KR20130141878A - 섬유아세포성장인자-2 를 이용한 면역 보강제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 섬유아세포성장인자-2 (FGF2) 를 유효성분으로 함유하는 면역보강용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 항원을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바이러스, 세균, 곰팡이, 또는 원생동물에 의해 유도되는 감염질환 혹은 세균, 곰팡이, 원생동물에서 분비되는 세포밖 소포체에 의한 염증질환의 예방 혹은 치료를 위한 약학적 조성물, 백신용 조성물 등으로 이용될 수 있다.

Description

섬유아세포성장인자-2 를 이용한 면역 보강제 {IMMUNE ADJUVANT USING FIBROBALST GROWTH FACTOR-2}

본 발명은 병원균에 의한 질환의 발생을 예방 혹은 치료를 위한 면역보강용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 섬유아세포성장인자-2 를 함유하는 것을 특징으로 한다.

병원균 (pathogen)은 숙주 (host)의 방어막을 뚫고, 숙주에 침범하여 질병을 유발하는 미생물을 통칭한다. 병원균은 크게 바이러스(virus), 세균(bacteria), 곰팡이(fungi), 및 원생동물(protozoa) 등을 포함한다. 병원균은 숙주의 선천면역세포 (innate immune cells)를 자극하여 선천면역반응 (innate immune response)을 유도하여 염증반응을 유도할 뿐만 아니라, 항원특이 후천면역반응 (adaptive immune response)의 양상을 결정한다 [Soroosh, P. and T. A. Doherty, Th9 and allergic disease. Immunology 2009;127: 450-458]. 한편, 단백질 등의 양성 항원(benign antigen) 단독으로 체내에 흡수되면 항원에 대한 면역관용(immune tolerance)이 유도되어, 재차 항원이 체내에 들어오더라도 항원에 대한 면역반응이 발생하지 않는다 [Ayres JS, Schneider DS. Tolernace of infections. Annu Rev Immunol 2012;30:271-94].

IgA는 후천면역반응의 결과로 유도되는 다섯 가지 항체 중 한가지로, Isotype switching 에 의해서 형성되며, IgA1 과 IgA2로 구성된다 [Pilette C, Ouadrhiri Y, Godding V, Vaerman JP, Sibille Y. Lung mucosal immunity: immunoglobulin-A revisited. Eur Respir J 2001;18:571-588]. IgA 는 혈장에서는 단일체 (monomer)로, 점막에서는 이합체(dimer)로 분비된다 [Janeway’s Immunobiology,7th edition, Kenneth Murphy, Paul Tranvers, and Mark Walport, Garland Science, Chapter4,164-166]. 혈장 IgA의 80% 가 IgA1 이며, IgA2 는 점막에서 발견된다. IgA는 병원균 혹은 미생물이 점막조직에 부착되는 것을 억제하고, 세포내 병원균을 무력화하며, IgA와 결합된 병원균은 기도 대식세포 (alveolar macrophage)의 식세포 작용을 유도한다 [Mazanec MB, Nedrud JG,Kaetzel CS, Lamm ME.A three-tiered view of the role of IgA in mucosal defense. Immunol Today 1993;14:430-435].

염기성 섬유아세포성장인자 (Basic fibroblast growth factor) 혹은 섬유아세포성장인자-2 (FGF2)는 FGF family 중 하나이다 [Chlebova K, Bryja V, Dvorak P, Kozubik A, Wilcox WR, Krejci P. High molecular weight FGF2: the biology of a nuclear growth factor. Cell Mol Life Sci 2009;66:225-35]. FGF2는 혈관 내피세포, 평활근 세포 (smooth muscle cell)의 분화를 촉진하고, 섬유아세포 (fibroblast)의 이동 및 분화를 촉진하며, 상처의 치료과정 중에서 기도 상피세포 (airway epithelial cell)의 재생성을 유도한다 [Nugent MA, Iozzo RV. Fibroblast growth factor-2. Int J Biochem Cell Biol 2000;32:115-20; Maltseva O, Folger P, Zekaria D, Petridou S, Masur SK. Fibroblast growth factor reversal of the corneal myofibroblast phenotype. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:2490-5]. FGF2 의 수용체는 4가지가 알려져 있는데, 기관지 상피세포에서는 수용체 1, 2, 4 가 발현되고, 폐포세포 (alveolar cell)에서는 수용체 2, 3, 4 가 발현된다 [Kannan K, Givol D. FGF receptor mutations: dimerization syndromes, cell growth suppression, and animal models.IUBMB Life 2000;49:197-205; Davies DE, Wicks J, Powell RM, Puddicombe SM, Holgate ST. Airway remodeling in asthma : New insights. J Allergy Clin Immunol 2003;111:215-25]. 동물 실험에서는 FGF 수용체 신호전달을 억제하였을 때, 폐기종이 나타나며, FGF 수용체 3과 4가 결핍된 마우스에서는 폐포생성 (alveogenesis)이 억제되는 것으로 알려져 있다 [Weinstein M, Xu X, Ohyama K, Deng CX. FGFR-3 and FGFR-4 function cooperatively to direct alveogenesis in the murine lung. Development 1998;125:3615-23]. 그러나, 현재까지 FGF2의 면역학적 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 아니하다.

본 발명자들은 감염질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 재조합 섬유아세포성장인자-2 (FGF2)를 백신용도의 면역보강제로 사용하여 양성 항원의 일종인 난알부민 (ovalbumin)과 재조합 FGF2를 기도에 투여하였을 때 기도세척액에서 난알부민 특이 sIgA가 현저히 증가된 현상을 발견하게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 재조합 FGF2와 항원을 점막으로 동시에 투여하여 항원특이 sIgA를 유도함으로써 병원균에 의한 질환의 발생을 예방 혹은 치료를 위한 백신용도의 면역보강제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 감염질환 혹은 감염인자에 의한 염증질환의 예방 혹은 치료를 위한 재조합 FGF2를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물 및 백신 조성물을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 FGF2는 항원과 병용 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항원은 바이러스, 세균, 곰팡이, 또는 원생동물에서 유래한 항원일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원균에 의한 질환의 예방 혹은 치료 방법을 제공한다.

상기 투여방법에는 제한이 없으나, 비강, 흡입, 경구, 설하, 항문 등의 투여방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 재조합 FGF2를 유효성분으로 함유하는 조성물은 바이러스, 세균, 곰팡이, 원생동물에 의해 유도되는 감염질환 혹은 세균, 곰팡이, 원생동물에서 분비되는 세포밖 소포체에 의한 염증질환의 예방 혹은 치료를 위한 약학적 조성물, 백신용 조성물 등으로 이용될 수 있다.

도 1은 BALB/c 마우스에 Ovalbumin(75μg; OVA)과 재조합 FGF2 (25μg, 동아제약 제조)를 비강으로 1일 혹은 3일동안 투여한 후, 기도세척액에서 염증세포의 유입을 확인한 결과이다.
도 2는 도 1에서와 같은 방법으로 실험을 한 후, 마우스 폐조직내 염증세포의 유형을 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 3은 도 1에서와 같은 방법으로 실험을 한 후, 마우스 폐조직을 떼어내어 분쇄한 후, 폐조직 내 thymic stromal lymphopoietin (TSLP)의 양을 측정한 결과이다.
도 4는 폐포 대식세포 (alveolar macrophage; MH-S cell line)에서 양성 항원 (OVA-FITC), 양성 항원과 재조합 FGF2를 병용투여하여, FGF2에 의하여 염증세포에서 항원의 섭취가 증가되는 것을 나타낸 결과이다.
도 5는 기도 상피세포(airway epithelial cell; Beas-2b cell line) 에서 양성 항원 (OVA-FITC), 양성 항원과 재조합 FGF2를 병용투여하여, FGF2에 의하여 상피세포에서 항원의 섭취가 증가되는 것을 나타낸 결과이다.
도 6은 0, 1, 2 그리고 7일에 양성 항원 및 양성 항원과 재조합 FGF2를 비강으로 투여하고, 14, 15, 21, 22 일에 양성 항원만을 투여하여 24일째에 폐조직에서 단일세포를 분리 한 후, anti-CD3와 anti-CD28 로 12시간 자극을 한 후, 분비되는 사이토카인의 양을 측정한 결과이다.
도 7은 도 6과 같은 방법으로 실험을 진행 한 후, 기도세척액에서 항원특이 IgA 양을 측정한 결과이다.

감염질환은 바이러스(virus), 세균(bacteria), 곰팡이(fungi), 원생동물(protozoa) 등의 병원균이 숙주를 침범하여 발생한다. 감염질환을 예방 및 치료하기 위해서는 병원균를 효과적으로 제거하는 것이 가장 중요하다. 현재 감염질환을 예방하기 위해 병원균에서 유래한 항원을 백신의 용도로 사용하는데, 병원균에서 유래한 단백질 만을 투여하였을 때는 대개 면역관용이 유도되고, 면역반응을 유도하기 위하여 항원과 함께 면역보강제를 병합 투여하게 된다. 본 발명자들은 마우스에 양성 항원과 재조합 FGF2를 비강으로 병용 투여하여 항원에 의한 후천면역반응을 유도하였고, 특히 점막 내 항원특이 IgA의 분비가 효율적으로 유도됨을 확인하였다. 항원과 재조합 FGF2를 병용 투여하였을 때 염증세포와 상피세포에서 항원의 유입이 증가되었고, sIgA 생성을 유도하는 TSLP의 분비를 증가시킴을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 재조합 FGF2를 유효성분으로 함유하는, 병원균에 의한 질환의 예방 혹은 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 “병원균에 의한 질환”이란 바이러스, 세균, 곰팡이, 또는 원생동물 자체가 숙주에 침범하여 발생하는 감염질환 (infectious disease), 혹은 병원균유래 세포밖 소포체가 숙주에 들어와서 발생하는 염증질환, 대사질환, 암을 포함하는 의미이다.

또한 본 발명에서 “예방 혹은 치료”란, 질환의 발생 혹은 이미 발생한 질환의 경과를 예방 혹은 치료하는 것을 포함하는 의미이다.

상기 본 발명의 조성물은 백신 조성물 및 약학적 조성물을 포함한다.

상기 약학적 조성물은 상기 재조합 FGF2를 유효 성분으로 함유하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 흡입제, 경구제, 주사제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질환의 치료 또는 예방용 조성물은 백신용 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 백신 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 재조합 FGF2를 함유할 뿐만 아니라, 백신 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 콜레라독소, alum 등의 면역보강제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 재조합 섬유아세포 성장 인자-2를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물의 약제학적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원균에 의한 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 “약제학적 유효량”은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 비강, 설하, 흡입, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 FGF2 에 의한 선천면역반응

BALB/c 배경의 6주령 마우스에 난알부민 (75 μg)과 재조합 FGF2 (25 μg) 를 비강으로 각각 1일 혹은 3일동안 처리한 후, 24시간 후에 기도세척액을 얻은 후, 염증세포의 유입을 확인하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 기도세척액에서 확인된 염증세포는 대부분이 대식세포임을 알 수 있으며, 1일동안 자극한 마우스의 염증세포에서, 난알부민과 재조합 FGF2를 병용투여 하였을 때 난알부민 단독으로 처리한 것에 비해 대식세포의 수가 2배 증가함을 확인하였다. 또한, 3일동안 자극한 마우스의 대식세포의 수도 난알부민 단독으로 처리한 마우스보다 난알부민과 재조합 FGF2를 병용투여 하였을 때, 2배정도 증가함을 확인하였다.

또한 난알부민과 재조합 FGF2를 3일간 병용투여 하고 폐조직에서 염증세포를 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 재조합 FGF2의 농도가 증가할수록 CD11b⁺11c^- cells 이 41.11% 에서 63.55%로 증가함을 알 수 있다. 구체적으로, CD11b^-c⁺ cells 은 12.94% 에서 3.89%로 감소함을 확인하였고, CD11b⁺11c⁺ cells 은 각각 23.67%, 21.32% 로 차이가 없음을 확인하였다. 통상적으로 CD11b⁺11c^- cells 은 대식세포를 대변하고, CD11b^-c⁺ cells 는 수지상세포를 대변한다.

이에 더하여, 폐조직에서 선천면역 반응을 유발하는 사이토카인을 확인 하였을 때, TH2 혹은 Treg 면역반응을 유도하는 TSLP 양이 재조합 FGF2의 농도가 증가할수록 증가됨을 확인하였다 (도3 참조).

실시예2 . 숙주세포에 의한 항원의 섭취력에 대한 재조합 FGF2 의 효과

양성 항원 (난알부민)과 재조합 FGF2을 병용투여 하였을 때, 대식세포와 기도 상피세포에서 난알부민의 섭취가 증가되는지 확인하기 위해 마우스 폐포 대식세포 (MH-S) 와 사람 기도 상피세포(Beas-2b)를 이용하였다.

먼저 마우스 폐포 대식세포에 난알부민-FITC 를 단독으로 처리한 것과, 재조합 섬유아세포 FGF2를 병용투여 하였을 때를 비교하였다. 도 4 에 나타난 바와 같이, 난알부민-FITC 단독으로 처리한 경우 (OVA-FITC)는 MFI 값이 300 정도 이고, 재조합 섬유아세포 성장 인자 2를 병용투여 하였을 때 (OVA-FITC + FGF2) MFI 값이 4500으로 증가함을 확인하였다.

또한 사람 기도 상피세포에서 위와 동일한 방법으로 실험 하였을 때, 난알부민-FITC 단독은 MFI 값이 2 정도 이고, 재조합 섬유아세포 성장 인자 2를 병용투여 하였을 때 MFI 값이 10으로 증가함을 확인하였다 (도5 참조).

상기 결과는 숙주세포에 의한 항원 (난알부민) 섭취가 재조합 FGF2의 병용투여에 의하여 현저히 증가됨을 의미한다.

실시예 3. 재조합 FGF2 에 의한 항원특이 TH2 면역반응

난알부민 (75μg) 단독, 혹은 난알부민(항원)과 재조합 FGF2 (25μg)를 병용하여 0일, 1일, 2일, 7일에 비강으로 투여하고, 14일, 15일, 21일, 22일에는 난알부민 (50μg)만 단독으로 비강으로 투여하여 후천면역 반응을 유도하는지 평가하였다. 제 24일째, 폐조직과 림프절에서 단일세포를 분리 한 후, anti-CD3와 anti-CD28 로 12시간 자극을 한 후, 분비되는 사이토카인의 양을 확인하였다. 도 6 에 나타난 바와 같이, TH2 세포에서 분비되는 IL-13 의 양이 재조합 FGF2의 병용투여 때 증가함을 확인하였다.

실시예 4. 재조합 FGF2 에 의한 점막내 항원특이 IgA 분비

상기 실시예 3과 같이 마우스 실험을 진행 한 후, 24일 째에 마우스 기도세척액을 얻어, 기도세척액 내에 존재하는 항원 (난알부민)특이 IgA 의 양을 측정하였다.

도 7 에 나타난 바와 같이, 난알부민 단독으로 처리하였을 때 (OVA/OVA)에는 기도세척액 내 항원특이 IgA가 측정되지 않았으나, 난알부민과 재조합 FGF2를 병용투여 하였을 때(OVA + FGF2/OVA) 항원특이 IgA가 200 ng/ml 의 양이 측정되었다.

상기 결과는 난알부민(항원) 단독투여로는 점막내 항원특이 IgA의 분비가 유도되지 못하나, 항원과 함께 재조합 FGF2를 점막으로 투여하였을 때 점막내에서 효율적을 항원특이 IgA 분비가 효율적으로 유도된다는 것을 의미하며, 이는 본 발명자들에 의해 최초로 발견되었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (15)

1. 재조합 섬유아세포성장인자-2 (FGF2)를 유효성분으로 함유하는, 병원균에 의한 질환의 예방 혹은 치료용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 항원을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 항원은 바이러스에서 유래한 항원을 사용하는 것인, 조성물.
   
4. 제 2항에 있어서,
   상기 항원은 세균에서 유래한 항원을 사용하는 것인, 조성물.
   
5. 제 2항에 있어서,
   상기 항원은 곰팡이에서 유래한 항원을 사용하는 것인, 조성물.
6. 제 2항에 있어서,
   상기 항원은 원생동물에서 유래한 항원을 사용하는 것인, 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 질환은 바이러스, 세균, 곰팡이, 또는 원생동물에 의한 감염질환인, 조성물.
   
8. 제 1항에 있어서,
   상기 질환은 세균, 곰팡이, 또는 원생동물에서 유래하는 세포밖 소포체에 의한 염증질환, 대사질환, 또는 암인, 조성물.
   
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 약학적 조성물, 또는 백신 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원균에 의한 질환의 예방 혹은 치료 방법.
    
11. 제 10항에 있어서,
    상기 투여는 비강으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
12. 제 10항에 있어서,
    상기 투여는 흡입으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
13. 제 10항에 있어서,
    상기 투여는 설하로 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
14. 제 10항에 있어서,
    상기 투여는 구강으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
15. 제 10항에 있어서,
    상기 투여는 항문으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    

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