KR102056118B1 - 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알레르기 비염 치료용 약학조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 알레르기 비염을 앓고 있는 것이 확인된 마우스 모델을 대상으로 알레르기 비염 증상이 호전되는 것을 명확히 확인한 기생충 유래 단백질추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물에 대한 것이다.

Description

알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물{A pharmaceutical composition for alleviating, treating or preventing allergic rhinitis}

본 발명은 알레르기 비염 치료용 약학조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 알레르기 비염을 앓고 있는 것이 확인된 마우스 모델을 대상으로 알레르기 비염 증상이 호전되는 것을 명확히 확인한 기생충 유래 단백질추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물에 대한 것이다.

알레르기(allergy)란 어떤 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상을 말한다. 즉, 우리 몸속에서 일어나는 면역반응의 한 종류로서, 사람에게 문제가 되지 않는 외부 이물질(항원, antigen)에 대하여 체내의 항체 또는 림프구가 지나치게 반응하여 신체의 이상을 초래하는 이상 과민 면역 반응으로 생기는 질환이 알레르기 질환이다. 대표적인 알레르기 질환에는 발생 부위에 따라 기침, 천명, 호흡곤란을 주요 증상으로 하는 기관지 천식(기관지), 맑은 콧물, 재채기, 코막힘의 알레르기성 비염(코), 가려움증, 피부표면의 평평한 융기 등의 두드러기, 아토피성 피부염(피부), 알레르기성 결막염(눈) 등이 있다. 알레르기 질환은 문명이 발달함에 따라 증가되는 질환 중의 하나로, 우리나라에서도 서구화된 생활환경, 공해, 화학 물질에 노출이 많아져서 점차 증가 추세에 있다.

특히, 알레르기 질환 중에서 알레르기 비염은 콧물 코막힘 재채기 가려움을 특징으로 대표적인 알레르기 질환으로 가장 흔한 질환이며, 도 1에 도시된 바와 같이 국내인구의 약 40%, 세계적으로는 약 4억 명이 앓고 있는 질환이다. 알레르기 비염은 천식, 삼출성중이염, 축농증 등과 타 질환과 밀접한 관계에 있으며, 비염 조절이 천식의 조절에도 중요한 요소로 작용한다.

알레르기 비염의 진단을 위해서는 피부따끔검사 등 항원특이적 면역글로불린 E (IgE)를 확인하기 위한 검사들이 많이 시행되지만, 이들 검사결과 만으로는 알레르기 비염을 진단할 수 없다. Tomohisa 등의 연구결과에 의하면, 피부따끔검사에서 같은 항원에 양성 반응을 보이는 환자에서도 알레르기 비염 증상을 보이는 환자도 있고, 보이지 않은 환자도 있다 (.Iinuma T, Okamoto Y, Morimoto Y, Arai T, Sakurai T, Yonekura S, Sakurai D, Hirahara K, Nakayama T (2017) Pathogenicity of memory Th2 cells is linked to stage of allergic rhinitis. Allergy. doi:10.1111/all.13295) 따라서 알레르기 비염 진단을 위해서는 콧물 코막힘 재채기 가려움 등 증상의 확인이 필수적이며, 치료시에도 증상의 호전을 판단하는 것이 매우 중요하다.(Wheatley LM, Togias A (2015) Clinical practice. Allergic rhinitis. N Engl J Med 372 (5):456-463. doi:10.1056/NEJMcp1412282)

이와 같이 진단도 어려운 알레르기비염이 공기의 질이 나빠짐에 따라 더욱 증가하고 있어 생활의 질에 영향을 주고 생산능력의 감소와 치료비 부담의 증가로 인해 사회 경제적으로 문제가 되고 있으나 뚜렷한 치료법은 아직 없고, 주로 대증적인 치료에 머무는 실정으로 완치가 어려운 난치성 질환이다. 약물요법은 알레르기 비염의 기본적인 치료지만 약제중단시 재발이 흔하고 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 면역요법은 면역체계를 일부 변형시킬 수 있는 것으로 알려져 있지만, 수년간의 치료가 필요하고 과민반응과 비용이 문제가 될 수 있으며, 치료후 일정기간이 지나면 치료효과가 떨어지는 것으로 알려져 있다.

한편, 항생제등 약물사용과 환경위생의 발달로 병원체의 침입이 적어지고 우리의 면역 시스템이 병원체에 노출될 기회가 적어져서 박테리아 및 기생충 감염은 억제되나, 면역조절기능의 이상 역시 야기될 수 있어, 알레르기 질환 유병율이 높아진다는 위생가설이 있다. 이것을 뒷받침하는 한 가지 예로 기생충 감염이 많은 지역에서는 알레르기 질환이 적다는 것이다. 대규모 역학조사들에서 기생충 감염 유병율이 높은 집단에서 Th1 연관의 자가면역 질환이나 Th2 관련된 천식, 알레르기 비염의 유병율이 낮고, 반대로 기생충 감염 유병율이 낮은 집단에서는 알레르기 질환의 유병율이 높은 현상 보이는 것이 밝혀졌기 때문이다. 또한 젖먹이나 어린이의 감염질환의 감소도 주원인으로 주목받고 있다. 어릴 적 세균이나 바이러스에 감염되면 알레르기 질환의 발생을 억제하는 Th1 세포가 만들어지지만 그렇지 않으면 오히려 알레르기 질환을 유발하는 Th2 세포가 생성되기 때문이다.

비정상적인 Th1 또는 Th2 반응을 유발하는 면역계의 조절장애는 여러 인간 질병의 원인이 될 수 있는데, 도 2에 도시된 바와 같이, 기생충 자극이 수지상세포에서 Treg를 유도한 결과로서, Treg은 Th1 이나 Th2에 의한 염증반응을 줄일 수 있는 것이 알려져 있다.

따라서, 아직까지 뚜렷한 치료법이 알려지지 않은 알레르기 비염질환의 새로운 치료 모델로서 기생충 연계 면역치료 후보 물질을 개발할 가능성이 검토될 필요가 있다.

본 발명자들은 알레르기 비염질환에 유효한 기생충 연계 면역치료제를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과 알레르기비염증상을 호전시키는 약학조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 국내 토착성 흡충류 중 하나인 요코가와흡충의 단백질계추출물이 가진 알레르기비염증상을 호전시키는 새로운 용도를 이용하여 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 현재 완치 방법이 존재하지 않는 알레르기 비염을 예방할 수 있을 뿐만 아니라 완치를 기대할 수 있는 알레르기 질환의 새로운 치료 모델로서 국내 토착성 흡충류를 대상으로 기생충연계 면역치료 후보 물질을 발굴하여 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 상세한 설명의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 목적 역시 당연히 포함될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 먼저 본 발명은 요코가와 흡충 단백질계 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

바람직할 실시예에 있어서, 상기 약학조성물의 투여농도는 1.2 ~ 1.5ug/10ul이다.

바람직할 실시예에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 주사제이다.

바람직할 실시예에 있어서, 상기 약학조성물은 림프절에 투여된다.

바람직할 실시예에 있어서, 상기 약학조성물은 1회 투여된다. 되

또한, 본 발명은 상술된 어느 한 항의 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물을 림프절에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유류의 알레르기 비염 치료방법을 제공한다.

상술된 본 발명에 의하면, 알레르기비염 예방 및 치료에 필수적인 면역조절 표지자인 조절T세포 연관 사이토카인 및 전사인자가 변화됨을 증명하였을 뿐만 아니라 알레르기 비염 진단에 필수적인 알레르기 비염 증상 발현 동물모델에서 알레르기 비염 증상이 개선되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 약학조성물에 의하면 유병율이 전체 인구의 40%에 가깝지만, 현재 완치 방법이 존재하지 않는 알레르기 비염의 완치를 기대해 볼 수 있을 뿐만 아니라 알레르기 비염의 예방을 기대해 볼 수 있다.

본 발명의 이러한 기술적 효과들은 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.

도 1은 한국의 알레르기 비염에 대한 연간 환자 수 및 의료 비용을 나타낸 그래프이다.
도 2는 위생 가설, 병원균 부담의 영향을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에서 사용된 알레르기 비염 마우스 모델링 개념도이다.
도 4는 본 발명에 따른 요코가와흡충 단백질계추출물의 알레르기비염치료효과를 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명에 따른 요코가와흡충 단백질계추출물 투여시 면역사이토카인의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 알레르기비염 마우스 모델에 간흡충을 감염시켜 알레르기비염 치료효과를 비교한 결과그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 갖는 통상의 의미와 본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 기재된 내용을 토대로 해석되어야 한다. 특히, 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등이 사용되는 경우 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되는 것으로 해석될 수 있다.

단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "단백질계추출물"은 생체 내에 존재하는 단백질을 함유 고분자물질을 추출한 것으로 단백질, 지단백 및 당단백을 포함하는 개념이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 단순히 알레르기비염 예방 및 치료에 필수적인 면역조절 표지자인 조절T세포 연관 사이토카인 및 전사인자가 변화됨을 확인한 것에 더하여, 알레르기 비염 진단에 필수적인 알레르기 비염 증상을 발현시킨 실제 동물모델에서 알레르기 비염 증상이 개선되는 것을 확인함으로써 요코카와 흡충 단백질계추출물이 알레르기 비염을 완화하고 치료할 뿐만 아니라 예방할 수 있는 요코카와 흡충 단백질계추출물의 새로운 용도를 발견하고, 이를 유효성분으로 포함하는 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물을 개발한 것에 있다.

즉, 흡충은 흡충강(吸蟲綱：편형동물의 한 분류) 전구목(前口目：앞에 입이 있음)에 속한 편형동물(扁形動物：편편한 모양의 동물)의 총칭으로 디스토마(distoma)로도 불리는데, 포유류의 간ㅇ폐 또는 장에 기생하고, 그 기생 부분에 따라 간흡충, 폐흡충으로 구분되는 등 다수의 종류가 알려져 있다. 간흡충은 우리나라에서 가장 흔하게 발견되는 인체 감염 흡충류이나, 수년에 걸친 만성 감염시에는 담관암의 위험인자로 작용할 수 있는 반면, 요코가와흡충은 장내 기생 흡충류로 인체 내에서 대개 증상을 일으키지 않거나 경증의 복통 또는 설사가 간혹 있을 수 있는 등 인체에 미치는 영향이 다소 미미하여 타 인체 기생 가능 흡충류에 비해 안전성이 우수하다.

따라서, 본 발명의 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물은 요코가와 흡충 단백질계 추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 요코가와 흡충 단백질계 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 림프절주사, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다. 여기서, "환자"는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미할 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다. 일 구현예로서 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 특히, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중㎏당 1 내지 6000 mg, 바람직하게는 60 내지 600 mg을 1회 또는 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여농도가 1.2 ~ 1.5ug/10ul일 때, 환자 체중kg당 0.5 ml 를 림프절주사로 투여하는 경우 1회 투여만으로 알레르기 비염 증상을 개선하는 탁월한 효과가 있다.

실시예

1.요코가와흡충의 피낭유충 분리 수집단계

요코가와흡충의 확보를 위해 경상남도 하동지역에서 채집한 은어를 마쇄하여 인공소화액 (pepsin-HCl 용액)으로 36℃배양기에서 약 2시간 동안 소화시켰다. 소화된 내용물을 채(1 mm x 1 mm mesh)로 거른 후 침전시키고 상층액을 버렸으며 상층액이 맑아질 때까지 생리식염수를 보충해 주면서 이 조작을 반복하였다. 상층액이 맑아졌을 때 입체해부현미경하에서 요코가와흡충의 피낭유충을 분리 수집하였다.

2. 단백질계추출물 준비단계

분리 수집한 피낭유충을 Homogenation buffer (5mM EDTA, 1% NP-40, 0.2mM PMSF) 1.5mL과 혼합하여 15분 간 vortexing하고 4℃ 조건 하에 13,000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리한 상층액을 딴 후 Pierce BCA Protein Assay Kit를 이용하여 프로토콜에 따라 단백질계추출물을 추출하였다. 추출된 단백질계추출물의 농도는 1.2-1.5 ug/10ul에 맞춰 준비되었다.

실험예

1.알레르기 비염 마우스모델링

알레르기 비염 증상 개선에 효과가 있는지 여부를 실제로 검증하기 위해 항원을 이용해 알레르기 비염을 만든 마우스를 도 3과 같이 준비하였다.

4주령 Balb/c 마우스에 4주간의 모델링 과정을 거쳐 알레르기 비염을 지닌 질환모델을 만들었는데, 이 모델링 방법은 기존 알레르기 비염 연구에 가장 많이 사용되는 모델링중 한가지로서, Alum 과 Ovalbumin 을 2주간 복강내 주입한 이후에 다시 비강으로 ovalbumin 을 투여해 만들 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 4주령의 Balb/c 마우스를 이용하되, OVA 25 ug과 Alum 1 mg을 흡착시킨 후 복강주사를 1 주일 간격으로 3회 시행하였다 (0일 째, 7일 째, 14일 째). 25일 째부터 29일째까지 5회 OVA 100 ug을 비강으로 점적하여 OVA 모델을 확립하였다. OVA 또는 Alum 대신 PBS를 주입 및 점적한 4주령의 암컷 Balb/c 마우스를 음성 대조로 사용하였다.

2. 요코가와흡충 단백질계 추출물이 투여된 치료군 준비

알레르기 비염이 모델링된 마우스를 희생시키기 1주일 또는 2주일 전 준비된 요코가와흡충 단백질계 추출물을 경부림프절에 주입하여 치료군으로 사용하였다. 단백 농도는 1.2-1.5 ug/10ul에 맞춰 10ul이 주입되게끔 하였다.

3. 알레르기 비염증상 및 개선 여부 관찰

30일째에 마우스를 희생시키기 전 OVA 100 ug을 비강으로 점적하고 10분 후부터 10분 간 각 마우스가 재채기하거나 코를 긁는 행위의 횟수를 측정하였다. 측정된 결과는 도 4에 도시되었다. 도 4에서, 각 표지의 의미는 다음과 같다. No model: 알러지 모델링(-), 요코가와흡충 단백질계추출물 투여치료(-), Allergic rhinitis model: 알러지 모델링(+), 요코가와흡충 단백질계추출물 투여치료(-), ICL injection of MY (1wk): 알러지 모델링(+), 요코가와흡충 단백질계추출물 투여치료(+. Harvest 1주일전 1회치료), ICL injection of MY (2wk): 알러지 모델링(+), 요코가와흡충 단백질계추출물 투여치료치료(+. Harvest 2주일전 1회치료)

도 4로부터, 요코가와흡충 단백질계추출물의 1회 투여치료로 알레르기 비염 증상이 일주일 만에 절반 이상 감소되었을 뿐만 아니라 2주일이 경과해도 여전히 치료효과가 있는 것을 알 수 있다.

4. 체내 사이토카인 발현량 측정

마우스를 희생시킨 다음 비장, 경부 임파선, 코 점막 조직을 확보하여, RNA를 추출하기 전까지 -70 ℃에서 보관하였다. 각 조직에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성을 위한 RT 반응액은 1st Strand cDNA synthesis kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 1200 ng RNA, 200 U MMLV reverse transcriptase, 5 mM dNTP, 20 U RNase inhibitor 및 500 ㅅg random primer p(dN)6을 넣어 총 50 μL의 양으로 시행하였다. Th1 세포에서 주로 분비되는 사이토카인인 IFN-r, Th2 계의 IL-4, Th17 계의 IL-17, Treg 계의 사이토카인인 TGFb의 mRNA 발현량을 측정하였다. 면역세포의 사이토카인 발현량을 결정짓는 전사인자인 Tbet, RORrt, GATA 역시 mRNA 발현량을 측정하여 비교하고자 하였다. 각 유전자 발현량의 측정은 ROTOR Gene 3000 (Corbettet research, Sydney, Australia)을 이용하였다. Real-time PCR은 Quantitect SYBR Green PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여, 2x SYBR Green PCR Master Mix 12.5 uL, 각 시발체 쌍 0.25 uM, cDNA 6 uL을 넣어 총 25 uL양으로 실험하였다. 이를 95℃ 10분, 95℃ 15초/54℃ 11초/72℃ 22초간 총 40회 반복하는 조건으로 반응시켰으며, 각 검체당 3회 PCR을 시행하였다. 각 유전자의 정량은 housekeeping 유전자를 이용하여 보정한 후 상대적인 유전자 발현량을 ΔΔCt 값으로 산정하였다. 결과는 도 5a 및 도 5b에 도시하였다.

도 5a 및 도 5b로부터, 알레르기 비염의 경우 과도하게 발현된 Th2 사이토카인(대표적으로 IL-4)과 관련 전사인자 (GATA3)가 특징적이며, 알레르기 비염의 치료 효과는 이들의 상대적인 감소를 통해 확인할 수 있는데, 알레르기 비염 마우스에서 요코가와흡충 단백질계추출물의 경부림프절 내 주입시, Th2 사이토카인인 IL-4, GATA3는 감소한 반면, 조절 T세포에 관련된 사이토카인인 TGF-b, FoxP3 는 증가하는 양상을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 최근 과도하게 발현되는 Th2 사이토카인의 억제에 있어서 조절 T세포의 활성화가 중요하다는 연구결과와 일치하는 것으로 본 발명의 요코가와흡충 단백질계추출물이 알레르기 비염을 완화하고 치료하며, 예방할 수 있음을 보여준다.

비교실험예

본 발명의 요코가와흡충이 기타 다른 흡충과 구별되는 알레르기 비염 치료효과가 있는지 확인하기 위해 공지된 간흡충 (Clonorchis sinensis, CS) 감염 매개 알레르기 비염 치료 효과를 비교하고 그 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다. 도 6a 및 6b에서 각 표지의 의미는 다음과 같다. NC: : 알러지 모델링(-), 치료 (-), PC: Positive control. 알러지 모델링(+), 치료(-), CS: 알러지 모델링(+), 간흡충 치료(+. 경구강, harvest 일주일전 1회치료), CS po: 알러지 모델링(+), 간흡충 치료(+. 경구강, harvest 일주일전 1회치료)

도 6a 및 도 6b는 알레르기 비염이 모델링된 마우스에서 간흡충을 경구 감염시킨 경우, 알레르기 비염 증상이 감소한 양상을 보였으나, Th2 사이토카인 및 조절 T세포에 관련된 사이토카인 변화가 현저하지 않아 알레르기 비염이 모델링된 마우스에 대한 간흡충의 면역변형능을 확인할 수 없었다.

이러한 실험결과는 본 발명의 요코가와 흡충과 비교하여 간흡층의 알레르기 비염 치료효과가 떨어지는 것을 보여준다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (6)

1. 요코가와 흡충 단백질계 추출물을 유효성분으로 포함하는데,
   상기 약학조성물에 포함되는 상기 요코가와 흡충 단백질계 추출물의 농도는 1.2 ~ 1.5ug/10ul이며,
   상기 약학조성물의 제형은 주사제인 것을 특징으로 하는 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 약학조성물은 림프절에 투여되는 것을 특징으로 하는 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 약학조성물은 1회 투여되는 것을 특징으로 하는 알레르기비염 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물.
   
6. 삭제

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