CN109908117B - 化合物pyrogallol在抗犬新孢子虫的医用用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物pyrogallol在抗犬新孢子虫的医用用途，可以制成一种新型的抗犬新孢子虫药物，通过作用于宿主细胞和小鼠模型的动物实验两方面来证实它对新孢子虫的治疗效果，可以制成抑制新孢子虫细胞感染和小鼠模型心、肝、脾、肺、肾、脑组织感染的化学药物，具有显著的疗效；本发明为新孢子虫的治疗提供了新的候选药物作用靶标‑活性氧（ROS）和新的候选药物‑pyrogallol,为未来寻找抗新孢子虫病的新型药物奠定基础。
Description
技术领域
本发明提供了化合物pyrogallol在抗犬新孢子虫的医用用途，可以制成一种新型的抗犬新孢子虫药物，属于抗寄生虫药物技术领域。
背景技术
新孢子虫病（Neosporiasis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）感染所引发的一种致死性原虫病。其宿主范围广泛，包括绝大多数哺乳动物，犬及犬科动物是其终末宿主，中间宿主包括牛、羊、鹿、马、犬、兔等动物，主要引起孕畜流产、新生胎儿运动及神经系统疾病，其中对牛的危害最为严重,给世界养牛业造成严重经济损失。基于新孢子虫病给畜牧、养殖业带来的危害，近年来该病的研究逐渐被兽医学界重视。
目前为止，复方新诺明、四环素、乙胺嘧啶等药物虽有一定的效果，但目前缺乏特效药,因此急需研发新的药物。
本发明涉及的化合物pyrogallol的化学结构式如下：
其化学式为C6H6O3，分子量为126.11；
该化合物是一种靶向活性氧（ROS）诱导剂，能够诱导宿主细胞ROS的释放；经检索未见化合物Pyrogallol在抗犬新孢子虫方面的医用用途。
发明内容
本发明提供了化合物pyrogallol在抗犬新孢子虫的医用用途，用于抑制新孢子虫的感染及增殖，以达到治疗新孢子虫病的作用，具有显著地医疗效果。
本发明通过NLRP3炎症小体参与宿主抗新孢子虫的调控作用，从宿主方面发挥阻断新孢子虫感染和清除已感染的新孢子虫的作用；利用活性氧是NLRP3炎症小体的上游信号分子，参与NLRP3炎症小体的活化；以ＲOS介导NLRP3通路为靶标制备抗新孢子虫感染的药物。
根据NLRP3炎症小体的活化有利于抗新孢子虫的机制，寻找活化NLRP3炎症小体的上游信号分子ROS的化学诱导剂，用该诱导剂激活NLRP3信号通路后，通过细胞入侵、感染实验，以及小鼠模型的动物实验，观察其对新孢子虫侵入宿主细胞、在宿主细胞内增殖和在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各组织中寄生虫感染的治疗效果，另外提供该诱导剂发挥抗新孢子虫作用的工作浓度和潜在的作用途径，为抗新孢子虫感染提供新的作用靶标-活性氧（ROS），以及为将来治疗新孢子虫病提供一种新的候选药物。
本发明抗新孢子虫药物的作用途径，包括以下内容：
通过免疫印迹法对宿主细胞NLRP3炎症小体活化相关蛋白表达水平进行检测，分析该ROS诱导剂对宿主细胞NLRP3信号通路的活化作用，并对宿主细胞NLRP3通路活化后，新孢子虫侵入宿主细胞的情况进行评估；其次，通过RT-qpcR检测宿主细胞内新孢子虫增殖情况和小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等各组织中虫体数量，还通过免疫荧光技术检测宿主细胞内新孢子虫感染和增殖情况，最后通过ROS诱导剂作用后细胞释放的乳酸脱氢酶（LDH）来对细胞死亡情况进行评估，分析ROS诱导剂对宿主感染新孢子虫的清除作用。
以化合物pyrogallol为主要活性成分加入药学上可接受的辅料后，制成抗犬新孢子虫的丸剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、散剂等常见剂型。
本发明的积极效果在于：
提供了化合物Pyrogallol的一种新医用用途, 通过作用于宿主细胞和小鼠模型的动物实验两方面来证实它对新孢子虫的治疗效果，可以制成抑制新孢子虫细胞感染和小鼠模型心、肝、脾、肺、肾、脑组织感染的化学药物，具有显著的疗效；本发明为新孢子虫的治疗提供了新的候选药物作用靶标-活性氧（ROS）和新的候选药物-pyrogallol,为未来寻找抗新孢子虫病的新型药物奠定基础。
附图说明
图1为本发明Pyrogallol对NLRP3炎性小体的调控；
图2为本发明Pyrogallol对新孢子虫侵入细胞的阻断效果；
图3~图4a、图4b为本发明Pyrogallol对新孢子虫胞内增殖的阻断效果；（a:为N.caninum处理;b：为N.caninum处理数小时再加pyrogalol）；
图5为本发明Pyrogallol对新孢子虫在小鼠各组织器官感染的阻断效果。
具体实施方式
以下描述了本发明的具体实施方式,但是本领域的技术人员应当理解,这仅仅是举例说明,本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的,本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下,可以对这些实施方式做出多种变更或修改,这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
实施例1
本发明以ROS诱导剂Pyrogallol为例，证明其对新孢子虫入侵细胞、胞内增殖和小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑感染的治疗效果。
Pyrogallol作用于原代小鼠腹腔巨噬细胞的途径：用Pyrogallol活化宿主细胞NLRP3通路后,观察其对新孢子虫感染宿主细胞的影响,并且对试验所得数据进行生物统计学分析。细胞感染新孢子虫速殖子（速殖子：细胞=1：1）6h后再向培养基中加入Pyrogallol（30 µM）和宿主细胞共孵育24h和48h，结果显示：24 h时，胞内虫体百分比减少了83.84%（P<0.05）；48 h时，胞内虫体百分比减少了28.8%（P<0.05）；免疫荧光技术结果:观察到Pyrogallol作用24h后新孢子虫数量显著减少。而细胞感染新孢子虫速殖子（速殖子：细胞=2：1）8h后再向培养基中加入Pyrogallol（30 µM）和宿主细胞共孵育24h、36h和48h, 通过Westernblot技术检测pyrogallol刺激不同时间段后NLRP3炎症小体活化相关蛋白IL-1β，caspase-1和NLRP3的表达情况，发现24h时未检测到NLRP3炎症小体相关蛋白的活化，36h和48h时分别都有检测NLRP3炎症小体活化相关蛋白IL-1β、caspase-1和NLRP3表达情况，结果表明Pyrogallol作用细胞后对新孢子虫感染诱导的NLRP3炎症小体活化显著升高，说明Pyrogallol作用宿主细胞后通过增加NLRP3炎症小体的活化来发挥抗新孢子虫感染的作用（如附图1）。
实施例2
抗新孢子虫药物的用途
1、ROS诱导剂对新孢子虫侵入细胞的阻断效果及胞内虫体增殖的抑制效果
本发明以ROS诱导剂Pyrogallol为例，观察其对新孢子虫入侵小鼠原代腹腔巨噬细胞的阻断效果及对胞内虫体增殖的抑制效果，并且对试验所得数据进行生物统计学分析。结果显示：Pyrogallol在抑制新孢子虫入侵细胞作用上未呈现浓度依赖性，在新孢子虫速殖子感染6h后，再用15µM、30μM、60μM的Pyrogallol分别处理24时，统计每100个细胞中的速殖子数分别减少了36.5%、37.7%和32%（P<0.05）（如附图2）。
、ROS诱导剂对新孢子虫胞内增殖的抑制效果
本发明以ROS诱导剂Pyrogallol为例，观察它对新孢子虫在小鼠原代腹腔巨噬细胞内增殖的抑制效果。
小鼠原代腹腔巨噬细胞感染新孢子虫速殖子（速殖子：细胞=1：1）数小时后，再加入ROS诱导剂Pyrogallol数小时,通过细胞感染实验，观察ROS诱导剂对细胞内新孢子虫增殖的抑制效果，并对所得数据进行生物统计学分析。结果显示：Pyrogallol对宿主细胞内新孢子虫增殖的抑制未呈现浓度及时间依赖性，当Pyrogallol为15 µM、30uM、60uM时，在新孢子速殖子感染6h,Pyrogallol处理24h时，每1×106个细胞的速殖子数分别减少了46.5%（P<0.05）、83.84%（P<0.05）和47.3%（P<0.05）；Pyrogallol处理48h为15µM ，30 µM、60uM时，新孢子虫虫体在小鼠原代腹腔巨噬细胞体内增殖减少百分比分别为46.2%（P<0.05）、28.8%（P<0.05）和13.1%（P<0.05），说明Pyrogallol的作用浓度为15 µm和30 µM时均能显著抑制胞内新孢子虫的增殖（如附图3、图4a、图4b）。
、ROS诱导剂对小鼠模型新孢子虫感染的治疗效果
本发明以ROS诱导剂Pyrogallol为例，观察它对新孢子虫小鼠感染模型的治疗效果。
小鼠腹腔接种2×107个NC-1速殖子，感染两天后，每天给小鼠腹腔注射Pyrogallol溶剂，连续给药至一周，分别设立PBS组、单纯攻虫组以及攻虫给药组75mg/kg，观察小鼠的体重变化及死亡率，给药结束后处死小鼠，对其心、肝、脾、肺、肾、脑各组织进行研磨及基因组提取，通过RT-qPCR检测每500 ng各组织DNA的新孢子虫速殖子数量（使用Nc-5特异性引物，引物序列为
上游：5′-TCCCTCGGTTCACCCGTTCACACAC-3′；
下游：5′-CACGTATCCCACCTCTCACCGCTACCA-3′；
结果发现：Pyrogallol(75mg/kg) 给药一周后，小鼠腹腔灌洗液细胞中虫体减少百分比为80.07%，小鼠各组织中速殖子数/500ng DNA心、肝、脾、肺、肾、脑分别减少了49.3%（P<0.05）、100%（P<0.05）、100%（P<0.05）、59.62%（P<0.05）、94.0%（P<0.05）、82.73%（P<0.05）。说明Pyrogallol的作用浓度为75mg/kg时能显著降低新孢子虫感染小鼠模型各组织中的虫体数量（如附图5）。
综合上述实验结果，本发明的抗新孢子虫药物通过作用于宿主细胞和感染小鼠动物模型两种途径，得到其对新孢子虫入侵宿主细胞、宿主细胞内虫体的增殖及对小鼠各组织中的虫体数量均发挥显著抑制效果，说明Pyrogallol可发挥良好的抗新孢子虫作用，可作为一种新型候选药物用于新孢子虫病的治疗。
Claims (2)
1.化合物pyrogallol在制备抗犬新孢子虫的药物中的医用用途，其特征在于该化学结构式如下：
其化学式为C6H6O3，分子量为126.11。
2.如权利要求1所述的用途，其中以化合物pyrogallol为主要活性成分加入药学上可接受的辅料后，制成抗犬新孢子虫的丸剂、片剂、胶囊剂或散剂常见剂型。
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