KR20130139837A - 금 입자를 이용한 혈액의 겔솔린 농축 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 치료 유효성 단백질 또는 단백질 혼합물을 용기에서 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 상기 용기는 체액 및 금 입자로 채우고, 또 상기 공정 중 치료 유효성 단백질이 체액 중에서 형성된다.

Description

자가유래 단백질의 제조 방법{Method for producing autologous proteins}
본 발명은 용기에 체액을 채우고, 배양하여 치료유효성 단백질을 체액에서 형성시키는, 용기 내에서 적어도 하나의 치료유효성 단백질 또는 단백질 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법을 실시하기 위한 용기, 및 상기와 같이 제조된 단백질을 활성 성분으로 함유하는 약물에 관한 것이다.
퇴행성 관절 질환은 인간 및 동물 양자에서 아주 중요하다. 인간의 경우에서, 관절증은 노인 환자에서 특발적으로(공지된 위험 인자에 의해) 생기거나, 또는 외상(post-trauma)으로 인하여 젊은 환자들에서 합병증으로서 생길 수 있다. 그러나, 양쪽 형태는 관절통 및 기능제한과 같은 동일한 임상 증상을 갖고, 또 흔히 발병 환자에게 있어 아주 제한된 삶의 질을 초래한다. 과적 하중, 부적절한 하중, 관절 불안정성 또는 기타 감염과 같은 다양한 원인들이 관절연골(articular cartilage)의 기계적 및 효소적 손상과 더불어 연골세포의 세포사멸(apoptosis)을 초래하며, 또한 II형 콜라겐 및 프로테오글리칸의 손실도 초래한다. 여기서, 퇴행과 복구(repair) 사이의 불균형이 존재한다. 연골 퇴행은 발병의 중심이지만, 상기 질환은 연골뿐만 아니라 관절낭과 연골하골에도 영향을 미친다. 연골 손상의 경우, 분해 산물은 활액(synovial fluid)에 도달하여 활막염을 초래한다. 또한, 관절낭 손상은 직접적으로 염증 매개체의 방출을 초래하며 또 심각한 외상을 입은 관절낭 또한 관절 불안정성을 초래한다. 주기적 고 하중의 경우, 연골하골판은 골밀도 증가에 의해 적응한다. 그러나, 이러한 경화의 결과로, 뼈는 점점 더 굳어져서 더 잘 부서지게 된다. 이는, 첫째로는, 충격 흡수능 감소를 초래하여 위에 놓은 연골에 대해 더욱 하중을 주게 되며, 또 둘째로는, 연골하골판과 광물화된 뼈(mineralized bone) 사이의 전이에 전단력을 초래한다. 관절증 및/또는 골관절염 및/또는 기타 관절 질환에 걸린 말의 경우, 활액에서 염증유발성(proinflammatory)(염증-촉진) 사이토카인 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 인터루킨 1(IL-1) 및 인터루킨 6(IL-6)과 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 메탈로프로테이나제의 농도 증가가 측정되어 왔다. 관절증에 걸린 인간의 경우, 염증유발성 사이토카인의 농도가 혈액 및 활액에서 역시 증가하였다.
염증유발성(염증-촉진) 사이토카인 TNFα, IL-1 및 IL-6은 활막의 B형 활막세포(Synoviocyti secretorii)에 의해, 활막에서 염증 세포에 의해 및 연골세포에 의해 분비되며 또 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 및 아그레카나제의 방출과 프로스타글란딘(PGE2) 또는 산화질소(NO)와 같은 다른 염증 매개체의 방출을 자극한다. 메탈로프로테이나제는 연골의 매트릭스(II형 콜라겐, 프로테오글리칸 포함)를 분해하는 효소이다. IL-1 및 TNFα는 또한 II형 콜라겐의 생산을 직접적으로 억제한다.
대부분의 경우, 퇴행성 관절 질환에 대한 통상적인 요법은 염증의 대증(symptomatic) 치료로 이루어지며, 즉 적절한 약물을 이용한 전신적 또는 관절내 염증 억제로 이루어진다. 이들은 때때로 히알우론산과 조합되는 코르티코스테로이드를 포함하며, 관절내로 투여되고 또 가장 흔히 사용된다. 또한, 연골보호제도 또한 때때로 투여된다. 그러나, 이들 약물 요법은 여러 가지 나쁜 효과를 갖는다.
대증 요법(비-스테로이드성 및 스테로이드성 소염제 기본)에 대한 대안은 "질병조절(disease-modifying) 약물"이라고도 불리는 사이토카인 억제제 또는 연골보호제를 사용한 치료에 의해서 형성된다(Qvist et al. 2008). 이들은 또한 환자의 혈액으로부터 내인성(자가유래) 단백질을 얻고 이것을 개별 약물로서 환자에게 재투여하는 요법을 포함한다.
WO 9909051호는 (동물 또는 인간) 환자로부터 이전에 얻은 체액 샘플에서 치료 유효성, 자가유래(= 내인성) 단백질을 제조하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 위한 주사기를 개시한다. 언급된 상기 방식으로 얻을 수 있는 단백질은 에리쓰로포이에틴, 인슐린, 인터페론, 인터루킨 4, 인터루킨 10, 용해성 종양 괴사 인자 수용체 및 인터루킨-1 수용체 길항제이다. 상기 단백질은 주사기에서 제조되어 제공된다.
주사기 내에 배열된 입자, 더욱 특히 황산 크롬에 의해 함침된 글래스 비드를 포함한 주사기의 내부 구조는, 소망하는 단백질의 생합성을 자극하도록, 고정화된 유도제에 의해 코팅된다. 체액 샘플로서 혈액의 경우, 항염증성 단백질을 형성하는혈액 중에 함유된 단핵구를 자극하기 위한 유도제로서 면역글로불린, 더욱 특히 면역글로불린 G가 고려된다.
상기 방법은 주가기에 환자로부터 얻은 체액을 충전해서 배양하는 것에 의해 실시된다. 상기 치료 유효성 단백질은 체액에서 형성된다.
이런 방식으로 농축된 체액은 주사기에 멸균 저장될 수 있고 또 필요한 경우 추가의 처리 없이 또는 예컨대 원심분리 및/또는 멸균 여과 후, 환자에게 직접 재도입될 수 있다.
본 발명의 목적은 생성된 단백질이 상당히 많은 양으로 존재하고 또 바람직하지 않은 부작용을 피하도록 하는 방법을 개발하거나 또는 변형하는 것이다.
상기 목적은 용기가 금 입자를 함유하는 처음에 언급한 유형의 방법을 제공하는 것에 의해 달성된다.
본 발명은 이하에 예시적 실시양태 및 관련 도면을 이용하여 더욱 자세하게 설명된다.
도 1: 대조군과 비교하여 본 발명에 따른 방법을 실시하기 전(T0) 및 후(T24) 다양한 환자의 혈청에서 단백질 프로파일의 MID-FTIR 분광분석. 청색은 시간 T0에서의 단백질 프로파일을 나타내고, 녹색은 시간 T24에서 본 발명에 따른 방법을 이용하여 처리된 샘플의 단백질 프로파일을 도시하며, 적색은 시간 T24에서 대조 혈청의 단백질 프로파일을 도시한다.
도 2: 상기 단백질의 복합 분석(multiplex analysis)의 결과를 도시한다:
GS = 겔솔린
IL-4 = 인터루킨-4
IL-10 = 인터루킨-10
IL-13 = 인터루킨-13
IL-1Ra = 인터루킨-1 수용체 길항제
IL-1β= 인터루킨-1β
TNF-a = 종양 괴사 인자 알파
G-CSF = 과립구-콜로니 자극인자
GM-CSF = 과립구-대식세포 콜로니 자극인자
IFN-g = 인터페론 감마
SCGF-β= 조혈 줄기세포 성장인자
MIP-1a = 대식세포 염증성 단백질-1a
MIP-1β = 대식세포 염증성 단백질-1β
VEGF = 혈관 내피 성장인자
IL-18 = 인터루킨-18
MCP-3 = 대식세포 화학주성 단백질
SDF-a = 스트로마 유래 인자
염기성 FGF = 섬유아세포 성장인자
GROa = 성장-조절된 발암유전자 알파
시간 T0("TO")에서 혈액 샘플 및 24-시간 배양 후, 한편으로는 추가의 처리 없이("대조군"), 또 다른 한편으로는 WO 9909051호에 따른 처리("StdT") 또는 본 발명("본 발명")에 따른 방법에 따라 처리.
도 3: 각 재조사 시간에서 본 발명에 따른 치료 전후에 모든 조사된 말의 팽윤 정도의 그래프를 도시한다.
도 4: 각 재조사 시간에서 본 발명에 따른 치료 전후에 모든 조사된 말의 절뚝거림(lameness) 정도의 그래프를 도시한다.
도 5: 무릎관절증에 걸린 환자의 치료 전후의 KOOS 점수를 도시한다.
도 6: 제1(T1), 제2(T2) 및 제3(T3) 주사후 시간 경과에 걸쳐 무릎관절증에 걸린 환자의 활액에서 유출(effusion) 및 겔솔린 농도를 도시한다.
도 7: 치료 후 이식물/연골뼈 제제의 프로테오글리칸 방출을 도시한다.
용어 "용기"는 이후에서 소정 길이의 시간 동안 액체를 저장하기 위한 닫을 수 있는 그릇 또는 닫을 수 있는 저장기를 의미하며, 상기 그릇 또는 저장기는 수용할 액체에 대해 누출 방지성이다.
금을 약물로 사용하는 것은 의약에서 오래전부터 알려져 있다. 19세기 말경, 금은 특히 결핵치료를 위한 약물로서 사용되었다. 류마티스성 관절염이 일종의 감염 질병이라는 잘못한 가정으로 인하여, 금이 이 질병에 대한 약물로 또한 사용되었다. 이 요법은 성공적이었고 또 오늘날까지 다년간 사용되었다(Kean and Kean 2008). 인간 연골세포에 대한 시험관내(in vitro) 연구는 금 화합물(오로티오말레이트: aurothiomlate)가 연골세포에 의한 산화질소(NO)의 생성을 억제하는 것을 나타내었다. 산화질소는 염증유발성 사이토카인 IL-1 및 TNFα의 파괴 효과를 매개한다(Green et al. 2006). 이는 감소된 콜라겐 및 프로테오글리칸 생산, 연골세포 세포사멸 및 메탈로프로테이나제의 자극을 초래한다(Vuolteenaho et al. 2005).
종래 기술에 공지된 치료 방법에 있어서, 금은 근육내로 또는 경구 투여된다. 그러나, 이들 투여방법 및 적절한 금 약제를 사용하여서는, 시험관내 연구로부터 공지된 소망하는 효과가 어느 정도만 달성된다.
본 발명에 따른 방법에서 처음으로 사용되는, 폐쇄계에서 금 입자와 인간 또는 동물 자가유래 또는 상동 체액, 더욱 특히 그의 혈액 샘플과의 조합은 놀랍게도 (i) 이전에 공지된 방법과 비교하여 뚜렷이 더 높은 농도의 소망하는 단백질, 더욱 특히 혈액의 경우에서 사이토카인(특히 IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, G-CSF, MCP-1, MIP-1, RANTES, TNF-알파, GRO-알파, MCP-3, MIF 및 IL-1RA) 뿐만 아니라 (ii) 배양 시간 동안 생리학적 단백질 노화 억제에 기인한 더 우수한 품질의 고려중인 단백질 및 또한 (iii) 단백질 겔솔린(gelsolin)의 현저한 축적을 제공한다. 겔솔린은 모든 동물 세포(인간 세포 포함) 내에 또 세포외에(예컨대 혈장 내에) 편재하는 액틴 결합 단백질이며 Ca2 +-의존적 액틴 필라멘트를 단편화하고 재중합화하는 것을 방지하며, 또 액틴-필라멘트 결합 및 분리 방법의 조절에 핵심 작용을 갖거나/충족한다. 겔솔린은 세포질 추출물에서 발견되어 확인되었고, 또 운동성(motile) 세포에서 그의 편재와 계통발생적 보존은 세포내 조절 단백질로서 필수적 역할을 제시한다. 이후에 겔솔린은 또한 포유동물의 혈장에서도 생기며 또 그곳에서 액틴을 중합체분해(depolymerize)하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 소위 혈장 겔솔린(pGelsolin, pGS)은 세포질 겔솔린(cGelsolin, cGS)의 이소형태(isoform)이며 또 N-말단에서 부가적인 23개 아미노산을 갖는 점에서 구조적으로 상이하다. 혈장 겔솔린의 생리학적 작용은 여전히 수많은 연구 작업의 주제이기도 하다(DiNubriu, 2007 및 여기에서 인용된 문헌). 겔솔린은 세포 운동성, 식균작용, 세포사멸 및 혈소판 활성화와 같은 중요한 세포 작용을 조절한다(Silacci et al. 2004, Trickey et al. 2004). 류마티스성 관절염에 걸린 인간의 경우, 겔솔린의 혈장 농도가 감소된다(Osborn et al. 2008). 조직 퇴행을 포함한 다른 질환의 경우 및 더욱 특히 패혈증의 경우에서, 상기 겔솔린의 혈장 농도도 또한 감소된다(Suhler et al. 1997, Osborn et al. 2008, Lee et al. 2007). 종래 기술은 혈장 겔솔린이 몸의 과도한 염증 반응을 흡수하기 위한 완충제로서 작용함을 나타낸다(DiNubile 2008).
본 발명에 따른 방법을 이용하여 생산된 단백질, 더욱 특히 겔솔린 및 사이토카인은 용기 내에 위치한 액체의 다른 성분과 함께 직접적 방식으로, 즉 예를 들어 원심분리, 멸균 여과 또는 다른 용기로의 전달과 같은 추가의 조작없이 환자에게 재투여될 수 있다(그러나 반드시 그래야 하는 것은 아니다). 그 결과, 단백질 용액의 오염을 피하고 또 단백질을 투여하는 동안 환자의 감염 위험을 최소화한다.
본 발명에 따른 방법의 본 발명에 따른 변형에서, 상기 금 입자는 시험관내에서 배양한 후, 체액, 예를 들어 혈청으로부터 제거되어 폐기된다. 이것의 이점은 상기 체액, 예를 들어 상기 혈청을 투여하는 동안 또는 투여한 후 금 유도된 나쁜 효과를 완전히 피하는 것이다.
본 발명에 따른 방법의 본 발명에 따른 바람직한 변형에서, 상기 금 입자 및 체세포(예를 들어 혈액세포) 및 기타 불용성 응집물은 시험관내에서 배양한 후 체액(예를 들어, 혈청)으로부터 제거되어 폐기된다. 자가유래 인간 체액 및, 더욱 특히, 제조된 상기 종류의 혈청은 용인성이 탁월하며, 또 나쁜 영향은 예상되지 않는다.
상기 방법에 사용된 금 입자는 바람직하게는 소정 구조 및/또는 소정 크기를 갖는다. 10 나노미터 내지 500 마이크로미터 범위의 입자 크기를 갖는 미세입자 및/또는 나노입자가 특히 적합하다.
금 입자가 시험관내 배양 후 체액, 예를 들어, 혈청으로부터 제거되어 폐기되는 본 발명에 따른 방법의 변형에서, 바람직하게는 약 1 ㎛ 크기의 금 입자가 더욱 바람직하게는 10 ml 당 103 -104 금 입자 양으로 상기 방법에 사용된다. 상기 용도의 경우, 용량이 약 10 ml인 용기(예를 들어 주사기)가 실제로 유용한 것으로 밝혀졌다.
실제 사용에서 성공적인 것으로 입증된 일개 실시양태에서, 상기 금 입자는 1 ml의 체액당 0.3 mg 양으로 용기 내에 존재한다. 원칙적으로 1 ml당 0.1 내지 10 mg의 농도가 적합한 것으로 고려된다.
용기의 내부 구조는 바람직하게는 헤파린, 시트레이트, EDTA 또는 CPDA와 같은 항응고제를 갖지 않는데, 본 발명이 기본으로 하는 작업의 일부로서, 놀랍게도, 이들 물질의 부재하에서 보다는 이들 물질의 존재하에서 몇 개의 단백질이 생합성된다는 것이 밝혀졌기 때문이다. 특히 체액인 혈액 및 항응고제인 헤파린의 경우에서, 헤파린 및 기타 항응고제의 부재하에서보다는 예들 들어 용기 내벽의 코팅으로서 헤파린 존재하에서 상당히 낮은 사이오카인 생산이 얻어졌다.
가능한 용기는 특히 주사기인데, 이는 이것이 배양 용기로서 사용될 수 있을뿐만 아니라 동시에 체액을 얻기 위한 수집 기구로서 및/또는 단백질을 환자에게 투여하기 위한 투여 기구로서 적합하기 때문이다.
그러나, 다른 가능한 용기는 밀봉가능한 파우치인데, 이는 특히 비교적 큰 부피의 경우에서 상응하는 부피의 주사기에 비하여 더욱 유연하게 취급되고 저장될 수 있고, 또 기술적으로 간단하고 신뢰성있는 방식으로 주사기에 커플링될 수 있기 때문이며, 또 상기 주사기를 통하여 충전과 비움이 실시될 수 있기 때문이다.
본 발명에 따른 방법은 혈액 세포로부터 단백질을 생성(생합성)하고 축적하는데 특히 적합하다. 따라서, 특히 혈액, 바람직하게는 혈청이 체액으로 고려된다.
놀랍게도, 상기 치료 유효성 단백질 겔솔린은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 생성되고 또 특히 효과적으로, 즉 상당한 양으로 축적될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 특히 겔솔린을 얻기 위한 것이다.
체액으로 채워진 용기에 대한 배양 조건에 관해서는, 20℃ 내지 41℃, 바람직하게는 37℃의 온도에서 12 내지 72시간, 바람직하게는 24시간의 배양 시간이 양호한 결과를 초래함이 실제로 밝혀졌다.
상술한 목적은 체액에서 치료 유효성 단백질을 시험관내에서 생합성하고 축적(시험관내 유도)하기 위한 용기를 제공하는 것에 의해 달성되며, 이는 용기가 금 입자를 함유하고 또 체액 샘플을 수집하고, 저장하며 또 재분배하기에 적합하다는 사실과 내용물이 중공(hollow) 바늘(캐눌라, 주사바늘)에 의해 주사될 수 있도록 중공 바늘(캐눌라, 주사바늘)과 커플링가능하다는 사실을 특징으로 한다.
상기 용기를 이용하여, 상술한 단백질 제조 방법을 실시할 수 있고 또 그와 관련된 이점을 이용할 수 있다. 상기 제조된 단백질은 커플링가능한 중공 바늘에 의해 소망하는 투여 부위에 직접 투여, 더욱 특히 인간 또는 동물 체내에 도입될 수 있다.
상기 금 입자는 바람직하게는 소정 구조 및/또는 소정 크기를 갖는다. 미세입자 및/또는 나노입자(10 나노미터 내지 500 마이크로미터의 입자 크기)가 특히 적합하다. 용기 중의 금 입자의 적절한 양은 1 ml의 체액당 0.1 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 1 ml의 체액당 0.3 mg이다.
상기 용기는 바람직하게는 주사기 또는 파우치이다. 주사기의 이점은 배양 용기로서 사용될 수 있을뿐만 아니라 동시에 체액을 얻기 위한 수집 기구 및/또는 단백질을 환자에게 투여하기 위한 투여 기구로서 사용될 수 있다는 것이다. 파우치의 이점은 비교적 대 부피인 경우, 상응하는 부피의 주사기에 비하여 더욱 유연하게 취급되고 저장될 수 있고 또 충전 및 비우기를 위해 주사기에 커플링될 수 있다는 것이다.
특히 아주 적합한 용기는 내부 공동에 특정 디자인을 갖지 않는 시판되는 주사기(예를 들어, 5 내지 100 ml 주사기)이다. 상기 금 입자(예를 들어, 바이오라드 라보라토리즈로부터 입수한 Gold Microcarriers, 카탈로그 165-2264)는 주사기 실린더에 도입된다.
주사기, 더욱 특히 주사기 실린더의 내벽 및 실린더 내에 있는 주사기 플런저(plunger)의 일부는 바람직하게는 플라스틱, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌(중성 S-Monovettes, Sarstedt) 또는 유사한 물질 또는 그의 혼합물로 이루어진다.
상기 용기는 혈액 세포로부터 단백질, 더욱 특히 겔솔린을 제조(생합성)하고 또 축적하기에 특히 적합하다. 따라서, 특히 혈액, 바람직하게는 혈청이 체액으로 고려된다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여 체액에서 생성된 단백질은 상기 체액 및 금 입자와 함께 또는 금 입자 없이 질병 치료를 위한 약물로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여 제조된 상기 단백질-농축된(protein-enriched) 및, 더욱 특히, 사이토카인-농축된 및 겔솔린-농축된 체액, 더욱 특히 혈청은 더 안전하고, 염가로 신속하게 제조될 수 있으며, 또 나쁜 영향이 특히 적어, 통상의 상응하는 약물 제제에 대한 대안을 나타낸다.
따라서 본 발명은 또한 체액, 더욱 특히 혈청과 금 입자의 혼합물을 배양(예를 들어, 20℃ 내지 41℃, 바람직하게는 37℃의 온도에서 12-72시간, 바람직하게는 24시간 동안)하는 것에 의해, 또 이어 금 입자 및 바람직하게는(즉, 경우에 따라) 부가적으로 혈액 세포 및 기타 불용성 성분을 체액, 더욱 특히 혈청으로부터 제거하여 폐기(바람직하게는 원심분리 및/또는 멸균 여과에 의해)하는 것에 의해, 금 입자, 바람직하게는 약 1 ㎛ 크기이고 또 바람직하게는 10 ml 용기당 103 -104 금 입자(또는 1 ml의 혈액/용기당 1 ㎛의 직경을 갖는 금 입자 0.3 mg) 양으로 금 입자를 함유하는 용기에 수집되는 체액, 더욱 특히 혈청에 의해 얻을 수 있는, 약물로서 사용하기 위한 또는 약물을 제조하기 위한 단백질-농축된 체액, 더욱 특히 사이토카인-농축된 및 겔솔린-농축된 혈청을 제공한다.
본 발명은 자가유래 또는 상동 혈액 및 금 입자의 약물로서 또는 약물 제조를 위한 용도를 제공한다. 즉: 본 발명은 약물로 사용하기 위한 자가유래 또는 상동 혈액 및 금 입자로 이루어진 물질 혼합물, 또는 활성 성분 조합으로서 축적된 단백질을 비롯한 자가유래 또는 상동 혈액 및 금 입자로 이루어진 물질 혼합물을 포함하는 약물을 제공한다.
본 발명에 따른 약물은 간단하고, 저렴하며, 위험이 적고 또 효과적인 치료를 허용한다.
기재된 약물은 퇴행성 관절 질환, 특히 관절증 및 건손상(건염)의 치료에 특히 적합하다. 특히 금 입자와 배양된 다음 입자를 제거한 약물은 관절증 및 조직 퇴행 및/또는 겔솔린 결핍과 관련된 다른 질병을 치료하기에 아주 적합한 것으로 고려된다.
본 발명에 따른 약물의 일개의 특정 실시양태는 배양 후 겔솔린에 대한 관련 표준 혈액값의 적어도 2배인 겔솔린 함량을 갖는, 금 입자와 배양된 체액(더욱 특히 혈액)인 것을 특징으로 한다. 본 내용에서, 용어 "겔솔린에 대한 관련 표준 혈액 수준"은 약물에 의해 처리될 환자군의 혈액에서 겔솔린에 대한 의료적 또는 수의과적 표준 값을 의미한다. 상기 환자군은 동물학적 종 및 인종, 성별 및 나이 면에서 특징으로 한다. 이러한 겔솔린-풍부 약물은 환자의 혈액에서 겔솔린 결핍과 관련된 질병, 예를 들어 패혈증 또는 중풍의 치료용으로 고려된다.
배양된 혈액-금 혼합물은 전체적으로 또는 부분적으로 투여될 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어 혈액으로부터 세포 및 세포 단편을 제거하기 위해 또 따라서 동시에 주사 부피를 감소시키기 위하여 (동물 또는 인간) 환자에게 투여하기 전에 원심분리 및/또는 멸균 여과에 처리될 수 있다.
실시예 1: 본 발명에 따른 방법에 이은 혈액 샘플에서 또 본 발명에 따른 용기에서 단백질 생산을 MID - FTIR 분광측정법 및 복합 분석에 의해 확인
11명의 상이한 환자(번호 1-11) 각각으로부터 2개의 9 ml 혈액 샘플을 본 발명에 따른 용기, 즉 2.7 mg의 금 입자(1 ㎛의 직경을 가짐)로 미리 채워진 9 ml 주사기에 수집하였다. 동일 공급원(환자)으로부터 동량의 혈액 샘플을 어떠한 금 입자도 함유하지 않는 유사한 9 ml 주사기 내에 수집하였다. 상기 샘플들은 상이한 시기에, 즉 혈액을 취한 직후 시간 T0 및 37℃에서 24시간 배양한 후 시간 T24에서 분석하였다.
상기 샘플들은 중적외선 범위(스펙트럼 범위 4000 cm-1 내지 400 cm-1)에서 포리어 변환 적외선 분광측정기, 간단히 말해 MID-FTIR 분광측정기(예컨대, Micro-Biolytics GmbH/Esslingen으로부터의 AquaSpec 방법)에 의해 분석하였다. 포리어 변환 적외선 분광측정기를 지지하는 측정 원리는 물질에 전자기파를 조사하여 특정 주파수 범위가 흡수되는 것을 기초로 한다. 적외선 방사선은 에너지적으로 분자 결합의 진동 수준 범위에 있기 때문에, 흡수는 결합의 진동 자극을 초래한다. 이는 측정된 스펙트럼에서 굴절 형태로 볼 수 있게 된다(다이아그램). 따라서 필요한 에너지 또는 진동수는 특정 결합의 특징이기 때문에, 물질을 확인하고 구조를 명확하게 할 수 있다.
FTIR 분광측정은 생물학적 거대분자에서 구조적, 반응-유도된 변형의 분석에 특히 적합하다. 이 방법을 이용하여, 생물학적 계, 더욱 특히 단백질-함유 수성 액체를 조사할 수 있다. 상기 샘플은 변형되지도 파괴되지도 않으며 또 생체분자의 천연 조건하에서 작업이 실시되며, 즉 샘플의 고정도 상이한 종류의 샘플 제조도 필요하지 않기 때문에 "실제 상태"가 측정될 수 있다.
단백질의 모든 분자 구성분은 적외선 분광 범위에서 흡수 밴드를 가지기 때문에, 단백질의 거의 모든 영역이 관찰될 수 있고 또 단백질의 구조에 대한 상세한 정보도 얻을 수 있다.
MID-FTIR 분광측정 방법은 단백질 구조 및 단백질 농도의 측정에서 자동화되고 재현가능한 변화의 확인 정량을 허용한다. 아주 낮은 단백질 농도(0.1 mg/ml 미만) 및 아주 적은 구조 변화도 검출될 수 있다.
본 발명의 내용에 따른 방법을 실시할 때, 금 입자를 갖거나 또는 갖지 않는 혈액 샘플은 분광학적 측정 셀(투과 셀) 내의 "실제 상태"에서 분석하였고, 이는 아주 정밀하고, 생체에 적합하고 또 수성 샘플에 적합하였다. 내부 검량을 이용하여, 용해된 단백질의 농도 및 그의 이차 구조(알파 헬릭스, 베타 시트)는 각 측정된 샘플에 대해 자동적으로 결정하였다.
상기 측정의 결과는 도 1에 그래프로 도시한다. 본 발명에 따라 금 입자 존재하에서 배양된 샘플의 생물학적 거동은 대조군 샘플의 생물학적 거동과 상이함을 나타낸다. 시간 T0에서 모든 샘플의 측정된 값은 청색으로 표시하며 상부-좌측 사분면에서 우세하다. 24시간의 배양 시간으로 본 발명에 따른 방법을 실시한 후 측정된 값은 녹색으로 표시하며 하부-좌측 사분면 내 또는 근처에서 우세하다. 이는 혈액을 배양하는 동안 생리학적 단백질 노화(ageing)가 금의 부가에 의해 억제되는 것을 나타낸다. 24시간 동안 배양한 후의 대조군 샘플의 측정된 값은 적색으로 나타내고 또 상부-우측 사분면에서 우세하다. 이러한 우측으로의 이동은 단백질 구조의 노화를 나타낸다.
눈에 띄게 코드화된 미세입자(예컨대 뮌헨에 소재하는 바이오라드 라보라토리스로부터 입수가능한 BioPlexTTM 200 시스템)를 기본으로 한 다변수 분석법(동의어: 복합 분석)을 이용하여, 본 발명에 따른 방법에 관련된 샘플("본 발명"), WO 9909051호에 따른 방법과 관련된 샘플("StdT") 및 아무런 처리를 하지 않는 상응하는 대조군에서 하기 단백질을 시간 T0 및 T24에서 정량 측정하였다:
겔솔린(GS), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra), 인터루킨-1β(IL-1β), 종양 괴사 인자 알파(TNF-a), 과립구-콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 감마(IFN-g), 조혈 줄기세포 성장인자(SCGF-β), 대식세포 염증성 단백질-1a(MIP-1a), 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 인터루킨-18(IL-18), 대식세포 화학주성 단백질(MCP-3), 기질(stromal) 유래 인자(SDF-a), 섬유아세포 성장인자 베이식(FGF), 성장-조절된 발암유전자 알파(GROa). 이들 단백질은 조직 퇴행 및 조직 복구에 중요한 역할을 한다.
상기 분석 결과를 표 1에 나타내며 또 도 2에 그래프로 도시한다.
이들은, 본 발명에 따라 처리된 샘플("본 발명")의 경우, 24시간 후 겔솔린 농도에서 상당한 증가(10 인자)가 생긴 반면에, 대조 샘플의 경우("대조군 T24" 및 "StdT T24"), 겔솔린 축적보다는 겔솔린 소실이 발견됨을 보여준다. 종양 괴사 인자 알파(TNF-a), 대식세포 화학주성 단백질(MCP-3) 및 성장-조절된 발암유전자 알파("GROa")의 농도는 대조군 샘플("대조군 T24" 및 "StdT T24")에서보다는 본 발명에 따라 처리된 샘플("본 발명")에서 실질적으로(TNF-a: 30-40 인자; MCP-3: 20-30 인자) 또는 적어도 분명히(GROa: 2 인자) 더 높았다.
실시예 2: 동물에서 약물 효능 연구
A) 연질-조직 팽윤
유망한 임상 연구의 일부로서, 건염(뼈에 대한 부착 영역에서 텐던(tendon)에 대한 퇴행성 변화)에 따른 현저한 연질 조직 팽윤을 갖는 8마리 말을 본 발명에 따른 약물에 의해 처리하였다.
상기 약물을 제조하기 위하여, 금 입자-함유 주사기 형태의 본 발명에 따른 용기에 관심 동물로부터 얻은 혈액을 채우고 37℃ 영역의 온도에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 기간의 말기에, 약물은 상기 기간 동안 합성되어 축적된 단백질, 더욱 특히 사이토카인 및 겔솔린, 및 금 입자를 함유하는, 주사기에 위치한 혈액 형태로 완성되며, 또 직접적으로 또 즉시 사용될 수 있다. 상기 약물은 주사기 내에서 제조되었기 때문에, 옮기지 않고 또 따라서 오염 및 물질 손실 없이 주사에 의해 동물에 투여될 수 있다.
현재의 연구를 위해, 각 말에 대하여 시간 T0에서 4종의 약물-복용량을 제조하며, 즉 4개의 금 입자-함유 주사기에 고려 중인 동물로부터 얻은 혈액을 채우고, 37℃ 영역의 온도에서 24시간 동안 배양하였다.
이들 약물 주사제를 각 경우에서 1주의 간격을 두고 각 말에 투여하였다. 최초의 투여는 시간 T24에서 실시하였고, 또 제2회, 제3회 및 제4회 투여는 1주후, 2주 후 및 3주 후에 실시되었다. 제2회, 제3회 및 제4회 투여를 위한 약물-함유 주사기는 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
팽윤 상태는 1주후, 2주후, 3주후, 3개월 후, 6개월 후 및 1년 후에 확인하였고 또 0-5 기준을 이용하여 평가하였다(0 = 전혀 팽윤없음, 5 = 심각한 팽윤).
모든 8개 경우에서, 3주 후만에 현저한 팽윤 감소가 발견되었다. 6개월 후 및 1년 후에도, 모든 말은 팽윤에서 완전히 자유로왔다. 치료하는 동안, 어떠한 나쁜 효과도 밝혀지지 않았다.
이 연구의 결과는 도 3에 그래프로 도시되어 있다.
B) 절뚝거림( Lameness )
다른 말 연구에서, 절뚝거리는 임상 증상(12개의 사지가 영향을 영향을 받음)을 나타내는 11마리의 말을 본 발명에 따른 약물로 치료하였다. 절뚝거리는 증례의 의료적 원인은 6개의 증례에서는 관절 내/관절 상에서 퇴행성 연골 변화(n=6)이었고 또 6개의 증례에서는 연질-조직 질환(n=6)이었다.
약물을 제조하기 위하여, 각 말의 경우, 금 입자-함유 주사기 형태의 본 발명에 따른 4개 용기에 고려중인 동물로부터 얻은 혈액을 채우고 또 37℃ 영역의 온도에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 기간의 말기에, 약물은 상기 기간 동안 합성되어 축적된 단백질, 더욱 특히 사이토카인 및 겔솔린, 및 금 입자를 함유하는, 주사기에 위치한 혈액 형태로 완성되었다. 주사 부피를 최소화하기 위하여, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해, 뒤이은 원심분리 방법에 의해 혈구 분획을 제거하였다. 각 상청액 만을 주사에 사용하였다.
이들 약물 주사제를 각 경우에서 1주의 간격을 두고 각 말에 투여하였다. 최초의 투여는 시간 T24에서 실시하였고, 또 제2회, 제3회 및 제4회 투여는 1주후, 2주 후 및 3주 후에 실시되었다. 제2회, 제3회 및 제4회 투여를 위한 약물-함유 주사기는 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
절뚝거림은 1주후, 2주후, 3주후, 3개월 후, 6개월 후 및 1년 후에 확인하였고 또 절뚝거림의 정도는 AAEE(American Association of Equine Practioners)에 따라 0-4 기준(0 = 전혀 절뚝거림 없음, 5 = 심각한 절뚝거림)을 이용하여 평가하였다.
모든 12개 경우에서, 3주 후만에 현저한 절뚝거림 감소가 발견되었다. 6개월 후 및 1년 후에도, 모든 말은 증상에서 완전히 자유롭고, 더욱 특히 절뚝거림에서 자유로왔다. 치료하는 동안, 어떠한 나쁜 효과도 밝혀지지 않았다.
이 연구의 결과는 도 4에 그래프로 도시되어 있다.
실시예 3: 금 입자를 함유하는 본 발명에 따른 용기의 제조
사용된 금 입자는 금 분말이었다(입자 크기 1 ㎛, 뮌헨에 소재하는 바이오-라드 라보라토리즈). 상기 금 입자는 제조자에 의해 추천된 바와 같이 먼저 멸균된다; 소망하는 양의 금 입자/금 분말, 예를 들어 30 mg을 1 ml의 70% 세기 에탄올과 함께 혼합하고, 가볍게 교반(혼합기, 보르텍서)하면서 10분간 배양하고, 1분간 침강시킨 후 원심분리시킨 다음 상청액을 제거하였다. 그후, 상기 금 입자는 각 경우에서 1 ml의 멸균 이중-증류된 물을 사용하여 3회 세척하였다. 최종 원심분리에 따라 마지막 세척 과정과 상청액을 따라낸 후, 상기 금 입자를 멸균 PBS에 재현탁시키고 또 소망하는 농도, 예를 들어 60 mg/ml로 조절하였다. 연속적인 교반하에서, 피펫을 이용하여 10 ㎕의 금 입자 용액을 제거하였고 또 Sarstedt(REF 02.1726.001)로부터 얻은 S-Monovette(모노베트) - 중성/9 ml(92 x 16 mm)로 옮겼다. 상기 모노베트는 먼저 멸균 작업대(스크류 캡)에서 열고, 10 ㎕ 금-입자 용액을 주사기 내벽에 가한 다음 다시 닫았다. 채워진 모노베트는 사용할 때까지 실온에서 저장하였다. 본 발명에 따른 방법을 실시할 때 사용하기 위하여, 9 ml의 체액(예컨대 혈액)을 상기 제조된 모노베트에 채우고 금-입자/PBS 용액과 혼합하였다.
실시예 4: 인간에서 약물 효율 연구
유망한 종적 연구의 일부로서, 방사능적으로 검출된 무릎관절증에 걸린 총 9명의 환자 또는 13개의 관절을 등록 의사에 의해 치료받았다. 관절증의 정도는 켈그렌-로렌스 기준에 따라서 등급 3-4로 평가되었다(Kellgren J.H. and Lawrence J.S.: "Radiological Assessment of Osteo-Arthrosis", Ann. rheum. Dis.(1957), 16, 494-501). 모든 환자는 먼저 금으로 처리된 다음 입자를 제거하여 본 발명에 따른 자가유래 혈청에 의해 관절강내 주사를 각각 1주일 간격으로 4회 투여받았다. 관절강내 유출이 있다면, 주사 전에 각 경우에서 배수되었고, 배수된 양을 수록하고, 또 이후의 가공을 위해 -20℃에서 1 ml 분량(aliquot)으로 냉동시켰다. 이 치료의 임상 결과는 처리 전 및 허가된 점수 평가 시스템(동의어: 스코어) "KOOS"를 이용하여 치료한 지 1, 3, 6 및 12개월 후에 기록하였다(Roos E.M., Roos H.P., Lohmander L.S., Ekdahl C., Beynnon B.D.: "Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score (KOOS - development of a self-administered outcome measure", J. Orthop. Sports Phys. Ther. 1998, 28: 88-96). 최대로 얻을 수 있는 점수는 100이었다. 점수가 높을수록, 달성한 결과가 더 우수하였다. 결과를 도 5에 그래프로 도시한다.
변수 "증상" 및 "스포츠 활동도"에 관련된 KOOS 점수의 평가는 3개월 및 6개월 후 임상 증상에서 뚜렷한 향상을 나타내었다(참조. 도 5).
1명 환자의 경우에서, 처음에는 상당한 유출이 있었다. 상기 유출은 주사 치료 전에 각 경우에서 배출되었고, 유출 양을 수록하고 또 겔솔린 농도에 대하여 활액 흡인물(synovial aspirate)을 시험하였다. 겔솔린 농도는 유출에 의한 희석 정도에 따라 달라지기 때문에, 겔솔린 농도는 우레아 농도를 기본으로 하였다(Kraus et al.: Urea as a Passive Transport Marker for Arthritis Biomarker Studies, ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 46, No. 2, February 2002, pp. 420-427). 그 결과는 도 6에 그래프로 도시되어 있다.
본 발명에 따라 제조된 혈청, 즉 금 입자와 함께 배양한 다음 (모든) 입자가 제거된 혈청을 관절강내 투여하는 것에 의해, 관절강내 겔솔린 농도를 분명하게 증가시킬 수 있었다(참조: 도 6). 동시에, 유출량에서 감소가 있었고(참조: 도 6) 또 임상 증상에서 분명한 향상이 있었다.
이 연구는 관절증 치료, 및 일반적으로 겔솔린 결핍증과 관련된 질병을 치료에 대한 증거를 제공한다.
실시예 5: 시험관내 연골 충격 모델에서 본 발명에 따른 연골보호 효과의 표시
관절증 발병하는 동안 관절 연골에 대한 기계적 과부하의 영향은 충분히 알려져 있다. 연골뼈 이식물에 대한 기계적 하중의 영향을 시험하는 시험관내 모델, 예를 들어 후저 및 데이비스로부터의 모델(Huser C.A. and Davies M.E.: "Validation of an in vitro single-impact load model of the initiation of osteroarthritis-like changes in articular cartilage", J Orthop Res., Apr 2006; 24(4): 725-732)이 잘 확립되고 입증되어 있다. 이러한 모델에서 연골 퇴행 개시에 대한 양호한 지표는 시험된 연골-뼈 샘플의 배양 배지에서 프로테오글리칸 함량의 측정이다.
본 발명을 초래한 조사를 진행하는 동안, 6 마리 동물을 포함하는 미니피그 "Goettinger Minipig"에 대한 동물-실험 연구에서, 103 금 입자를 각기 함유한 9 ml 주사기를 이용하여 동물 당 각 경우에서 4개 혈액 샘플(9 ml)을 수집하고, 또 본 발명에 따른 방법에 따라서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 기간 후, 상기 혈액 샘플을 주사기 실린더에서 원심분리하였고 또 각 주사기(또는 주사기 실린더)의 경우, 상청액은 멸균 필터를 통하여 새로운/신규 금 입자를 갖지 않는 주사기 실린더로 옮겼다.
혈액 샘플의 수집과 병행하여, 연골뼈 샘플도 각 대퇴골두로부터 무균 조건하에서 고려중인 동물로부터 수집하고 또 8 x 8 x 10 mm (길이/폭/높이) 블록으로 절단하였다. 상기 연골은 모든 이식물의 경우에서 육안으로 완전하였다. 충격 시험에서 사용하기 전에, 상기 연골뼈 샘플은 10% 인간 혈청(HS), 100 U/ml 페니실린, 100 ?/ml 겐타마이신 및 1.25 U/ml 암포테리신 B가 보충된 DMEM 배지에서 유지시켰다.
샘플 수집하는 날에, 충격 시험을 실시하였다. 이를 위하여, 연골뼈 샘플 블록/이식물을 각 경우에서 폴리메틸 메타크릴레이트로 이루어진 실린더 드롭 타워(drop tower) 내에 멸균 조건하에 수집하여 충격 플런저(plunger) 아래에 거리를 두고 33 cm 높이 및 4 cm 축으로 측정되었다. 상기 충격 플런저는 높이 5 cm 및 직경 3.94 cm 크기의 실린더 형태이고 또 그 중량은 493 g이었다. 상기 충격 플런저는 실을 통하여 높이 7 g, 높이/두께 1 cm 및 직경 0.6 cm를 갖는 실제 충격기 디스크(충격기 단위)에 연결되었다.
샘플에 대한 높이가 15 cm인 충격기 디스크(충격기)를 함유하는 충격 플런저의 자유 낙하에 의해 드롭 타워내에 있는 연골-뼈 샘플 블록당 1회 충격을 가하였다. 충격은 28.3 mm2의 연골 표면적 위에 0.736 J이었다.
연골-뼈 샘플 블록/이식물은 다음 3개 군으로 나뉘었다:
● 충격처리 받지 않은 이식물 = "충격이 가해지지 않은 대조군" = "0 대조군"
● 충격처리 받은 이식물 = "충격이 가해진 대조군" = "충격 대조군"
● 충격 처리된 다음 본 발명에 따라 제조된 단백질-농축된 혈청과 함께 배양된 이식물.
충격 처리에 이어, 상기 처리된 뼈-연골 제제 및 또한 0 대조군을 PBS에 의해 3회 세정하고 12-웰 배양판으로 전달하였다. 각 이식물에 3 ml의 각 처리 배지를 제공하고 표준화된 조건(37℃, 5% CO2) 하, 배양기에서 배양하였다. 배양 배지는 매 72시간 마다 교환하였다.
본 발명에 따라 제조된 단백질-농축된 혈청은, 이식물의 경우, 0일 및 7일에서 고려중인 이식물 군에 부가하였다. 2일, 7일 및 14일에, 배양 배지 중의 프로테오글리칸 함량을 모든 시편에 대해 측정하였다. 이를 위하여, 바이오컬러 리미티드 (영국 캐릭퍼거스 소재)로부터 입수한 Blyscan Glycosaminoglycan Assay를 사용하였다. 결과를 도 7에 그래프로 도시한다. 프로테오글리칸 함량은 평균 글리코사미노글리칸(GAG) 농도(㎍/배지 ml)로 특정된다.
프로테오글리칸 방출 분석은 모든 3개 군에서, 즉 0 대조군 및 2개의 충격처리된/충격이 가해진 이식물(연골-뼈 제제)에서, 프로테오글리칸 양이 시간 경과에 따라 증가함을 나타낸다.
그러나, 본 발명에 따라 제조된 단백질-농축된 혈청에 의해 처리된 이식물/연골-뼈 제제의 경우에서는, 그러한 증가는 충격처리 받지 않은 대조군(0 대조군)의 경우에서보다 약간 강한 정도인 반면, 상응하는 혈청 처리를 받지 않은 충격-처리된/충격처리된 이식물(연골-뼈 제제)는 아주 높은 증가를 나타내었다.
따라서 이 시험은 본 발명에 따른 약물의 연골보호 효과에 대한 증거를 제공한다.
Figure pct00001

Claims (31)

  1. 금 입자를 함유하는 용기에 체액을 채우고, 배양하며, 또 치료 유효성 단백질을 체액에서 형성시키는, 용기 내에서 적어도 하나의 치료 유효성 단백질 또는 단백질 혼합물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금 입자는 시험관내 배양 후 체액으로부터 제거되어 폐기되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금 입자 및 체세포 및 기타 불용성 응집물이 시험관내 배양 후 체액으로부터 제거되어 폐기되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금 입자가 소정 크기를 갖는, 더욱 특히 미세입자 및/또는 나노입자인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금 입자는 1 ml의 체액당 0.1 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 1 ml의 체액당 0.3 mg의 양으로 용기 내에 존재하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금 입자는 약 1 ㎛ 크기이고 또 10 ml당 103-104 금 입자 양으로 존재하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용기가 주사기인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용기가 밀봉가능한 파우치인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체액이 혈액인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 체액으로 채워진 상기 용기는 20℃ 내지 41℃, 바람직하게는 37℃의 온도에서 12 내지 72시간, 바람직하게는 24시간 배양되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 유효성 단백질이 겔솔린인 방법.
  12. 체액 중의 치료 유효성 단백질을 시험관내 생합성 및 축적(시험관내 유도)하기 위한 용기로서,
    상기 용기는 금 입자를 함유하고, 체액 샘플을 수집하고, 저장하며 또 재분배하기에 적합하며, 또 중공 바늘과 커플링가능해서 그 내용물이 상기 중공 바늘에 의해 주사될 수 있는, 용기.
  13. 제12항에 있어서, 상기 금 입자가 소정 크기를 갖고, 더욱 특히 미세입자 및/또는 나노입자인 용기.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 금 입자는 1 ml의 체액당 0.1 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 1 ml의 체액당 0.3 mg의 양으로 용기에 존재하는 용기.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용기가 주사기인 용기.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용기가 밀봉가능한 파우치인 용기.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체액이 자가유래 또는 상동 혈액인 용기.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 유효성 단백질이 겔솔린인 용기.
  19. 자가유래 또는 상동 혈액 및 금 입자를 포함하는 약물로 사용하기 위한 물질 혼합물.
  20. 제19항에 있어서, 겔솔린에 대한 관련 표준 혈액 값의 적어도 2배인 겔솔린 함량을 갖는 물질 혼합물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 약물은 겔솔린 결핍과 관련된 질병 치료용으로 적합한 것으로 고려되는 물질 혼합물.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 약물이 조직 퇴행과 관련된 질병 치료용으로 적합한 것으로 고려되는 물질 혼합물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 질병은 관절증이고 또 상기 약물은 관절증 치료용으로 적합한 것으로 적합한 것으로 고려되는 물질 혼합물.
  24. 금 입자를 함유하는 용기 내에 혈청을 수집하고, 상기 혈청과 금 입자의 혼합물을 배양하며 또 이어 상기 금 입자를 혈청으로부터 제거하여 폐기하는 것에 의해, 약물로 사용하기 위한 사이토카인-농축된 및 겔솔린-농축된 혈청.
  25. 제24항에 있어서, 겔솔린에 대한 관련 표준 혈액 값의 적어도 2배인 겔솔린 함량을 갖는 혈청.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 금 입자 및 혈액 세포 및/또는 기타 불용성 성분이 혈청으로부터 제거되어 폐기되는 혈청.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금 입자가 약 1 ㎛ 크기인 혈청.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금 입자는 10 ml 용기 당 103 -104 금 입자량 또는 1 ml의 혈액/용기 당 1 ㎛ 직경을 갖는 금 입자량 0.3 mg으로 존재하는 혈청.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 조직 퇴행과 관련된 질병 치료용으로 적합한 것으로 고려되는 혈청.
  30. 제29항에 있어서, 상기 질병은 관절증이고 또 상기 약물은 관절증 치료용으로 적합한 것으로 적합한 것으로 고려되는 혈청.
  31. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 겔솔린 결핍과 관련된 질병 치료용으로 적합한 것으로 고려되는 혈청.
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