로로포름 추출은 다른 분획으로부터 지질을 분리하는데 사용한다. 바이오리엑터에서 생산한 50ml의 K4B3 균사체 배양액을 원심분리하여 균사체를 모우고, 이를 균질화하고, 40ml의 1:2 메탄올:클로로포름을 사용하여 여과하였다. 9ml의 0.02% CaCl₂를 첨가하여, 혼합하였다. 상이 분리된 경우, 상층을 제거하고, 클로로포름이 증발되도록 실온에서 밤새 방치하였다. 1ml의 메탄올을 사용하여, 건조 잔여물을 재현탁하였다. 300㎕의 이 용액을 진딧물에 대해 에세이하였고(도 15), 강한 활성이 있다고 나타났다.

HP ₂ 0 샘플

K4B3 균사체 배양액 (HP₂0 샘플)의 배양 여과액의 메탄올 추출액은, 진딧물에 대한 활성이 결핍된다고 밝혀졌으나(도 16), 배추좀나방의 유충에 대해서는 활성을 갖는다(도 17). HP₂0 샘플은 4~5일간의 바이오에세이 동안 잎에 영향을 주며, 이는 일부 식물 독소 성분이 존재할 수도 있다는 것을 암시한다.

결론

이들 실험은 뷰베리아 바시아나 K4B3와 같은 사상균에 의해 생산되는, 다중 활성의 살충성 지질이 있다는 것을 암시한다. 개선된 살충 활성(개선된 생물 활성 포함)을 갖는 지질 분획을, 본 발명에 의해 제공된 제조 방법을 사용하여 생산하였다.

실시예 3 - 곤충 방제의 바이오에세이

이 실시예는 다양한 지질 또는 지질 분획의 살충 효력을 결정하기 위한, 확장된 범위의 바이오에세이 개발에 대해 설명한다.

몇몇 목표 곤충의 에세이가 개발되었고, 1) 이용가능성, 2) 취약성 및 3) 사용의 용이성이라는 기준에서 평가하였다. 4개의 곤충 시스템을 시험하였다: 가루이, 배추좀나방, 밀웜, 및 모기

1. 가루이 유충(노린재목)

가루이는 현재 적절한 방제제가 부족한 주요 목표 곤충이다. 가루이 유충은 Bioforce Ltd 사(뉴질랜드, 오클랜드)로부터 얻었다. K4B3 지질 분획의 샘플 및 대조군 배지를 사용하여, 포터탑(Potter Tower)을 통하여 대략 100마리 유충의 군들을 접종하였다.

2. 밀웜(갈색거저리, Tenebrio molitor) 유충 (딱정벌레목, Coleoptera)

거저리 유충은 생물공급업자로부터 얻었다. 10마리의 유충에 지질 샘플 또는 물 대조군을 스프레이하고, 2주간 모니터링하였다.

3. 배추좀나방-DBM (Plutella xylostella) 유충 (나비목)

배추좀나방은 전세계적으로 브라시카에 대한 주요 해충이며, 대부분의 방제용 화학물질에 대해 내성이 있는 곤충이다. 배양액은 K4B3 지질 샘플과 함께 시험하기 위해, Lincoln University에서 얻었다.

표준 방법은 포터탑의 미니 버전을 사용하였다. 수동 A320 에어브러쉬를 마이크로 부피를 취하도록 조작하여, 지질 샘플 또는 대조군 용액을 분무하였다. 유충들을, 0.05% 트윈 80을 사용하는 물 아가 플레이트(물 + 1% 아가) 표면상의 작은 양배추잎에 유지한다. 모든 크기(1령기 내지 전용기)의 5~20 마리의 유충들을 각 시험에서 사용하였다. 하나의 시험에서, 유충을 또한 용액 방울들로 적신다. 액적 급식(Droplet feeding)을 시도하여, 독성이 외용성(topical)인지 섭취용(ingestion)인지를 결정하였다.

2령기 내지 6령기 유충을, K4B3 지질 분획에 3 내지 8마리, 대조군에 19 마리를 접종하였다. 접종 후 유충들을 16hL:8hD로 20℃에서 유지하였다.

4. 모기 유충(Mosquito larvae)

K4B3 지질 분획의 양을 다양화하여, 큘렉스 페르빌리간스(Culex perviligans) 유충을 포함하는 대략 12.5ml의 물이 든 병에 첨가하는 바이오에세이를 실시하였다. 유충은 거의 용화(pupation)를 앞두고 있었고, 일부는 실험 도중 용화될 수 있다.

실시예 4 - 포유류 모델에 대한 뷰베리아 바시아나 K4B3 지질의 독성

도입

본 실시예는 포유류 모델에 대한 K4B3 지질의 독성 평가를 설명한다.

방법

K4B3 지질 분획은 상기 실시예 2에서 설명한 바와 같이 분리하였다.

OECD 가이드라인 425 (급성 구강 독성-상하공정(Up-and-down Procedure))에 따라서 마우스를 시험하였다. 이 물질이 독성이 크지 않다고 기대되므로, 구강 삽관(oral intubation)에 의한 2,000mg/kg의 단일 투여 수준의 한계 시험(Limit Test)을 선택했다. 이러한 투여는 OECD에 의해 예외적 환경 하에서의 경우를 제외하고는, 급성 독성의 평가로서 가장 많이 추천되는 것이다.

2,000mg/kg의 K4B3 지질의 단일 투여량을, 하기와 같이 5 마리의 암컷 스위스 마우스에 대하여 구강 삽관에 의해 투여하였다.

시험 조건

대략 오후 4시에 마우스 중 한 마리에 대해 식이를 중단하고, 이의 체중을 측정하였다. 다음날 아침, 마우스의 체중을 다시 측정하고, 2,000mg/kg 투여량을 제공하기 위해 요구되는 K4B3 지질의 중량을 계산하였다. 이 양을 달아서, 150㎕의 물에 희석하였다. 전체 부피를 위관영양법(gavage)에 의해 마우스에 투여하였다.

투여 후, 마우스를 즉시 음식에 접근하도록 허용하였다. 화학 물질 시험에 대한 OECD 가이드라인(2000년 10월호, 개정된 초안 가이드라인 425 페이지)에 의해, 투여 후 60분 동안, 및 투여일 및 그 후 몇일 동안, 수 회의 간격으로 집중적으로 관찰하였다. 두번째 마우스는 첫번째 마우스 이후 48 시간 후에 K4B4 폴리펩티드를 2,000mg/kg 체중으로 투여하였다. 세번째, 네번째 및 다섯번째 마우스도 계속 48 시간 간격으로 모두 2,000mg/kg로 투여하였다.

마우스를 (투여 전 밤새 단식하는 경우는 제외하고는) 적당한 물 및 음식과 함께 개별적으로 수용하였다. 마우스를 매일 관찰하고, 투여 후 2 주 동안 체중을 측정하였다. 투여 후 1일, 1주일 및 2주일 동안 체중을 기록한 후, 동물들을 이산화탄소 흡입으로 죽여서, 부검(post-mortem examination)을 실시하였다.

결과

K4B3 복합체 주입 후 독성 효과를 보이지 않는다는 결과는, 마우스가 관찰 기간 내내 건강 상태가 양호했고, 투여 직후 섭취를 했고, 투여일 및 실험 기간 내내 정상 거동을 했다는 사실과 함께, 독성이 없다는 표시이다.

체중. 표 3에 나타난 바와 같이, 실험 기간 내내 다양한 시간 간격에서 마우스의 평균 체중이 변하지 않았음을 보여주는 결과는, 독성이 없다는 표시이다.

K4B3 지질을 제공받은 마우스의 체중
	음식 제거 전의 체중(g)	섭취 시의 체중(g)	섭취 1일 후의 체중(g)	섭취 7일 후의 체중(g)	섭취 14일 후의 체중(g)
평균	25.0	22.6	24.4	25.3	25.4
마우스 1	25.4	23.1	25.6	26.5	25.6
2	25.5	23.2	24.4	25.8	27.7
3	27.1	24.1	25.3	25.6	26.1
4	23.0	20.8	22.7	23.8	23.1
5	24.0	21.6	24.0	24.6	24.7

밤새 단식한 후, 마우스는 통상 체중이 평균 2.4g 빠진다. 이러한 체중 감소가 음식을 다시 접하여 섭취하게 된 다음날 회복되는 환경, 및 마우스가 2주간의 관찰 기간 동안 체중을 유지하는 환경 하에서는, 독성이 나타나지 않는다.

부검시의 발견(Post - mortem findings ). 마우스의 검시(necropsy)에서 비정상이 나타나지 않았다는 결과, 및 하기 표 4에 나타난 바와 같이 마우스의 간, 신장, 비장, 심장, 폐 및 장(유문 내지 항문)(pylorus to anus)의 중량이 정상 범위 내에 든다는 결과는 독성이 없다는 표시이다.

K4B3 지질을 제공한 마우스의 장기의 상대 중량
장기의 상대 중량 (g/100g 체중)
	간	신장	비장	심장	폐	장
평균	5.17	1.39	0.50	0.548	0.874	10.49
마우스 1	4.96	1.35	0.50	0.512	0.836	10.17
2	5.83	1.43	0.690	0.534	0.903	10.77
3	5.55	1.33	0.475	0.498	0.858	9.79
4	4.73	1.39	0.394	0.589	0.931	10.93
5	4.79	1.43	0.441	0.607	0.842	10.79

논의

K4B3 펩티드를 마우스에 대해 2,000mg/kg 투여량으로 구강 투여한 것이 식별가능한 부작용을 유발하지 않았으며, 죽는 것도 없고 부검시 비정상도 나타나지 않았으며, 장기의 중량은 정상 범위 내에 있고, 마우스의 거동이 전체적으로 정상이라는 결과들은, 급성 독성이 낮다는 표시이다.

상기 결과는 K4B3 지질이 급성 구강 독성이 낮다(LD₅₀가 2,000mg/kg 체중 초과)는 것을 나타낸다. 상기 결과는 K4B3 지질이 New Zealand Hazardous Substances and New Organisms (HSNO)(1996년 10월) 하에서 최저 독성 부류로 분류될 것이라는 것을 나타낸다.

실시예 5 - 진딧물 및 배추좀나방에 대한 진균으로부터의 총 지질의 독성 평가

개 요

본 실시예는 다양한 사상균으로부터의 지질의, 진딧물 및 배추좀나방에 대한 독성의 평가를 설명한다.

방법

4종의 진균을 지질 추출물을 제조하는데 사용하였다:

1. 뷰베리아 바시아나 균주 AM2.

2. 뷰베리아 바시아나 균주 F480.

3. 트리코데르마 종 분리균 1328.

4. 메타리지움 종

모든 진균을 실온에서 100ml의 PDB 중에, 140~160rpm으로 진탕하면서, 3일 이내로 키웠다. 50ml의 진균 배양액을 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 펠렛의 균사체(mycelium)에 20ml의 1:2 메탄올:클로로포름을 가하였다. 균사체를 수동 균질화(hand homogenised)한 후, Whatman 필터지 1호를 통하여 여과하였다. 추가로 20ml의 1:2 메탄올:클로로포름을 사용하여 필터를 세척하였다. 9ml의 0.02% CaCl₂를 가하고, 그 혼합물을 2시간 이상 동안 분리되도록 방치하였다. 상층을 버리고, 클로로포름/지질 용액이 증발되도록 밤새 방치하였다. 일단 건조시킨 후, 1 ml의 100% 메탄올을 사용하여, 지질을 재현탁하였다.

분리된 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3로부터의 지질 추출액을, 또한 상기에서 설명한 바와 같이 제조하여 사용하였다.

항온실의 양배추 식물에서 키운 Myzus persicae (복숭아흑진딧물) 또는 배추좀나방 유충을 사용했다. 혼합 연령의 진딧물을, 보통 30~50 마리/패트리디쉬로 사용했다. 3~5 령기의 DBM 유충을 사용하였다.

진딧물 또는 유충을 추출물과 함께 접종하기 위하여, 곤충들을 잎과 아가 사이의 습윤제로서 0.05% 트윈 80을 사용하는 1% 물 아가 플레이트 표면상의 양배추 잎 조각에 옮겼다.

수동 Paasche 에어브러쉬를 마이크로 부피가 되도록 조작하여, 300㎕의 시험 또는 대조군 용액을 분무하는데 사용하였다. 이어서, 처리된 곤충들이 담긴 플레이트를 20℃에서, 12시간 광조건:12시간 암조건 하에 유지하고, 매일 체크하였다. 죽은 것들은 제거하였다. 접종한 진딧물은 새로 태어난 진딧물이 % 사망률에 포함되는 것을 피하기 위하여 스프레이 직후에 카운팅되었으나, 배양 도중에 신생 유충을 제거하는 수고는 하지 않았다.

결과

일반적으로, 50ml의 뷰베리아 및 메타리지움 배양액에서 대략 3ml 등량의 습윤 균사(hyphae)를 얻었다. 50ml의 트리코데르마 배양액에서 15ml의 습윤 균사 등량을 얻었다.

뷰베리아 바시아나 균주 AM2, F480, 및 K4B3에서 추출한 총 지질에 대한 바이오에세이는, 이들 지질이 매우 강력한 살충 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, 각 균주로부터의 총 지질의 적용으로 단 21시간 후에 거의 100%의 사망률을 보였다. 유사하게, 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3로부터의 지질 분획 4 및 5는, 목표 진딧물에 대해 100% 사망률을 유도하였다.

이들 결과는 또한 다른 사상균으로부터의 총 지질에서도 관찰된다. 트리코데르마 및 메타리지움으로부터의 지질은, 뷰베리아 바시아나로부터의 지질에서와 마찬가지로, 강력한 살충 활성을 보여준다. 도 19에서 나타난 바와 같이, 진딧물에 대한 거의 100% 사망률이, 트리코데르마 및 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3로부터의 지질에 노출된 지 단 21시간 후에 관찰되었으며, 동일 시점에서 메타리지움으로부터의 지질에 노출된 이들 진딧물에서는 거의 50% 사망률을 보인다. 기준 사망률은 메탄올 음성 대조군에 의해 확립되었다.

이러한 바이오에세이는 총 3일 동안 계속되며, 복숭아흑진딧물에 대한 % 누적 사망률이 도 20에 나타나있다. 이 데이터는 이들 지질에 의해 나타나는 살충 활성이 좀더 긴 기간에 걸쳐 일부 추가 사망을 실시할 경우, 좀더 신속히 작용할 수 있다는 것을 암시한다.

뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 (뷰베리아), 트리코데르마 및 메타리지움으로부터의 다양한 지질 분획의, 배추좀나방 유충에 대한 바이오에세이는, 진딧물에 대해서 보다는 덜 효과적이지만, 이들 지질 중 특정한 것들은 여전히 나방 유충(moth larvae)에 대하여 일부 살충 활성을 보인다는 것을 암시한다. 도 21에서 나타난 바와 같이, 30% 초과의 누적 사망률이 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 및 메타리지움로부터의 지질에 대하여 4 내지 5일에서 관찰되었다.

도 22 는 본 명세서의 실시예 5에서 설명한 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 및 트리코데르마로부터의 다양한 지질 분획에 대한 바이오에세이 상에서, 21시간(20 ℃)에서의 복숭아혹진딧물(green peach aphid)의 사망률을 보여준다. 시험 분획은 메탄올-추출(-MeOH) 및 클로로포름 추출(-Chloro) 분획을 포함하며, 음성 대조군으로서 메탄올 및 물을 사용하였다.

트리코데르마 및 뷰베리아 바시아나로부터의 다양한 지질 분획의, 진딧물에 대한 바이오에세이는, 클로로포름- 및 메탄올-추출 지질 분획이 강력한 살충 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 도 22에서 나타난 바와 같이, 트리코데르마 및 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3로부터의 클로로포름- 및 메탄올-추출 지질에 노출된 진딧물 중 거의 100%가 사망한 것이, 단 21 시간 노출 이후에 관찰되었다. FS-MeOH 및 Beaublast-MeOH는 K4B3 산물로부터의 다른 추출물들이다.

논의

이 실시예는 살충성 지질이 넓은 범위의 사상균으로부터 제조되며, 상기 지질의 생산이 뷰베리아 바시아나 K4B3 균주에 제한되지 않는다는 것을 나타낸다. 추출된 지질은 종종 목표 곤충을 24시간 노출 이내에 거의 100% 죽이는, 강력한 살충 활성을 갖는다.

산업상 이용가능성

상기 명세서에서 명백히 나타난 바와 같이, 본 발명은 사상균으로부터의 살충성 지질 또는 지질 분획, 및 이와 함께 곤충, 예컨대 식물병원성 곤충의 방제에 유용한 상기 지질 또는 지질 분획을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 곤충, 예컨대 식물병원성 곤충의 방제 방법에서의 상기 지질 및 지질 분획의 용도도 또한 제공한다. 본 발명의 지질 또는 지질 분획 및 조성물은, 농업 및 원예 응용 분야에서 널리 유용성을 갖는다.

관련 문헌

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Elhag, E.A.; Horn, D.J. 1983 Resistance of greenhouse Whitefly (Homoptera: Aleyrodidae) to insecticides in selected Ohio greenhouses. Journal of Economic Entomology 76: 945-948.

Georghiou, G.P. 1981 The occurrence of resistance to pesticides in arthropods, an index of cases reported through 1980. FAO of UN , Rome 1981. 172 p.

Gorman, K.; Devine, G.J.; Denholm, I. 2000 Status of pesticide resistance in UK populations of glasshouse Whitefly, Trialeurodes vaporariorum, and the two-spotted spider mite, Tetranychus urticae. The BCPC Conference : Pests and diseases: 1: 459-464

Grossman, J. 1994 Onion Thrips. IPM Practitioner . 16(4): 12-13

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Wardlow, L.R. 1985 Pyrethroid resistance in glasshouse Whitefly (Trialeurodes vaporariorum, Westw.). Mededelingen van de Faculteit Landbouwwetenschappen, Rijksuniversiteit , Gent 50 (2b): 164-165.

Claims (38)

1. 자낭균 문 진균으로부터의, 하나 이상의 분리, 정제되거나, 또는 실질적으로 순수한 살충성 지질 또는 지질 분획.
2. 제 1 항에 있어서,
   하나 이상의 비-산성 지질 또는 비-산성 지질 분획이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로써 이루어지는 살충성 지질 또는 지질 분획.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   실질적으로 산성 지질이 포함되지 않는 지질 분획.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
   실질적으로 유리 지방산이 포함되지 않는 지질 분획.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
   하기의 것들 중 어느 하나 이상이거나, 또는 이들의 식별 특성을 갖는 지질 분획:
   a. 본 명세서의 도 4에 나타나거나 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 1, 분획 5, 또는 분획 6;
   b. 본 명세서의 도 7에 나타나거나 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 4, 또는 분획 5;
   c. 본 명세서의 도 8에 나타나거나 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9;
   d. 본 명세서의 도 8에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9;
   e. 본 명세서의 도 10에 나타나거나 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4b, 분획 5a, 분획 5b, 또는 분획 6.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나의 항에서,
   상기 분획 2, 분획 3, 분획 4b, 분획 5a, 분획 5b, 또는 분획 6의 식별 특성이, 도 12a 내지 도 12f 중 어느 하나에서 나타난 바와 같은 MALDI-TOF 질량 분광분석(MS) 프로파일인 지질 분획.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에서,
   본 명세서의 도 10 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 3이거나 또는 이의 식별 특성을 갖는 지질 분획.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 식별 특성이 도 13에서 나타난 바와 같은 NMR 스펙트럼인 지질 분획.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
   하기의 것들 중 어느 하나인 지질:
   a. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 86인 지질, 또는
   b. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 147인 지질, 또는
   c. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 445인 지질, 또는
   d. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 656인 지질, 또는
   e. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 454인 지질, 또는
   f. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질, 또는
   g. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 393인 지질, 또는
   h. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질, 또는
   i. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 693인 지질, 또는
   j. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 695인 지질, 또는
   k. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 717인 지질, 또는
   l. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 531인 지질, 또는
   m. MS/MS에 의한 질량이 m/z 86.02인 지질, 또는
   n. MS/MS에 의한 질량이 m/z 146.97인 지질, 또는
   o. MS/MS에 의한 질량이 m/z 444.82인 지질, 또는
   p. MS/MS에 의한 질량이 m/z 655.94인 지질, 또는
   q. MS/MS에 의한 질량이 m/z 454.19인 지질, 또는
   r. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.66인 지질, 또는
   s. MS/MS에 의한 질량이 m/z 393.39인 지질, 또는
   t. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.67인 지질, 또는
   u. MS/MS에 의한 질량이 m/z 692.69인 지질, 또는
   v. MS/MS에 의한 질량이 m/z 694.72인 지질, 또는
   w. MS/MS에 의한 질량이 m/z 716.71인 지질, 또는
   x. MS/MS에 의한 질량이 m/z 531.34인 지질.
10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    하기의 것들 중 어느 하나 이상을 포함하거나, 또는 이로써 이루어지는 지질 분획:
    a. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 86인 지질, 또는
    b. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 147인 지질, 또는
    c. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 445인 지질, 또는
    d. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 656인 지질, 또는
    e. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 454인 지질, 또는
    f. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질, 또는
    g. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 393인 지질, 또는
    h. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질, 또는
    i. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 693인 지질, 또는
    j. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 695인 지질, 또는
    k. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 717인 지질, 또는
    l. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 531인 지질, 또는
    m. MS/MS에 의한 질량이 m/z 86.02인 지질, 또는
    n. MS/MS에 의한 질량이 m/z 146.97인 지질, 또는
    o. MS/MS에 의한 질량이 m/z 444.82인 지질, 또는
    p. MS/MS에 의한 질량이 m/z 655.94인 지질, 또는
    q. MS/MS에 의한 질량이 m/z 454.19인 지질, 또는
    r. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.66인 지질, 또는
    s. MS/MS에 의한 질량이 m/z 393.39인 지질, 또는
    t. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.67인 지질, 또는
    u. MS/MS에 의한 질량이 m/z 692.69인 지질, 또는
    v. MS/MS에 의한 질량이 m/z 694.72인 지질, 또는
    w. MS/MS에 의한 질량이 m/z 716.71인 지질, 또는
    x. MS/MS에 의한 질량이 m/z 531.34인 지질.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 자낭균 문의 진균이 뷰바리아 바시아나 균주 K4B3(2008년 9월 23일자로, 오스트레일리아 국립표준연구소(NMIA)에 수탁번호 V08/025855로 기탁됨), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰바리아 바시아나 균주 AM2 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰바리아 바시아나 균주 F480 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 트리코데르마 분리균 1328를 포함하는 하나 이상의 트리코데르마 종, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 및 하나 이상의 메타리지움 종을 포함하는 군에서 선택되는 지질 또는 지질 분획.
12. 자낭균 문의 진균으로부터의 하나 이상의 살충성 지질 또는 하나 이상의 살충성 지질 분획, 및 이와 함께 하나 이상의 담체를 포함하는 조성물.
13. 자낭균 문의 진균으로부터의 하나 이상의 살충성 지질 또는 하나 이상의 살충성 지질 분획, 및 이와 함께 하나 이상의 담체가 추가된 조성물.
14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    자낭균 문의 진균 배양액으로부터의 배양액, 세포 추출물, 세포 현탁액, 세포 균질물, 세포 용해물, 세포 상등액, 세포 여과물, 세포 펠렛 또는 생장 배지이거나, 또는 이를 포함하는 조성물.
15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    자낭균 문의 진균으로부터 얻을 수 있는 포자를 추가로 포함하는 조성물.
16. 제 15 항에 있어서,
    뷰바리아 바시아나 균주 K4B3(2008년 9월 23일자로, 오스트레일리아 국립표준연구소(NMIA)에 수탁번호 V08/025855로 기탁됨), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰바리아 바시아나 균주 AM2, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰바리 아 바시아나 균주 F480, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 트리코데르마 분리균 1328를 포함하는 하나 이상의 트리코데르마 종, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 및 하나 이상의 메타리지움 종을 포함하는 군에서 선택되는 진균으로부터 얻을 수 있는 포자를 포함하는 조성물.
17. 제 16 항에 있어서,
    뷰베리아 바시아나 균주 K4B3로부터 얻을 수 있는 포자를 포함하는 조성물.
18. 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    뷰바리아 바시아나 균주 K4B3(2008년 9월 23일자로, 오스트레일리아 국립표준연구소(NMIA)에 수탁번호 V08/025855로 기탁됨), 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰바리아 바시아나 균주 AM2, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 뷰바리아 바 시아나 균주 F480, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 트리코데르마 분리균 1328를 포함하는 하나 이상의 트리코데르마 종, 또는 이의 식별 특성을 갖는 균주; 및 하나 이상의 메타리지움 종을 포함하는 군에서 선택된 진균으로부터의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을 포함하는 조성물.
19. 제 18 항에 있어서,
    뷰바리아 바시아나 균주 K4B3로부터의 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을 포함하는 조성물.
20. 제 12 항 내지 제 19 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    하나 이상의 지질 분획을 포함하며,
    상기 지질 분획이 하기의 것들 중 어느 하나 이상이거나, 또는 이의 식별특성을 갖는 조성물:
    a. 본 명세서의 도 4에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 1, 분획 5, 또는 분획 6;
    b. 본 명세서의 도 7에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 4, 또는 분획 5;
    c. 본 명세서의 도 8에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9;
    d. 본 명세서의 도 8에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9;
    e. 본 명세서의 도 10에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4b, 분획 5a, 분획 5b, 또는 분획 6.
21. 제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    비-산성 지질이 강화된 조성물.
22. 제 21 항에 있어서,
    하기의 것들 중 어느 하나 이상이거나 또는 이의 식별 특성을 갖는 하나 이상의 지질 분획에 존재하는 하나 이상의 지질이 강화된 조성물:
    a. 본 명세서의 도 4에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 1, 분획 5, 또는 분획 6;
    b. 본 명세서의 도 7에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 4, 또는 분획 5;
    c. 본 명세서의 도 8에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9;
    d. 본 명세서의 도 8에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 또는 분획 9;
    e. 본 명세서의 도 10에 나타나거나 또는 실시예 2에서 설명한 바와 같은, 분획 2, 분획 3, 분획 4b, 분획 5a, 분획 5b, 또는 분획 6.
23. 제 21 항에 있어서,
    하기의 것들 중 어느 하나 이상이 강화된 조성물:
    a. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 86인 지질, 또는
    b. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 147인 지질, 또는
    c. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 445인 지질, 또는
    d. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 656인 지질, 또는
    e. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 454인 지질, 또는
    f. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질, 또는
    g. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 393인 지질, 또는
    h. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 751인 지질, 또는
    i. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 693인 지질, 또는
    j. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 695인 지질, 또는
    k. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 717인 지질, 또는
    l. MS/MS에 의한 질량이 대략 m/z 531인 지질, 또는
    m. MS/MS에 의한 질량이 m/z 86.02인 지질, 또는
    n. MS/MS에 의한 질량이 m/z 146.97인 지질, 또는
    o. MS/MS에 의한 질량이 m/z 444.82인 지질, 또는
    p. MS/MS에 의한 질량이 m/z 655.94인 지질, 또는
    q. MS/MS에 의한 질량이 m/z 454.19인 지질, 또는
    r. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.66인 지질, 또는
    s. MS/MS에 의한 질량이 m/z 393.39인 지질, 또는
    t. MS/MS에 의한 질량이 m/z 750.67인 지질, 또는
    u. MS/MS에 의한 질량이 m/z 692.69인 지질, 또는
    v. MS/MS에 의한 질량이 m/z 694.72인 지질, 또는
    w. MS/MS에 의한 질량이 m/z 716.71인 지질, 또는
    x. MS/MS에 의한 질량이 m/z 531.34인 지질.
24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    강화되지 않은 조성물에 존재하는 양에 비하여, 적어도 약 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 이상의 강화물이 보강된 조성물.
25. 하나 이상의 곤충의 방제 방법에 있어서,
    하나 이상의 곤충을, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 항에 기재된 지질 또는 지질 분획, 또는 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
26. 하나 이상의 곤충의 방제 방법에 있어서,
    제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 항에 기재된 지질 또는 지질 분획, 또는 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물을, 식물 또는 이의 주변에 적용하는 것을 포함하는 방법.
27. 하기의 단계를 포함하는, 생물학적 방제 조성물의 생산 방법:
    자낭균 문의 하나 이상의 진균들의 배양액을 제공하는 단계;
    하나 이상의 지질 또는 지질 분획의 생산에 적합한 환경 하에서, 상기 배양액을 유지시키는 단계; 및
    i) 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 담체와 결합시키는 단계, 또는
    ⅱ) 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 하나 이상의 곤충병원성 진균 또는 이의 배양액과 결합시키는 단계, 또는
    ⅲ) 하나 이상의 지질 또는 지질 분획을, 진균으로부터 분리하는 단계, 또는
    ⅳ) 본 발명의 하나 이상의 지질을 적어도 부분적으로 정제 또는 분리하는 단계, 또는
    v) 상기 (i) 내지 (iv) 중 둘 이상의 것들의 조합.
28. 제 27 항에 있어서,
    상기 지질 또는 지질 분획이 제 2 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 항에서 청구한 지질 또는 지질 분획이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로써 이루어지는 방법.
29. 하기의 단계를 포함하는, 살충성 지질 또는 지질 분획의 제조 방법:
    자낭균 문의 하나 이상의 진균들의 배양액에 대한 유기 용매 추출액을 제공하는 단계;
    하나 이상의 비-산성 지질을, 하나 이상의 산성 지질로부터 적어도 부분적으로 분리하는 단계; 및
    하나 이상의 비-산성 지질 또는 지질 분획을 회수하는 단계.
30. 하기의 단계를 포함하는, 살충성 지질 또는 지질 분획의 제조 방법:
    자낭균 문의 하나 이상의 진균들의 배양액에 대한 유기 용매 추출액을 제공하는 단계;
    하나 이상의 극성 지질을, 하나 이상의 비-극성 지질로부터 적어도 부분적으로 분리하는 단계; 및
    하나 이상의 극성 지질 또는 극성 지질 분획을 회수하는 단계.
31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    상기 유기 용매가 단쇄 알킬 알콜, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소-프로판올, 또는 부탄올을 포함하는 알칸올이거나, 또는 클로로포름인 방법.
32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    회수한 지질 또는 지질 분획이, 제 2 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 항에서 청구한 지질 또는 지질 분획이거나, 이를 포함하거나, 또는 이로써 이루어지는 방법.
33. 하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제에 대한, 곤충의 내성을 전부 또는 부분적으로 역행시키는 방법에 있어서,
    곤충을, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 항에 기재된 지질 또는 지질 분획, 또는 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서,
    곤충을, 지질 또는 지질 분획, 및 이와 함께 하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
35. 제 33 항에 있어서,
    투여된 하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제가, 곤충이 내성을 갖거나 또는 내성을 가질 것으로 예측되거나, 또는 내성을 갖게 된 것과 동일한 것인 방법.
36. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 항에 기재된 지질 또는 지질 분획, 또는 제 12 항 내지 제 24 항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물과 접한, 하나 이상의 곤충에 대한 방제 방법에 있어서,
    하나 이상의 곤충을, 상기 하나 이상의 곤충을 방제하는데 효과적인 양의 살충제 또는 곤충병원성 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
37. 제 36 항에 있어서,
    하나 이상의 살충제 또는 하나 이상의 곤충병원성 제제가, 지질 또는 지질 분획의 투여 전, 투여와 함께, 또는 투여 후에 투여되는 방법.
38. 제 33 항 내지 제 37 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 조성물이 곤충병원성 진균, 및 이와 함께 선택적으로 다른 살충제 또는 곤충병원성 제제를 포함하는 방법.

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