KR20140006873A

KR20140006873A - 눈 길이 관련 질환을 진단 및 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20140006873A
Application number: KR20137021311A
Authority: KR
Inventors: 제이 네이츠; 모린 네이츠
Original assignee: 유니버시티 오브 워싱턴 스로우 잇츠 센터 포 커머셜라이제이션
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2014-01-16
Also published as: JP6545738B2; CA2819250C; US8951729B2; BR112013017745B1; MX355606B; CN103314116A; US20170292160A1; CA2819250A1; KR102011947B1; WO2012097213A3; CO6731117A2; AU2012205439A1; AR084866A1; CN103314116B; AU2012205439B2; EP2663653B1; EP2663653A2; TW201241429A; RU2013137831A; US10487361B2

Abstract

본 발명은 근시를 포함하는, 눈 길이 관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 근시를 포함하는, 눈 길이 관련 질환을 치료 및 제한하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 근시 및 보른홀름 눈 질환(Bornholm Eye Disease)을 포함하는, 눈 길이 관련 질환과 관련된 특정 해플로타입을 제공한다.

Description

눈 길이 관련 질환을 진단 및 치료하는 방법{METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING EYE-LENGTH RELATED DISORDERS}

상호 참조

본 출원은 2011년 1월 14일에 출원한 미국 가특허 출원번호 61/432984의 우선권을 주장하며, 이의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.

미국 정부 지원에 대한 진술

본 작업은 국립 보건원 보조금 R01EY09620, P30EY01931, 및 P30EY01730에 의해 지원되었다. 이에 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

기술분야

본 발명은 근시를 포함하는, 눈 길이 관련 질환을 검출 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 눈 길이 관련 질환과 관련된 특정 해플로타입(haplotype)에 관한 것이다.

배경기술

정시화(emmetropization)라고 칭해지는 과정에서, 눈 길이의 성장은 눈의 광학을 맞추고 각막/수정체의 곡률 및 능력의 유전적 다양성을 보상하고자 하는 시각적 경험에 의하여 조절된다. 고도로 예리한 명소시(photopic vision) 및, 즉, 정시화를 유도하는 시그널은 장파장(L) 및 중파장(M) 민감성 추상체 광수용기에서 발견되는 광색소 내 빛 흡수에 의해 개시된다. 흐림 대 선명하게 초점된 상을 특징짓는 망막상에서 빛과 어둠의 패턴 변화는 조직화된 평면(중립) 광학(coordinated piano (neutral) optics)을 위한 정확한 길이에 도달하였을 때 눈 성장을 정지하는 생물학적 과정에 의하여 관찰된다. 그러나, 근시 개체에 있어, 발달하는 동안 전체 눈 크기에 대한 눈의 상대적인 축 길이는 계속적으로 늘어나, 먼 곳에 있는 물체의 근접 최적 초점 조정(near-optimal focusing)을 제공하는 길이를 지나, 점점 현저한 근시에 이르게 한다.

근시 발생의 비율은 세계 여러 지역에서 놀라운 속도로 증가하고 있다. 최근까지, 비록 유전적 요인이 의심스러웠지만, 어린 시절의 과도한 독서가 근시의 발생과 연관된 인식 가능한 유일한 환경적 또는 행동적 요인으로 믿어졌다. 독서의 제한이 현재 유일하게 현실적인 어린이의 과도한 눈 길이 신장을 예방하는 기법이며, 안경 및 콘택트 렌즈를 포함하는, 수정 렌즈가 근시를 포함하는 눈 길이 관련 질환을 개선하는 일차적인 수단에 해당한다. 이러한 방법들이 눈 길이 관련 질환과 관련된 굴절 이상을 시각적으로 수정할 수는 있어도, 이들은 근본적인 원인인 눈 길이의 과도한 성장을 해결(address)하지 않는다.

따라서, 아직 눈 길이 관련 질환에 대한 감수성을 검출하는 방법, 및 이러한 개체의 과도한 눈 길이 신장을 예방하는 치료의 필요성이 있다.

발명의 요약

본 발명은 환자의 근시 가능성을 측정하는 방법으로서: 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입(haplotype)을 측정하기 위하여 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사함; 및 상기 해플로타입을 예상 구형 등가물 굴절(predicted spherical equivalent refraction)과 연관시킴을 포함하는 환자의 근시 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 다른 측면에 있어서, 상기 방법은: 환자의 눈의 L:M 추상체 비율을 측정함; 및 L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시킴의 단계를 추가로 포함하는 방법이다.

본 발명은 또한 환자의 눈 길이 관련 질환 감수성을 진단하는 방법으로서: 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사함; 및 상기 해플로타입을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시킴을 포함하며; 상기 예상 구형 등가물 굴절 이상(디옵터로 측정됨)이 음성 능력을 가지는 경우 환자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인, 방법을 제공한다. 한 측면에 있어서, 상기 방법은: 환자의 눈의 L:M 추상체 비율을 측정함; 및 L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시킴의 단계를 추가로 포함하는 방법이다.

본 발명은 나아가 환자의 눈 길이 관련 질환 감수성을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에 환자의 L 옵신 유전자 또는 M 옵신 유전자에 의하여 암호화된 특정 아미노산 조합에 대해 검사하는 것을 포함하며, 표 1에 제시된 아미노산 조합 중 하나가 존재하는 경우 환자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인, 환자의 눈 길이 관련 질환 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 눈 길이 관련 질환을 치료하는 방법으로서: 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사함; 환자의 눈의 L:M 추상체 비율을 측정함; 상기 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시킴; 환자의 예상 구형 등가물 굴절 이상이 음성 능력을 가지는 경우 파장 의존성 필터(wavelength-dependent filter)를 포함하는 치료 장치를 환자에게 제공함을 포함하는 방법을 제공한다.

한 측면에 있어서, 상기 파장 의존성 필터에 의하여 여과된 파장은 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율에 기초하여 선택된다.

다른 측면에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 치료 장치는 흐림 유도 렌즈(blur-inducing lenses)를 포함하는 안경 한 쌍이다. 특정 측면에 있어서, 상기 흐림 유도 렌즈는 하나 이상의: 상기 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면의 작은 볼록 또는 오목; 렌즈 물질과 다른 물질의 렌즈 내 이물질(inclusion); 렌즈의 고수준의 수차(aberration) 결합; 한쪽 또는 양쪽 렌즈에 이웃한 추상체 광수용기의 활성 간의 증가된 상관관계 제공; 및 분산성(diffusive) 또는 회절성 흐림을 야기하는 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면에 적용된 코팅 또는 필름에 의하여 흐림을 유도한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 치료 장치는 흐림 유도 콘택트 렌즈를 포함한다. 특정 측면에 있어서, 상기 흐림 유도 콘택트 렌즈는 하나 이상의: 렌즈 물질과 다른 물질의 렌즈 내 이물질; 렌즈의 고수준의 수차 결합; 및 분산, 회절 또는 빛 산란으로 흐림을 야기하는 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면에 적용된 코팅 또는 필름에 의하여 흐림을 유도한다.

특정 측면에 있어서, 본 발명의 방법에서 동정되는 상기 L:M 옵신 유전자 해플로타입은 표 1에 제시된 해플로타입 1 내지 13 중 하나이다.

본 발명은 또한 표 1에 제시된 해플로타입 1 내지 13 중 적어도 하나를 동정할 수 있는 일련의 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 환자의 눈 길이 관련 질환 감수성을 측정하는 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명은 나아가 환자가 눈 길이 관련 질환에 걸리기 쉬운지 여부를 측정하는 키트를 제공한다. 한 측면에 있어서, 본 발명의 키트는: 표 1에 제시된 해플로타입 1 내지 13 중 적어도 하나를 동정할 수 있는 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드; 및 사용을 위한 설명을 포함한다. 다른 측면에 있어서, 본 발명의 키트는 표 1에 제시된 해플로타입 1 내지 13 중 적어도 하나를 검출하기 위한 검정법을 포함한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 피험자(subject)의 눈에 들어가기 전에 디스플레이 화면으로부터 나오는 적색광을 우선적으로 차단하여, 상기 피험자의 눈의 굴절 이상(refractive error) 도입을 제한할 수 있는, 파장 의존성 필터를 포함하는 치료 광학 장치를 착용한 피험자를 포함하는, 디스플레이 화면에 대한 노출로 야기되는 피험자의 눈의 굴절 이상 도입을 제한하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 피험자의 눈에 들어가기 전에 디스플레이 화면으로부터 나오는 적색광을 우선적으로 차단하여, 상기 피험자의 눈 길이 관련 질환의 진행을 제한할 수 있는, 파장 의존성 필터를 포함하는 치료 광학 장치를 착용한 피험자를 포함하는, 피험자의 눈 길이 관련 질환의 진행을 제한하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 눈 길이 관련 질환은 근시를 포함한다.

본 발명의 구체적인 바람직한 구체예는 이하의 특정 바람직한 구체예의 보다 상세한 설명 및 청구항에 의하여 분명해질 것이다.

도면의 간단한 설명
도 1. 정상 대조군(A)과 비교한 LIAVA 변종(B, C, D)을 가지는 참가자의 추상체 모자이크의 평균 적응 광학 망막상(Averaged adaptive optics retinal images). 정상 추상체와 비교하여 LIAVA 변종이 발현되는 B, C, 및 D 추상체에 나타나는 피험자들은 낮은 반사율(reflectance)을 가졌으며 이는 모자이크에서 어두운 영역으로 나타난다. LIAVA 변종을 발현하는 추상체의 비율의 큰 가변성이 있었다. B, C, 및 D는 축 길이(E) 및 굴절 이상과도 연관되는 낮은, 중간 그리고 높은 비율의 근시 생성 변종을 발현하는 추상체를 가졌다.
도 2. 서로 다른 인종 집단의 축 길이 및 추상체 비율 간의 관련성. 인종 집단에 걸쳐 L:M 추상체 비율 및 축 길이(및 근시 발생 정도) 간에 높은 양성 상관관계(positive correlation)가 있었다.
도 3. (A) 근시 가능성이 증가하는 순서로 배열된, 159 남성의 13 개의 서로 다른 L/M 광색소 해플로타입 근시 가능성. 각각의 해플로타입을 가지는 개체의 수는 오른쪽에 주어진다. 해플로타입 표시는 단일 글자 아미노산 코드를 사용한다: M = 메티오닌, I = 이소류신; S = 세린, V = 발린, A = 알라닌, 및 L = 류신. 평균 SER는 각각의 해플로타입에 대하여 피험자의 가장 근시인 절반에 대하여, ±1 SEM 계산된 평균 구형 등가물 굴절이다. (B) (A)에 기재된 바에 대응하는 해플로타입을 가지는 11 피험자에 대한 예상 대 관측 구형 등가물 굴절(SER). L:M 추상체 비율은 각각의 피험자에 대하여 추산되었으며 L인 L 더하기 M 추상체의 백분율로 나타내었다.
도 4. (A) 1일 2시간 적색광에 대한 노출로 야기되는 근시 시프트(Myopic shift). 실험 과정의 개시 전에 각각의 피험자에 대하여 축 길이가 측정되었다. 그 다음에, 각각의 피험자는 L 추상체가 M 추상체에 대하여 보다 더 활성화될 수 있도록 오른쪽 렌즈가 착색되지 않고 왼쪽 렌즈가 착색된 고글을 착용하고 흑백 비디오 게임을 1일 2시간 동안 수행하였다. (B) 실험군 렌즈를 착용한 20 개 눈에 대하여 그리고 (C) 각각의 실험군의 눈에 대한 대조군으로 역할한 20 사람의 눈에 대하여 시간에 대한 함수로 정상화된 축 길이 측정. 에러 바가 그어진 검정선은 모든 눈의 평균(에러 바 ± 2 SEM)을 나타낸다. 실험군 렌즈는 근시 어린이의 눈 길이 신장 속도를 현저하게 감소시켰다. (D) 왼쪽으로는 실험군 렌즈를 착용한 눈, 오른쪽으로는 대조군 렌즈를 착용한 눈의 성장 속도이다.

발명의 상세한 설명

본원에 나타낸 상세한 설명은 실시예의 방법으로 나타냈으며, 본 발명의 바람직한 구체예를 예시적으로 기술할 목적일 뿐이고, 본 발명의 다양한 구체예의 원리 및 개념적 면의 설명을 쉽게 이해하고 가장 유용할 것으로 여겨지는 것을 제공할 목적으로 제시하였다. 이러한 점에서, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것보다 더 구체적으로 본 발명의 구조적인 상세한 설명을 나타낼 시도를 하지 않았으며, 본 발명의 몇몇 형태가 실시로 구체화될 수 있는 방법이 숙련자에게 명백하도록 하는 도면 및/또는 실시예와 함께 설명하였다.

하기 실시예에서 확실하고 명백하게 변형되거나 의미의 적용이 임의로 해석을 무의미하게 하거나 본질적으로 무의미하게 하는 경우가 아닌 한, 다음 정의 및 설명이 앞으로 전개될 임의의 해석에 효력을 발휘하는 것을 의미하며 이러한 것이 의도된다. 용어의 해석이 그것을 무의미하게 하거나 본질적으로 무의미하게 하는 경우, 정의는 Webster's Dictionary, 3rd Edition 또는 Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)와 같이 당해기술분야의 숙련된 기술자에게 공지된 사전으로부터 취해질 것이다.

본원에 사용되는 용어 "단수"는 본원에서 달리 특정되지 않으면 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"의 의미를 갖는다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 이상, 본원에 사용되는 단수형 용어는 복수를 포함하며 복수형 용어는 단수를 포함하는 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 눈 길이 질환을 위한 예방 치료의 이익을 측정하고 눈 길이 관련 질환에 대한 민감성을 가지는 것으로 확인되는 환자에 대한 예방 광학의 특성의 적절한 처방을 결정하는데에 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 본원에 논의된 바와 같이, 이러한 예방 광학은 눈 길이 성장을 예방할 수 있는 스펙트럼의 특성 및/또는 분광 특성을 포함하며, 이는 억제되지 않는 경우 눈 길이 관련 질환으로 이어질 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 환자의 눈 길이 관련 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서: 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사하고, 상기 해플로타입을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시킴을 포함하며; 상기 예상 구형 등가물 굴절이 음성 디옵터(negative diopter)인 경우 환자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인, 방법을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "연관시킴"은 본원에 나타나고 논의된 바와 같이 환자의 눈 길이 관련 질환에 대한 감수성을 측정하기 위하여 환자의 추상체 비율 및 옵신 해플로타입에 대한 정보의 조합을 사용하는 단계를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 구절 "눈 길이 관련 질환(eye-length related disorder)"은 근시를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에서, L:M 옵신 유전자 해플로타입은 환자의 Xq28 옵신 유전자 자리(locus) 해플로타입을 측정하기 위하여 환자의 DNA에서 뉴클레오티드 서열을 동정하여 측정된다. 상기 해플로타입은 OPN1LW 및 OPN1MW 유전자의 엑손 2, 3, 및 4의 뉴클레오티드 서열을 동정하여 측정될 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 해플로타입은 OPN1LW 및 OPN1MW 유전자의 코돈 65, 111, 116, 153, 171, 178, 180, 230, 233, 및 236에 의하여 암호화된 아미노산에 의하여 생성된다. 특정 구체예에서, 상기 해플로타입은 엑손 3의 코돈 153, 171, 178, 및 180 및 엑손 4의 코돈 236에 의하여 암호화된 아미노산에 의하여 측정된다. 바람직한 구체예에서, L:M 옵신 유전자 해플로타입은 표 1에 나타난 13 해플로타입 중 하나이며, 이는 본원에서 최초로 근시와 연관된 것으로 나타나는 것이다(실시예 및 도 3A 참조). 따라서, 환자가 표 1에 나타난 13 해플로타입 중 하나를 가지면, 환자는 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인 것으로 진단된다. 특히, 표 1에 나타난 해플로타입 중 하나를 가지는 환자는 근시에 걸리기 쉬운 것으로 진단된다. 일 구체예에서, L-옵신 유전자와 관련된 표 1에 나타난 변종 아미노산 조합 중 하나가 환자에서 확인되면 환자는 근시에 걸리기 쉬운 것으로 진단된다. 다른 구체예에서, M-옵신 유전자와 관련된 표 1에 나타난 변종 아미노산 조합 중 하나가 환자에서 확인되면 환자는 근시에 걸리기 쉬운 것으로 진단된다.

표 1

근시 해플로타입

다른 구체예에서, 본 발명은 눈 길이 질환에 대한 환자의 감수성을 진단하는 방법으로서: 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사하고, 환자의 눈의 L:M 추상체 비율을 측정하며, L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시킴을 포함하고, 상기 예상 구형 등가물 굴절 이상(디옵터로 측정됨)이 음성 능력을 가지는 경우 환자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인, 방법을 제공한다.

상기 L:M 추상체 비율은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 적응 광학 망막상(adaptive optics retinal imaging)은 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있으며, 또는 망막전위도(electroretinogram, ERG)(예컨대 플리커 측광 ERG(flicker photometric ERG)) 및 개별화된 추상체 스펙트럼(individualized cone spectra)이 사용될 수 있다. 상기 L:M 추상체 비율 측정은 Neitz and Neitz, J. Vis. 2:531-42, 2002에서 기술된 바와 같이 유전학 또한 수반할 수 있다. L:M 추상체 비율 측정에 대한 다른 비제한적인 예시는 Kuchenbecker et ah, Vis. Neurosci. 25(3):301-6, 2008에 기술된 바와 같이 와이드 필드 컬러 다초점 ERG(wide field color multifocal ERG)를 포함한다. L:M 추상체 비율 측정에 대한 다른 비제한적인 예시는 Gunther and Dobkins Vision Research 42: 1367-1378, 2002에 기술된 바와 같이 정신물리학적 이색 플리커 측광(psychophysical heterochromatic flicker photometry)을 사용하여 최소의 플리커를 가지도록 감지된 적색 대 녹색광의 비율 측정을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명은 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득된 생물학적 샘플의 검사를 포함하는 근시 가능성을 측정하는 방법을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근시 가능성"은 L:M 옵신 해플로타입과 관련된 예상 구형 등가물 굴절을 의미하며, 이는 환자가 가지거나 가질 것 같은 근시의 예상 정도와 연관된다. 특히, 상기 근시 가능성은 예를 들어, 도 3A에 나타난 바와 같은, 환자의 특정한 L:M 옵신 유전자 해플로타입에 기초하여 예상된 특정 구형 등가물 굴절을 의미한다.

특정 구체예에서, 근시 가능성은 환자의 L:M 추상체 비율을 측정하고, 상기 비율을 특정 L:M 옵신 유전자 해플로타입에 대해 예상된 구형 등가물 굴절과 연관시킴에 의하여 보다 구체적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서 논의된 바와 같이, 특정 L:M 옵신 해플로타입, 예컨대 표 1에 나타난 해플로타입을 가지는 환자에 대하여 상기 L:M 추상체 비율이 측정될 수 있다. 상기 L:M 추상체 비율은 측정되며, 계산은 보다 특정한 예상된 근시 가능성에 도달하기 위하여 이루어진다. 예를 들어, 일 개인이 해플로타입 8(도 3A)를 가진다면, 근시 가능성은 -4.5 디옵터이다. 그 개인이 1:1의 추상체 비율을 가진다면 그들은 전체(full) -4.5 디옵터의 굴절 이상을 가지는 것으로 예상될 것이다. 그러나, 그가 거의 100 퍼센트 L 추상체를 가졌다면 그는 거의 정시안(emmetropic)인 것으로 예상될 것이다. 75% L 추상체는 1:1 추상체 비율(50%L) 및 100 % L의 중간 지점에 떨어져서 해플로타입 8 및 75% L 추상체를 갖는 일 개인은 50%의 SER(또는 -4.5/2 = -2.25 디옵터)를 가지는 것으로 예상될 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 구절 "눈 길이 관련 질환에 대한 감수성"은 눈 길이 관련 질환, 예컨대 근시가, 특정 L:M 옵신 유전자 해플로타입이 존재할 때 생길 높은 가능성을 의미한다. 일 구체예에서, 근시 가능성을 높이는 순서로 나열된 것인, 표 1에 나타난 해플로타입 중 하나가 존재하는 경우, 환자는 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인 것으로 여겨진다.

본원에 기술된 바와 같이 눈 길이 관련 질환에 걸리기 쉽고/쉽거나 음성 디옵터와 관련된 근시 가능성을 가지는 환자를 확인한 후, 눈 케어 공급자(eye care provider)가 치료 프로토콜을 처방하고/하거나 환자의 근시 가능성을 감소시키거나 치료하기 위한 조치로 특정 태도를 제안할 수 있다. 예를 들어, 환자는 (본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어)치료 장치로 치료되거나 약리성 개입(pharmacological intervention)이 주어질 수 있다. 이러한 치료에 추가로 또는 대신에, 환자는 (환자의 특정 L:M 변종에 따라)적색광 또는 녹색광에 대한 노출을 제한하도록 어린 나이에 독서를 제한하고 야외 활동을 하는데 더 많은 시간을 소요하도록 당부받을 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 샘플"은 혈액, 타액, 구강 면봉으로부터 채취한(buccal swabbing) 세포, 피부의 생체검사(biopsy), 양수, 다양한 기타 조직 등을 포함하나, 제한되지 않는다. 진단 분석에 사용하기 위하여 생물학적 샘플로부터 핵산을 정제 또는 부분 정제하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 상기 핵산은, 예를 들어, 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA일 수 있다. 게놈 DNA는 예를 들어, 말초 혈액 백혈구로부터 QIAamp DNA Blood Maxi Kits (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 분리될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 환자의 보른홀름 눈 질환(Bornholm Eye Disease, BED)을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하고 환자의 L 및 M 옵신 유전자의 뉴클레오티드 서열을 동정하는 단계를 포함하며, 상기 환자가 보통의 옵신 유전자 및 변종 옵신 유전자를 가지는 경우 환자가 BED를 가지는 것으로 진단되는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 변종 옵신 유전자는 아미노산 위치 153의 류신(L153), 위치 171의 발린(V171), 위치 174의 알라닌(A174), 위치 178의 발린(V178), 및 위치 180의 알라닌(A180)("LVAVA") 또는 아미노산 위치 153의 류신(L153), 위치 171의 이소류신(I171), 위치 174의 알라닌(A174), 위치 178의 발린(V178), 및 위치 180의 알라닌(A180)("LIAVA")을 각각 L 또는 M 옵신 유전자에 포함한다. 다른 구체예에서, 두번째 유전자는 아미노산 위치 153, 171, 174, 178, 및 180 ("MVVVA")에서 메티오닌, 발린, 발린, 발린, 및 알라닌의 조합을 가진다.

본 발명의 진단 방법은 하나의 비제한적인 구체예에서, 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위한 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 포함하는 표준 분자 생물학 방법을 수반한다. 현재 L 및 M 옵신 유전자의 DNA 서열을 검사하도록 허용하는 사용가능한 다양한 분자 생물학적 방법이 존재한다. 예를 들어, 유전자 단편은 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 사용하여 증폭될 수 있다. 앞서 기술된 바와 같이 상기 유전자들은 별도로 또는 선택적으로 증폭될 수 있다(Neitz et ah, Vision Research 35: 2395-2407, 1995).

증폭된 유전자 단편은 바람직하게는 DNA 서열에 대한 정보를 제공하는 하나 이상의 하기의 과정을 받을 수 있다:

1) 앞서 기술된 바와 같은 PCR 산물의 직접 DNA 서열(J. Neitz, M. Neitz and Grishok, supra, 1995).

2) 제한 소화 분석(Restriction digestion analysis) (J. Neitz, M. Neitz and Grishok, supra, 1995에서 앞서 기술함).

3) 단일 가닥 구조 다형성(Single strand conformation polymorphism) 또는 기타 유사한 과정. 증폭된 DNA 단편은 형광 또는 방사성 말단 표지되고, 단일 가닥으로 변성되며, 상기 가닥들은 전기영동으로 분리된다. 전계에서의 상기 가닥의 이동성에 기초하여, DNA 서열에 대한 정보가 추론될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 눈 길이 관련 질환을 치료하는 방법으로서: 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 검사; 환자 눈의 L:M 추상체 비율을 측정; 상기 해플로타입과 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시킴; 환자의 예상 구형 등가물 굴절이 음성 디옵터인 경우 파장 의존성 필터(wavelength-dependent filter)를 포함하는 치료 장치를 환자에게 제공을 포함하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, L:M 옵신 유전자 해플로타입은 표 1에 제시된 해플로타입 1 내지 13 중 하나이다.

국제 특허 출원 공개 WO 2010/075319 호에 언급된 바와 같이, 본원의 내용이 그 전체로서 본원에 참조로서 포함되며, 옵신 유전자의 유전적 변이가 옵신 광수용체 단백질의 흡수 특성에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 파장 의존성 필터는 변종 옵신 광수용체 단백질의 유효 흡수 스펙트럼(effective absorbance spectrum)을 조정하기 위해서 눈으로 진입하기 전에 빛을 여과하려는 것이다. 변종 M-옵신 유전자로 인하여, 보통의 M 광수용체 단백질에 비하여 적은 빛을 흡수하는 결함이 있는 M 광수용체 단백질을 가지는 환자에서, 파장 의존성 필터는 적색광을 우선적으로 차단할 수 있다. 반면, 변종 M-옵신 유전자로 인하여, 보통의 L 광수용체 단백질에 비하여 적은 빛을 흡수하는 결함이 있는 L 광수용체 단백질을 가지는 환자에서, 파장 의존성 필터는 녹색광을 우선적으로 차단할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 특정 파장 의존성 필터는 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입에 기초하여 선택될 수 있으며, 이는 환자의 눈에 존재하는 M 광수용체에 관하여 L 광수용체의 숫자를 확인하는, 특정 광수용체 변종 및/또는 환자의 L:M 추상체 비율을 확인한다. 특정 L:M 옵신 유전자 해플로타입 및/또는 L:M 비율에 기초하여, 필터는 매우 구체적인 파장을 차단 및/또는 전달하도록 제작되어 결함이 있는 광수용체 단백질의 상대적인 흡수 특성을 회복시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입 및/또는 L:M 추상체 비율에 기초하여 특정한 환자를 위하여 치료 장치를 커스터마이징하는 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 환자가 보다 활성인 적색(M) 추상체와 관련된 옵신 변종을 가지는 경우 필터는 적색광을 차단하도록 제작될 수 있으며; 환자가 보다 활성인 녹색(L) 추상체와 관련된 옵신 변종을 가지는 경우 필터는 녹색광을 차단하도록 제작될 수 있다.

특정 구체예에서, 치료 장치는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 2010/075319 호에서 기술된 바와 같은, 흐림 유도 렌즈를 포함한다. 일 구체예에서, 장치는 흐림 유도 렌즈를 포함하는 한 쌍의 안경(spectacle)이며, 흐림은 망막 내에 이웃한 추상체 광수용체 사이의 상대적인 활성을 감소시키기 위하여 설계된 것이며, 이는 본원에서 눈이 비정상적인 길이로 성장하는 것을 촉진하는 신호를 야기한다. 상기 흐림 유도 렌즈는 흐림을 유도하기 위하여, 예를 들어, 하나 이상의: 상기 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면의 작은 볼록(bumps) 또는 오목(depressions); 렌즈 물질과 다른 물질의 렌즈 내 이물질; 렌즈의 고수준의 수차 결합; 및 광산란(light scatter), 분산(diffusion) 또는 회절(diffraction)로 흐림을 야기하는 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면에 적용된 코팅 또는 필름에 의하여 만들어질 수 있다.

또 다른 구체예에서, 치료 장치는 흐림 유도 렌즈를 포함한다. 흐림 유도 콘택트 렌즈는 흐림을 유도하기 위하여, 예를 들어, 하나 이상의: 렌즈 물질과 다른 물질의 렌즈 내 이물질; 렌즈의 고수준의 수차 결합; 한쪽 또는 양쪽 렌즈에 렌즈의 중앙에서부터 렌즈의 바닥까지 점진적 음성 보정(progressive negative corrections)의 제공; 및 광산란, 분산 또는 회절로 흐림을 야기하는 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면에 적용된 코팅 또는 필름에 의하여 만들어질 수 있다.

추가적인 실시예에서, 본 발명은 피험자의 눈에 들어가기 전에 디스플레이 화면으로부터 나오는 적색광을 우선적으로 차단하여 상기 피험자의 눈에 굴절 이상(refractive error) 도입을 제한할 수 있는, 파장 의존성 필터를 포함하는 치료 광학 장치를 착용한 피험자를 포함하는, 디스플레이 화면에 대한 노출로 야기되는 피험자의 눈에 굴절 이상의 도입을 제한하는 방법을 제공한다.

더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 피험자의 눈에 들어가기 전에 디스플레이 화면으로부터 나오는 적색광을 우선적으로 차단하여, 상기 피험자의 눈 길이 관련 질환의 진행을 제한할 수 있는, 파장 의존성 필터를 포함하는 치료 광학 장치를 착용한 피험자를 포함하는, 피험자의 눈 길이 관련 질환의 진행(development)을 제한하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 눈 길이 관련 질환은 근시를 포함한다.

이러한 방법들은 화면 디스플레이로부터 과도한 적색광의 노출로 야기되는 눈에 가해지는 손상을 제한하기 위하여 사용될 수 있다. 다양한 비제한적인 구체예에서, 화면 디스플레이는 컴퓨터 모니터, 타블렛 모니터, 텔리비전 화면, 휴대용 기기(handheld device) 화면, 비디오 게임 화면, 두부 장착형(head-mounted) 디스플레이 화면, 및 영화관 화면일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "제한하다"는 하나 이상의 (a) 피험자의 눈에 굴절 이상의 도입의 발생 정도(incidence)를 감소시키는 것 및/또는 치료되는 피험자에서 진행되는 눈 길이 관련 질환의 발생 정도를 감소시키는 것; (b) 피험자의 눈에서 나중에 진행된 굴절 이상의 심각성을 감소시키는 것 및/또는 나중에 진행된 피험자의 눈 길이 관련 질환의 심각성을 감소시키는 것; 및/또는 (c) 피험자의 눈의 굴절이상의 특이적 증상(symptoms characteristic) 및/또는 눈 길이 관련 질환의 진행을 제한 또는 예방하는 것을 의미한다.

이러한 각각의 추가적인 측면에서, 치료 광학 장치는 추가로 흐림 유도 렌즈를 포함할 수 있으며, 이는 WO 2010/075319 호에 개시된 것들 및 상기 기재된 바를 포함하나 이에 제한되지 아니한다. 일 구체예에서, 예를 들어, 이하의 실시예에 기술되는 바와 같이, 상기 흐림 유도 렌즈는 렌즈 표면에 적용된 홀로그래픽 산광기(holographic diffuser)를 포함한다. 상기 홀로그래픽 산광기는 예를 들어, 디스플레이로부터 입사 광선을 바람직한 각도 너머에 퍼뜨려 약한 흐림을 만들고 따라서 인접한 추상체 사이에 활성 차이를 감소시키기 위하여 사용될 수 있다. 임의의 이들 구체예 중에서, 치료 광학 장치는 안경(glasses/spectacles) 및 콘택트 렌즈를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 유형일 수 있다.

21 세 또는 그 미만의 연령인 어린이를 포함하는, 바람직하게는 3-21, 3-20, 3-19, 또는 3-18 세 사이의, 임의의 적합한 피험자는 이러한 측면으로 치료될 수 있다. 상기 구체예 중 임의의 것과 조합될 수 있는 다른 구체예에서, 피험자는 눈 길이 관련 질환, 예컨대 근시에 걸리기 쉽다. 본 구체예는 임의의 피험자를 언급된 임의의 앞선 개시에 따른 위험에 처한 치료하는 것을 포함할 수 있다. 일 특정 구체예에서, 피험자가 표 1에 제시된 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 가지는 경우 피험자는 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인 것이다.

일 구체예에서, 본 발명은 예를 들어, 눈 길이 관련 질환 진단에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 표 1에 정의된 바와 같은, L:M 옵신 유전자 해플로타입의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 일련의 해플로타입 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 키트는: 본원에 기재된 해플로타입과 관련된 엑손 3 및 4의 부분, 예컨대 표 1에 열거된 해플로타입 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13을 증폭시키기 위한 일련의 프라이머 짝; 본원에 기재된 해플로타입과 관련된 엑손 3 및 4의 부분을 혼성화(hybridize)할 수 있는 일련의 프로브; 및/또는 마이크로어레이, 예컨대 SNP 칩을 포함한다. 프라이머 및 프로브는 본원에 기재된 해플로타입과 관련된 엑손 3 및 4의 부분과 관련된 서열에 의거하여 당해 기술분야의 숙련된 기술자에 의해 손쉽게 그리고 용이하게 설계될 수 있다. 마이크로어레이도 또한 본원에 기재된 해플로타입과 관련된 엑손 3 및 4의 부분과 상응하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 용이하게 그리고 손쉽게 설계될 수 있다. 다르게는, 분석은 질량 분석에 뒤이어 특별히 설계된 PCR 프라이머를 사용하는 공지된 다형 영역(polymorphic site)의 유전자형(genotyping)을 허용하는 질량 분석 기구(예를 들어, MassArray™ 기구)를 사용하여 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 그 유전적 기반(genetic underpinning)이 잘 이해되는 자의 여기에 기술된 축 길이 질환과 같은 상태의 진단에 적합하다. MassArray™ 프라이머 신장법(primer extension process)은 단일 뉴클레오티드 수준에서 서열 차이를 검출한다. PCR의 첫째 회전은 게놈 DNA로부터 SNP를 둘러싼 짧은 길이의 DNA로 증폭한다. 이에 뒤이어 SNP에 직접 인접하여 어닐링하는 프라이머의 단일-염기 신장(single-base extensions)이 계속된다. 프라이머는 주형 서열(template sequence)에 의존하여 신장되며, 신장 산물(extension product) 간의 질량에서의 대립형질 특이적 차이를 야기한다. 이러한 질량 차이는 MALDI TOF 질량 분석을 사용한 SNP 대립형질 간의 분화(differentiation)를 허용한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본원의 실시예에서 기술된 바와 같은, 근시와 관련된 변종 녹색(L) 광색소 단백질(photopigment protein)을 포함하는 눈 길이 관련 질환의 마우스 모델을 제공한다. 본 발명은 변종 적색(M) 및 정상 또는 변종 녹색(L) 광색소 단백질을 발현하며, 변종 단백질은 근시와 관련된 아미노산 서열을 가지는 마우스 모델을 추가로 제공한다. 이러한 마우스는 기술된 바와 같이, 예를 들어, 본원에서 제공된 방법에 따라 만들어질 수 있다. 이러한 마우스는 상기 방법의 이형접합체(heterozygous) 마우스가 적색 및 녹색 광색소 단백질을 포함하도록, 본원에 기재된 방법을 사용하여 만들어졌다. 특정 구체예에서, 본 발명의 마우스 모델은 눈 길이 관련 질환 개입(intervention), 예컨대 약리적 또는 유전적 개입 검사에 사용될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 진단 장치가 환자의 L:M 추상체 비율 또는 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하도록 야기하기 위한 일련의 명령을 포함하는, 기계 판독가능한 저장 매체를 제공한다. 기타 구체예에서, 본 발명은 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인 것으로 확인된 환자에 대해 예방 광학의 특성의 적절한 처방을 결정하기 위하여 프로세서가 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 연관시키기 위한 자동화된 방법 단계를 실행하도록 야기하기 위한 명령을 포함하는 기계 판독가능한 저장 매체를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "컴퓨터 판독가능한 저장 매체"는 자기 디스크, 광디스크(optical disk), 유기 메모리(organic memory), 및 임의의 기타 CPU로 판독가능한 휘발성(예를 들어, 랜덤 액세스 메모리(Random Access Memory, "RAM")) 또는 비휘발성(예를 들어, 읽기 전용 메모리(Read-Only Memory, "ROM")) 대용량 저장 시스템을 포함한다. 컴퓨터 판독가능한 매체는 협력(cooperating) 또는 상호연결(interconnected) 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며, 프로세싱 시스템에 배타적으로 존재하거나 프로세싱 시스템에 장소하거나 떨어져 있는 복합적으로 상호연결된 프로세싱 시스템 중에 분포한다. 본원에 사용된 바와 같이, "진단 장치"는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 L:M 추상체 비율 측정 또는 L:M 옵신 유전자 해플로타입 측정을 수행하는 것이 가능한 장치를 의미하며, 마이크로어레이 판독기 또는 질량 분석기를 포함하나 이에 제한되지 아니한다.

본원에서 인용하는 참고문헌은, 이들이 본원에서 제시된 것들을 보완하는 예시적 절차적 또는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도까지, 인용에 의해 구체적으로 포함된다.

당해 기술분야에서 숙련된 자들은, 본원의 개시를 고려하여, 본원에 개시된 구체예의 명백한 변형이 본 발명의 본질 및 범위를 벗어남 없이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 본원에 개시된 모든 구체예는 본원의 개시를 고려하여 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 전범위는 명세서 및 이들의 균등한 구체예에 개시되어 있다. 명세서는 본 발명이 보호받을 권리가 있는 전 범위를 과도하게 좁히는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예

수행한 실험 및 달성한 결과를 포함하는, 이하의 실시예는 단지 예증의 목적으로 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 1

보른홀름 눈 질환(Bornholm Eye Disease)의 변종 OPNILW 및 OPNIMW 유전자

최초로 확인된 고도 근시 자리는 염색체 Xq28에 집중되어 있으며 MYP1로 표기되었다(M. Schwartz, M. Haim, D. Skarsholm, Clinical Genetics 38, 281 (1990년 10월)). 표현형은 또한 보름홀른 눈 질환(Bornholm Eye Diseasem, BED)으로 알려져 있었으며, 이는 근시, 난시 및 시신경 변화와 함께 X-연관 추상체 기능장애 증후군(X-linked cone dysfunction syndrome)에 해당한다(T. L. Young et al., Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004년 6월); U. Radhakrishna et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science supplement (abstract #3814) (2005); M. Michaelides et al, Ophthalmology 112, 1448 (2005)). X-연관 추상체 기능장애 증후군과 함께 BED의 표현형의 일부는 비정상 추상체 망막전도(abnormal cone electroretinogram, ERG)이다. OPNILW 및 OPNIMW 유전자는 Xq28에 있으며 추상체 ERG를 만드는 최초의 사건의 원인이 되는 추상체 광색소를 암호화한다.

L 및 M 추상체 옵신 유전자는 BED 표현형의 후보로 평가된다. Young et al.(T. L. Young et al., Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004년 6월))에 기술된 상기 두 관련없는 X-연관 근시/추상체 기능장애 패밀리는 오리지날 BED(M. Schwartz, M. Haim, D. Skarsholm, Clinical Genetics 38, 281 (1990년 10월)) 패밀리 내의 추상체 옵신 유전자 배열 내의 처음 두 위치 중 어느 한쪽의 OPNIMW 유전자의 부재 및 미네소타(Minnesota, MN) 패밀리인 경우 무결한(intact) OPNILW 유전자의 부재로 인한 색맹을 가진다. 인도에 거주하는 세번째 패밀리에서는, 발병한(affected) 남성(U. Radhakrishna et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science supplement (abstract #3814) (2005))은 정상의 색각을 가졌다. X-염색체 옵신 배열의 첫번째 유전자는 선택적으로 증폭되었으며 MN, BED1, 및 인도 패밀리에서 발병 및 미발병의 남성들로부터의 개별적인 엑손이 직접 시퀀싱되었다. 첫번째 유전자 하류의(downstream) 옵신 유전자 또한 선택적으로 증폭되었으며, 엑손이 직접 시퀀싱되었다. MN 패밀리에서 발병한 모든 남성에 대하여, 배열에서 첫번째 위치(5'-most) 옵신 유전자는 M 옵신을 엑손 3의 이형태성 코돈으로 명시되는 아미노산의 특이한 조합으로 암호화했다. 이 조합은 아미노산 위치 153의 류신(L153), 위치 171의 발린(V171), 174의 알라닌 (A174), 178의 발린(V178), 및 180의 알라닌(A180), 줄여서 "LVAVA"이다. 배열에서 두번째 유전자는 전형적으로는 시각적 이상이 없는 개체의 M 옵신에서 발견되는 이들 위치에서 아미노산의 조합("MVVVA")을 암호화했다.

두번째, Young et al.(T. L. Young et al., Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004년 6월))에서 보고된 관련없는 BED 패밀리(BED1) 및 인도 패밀리(U. Radhakrishna et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science supplement (abstract #3814) (2005))의 발병한 구성원들도 LVAVA 조합을 가지는 것으로 발견되었으나, 이는 L 옵신이었다. 양 후자의 패밀리 모두, 발병한 남성에서 하류의 유전자는 정상 시각을 가지는 개체에서 전형적인 변종을 암호화했다. BED 패밀리에서 발병하지 않은 남성은 LVAVA 변종을 가지지 않았다. 대조 실험으로, 심각한 시력 이상이 없는 남성의 261 OPN1MW 유전자 및 320 OPN1LW이 시퀀싱되었다. 어떠한 유전자도 LVAVA 조합을 명시하지 않았다.

다섯 추가적인 패밀리에서 발병한 남성(M. Michaelides et al., Ophthalmology 112, 1448 (2005); M. McClements, M. Neitz, A. Moore, D. M. Hunt, Invest Ophthalmol Vis Sci, ARVO E (2010)) 및 BED 표현형과 관련 없는 다른 하나의 개체에서 LVAVA 조합 또는 이와 유사하게 발린 대신 위치 171(I171)에서 이소류신이 존재하는 것인 조합 중 하나를 가지는 것으로 발견되었다. 이 조합은 "LIAVA"로 지정되었으며 광수용체가 성인에서 비기능적이게 되도록 함을 앞서 보였다(J. Carroll, M. Neitz, H. Hofer, J. Neitz, D. R. Williams, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 8461 (2004); M. Neitz et al., Visual Neuroscience 21, 205 (2004); M. A. Crognale et al., Visual Neuroscience 21, 197 (2004)). X-연관 추상체 기능장애 증후군을 가지는 것으로 보고된 일곱번째 패밀리에서 발병된 구성원들은, 옵신을 비기능적으로 만드는 것으로 알려진 변이인(M. Michaelides et al., Ophthalmology 112, 1448 (2005); J. Winderickx et al., Nature Genetics 1, 251 (1992); J. Nathans et al., Science 245, 831 (1989)), 정상적으로는 위치 203에서 발견되는 시스테인을 아르기닌(C203R)으로 L 및 M 옵신 모두에서 치환하는 변이를 가지는 것으로 발견되었다(M. Michaelides et al., Ophthalmology 112, 1448 (2005)).

타겟 유전자 치환에 의한 마우스에서의 BED 옵신 변이의 추상체 표현형

비록 일부 패밀리에서 발견되는 LIAVA 및 C203R 변이가 앞서 추상체 광수용체 기능장애를 야기하는 것으로 기록되었으나, 다수의 BED 패밀리에서 발견되는 LVAVA 아미노산 조합 및 이의 추상체 기능 및 생존능력에 대한 영향은 전혀 확인되지 아니하였다. 개체에서 유일하게 발현된 X-연관 추상체 색소 유전자에 암호화된 LVAVA를 가지는 개체는 이러한 해플로타입을 가지는 추상체가 비정상적으로 기능하며 결과적으로는 악화됨을 나타내는 것인 추상체 장애(cone dystrophy)를 가진다. LVAVA와 관련된 비정상 추상체 기능을 확인하기 위해서, 마우스 M 옵신 유전자의 2 내지 6 엑손이 LVAVA 조합을 명시하는 인간 L 옵신 유전자의 엑손 2-6을 함유하는 cDNA로 치환된 마우스 라인이 제작되었다. 정상 시각을 가지는 개체에서 흔히 발견되는, LIAIS 조합을 명시하는 것을 제외하면 X-염색체 옵신 유전자 치환의 구조와 동일한 대조군 마우스 라인도 또한 제작되었다. 마우스는 L 추상체 분리 자극제를 사용하는 ON-OFF ERG를 사용하여 검사되었다. BED 환자의 비정상 ERG 조사결과와 일치하게, 대조군 마우스와 비교하여 LVAVA 변이를 가지는 마우스의 ERG 진폭은 감소되었다(T. L. Young et al., Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004년 6월)). 광수용체 기능과 가장 관련된 구성요소인 ERG-a-파장(ERG-a-wave)은 대조군 마우스와 비교하여 LVAVA 마우스에서 진폭이 반으로 감소되었다.

추상체 비율 및 BED 표현형의 심각성(severity)

이들을 발현하는 추상체를 비기능적으로 만드는, LIAVA 또는 C203R 변이를 가지는 개체의 경우, 이들의 색각 결함을 설명하는 중파장 내지 장파장을 흡수하는 단일 추상체 유형이 남겨진다. LVAVA 변이 및 색각 결함을 가지는 개체의 경우, 추상체는 LVAVA 옵신 기능을 함유하나, 배열에서 최초 두개의 유전자는 동일한 옵신 유형, BED1 패밀리에서 L, MN 패밀리에서 M을 암호화한다. 이에 반해, 인도 패밀리에서, L 추상체는 비정상적으로 기능하는 LVAVA 광색소를 발현하나, 독립된 추상체 부분모집단(subpopulation)에서 정상 M 옵신이 발현되며 이 패밀리에서 BED 근시를 가지는 개체는 정상 색각을 가진다.

통상적으로, X-염색체 옵신 유전자 배열에서 최초 두개의 유전자만이 발현된다. 그러나, BED/X-연관 고도근시 환자는 추상체 광색소 기능장애를 야기하는 변이를 가지는 하나의 X-연관 옵신 유전자와 두번째 정상 유전자를 가진다. 배열의 각각의 최초 두개의 옵신 유전자는 상기 두개의 옵신 유전자가 무작위로 배치된 각자의 추상체의 서브모자이크(submosaic)에서 발현된다. BED/X-연관 고도근시와 관련되는 것으로 발견된 각각의 변이는 보다 약화시키는 시각 장애(LVAVA의 경우 추상체 기능장애)를 만들거나 그것이 개체의 망막에 발현된 유일한 L/M 옵신인 경우 성인에서 L 및 M 추상체 기능이 완전히 부재하도록(LIAVA 및 C203R의 경우 청색 추상체 단색증(monochromacy)) 한다. 보다 약화시키는 망막 표현형으로부터 고도근시 환자를 구하는 것으로 나타나는 것은 추상체의 서브모자이크에 발현된 정상 X-염색체 색소 유전자의 존재이다. 그러나, 산재하는 정상 및 변이 추상체는 고도근시의 원인인 것으로 나타난다.

정규 모집단(normal population)에는 L:M 추상체 비율에는 광범위한 다양성이 있다. LIAVA BED 피험자 중에서 추상체 비율의 유사한 변주가 발견되었다(도 1). 적응 광학(adaptive optics, AO) 상(image)으로부터 BED와 관련된 변이가, 필시 이웃하는 추상체 중의 활성의 대조로부터 분명한 초점의, 결이 고운(fine-grained) 상의 존재에 대한 믿을 만한 정보를 추출하는 눈의 능력을 손상시켜 따라서 정시화를 방해함으로서 추상체 모자이크를 방해하는 것이 명백하다. 세 개체의 이미징은 어떻게 축 길이 및 근시의 심각성과 추상체 모자이크 방해의 정도가 연관되는지 극적인 예증을 나타냈다(도 1E).

LVAVA BED 환자에서, 변종 추상체는 기능적이지만, 정상 및 변종 추상체 간 반응의 차이가, 상에서 분명한 초점의 명암 윤곽(dark-light edge)의 하나는 밝은 쪽 및 하나는 어두운 쪽인 두개의 정상 추상체로 만들어지는 경우보다 크다. 성년에서, LIAVA 조합의 옵신을 함유하는 추상체는 완전히 비기능적이다(J. Carroll, M. Neitz, H. Hofer, J. Neitz, D. R. Williams, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 8461 (2004); M. Neitz et al., Visual Neuroscience 21, 205 (2004; M. A. Crognale et al., Visual Neuroscience 21, 197 (2004); 그러나, 이들이 유년기에서 어느 정도까지 기능한다는 증거가 존재한다(L. Mizrahi-Meissonnier, S. Merin, E. Banin, D. Sharon, Investigative Ophthalmology and Visual Science (2010년 3월 20일, 2010)).

본원에서, 최초로, 근시(즉, 보른홀름 눈 질환) 형성의 완전한 병인학(etiology)이 밝혀졌다.

실시예 2

근시와 관련된 옵신 변이 및 해플로타입

정상 색각을 가지는 인간 중에서, 불균등한 상동 재조합(unequal homologous recombination)을 통해 유발된 L 및 M 옵신의 아미노산 서열의 굉장한 변주가 있다(J. Nathans, T. P. Piantanida, R. L. Eddy, T. B. Shows, D. S. Hogness, Science 232, 203 (1986); M. Drummond-Borg, S. S. Deeb, A. G. Motulsky, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 983 (1989); B. C. Verrelli, S. A. Tishkoff, American Journal of Human Genetics 75, 363 (2004)). 예를 들어, 상기 기술한 대조군 샘플에서, 320 피험자에서 34 개의 서로다른 L 옵신 서열, 및 261 피험자에서 17 개의 서로다른 M 옵신 서열이 있었다. M에 대한 L 추상체의 비율은 또한 인간에서 매우 다양했다. 예를 들어, 정상 색각의 코카시안 남성에서, L:M 추상체의 비율은 1.1:1 내지 19:1의 범위를 가지며, 평균은 2.7:1이었다(J. Carroll, M. Neitz, J. Neitz, Journal of Vision 2, 531 (2002); H. Hofer, J. Carroll, J. Neitz, M. Neitz, D. R. Williams, Journal of Neuroscience 25, 9669 (2005년 10월)).

편향된 L:M 추상체 비율이 근시에 대한 보호를 제공하는지 결정하기 위해, 세 인종 집단에 대한 평균 축 길이 대 평균 L:M 추상체 비율이 플로팅되었다. 코카서스인(n=86)(H. Hofer, J. Carroll, J. Neitz, M. Neitz, D. R. Williams, Journal of Neuroscience 25, 9669 (2005년 10월); J. Carroll, C. McMahon, M. Neitz, J. Neitz, Journal of the Optical Society of America A 17, 499 (2000년 3월) 및 아프리카인(n=28)(C. McMahon, J. Carroll, S. Awua, J. Neitz, M. Neitz, Journal of Vision 8, 1 (2008))으로 자기 보고(self-report)한 남성에 대하여 ERG 및 유전학으로부터 L:M 추상체 비율은 앞서 평가되었다. 5 명의 관련없는 일본인 남성(n=5)의 샘플에 대한 L:M 비율이 또한 측정되었다. 값은 48.13% L 내지 38% L 추상체의 범위, 및 평균 비율 0.8 L:1 M에 상응하는 평균 43.4% L 추상체를 나타냈다. 이러한 작은 샘플에서도 코카서스인 남성 대 일본인 남성에 대한 평균 L:M 추상체 비율에서 결과는 통계학적으로 유의한 차이(p<0.0001 ; Mann Whitney U)를 나타냈다(도 2). 백인, 아프리카계 미국인, 및 아시아인의 민족 범주에 있어 마지막 생일에 12세의 남성에 대한 평균 축 길이 데이터는 Twelker et al.(J. D. Twelker et al., Optometry and Vision Science 86, 918 (2009))에서 발췌했다. L:M 추상체 비율 성향은 축 길이(R² = 0.99)와 강하게 부정적으로(negatively) 관련되었으며, 이에 따라 근시에 걸리기 쉬웠다.

OPNILW 및 OPNIMW 유전자의 암호화 서열의 변주가 이후 근시를 야기하는 후보로서 평가되었다. 피험자는 코카서스인 남성으로 자기 보고한 21세 이상의 336 명이었으며, 이들 몸두는 정상 색각을 가지는 것으로 확인되었다. 축 길이 및 각막 곡률(corneal curvature)이 모양근 마비(cycloplegia) 없이 Zeiss IOL master를 사용하여 측정되었으며, 이들의 구형 등가물 굴절(SER)이 하기 방법에 기술된 등식을 사용하여 계산되었다. 각각의 피험자에 대하여 옵신 유전자 해플로타입은 OPNILW 및 OPNIMW 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 선택적으로 증폭하고 시퀀싱하여 측정되었다. 해플로타입은 OPNILW 및 OPNIMW 유전자의 65, 111, 116, 153, 171, 178, 180, 230, 233, 및 236 코돈에 의하여 암호화된 아미노산을 사용하여 만들어졌다. 303 피험자에 대하여 완전한 해플로타입이 수득되었다. 해플로타입은 엑손 2, 3 및 4에 의해 암호화된 변종 위치의 아미노산 조합으로 확인되었다. 50% 초과의, 또는 159 남성이, 그룹 당 3 피험자 이상으로 13 해플로타입 그룹에 속했다(도 3A 참조). 각각의 13 해플로타입 그룹에서 유전자 중 어느 하나의 코돈 65, 111, 116, 230, 또는 233 또는 OPNIMW 유전자의 코돈 236의 변화는 없었다.

각각의 해플로타입에서, 피험자의 추상체 비율이 다양할 것이며, 고도로 편향된 L:M 추상체 비율을 가지는 피험자는 해플로타입의 근시 생성 작용(myopia-genic action)으로부터 보호될 것으로 예상되었다. 각각의 해플로타입에 대한 평균 SER은 해플로타입의 피험자 중 가장 근시인 절반에 대한 평균 SER로서 계산되었다. 각각의 그룹으로부터 가장 근시인 50%이 이들 개체가 보다 거의 동등한 L:M 추상체 비율을 가질 것이며 보다 근시를 야기하는 각각의 해플로타입에 대한 가능성의 정확한 반영일 것이라는 전제에 기초하여, 고려되었다. 해플로타입은 근시를 야기하는 가장 작은 가능성을 가지는 해플로타입을 1번으로, 가장 큰 해플로타입을 13번으로 하여 근시 가능성의 순서로 열거되었으며, 근시 가능성은 -1 내지 -9 디옵터의 평균 SER로부터 증가한다(도 3A). 해플로타입 및 구형 등가물 굴절(SER) 간의 연관성을 검사하기 위하여 1차원 분산 분석(one-way analysis of variance)이 사용되었으며; 고도로 유의한 연관성이 있었다(p < 0.0001).

도 3A의 피험자 중 11 명의 L:M 추상체 비율이 플리커 측광 ERG(flicker photometric ERG) 및 개별화된 추상체 스펙트럼을 사용하여 추산되었다(J. Carroll, C. McMahon, M. Neitz, J. Neitz, Journal of the Optical Society of America A 17, 499 (2000년 3월)). 11 피험자 각각에 대하여, 예상 SER은 도 3A로부터 해플로타입 그룹에 대한 평균 SER을 구하고, 각각의 피험자에 대하여 L 추상체였던 L 더하기 M 추상체의 비율에 따라 비례하여 계산되었다. 예를 들어, 해플로타입 8(도 3A)을 가지는 일 개인은, -4.5 디옵터의 근시 가능성을 가진다. 그 개인이 1:1의 추상체 비율을 가진다면, 그는 전체 -4.5 디옵터의 굴절 이상을 가질 것으로 예상할 수 있다. 그러나, 그 개인이 거의 100 퍼센트의 L 추상체를 가진다면 그는 거의 정시안(emmetropic)인 것으로 예상될 것이다. 75%의 L 추상체는 1:1 추상체 비율(50% L) 및 100% L의 가운데에 속하므로 해플로타입 8 및 75%의 L 추상체를 가지는 일 개인은 50%의 SER(또는 -4.5/2 = -2.25 디옵터)을 가지는 것으로 예상될 것이다.

각각의 피험자에 대한 SER는 조합된 해플로타입 및 추상체 비율 데이터로 예상된 SER에 대하여 비교되었다(도 3B). 상관 계수(R²)는 0.86으로, 본 샘플에서 각각의 피험자의 Xq28 옵신 유전자 위치 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 알아내어 86% SER가 예상될 수 있음을 시사하였다. L:M 추상체 비율은 또한 X-연관 옵신 유전자 배열의 유전적 변화에 의하여 암호화된다.

실시예 3

비디오 게임의 적색 콘텐츠(Red Content)는 굴절 이상의 증가를 야기함

비디오 게임의 적색 함량이 근시에 기여할 가능성이 이하와 같이 평가되었다. 7 명의 18 세의 피험자에 대한 기준치 축 길이 측정(Baseline axial length measurement)이, 2주의 인터벌 뒤에, 각각의 피험자가 특수 고글을 착용하고 비디오 게임을 하는 2달 동안 1일 1시간으로 얻어졌다. 비디오 게임은 흑백이었으며, 게임을 하는 동안, 피험자는 오른쪽 렌즈가 투명하여 L 및 M 추상체가 거의 동등하게 활성화되고 왼쪽 렌즈가 착색되어 M이 아닌 L 추상체만이 활성화되는 한쌍의 고글을 통하여 컴퓨터 모니터를 보았다. 도 4A에 플로팅된 데이터는 피험자의 오른쪽 대조 눈에 대하여 적색의 비디오 게임을 바라본 왼쪽 눈에서 유의한 근시 시프트(p=0.0076)의 추세선을 나타낸다. 흑백 비디오 게임에 대하여 적색에 노출된 눈의 증가된 축 길이는 년당 1/3 디옵터의 굴절 이상의 증가에 상응한다.

실시예 4

망막에 도달하는 빛의 분광 분포를 제어하는 안경은 근시를 예방할 수 있음

어린이가 일상적으로 착용하는 경우 변형된 안경의 눈의 축 길이 성장에 영향을 미치는 능력이 평가되었다. 실험 안경의 양쪽 렌즈는 참여자의 검안사(optometrist)에 의하여 결정된 각각의 피험자에 대한 최적의 보정(optimal correction)을 가졌다. 각 쌍의 안경에서 한쪽 렌즈는 착색되고 표면에 홀로그래픽 산광기가 적용된 실험 렌즈였다. 착색은 적색광을 제거하였으며 산광기는 입사광선을 0.5 도의 각도에 너머에 분산시켜 약한 흐림을 만들어 인접한 추상체 간 활성 차이를 감소시켰다. 각 쌍의 안경에서 나머지 렌즈는 L 및 M 추상체를 동등하게 활성화시키는 중성 필터로 착색된 대조 렌즈였으며, 양쪽 눈이 모두 같은 빛의 세기에 노출되도록 선택되었다. 각각의 피험자에 대하여 우세한 눈이 확인되었으며, 최초의 3달의 기간 동안 모든 피험자가 우세한 눈에 실험 렌즈를 착용하였다. 피험자는 3달 뒤에 재등록(re-enroll)할 기회를 제안받았으며, 재등록하기를 결정한 자들은 우세하지 않은 눈에 실험 렌즈를 두번째 3달의 기간 동안 착용하였다.

참여자들이 실험 안경을 착용하기 시작하기 전에, 어린이에 있어 반복된 축 길이의 측정 간의 표준 편차가 ±0.019를 가지는, 앞서 어린이에 대하여 정확하고 재생산 가능한 측정을 만드는 것으로 확립된 Zeiss IOL Master를 사용하여 양쪽 눈의 축 길이를 측정하였다(A. Carkeet, S. M. Saw, G. Gazzard, W. Tang, D. T. Tan, Optometry and Vision Science 81, 829 (2004); J. Gwiazda et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science 44, 1492 (2003)). 도 4에 플로팅된 각각의 축 길이 측정은 20 개의 양쪽 눈에 대한 측정의 평균이었다. 실험에 등록한 13 피험자의 일반적인 기준치 특성은 표 2에 주어져 있다. 구형 등가물 굴절(SER)은 실험을 시작할 때 양쪽 눈에 대하여 측정되었으며, 축 길이 측정은 양쪽 눈에 대하여 어린이가 그의 변형된 안경을 받은 날에 측정되었다. 주어진 값은 20 개의 양쪽 눈에 대한 측정의 평균이었다. 마지막 컬럼은 어떤 눈이 실험 대 대조 렌즈를 가졌는지를 나타낸다(OS 왼쪽 눈, OD 오른쪽 눈).

표 2

모든 참여자는 실험안(experimental eye)으로써 우세한 눈 및 내부 대조로써 다른 눈으로 실험을 완료하였다. 일곱 참여자가 두번째로 실험을 완료하기 위하여 재등록하였으나, 우세하지 않은 눈에 실험 렌즈를 착용하였다. 어느 렌즈를, 그러므로, 어느 눈에 실험 대 대조 렌즈가 착용되었는지는 표 2에 열거되어 있다. 실험의 적격을 결정하기 위하여, 초기, 구형 등가물 굴절(SER)는 조절마비 자동굴절검사(cycloplegic autorefraction)로 측정되었으며, 이는 최소 -1.00 내지 최대 -8.50 디옵터의 범위였다. 기준치 축 길이는 오른쪽 눈(OD)에 대하여 22.93 내지 27.53 밀리미터(mm) 및 왼쪽 눈(OS)에 대하여 23.08 내지 27.84 mm 범위였다.

축 길이 성장은 3달의 코스에 걸친 실험 렌즈 대 대조 렌즈의 효과를 평가하기 위하여 사용된 1차적인 결과 측정이었다. 상대적인 축 길이의 성장이 실험 렌즈를 착용한 20 개의 눈 및 대조 렌즈를 착용한 20 개의 눈에 대하여 측정되었다. 각각의 20 개의 시험에 대한 성장 곡선은 실험 대 대조군에서 현저한 차이를 보여주었다(도 4B 및 C). 실험 렌즈를 착용한 눈에 대한 성장 곡선은 기준치 근처에 무리를 이루어 눈의 신장의 감소를 나타냈고, 대조 렌즈를 착용한 눈에 대한 성장 곡선은 양성 성장을 향해 벗어나 눈의 신장이 계속됨을 나타냈다. 20 개의 시험 중 16 개는 실험 렌즈가 성장을 감소시키고 대조 렌즈가 성장을 계속하는 이러한 성장 패턴을 따랐다. 대조안 및 실험안 간의 축 길이에서 전체의, 정규화된 차이(normalized difference)는 대응 2-샘플 t 검정으로 평가되었다. 두 눈 사이의 성장의 절대 차이(absolute difference)는 30일째에 그룹으로써 통계학적 유의에 도달하였다. 개별적으로, 두 눈 사이의 성장 차이가 유의함에 도달한 날은 30일째부터 75일째까지 이르렀다.

실험 대 대조 렌즈를 착용한 눈에 대한 축 신장의 속도가 또한 평가되었다(도 4D). 실험 렌즈를 착용한 눈에서의 평균 축 길이 성장 속도는 0.063±0.33 ㎛/일(평균±SE)이었으며, 대조 렌즈를 착용한 눈에서의 평균 축 길이 성장 속도는 1.43±0.24 ㎛/일(평균±SE)이었다. 다시, 20 개의 시험 중 16 개가 결과적으로 실험 렌즈를 착용한 눈에 대한 축 신장의 속도가 대조 렌즈를 착용한 눈에 대하여 감소했다. 대조군에 관하여 실험군에서 전체 성장 속도의 감소는 통계적으로 유의했다(p = 0.0019, 도 4D).

평균적으로, 실험 렌즈를 착용한 눈은 대조 렌즈를 착용한 눈보다 거의 10 배 느리게 성장하였다.

방법

색각 검사: 참여자는 나겔 색각검사기(Nagel anomaloscope) 및 Richmond HRR 2004년판 위동색표(pseudoisochromatic plate) 검사를 사용하여 유전된 적록 색맹의 존재에 대한 검사를 받았다.

L:M 추상체 비율의 측정: L:M 추상체 비율은 앞서 기술된 바와 같이 플리커 측광(flicker photometry) 및 유전학을 사용하여 추산되었다(H. Hofer, J. Carroll, J. Neitz, M. Neitz, D. R. Williams, Journal of Neuroscience 25, 9669 (2005년 10월); J. Carroll, C. McMahon, M. Neitz, J. Neitz, Journal of the Optical Society of America A 17, 499 (2000년 3월)).

적응 광학 이미징(Adaptive Optics Imaging): 망막의 상은 앞서 기술된 바와 같이 적응 광학을 사용하여 수득되었다(J. Carroll, M. Neitz, H. Hofer, J. Neitz, D. R. Williams, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 8461 (2004); J. Carroll et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 20948 (2009); J. Carroll et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA submitted (2010)).

축 길이, 각막 곡률(corneal curvature), 및 구형 등가물 굴절(SER): 양쪽 눈에 대하여 축 길이 및 각막 곡률은 각 피험자에 대하여 Zeiss IOL Master를 사용하여 측정될 것이며, 예상 구형 등가물 굴절(SERs)은 400 명의 남자 피험자의 그룹으로부터 실제 SER, 축 길이(AL) 및 각막 곡률(CC)의 데이터 세트의 직선 회귀(linear regression)로부터 유도된 식을 사용하여 계산되었다. 식은: SER = -(AL*2.03 + 0.94*CC) + 88.58이며, AL의 값은 눈 당 20 개의 측정의 평균이고, CC는 각막 곡률을 측정하는 두 개의 서로다른 방법의 평균이었다. 측정은 양쪽 눈에 대하여 이루어졌다.

유전적 분석: DNA는 PureGene 키트를 사용하여 전혈로부터 또는 구강 표본으로부터 분리되었다. 폴리머라제 연쇄반응은 OPN1LW 및 OPNIMW 유전자를 선택적으로 증폭하기 위하여 사용되었으며, 엑손 2, 3, 및 4는 앞서 기술된 바와 같이 직접 시퀀싱되었다(M. Neitz et al., Visual Neuroscience 21, 205 (2004)). 정량 실시간 PCR이 각각의 피험자의 DNA 샘플에 대하여 앞서 기술된 검정법을 사용하여 OPN1LW 및 OPNIMW 유전자의 상대적인 숫자를 추산하기 위하여 수행되었다(M. Neitz, J. Neitz, Color Research & Application 26, S239 (2001)).

인간 피험자 연구: 모든 인간 피험자 연구는 위스콘신 의과대학(Medical College of Wisconsin)에서 IRB 승인 프로토콜 하에서 수행되었으며 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)의 원칙을 따랐다.

녹인/녹아웃(Knock-in/Knock-out) 마우스 구성. 타겟 벡터는 X-염색체의 내인성 마우스 OPNIMW 유전자를 인간 L 옵신 cDNA로 치환하기 위하여 설계되었다. 5' 상동 부위(homology arm)는 길이로 11,917 bp이며 마우스 X-염색체의 OPNIMW 유전자의 상류(upstream)인 뉴클레오티드 위치 71,366,218로부터 마우스 OPNIMW 유전자의엑손 2의 코돈 65(마우스 게놈 어셈블리의 2007년 7월판 뉴클레오티드 위치 71,378,135)를 통해 확장한다. 부위 특이적 돌연변이 유도(Site directed mutagenesis)(QuickChange Kit, Stratagene)가 인간 OPN1LW의 코돈과 상응하는 동일한 아미노산을 암호화하기 위하여 마우스 코돈 58, 62, 및 65를 변경시키기 위해 사용되었다. 아미노산 58 및 62는 인간 OPNILW 중에서는 달라지지 않지만 코돈 65는 달라지며, 본원의 구성에서 이 코돈은 트레오닌(T65)을 명시한다. 마우스 코돈 58은 ACC에서 GTC로 변경되었으며, 마우스 코돈 62는 CTT에서 TTT로 변경되었고, 마우스 코돈 65는 GTT에서 ACT로 변경되었다. 코돈 66으로부터 아데닐산중합반응(polyadenylation) 신호(플라스미드 hs7의 뉴클레오티드 1679 더하기 hs7의 폴리링커의 142 염기쌍)를 통해 확장하는 플라스미드 hs7(M. Drummond-Borg, S. S. Deeb, A. G. Motulsky, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 983 (1989))으로부터의 인간 cDNA 단편은 5' 상동 부위에 인 프레임(in frame)으로 결찰(ligate)되었다. lox P 자리 측면의 PGK-NEO 카세트(PGK-NEO cassette flanked by lox P sites)는 인간 cDNA 단편의 하류로 결찰되었으며, 이의 하류는 마우스 X-염색체 뉴클레오티드 71,389,460에서 71,392,250로 확장되는 3' 상동 부위로 결찰되었다. 3' 상동 부위는 마우스 OPN1MW 유전자의 인트론 5 내의 2823 염기쌍 단편에 상응한다. 모든 백터는 완전한 벡터의 직접 시퀀싱으로 확인되었다. 사용된 최종 벡터 및 녹인/녹아웃 마우스의 제작은 Ozgene Inc.에 의하여 완료되었다. 타겟 구성은 배아줄기세포 내로 전기천공(electroporate)되었으며, 네오마이신 저항 세포가 정확히 표적화된 사건을 위하여 써던 하이브리드화(Southern Hybridization)에 의하여 스크리닝 되고 시퀀싱으로 확인되었다. 정확히 표적화된 자리(correctly targeted locus)의 생식세포(germline) 전달을 나타내는 마우스는 PGK Neo 카세트를 제거하기 위하여 Cre 마우스와 교배되었다. 동물은 최종 변경 자리(final altered locus)를 위하여 PCR에 의하여 스크리닝되었으며, 직접 시퀀싱으로 확정되었다. Ozgene으로부터 파운더 마우스(founder mice)를 얻으면서, 각각의 마우스로부터의 게놈 DNA가 존재를 정확히 표적화된 위치를 확정하기 위하여 시퀀싱되었다.

표적화된 위치에서의 유전자 발현은 내인성 마우스 조절 DNA 서열(endogenous mouse regulatory DNA sequence)로 제어되었으며, 암호화된 옵신의 N 말단 꼬리는 마우스 엑손 1에 의해 암호화된 것에 상응하였다. 엑손 1에 의하여 암호화된 N 말단 부분은 아미노산 4 내지 8이 제거되었으며 7 개의 기타 위치에서 이하와 같이: 위치 11에서 알라닌 대신 트레오닌, 위치 13에서 아르기닌 대신 글루탐산, 위치 14에서 히스티딘 대신 글루타민, 위치 15에서 프롤린 대신 트레오닌, 위치 16에서 글루타민 대신 류신, 위치 18에서 세린 대신 히스티딘, 및 위치 37에서 아르기닌 대신 리신의 서열이 다르다는 점에서 인간과 차이가 있었다. 인간 L 옵신은 엑손 2에 의하여 암호화된 아미노산 위치 65, 111 및 116 및 엑손 4에 의하여 암호화된 230, 233 및 236에서 달라진다. 표적화된 위치는 T65, I116, S116, I230, A233 및 M236으로 명시된다. 엑손 3에 의하여 명시되는 아미노산 서열을 고려하여 두가지 버전의 표적화된 위치가 구성되었다. 이는 침팬지 L 옵신에서 발견되는 서열과 상응하는 L153, I171, A174, I178, S180(LIAIS)으로 명시되는 대조 위치, 및 L153, V171, A174, V178, A180(LVAVA)으로 명시되는 실험 하의 변이이다.

마우스 ERG: 마우스를 케타민/실라진(ketamine/xylazine)으로 마취시키고 실험 내내 워밍 테이블(warming table)에 두었다. 기록 전극(recording electrode)은 각막에 위치시켰고, 기준 전극(reference electrode)은 눈꺼풀 밑에 위치시켰으며 접지 전극(ground electrode)은 혀에 접촉시켰다. ON-OFF ERG(30 개는 ON, 30 개는 OFF로 교류)가 펄스 폭 변조(pulse width modulation)에 의해 제어되는 5 개의 서로다른 빛의 세기(0.3 log 강도 단계)에서 525 nm LED 자극을 사용하여 수행되었다. 525 nm 빛은 내인성 마우스 UV 옵신이 아닌, 이식유전자(transgene)에 의해 암호화된 인간 L 추상체 옵신으로 중재되는 반응을 일으켰다. 기록은 간상체(rod)가 포화되는 명순응 상태(light adapted condition) 하에서 수행되었다.

선행되는 개시가 본 발명의 어떤 특정 구체예를 강조하며 이와 대등한 모든 변형 또는 변경이 첨부된 청구항에 제시된 바와 같이 본 발명의 취지 및 범주에 속함이 이해되어야 한다.

Claims

환자의 근시 가능성을 측정하는 방법으로서:
a) 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사하고; 및
b) 상기 해플로타입을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시키는 것을 포함하는 환자의 근시 가능성을 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 L:M 옵신 유전자 해플로타입이 표 1에 제시된 해플로타입 1 내지 13 중 하나인 방법.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 환자의 눈의 L:M 추상체 비율을 측정하는 단계; 및
b. L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
환자의 눈 길이 관련 질환에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 환자의 L 옵신 유전자 또는 M 옵신 유전자 내의 특정 아미노산 조합에 대해 검사하는 것을 포함하며, 표 1에 제시된 아미노산 조합 중 하나가 존재하는 경우 환자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인, 방법.
환자의 눈 길이 관련 질환 감수성을 진단하는 방법으로서:
a. 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 상기 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사하고; 및
b. 상기 해플로타입을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시키는 것을 포함하며;
상기 예상 구형 등가물 굴절이 음성 디옵터(negative diopter)인 경우 환자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 L:M 옵신 유전자 해플로타입이 표 1에 제시된 해플로타입의 1 내지 13 중 하나인 방법.
제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 환자의 눈의 L:M 추상체 비율을 측정하는 단계; 및
b. L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈 길이 연관 질환이 근시인 방법.
눈 길이 관련 질환을 치료하는 방법으로서:
a. 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 측정하기 위하여 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 검사하고;
b. 환자의 눈의 L:M 추상체 비율을 측정하며;
c. 상기 해플로타입 및 L:M 추상체 비율을 예상 구형 등가물 굴절과 연관시키고;
d. 환자의 예상 구형 등가물 굴절이 음성 디옵터인 경우 파장 의존성 필터(wavelength-dependent filter)를 포함하는 치료 장치를 환자에게 제공하는 것을 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 L:M 옵신 유전자 해플로타입이 표 1에 제시된 해플로타입의 1 내지 13 중 하나인 방법.
제9항 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파장 의존성 필터가 적색광을 차단하는 것인 방법.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파장 의존성 필터가 녹색광을 차단하는 것인 방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파장 의존성 필터에 의하여 여과되는 파장은, 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입 및 L:M 추상체 비율에 기초하여 선택되는 것인 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 장치가 흐림 유도 렌즈를 포함하는 안경 한 쌍인 방법.
제14항에 있어서, 상기 흐림 유도 렌즈가: 상기 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면의 작은 볼록 또는 오목; 렌즈 물질과 다른 물질의 렌즈 내 이물질; 렌즈의 고수준의 수차 결합; 및 회절 산란 또는 분산으로 흐림을 야기하는 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면에 적용된 코팅 또는 필름 중 하나 이상에 의하여 흐림을 유도하는 것인, 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 장치가 흐림 유도 렌즈를 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 흐림 유도 콘택트 렌즈가: 렌즈 물질과 다른 물질의 렌즈 내 이물질; 렌즈의 고수준의 수차 결합; 및 회절 산란 또는 분산으로 흐림을 야기하는 렌즈의 한쪽 또는 양쪽 표면에 적용된 코팅 또는 필름 중 하나 이상에 의하여 흐림을 유도하는 것인, 방법.
표 1에 제시된 해플로타입의 1 내지 13 중 적어도 하나를 동정할 수 있는 일련의 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이.
a. 표 1에 제시된 해플로타입의 1 내지 13 중 적어도 하나를 동정할 수 있는 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드; 및
b. 사용을 위한 설명
을 포함하는, 키트.
표 1에 제시된 해플로타입의 1 내지 13 중 적어도 하나를 검출하기 위한 검정법을 포함하는 키트.
눈 길이 관련 질환의 마우스 모델로서, 상기 마우스 모델은 근시와 관련된 변종 적색 광색소 단백질(variant red photopigment proteins)을 포함하는 것인, 마우스 모델.
제21항에 있어서, 녹색 광색소 단백질을 추가로 포함하는 것인, 마우스 모델.
제22항에 있어서, 상기 녹색 광색소 단백질이 근시와 관련된 변종 L 옵신 광색소 단백질인, 마우스 모델.
피험자의 눈에 들어가기 전에 디스플레이 화면으로부터 나오는 적색광을 우선적으로 차단하여, 상기 피험자의 눈의 굴절 이상(refractive error) 도입을 제한할 수 있는, 파장 의존성 필터를 포함하는 치료 광학 장치를 착용한 피험자를 포함하는, 디스플레이 화면에 대한 노출로 야기되는 피험자의 눈의 굴절 이상 도입을 제한하는 방법.
피험자의 눈에 들어가기 전에 디스플레이 화면으로부터 나오는 적색광을 우선적으로 차단하여, 상기 피험자의 눈 길이 관련 질환의 진행을 제한할 수 있는, 파장 의존성 필터를 포함하는 치료 광학 장치를 착용한 피험자를 포함하는, 피험자의 눈 길이 관련 질환의 진행을 제한하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 눈 길이 관련 질환이 근시인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 광학 장치는 흐림 유도 렌즈를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제27항에 있어서, 상기 흐림 유도 렌즈는 상기 렌즈 표면에 적용된 홀로그래픽 산광기(holographic diffuser)를 포함하는 것인, 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 광학 장치가 안경을 포함하는 것인, 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 광학 장치가 콘택트 렌즈를 포함하는 것인, 방법.
제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이 화면이 컴퓨터 모니터, 타블렛 모니터, 텔레비전 화면, 휴대용 기기(handheld device) 화면, 비디오 게임 화면, 두부 장착형(head-mounted) 디스플레이 화면, 및 영화관 화면으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자가 18세 또는 그 미만의 연령인, 방법.
제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인 자인, 방법.
제33항에 있어서, 상기 피험자가 표 1에 제시된 L:M 옵신 유전자 해플로타입을 가지는 경우, 상기 피험자가 눈 길이 관련 질환에 대해 감수성인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 L:M 옵신 유전자 해플로타입이 질량 분석을 사용하여 측정되는 방법.